Набор реагентов для выявления РНК вируса гепатита А (НAV) в клиническом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией "АмплиСенс® HAV-FL" по ТУ 9398-105-01897593-2012 — инструкция и характеристики

РУ: ФСР 2010/07304 от 22.04.2010 · класс риска 2б

Производитель: ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Россия)

Вид изделия: Вирус гепатита А нуклеиновая кислота ИВД, анализ нуклеиновых кислот

В госконтрактах 44-ФЗ: 43 контракта, медианная цена за единицу 19 710 ₽.

Автоматически отфильтрованный фрагмент инструкции по применению (страницы, где похоже, что есть таблица технических характеристик) — не полный документ. Карточка РУ на портале Росздравнадзора →

Текст инструкции: технические характеристики

--- стр. 3 ---
«СОГЛАСОВАНО»
И.О.директора ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича
Роспотребнадзора
А.А.Мовсесянц


--- стр. 4 ---
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ....................................................................................................3
НАЗНАЧЕНИЕ......................................................................................................................3
ПРИНЦИП МЕТОДА........................................................................................... 3
ВАРИАНТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ.............................................4
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ............................................................................6
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ.........................................................................................7
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ...............................................9
ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА. 11
ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАКЦИИ РНК ........................12
ВАРИАНТ FEP....................................................................................................................14
СОСТАВ..............................................................................................................................14
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ.......................................................................17
ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ................................................17
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ...............................................................................18
А. Подготовка пробирок для проведения амплификации ..................................18
Б. Проведение амплификации..............................................................................20
ФЛУОРЕСЦЕНТАЯ ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ ПО «КОНЕЧНОЙ
ТОЧКЕ»...........................................................................................................................20
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ.............................................................................21
Интерпретация результатов в исследуемых образцах ......................................21
Интерпретация результатов в контрольных образцах .......................................22
ВАРИАНТ FRT....................................................................................................................23
СОСТАВ..........................................................................................................................24
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ......................................................................26
ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ...............................................27
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО
ВРЕМЕНИ».....................................................................................................................28
А. Подготовка пробирок для проведения амплификации..................................28
Б. Проведение амплификации с детекцией в режиме «реального времени» . 29
АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ..........................................................30
Интерпретация результатов в исследуемых образцах ......................................30
Интерпретация результатов в контрольных образцах .......................................31
СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ.....................33
ПРИЛОЖЕНИЕ А. Выделение РНК из образцов при использовании комплекта
реагентов «РИБО-преп»................................................................................................... 33
ПРИЛОЖЕНИЕ Б. Выделение РНК из образцов при использовании комплекта
реагентов «МАГНО-сорб»................................................................................................ 36
Б1. Выделение из 1000 мкл исследуемого образца..................................................36
Б2. выделение из 200 мкл исследуемого образца.....................................................38
ПРИЛОЖЕНИЕ В. Схема приготовления реакционных смесей для варианта FEP... 40 
В1. Приготовление реакционной смеси в случае необходимости подготовки
пробирок «ФОН»............................................................................................................40
В2. Приготовление реакционной смеси при повторном использовании пробирок
«фон»..............................................................................................................................41
ПРИЛОЖЕНИЕ Г. Схема приготовления реакционных смесей для варианта FRT.... 42
ОГЛАВЛЕНИЕ


--- стр. 5 ---
список СОКРАЩЕНИЙ
В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения:
ВКО - внутренний контрольный образец
РНК - рибонуклеиновая кислота
око - отрицательный контрольный образец
от - обратная транскрипция
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
пко - положительный контрольный образец
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
ФГУН ЦНИИЭ
Роспотребнадзо
ра
- федеральное государственное учреждение науки 
«Центральный научно-исследовательский институт 
эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере 
защиты прав потребителей и благополучия человека
HAV - вирус гепатита А
FEP - детекция по «конечной точке»
FRT - детекция в режиме «реального времени»
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов для выявления РНК вируса гепатита А {HAV) в клиническом 
материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции 
(ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Материалом для проведения 
ПЦР служат пробы РНК, выделенные из плазмы (сыворотки) крови, фекалий и 
объектов окружающей среды (концентраты (элюаты) проб воды (сточная, питьевая, 
вода из поверхностных водоемов и т.д.). Для выделения РНК используются наборы 
реагентов, производимые или рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. 
ВНИМАНИЕ! Результаты ПЦР-исследования учитываются в комплексной 
диагностике заболевания.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Выявление РНК HAV методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с 
гибридизационно-флуоресцентной детекцией включает в себя три этапа: 
1) экстракцию (выделение) РНК из исследуемого материала, 2) обратную 
транскрипцию РНК и ПЦР-амплификацию кДНК/ДНК и 3) гибридизационно- 
флуоресцентную детекцию, которая производится либо непосредственно в ходе ПЦР 
(вариант FRT), либо после ее завершения (вариант FEP). Экстракция РНК из 
исследуемого материала проводится в присутствии внутреннего контрольного 
образца (ВКО), который позволяет контролировать выполнение процедуры 
исследования для каждого образца. Затем с полученными пробами РНК проводятся 
реакция обратной транскрипции (ОТ) и реакция амплификации участка 
синтезированной кДНК в одном реакционном буфере (ОТ-ПЦР). Реакция
/
V


--- стр. 7 ---
окружающей среды, проведение реакции обратной транскрипции РНК и ПЦР- 
амплификации кДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке».
Формы комплектации 5 и 6 предназначены для проведения реакции обратной 
транскрипции РНК и ПЦР-амплификации кДНК с гибридизационно-флуоресцентной 
детекцией по «конечной точке». Для проведения полного ПЦР-исследования 
необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции (выделения) 
РНК/ДНК, рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.
Вариант FRT
Набор реагентов выпускается в 6 формах комплектации:
Форма 1 включает комплекты реагентов «РИБО-преп» вариант 50-2  штуки и 
«ПЦР-комплект» вариант FRT-100 F.
Форма 2 включает комплекты реагентов «РИБО-преп» вариант 50 и «ПЦР- 
комплект» вариант FRT-50 F.
Форма 3 включает комплекты реагентов «МАГНО-сорб» вариант 100-1000 и 
«ПЦР-комплект» вариант FRT-100 F.
Форма 4 включает комплекты реагентов «МАГНО-сорб» вариант 100-200 и 
«ПЦР-комплект» вариант FRT-100 F.
Форма 5 включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 F.
Форма 6 включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F.
Формы комплектации 1, 2, 3 и 4 предназначены для проведения полного ПЦР- 
исследования, включая выделение РНК из клинического материала и объектов 
окружающей среды, проведение реакции обратной транскрипции РНК и ПЦР- 
амплификации кДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме 
«реального времени».
Формы комплектации 5 и 6 предназначены для проведения реакции обратной 
транскрипции РНК и ПЦР-амплификации кДНК с гибридизационно-флуоресцентной 
детекцией в режиме «реального времени». Для проведения полного ПЦР- 
исследования необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции 
(выделения) РНК/ДНК, рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.


--- стр. 8 ---
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 
Аналитическая чувствительность
Вариант
Объём
выделения,
мкл
Метод
выделения
. #
Вид исследуемого 
материала
т
Аналитическая
чувствительность
Т. "ч ?.' ^  '
Плазма (сыворотка) 
крови;
100 «РИБО-
преп»
Осветленные 
экстракты фекалий; 500 коп/мл
Концентраты (элюаты) 
проб воды
Вариант
FEP/
Вариант
FRT
100 «NucliSENS 
easy MAG»
Плазма (сыворотка) 
крови;
Концентраты (элюаты) 
проб воды
500 коп/мл
200 «МАГНО-
сорб»
Плазма (сыворотка) 
крови;
Концентраты (элюаты) 
проб воды
250 коп/мл
1000 «МАГНО-
сорб»
Плазма (сыворотка) 
крови;
Концентраты (элюаты) 
проб воды
50 коп/мл
Аналитическая специфичность
Оценка аналитической специфичности набора реагентов проведена посредством 
добавления в реакцию геномной ДНК/РНК следующих организмов и вирусов: вирус 
гепатита В, вирус гепатита С, вирус гепатита D, вирус гепатита Е, вирус гепатита G, 
вирус иммунодефицита человека, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр, вирус 
простого герпеса 1  и 2 типов, вирус герпеса человека 6 и 8 типов, энтеровирус 
(Coxsakie В1, В2, ВЗ, В4, В5, В6, Polio I, II, III), ротавирус человека WA, астровирус, 
норовирус I и II типов, аденовирус (типы 2, 3, 7), Shigella, Salmonella, Yersinia,  
Campylobacter, Escherichia coll. Staphylococcus.aureus. Streptococcus pyogenes.  
Streptococcus agalactiae. Homo sapiens.
Перекрестные реакции для указанных организмов и вирусов зарегистрированы 
не были.


--- стр. 9 ---
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно­
биологические (ПЦР) исследования клинического материала на наличие 
возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-эпидемических 
правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III -  IV групп 
патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СП 2.1.7.728- 
99 «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических 
учреждений» и методических указаний МУ 1.3.1888-04 «Организация работы при 
исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными 
биологическими агентами III -  IV групп патогенности».
При работе всегда следует выполнять следующие требования:
- Следует рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные, 
организовывать работу и хранение в соответствии с СП 1.3.2322-08 
«Безопасность работы с микроорганизмами III -  IV групп патогенности 
(опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
- Убирать и дезинфицировать разлитые образцы или реактивы, используя 
дезинфицирующие средства в соответствии СП 1.3.2322-08 «Безопасность 
работы с микроорганизмами III -  IV групп патогенности (опасности) и 
возбудителями паразитарных болезней».
- Удалять неиспользованные реактивы в соответствии с требованиями СП 
2.1.7.728-99 «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно­
профилактических учреждений».
ВНИМАНИЕ! При удалении отходов после амплификации (пробирок, содержащих 
продукты ПЦР) недопустимо открывание пробирок и разбрызгивание содержимого, 
поскольку это может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны, 
оборудования и реагентов.
- Применять набор строго по назначению, согласно данной инструкции.
- Допускать к работе с набором только специально обученный персонал.
- Не использовать набор по истечении срока годности.
- Избегать контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой. При контакте 
немедленно промыть пораженное место водой и обратиться за медицинской 
помощью.
- Лист по безопасности материалов (MSDS -  nnaterial safety data sheet) доступен 
по запросу.
ВНИМАНИЕ! В соответствии с директивой Европейского Союза 67/548/ЕЕС 
следующие реагенты подлежат маркировке, как содержащие опасные вещества, а
7 / 1 / Ш


--- стр. 10 ---
также требуют указания факторов риска (R) и мер предосторожности (S):
Наименование
реагента
Наименование 
комплекта, в 
который 
входит 
реагент
Наименование 
опасного (в 
соответствии 
с директивой 
67/548/ЕЕС) 
вещества
Код опасности, 
перечень 
факторов риска 
(R) и мер
предосторожности 
(S)в соответствии 
с директивой 
67/548/ЕЕС
ПДК’ макс
разовая/среднесменная 
______(мг/м^),____
основная опасность
класс опасности
автоматический 
контроль за
содержанием вещества 
в воздухе рабочей 
зоньР
Раствор для 
лизиса «РИБО-преп»
Лизирующий
раствор
МАГНО-сорб
«МАГНО-
сорб»
Гуанидин
тиоционат
Раствор для 
отмывки 5
«МАГНО-
сорб»
Harmful 
R:20/21/22-32- 
52/53 
S; 13-61
Нет данных
Раствор для 
преципитации «РИБО-преп» Изопропанол
Highly Flammable. 
Irritant 
R: 11-36-67 
8:7-16-24/25-26
50/10
Пары
Класс опасности 3
не требуется
Раствор для 
отмывки 3 «РИБО-преп» 2000/1000
раствор для 
отмывки 4 «РИБО-преп»
Раствор для 
отмывки 5
«МАГНО-
сорб»
Этанол
Highly Flammable
R:11
8:7-16
Пары
Класс опасности 4
Раствор для 
отмывки 6
«МАГНО-
сорб» не требуется
Расшифровка обозначений факторов риска (R) и мер предосторожности (S). 
R11: легко воспламеняется.
R20/21/23: опасен при проглатывании, контакте с кожей или вдыхании.
R22: опасен при проглатывании.
R32; при контакте с кислотой образуются токсический газ.
R36: раздражает слизистую глаз.
R52/53: опасен для водных организмов, может вызывать долговременное 
нежелательное воздействие на водную среду.
R67: пары вещества могут вызывать сонливость и головокружение.
S7: держать емкость плотно закрытой.
S13: держать вдали от пищевых продуктов и напитков, продуктов для животных. 
S16: держать вдали от источников огня, не курить.
S24/25: избегать контакта с кожей и глазами.
' Данные ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе 
рабочей зоны». Классы опасности по ГОСТ 12.1.007-76. ССБТ. «Вредные вещества. Классификация. 
Общие требования безопасности».
^ Использованы данные о коде опасности, факторах риска (R) и мерах предосторожности (S) фирмы 
«Sigma-Aldrich».


--- стр. 11 ---
S26: в случае попадания в глаза, немедленно промыть большим количеством воды 
и обратиться за медицинской помощью.
S61: избегать попадания в окружающую среду.
ВНИМАНИЕ! При работе с легковоспламеняющимися веществами соблюдать 
правила пожарной безопасности для учреждений здравоохранения ППБО 07-91 от 
30.08.91.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
ЗОНА 1. Выделение РНК из образцов
1. Ламинарный бокс (например, «БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2», «Ламинарные 
системы», Россия, класс биологической безопасности II тип А).
2. Вортекс (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).
3. Набор электронных или механических дозаторов переменного объема 
(например, «Ленпипет», Россия).
4. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся 
микропробирки объемом 1,5 мл (например, «Ахудеп», США).
5. Одноразовые наконечники для дозаторов с аэрозольным барьером до 200 мкл и 
до 1000 мкл (например, «Ахудеп», США).
6. Штативы для наконечников (например, «Ахудеп», США) и микропробирок 
объемом 1,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).
7. Холодильник от 2 до 8 °С.
8. Отдельный халат и одноразовые перчатки.
9. Емкость с дезинфицирующим раствором.
При использовании комплекта реагентов «РИБО-преп»:
1. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, «ТЕРМО 
24-15», «Биоком», Россия).
2. Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 12 тыс g (например, 
«MiniSpin», «Eppendorf», Германия).
3. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления 
надосадочной жидкости (например, «ОМ-1», г. Ульяновск, Россия).
4. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл 
(например, «Ахудеп», США).
При использовании комплекта реагентов «МАГНО-сорб»:
1. Термостат для пробирок объемом 5 мл, диаметром 12 мм от 25 до 100 °С 
(например, «Bioer Technology», Китай )
2. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С ((например, «ТЕРМО
аЙ\А/(


--- стр. 12 ---
24-15», «Биоком», Россия).
3. Магнитный штатив для пробирок типа «Эппендорф» на 1,5 мл (например, 
«Рготеда», США).
4. Магнитный штатив для пробирок на 5 мл, диаметр 12 мм (например, «Рготеда», 
США).
5. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления 
надосадочной жидкости (например, «ОМ-1», г. Ульяновск, Россия).
6. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся 
микропробирки объемом 1,5 мл (например, «Ахудеп», США).
7. Одноразовые полипропиленовые или полистирольные пробирки объемом до 5 
мл диаметром 12 мм, круглодонные (например, «Ахудеп», США).
8. Одноразовые полипропиленовые крышки для пробирок объемом до 5 мл 
диаметром 12 мм (например, «Ахудеп», США)
9. Электронный или механический дозатор переменного объема с возможностью 
дозирования от 1000 до 5000 мкл (например, «Ленпипет», Россия)
10.Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл, до 
1000 мкл и до 5000 мкл (например, «Ахудеп», США).
При использовании автоматических станций для выделения нуклеиновых кислот:
1. Автоматическая станция для выделения РНК/ДНК (например «NucliSENS® 
easyMAG™» («bioMerieux», Франция)).
2. Набор реактивов и расходных материалов к автоматической станции (например 
«NucliSENS® easyMAG™» (NucliSens буфер для экстракции 1, NucliSens буфер 
для экстракции 2, NucliSens буфер для экстракции 3, NucliSens буфер для 
лизиса, NucliSens магнетизированная силика) («bioMerieux», Франция)).
ЗОНА 2. Проведение реакции обратной транскрипции, ПЦР и гибридизационно- 
флуоресцентной детекции продуктов амплификации
1. ПЦР-бокс (например, «БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», «Ламинарные системы», Россия).
2. Вортекс (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).
3. Набор электронных или автоматических дозаторов переменного объема 
(например, «Ленпипет», Россия).
4. Одноразовые наконечники с аэрозольным барьером до 200 мкл (например, 
«Ахудеп», США).
5. Штативы для наконечников (например, «Ахудеп», США) и микропробирок на 0,5 
(0,2) мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).
6. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С.
7. Отдельный халат и одноразовые перчатки.
1 •(/


--- стр. 13 ---
8. Емкость с крышкой для дезинфицирующего раствора.
Пр и использовании комплектов реагентов «ПЩР-комплект» вариант 100-FEP F.
«ПЦР-комплект» вариант 50-FEP F:
9. Амплификатор, адаптированный для ПЦР-пробирок 0,5 мл, например, «Терцик» 
(«ДНК-Технология», Россия) или амплификатор, адаптированный для ПЦР- 
пробирок 0,2 мл, например, «Gradient Palm Cycler» («Corbett Research», 
Австралия), «GeneAmp PCR System 2700» («Applied Biosystems», США) 
«MAXYGENE» («Axygen», США) или эквивалентные. Флуоресцентный ПЦР- 
детектор, например, «АПА-1/4» («BioSan», Латвия), «Джин-4» («ДНК-Технология», 
Россия), «Джин-2» (версия п.о. не ниже 4.4i) («ДНК-Технология», Россия) или 
эквивалентный.
10.Одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР (плоская крышка, 
нестрипованные) на 0,2 или 0,5 мл;
а) объемом 0,2 мл (например, «Ахудеп», США) -  для амплификаторов,
адаптированных для ПЦР-пробирок 0,2 мл («Gradient Palm Cycler», «GeneAmp 
PCR System 2700», «MAXYGENE» и др.);
б) объемом 0,5 мл (например, «Ахудеп», США) -  для амплификаторов,
адаптированных для ПЦР-пробирок 0,5 мл («Терцик» и др.).
При использовании комплектов реагентов «ПЦР-комплект» вариант 100-FRT F.
«ПЦР-комплект» вариант 50-FRT F:
11 .Амплификатор роторного типа, например, «Rotor-Gene» 3000 или 6000 («Corbett 
Research», Австралия) или амплификатор планшетного типа, например, «105» 
(«BioRad», США), «МхЗОООР» («Stratagene», США) или эквивалентные.
12.Одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР:
а) на 0,2 мл (плоская крышка, нестрипованные), (например, «Ахудеп», США) для 
постановки в ротор на 36 пробирок -  для приборов для ПЦР в реальном 
времени с детекцией через дно пробирки (например, «Rotor-Gene»).
б) на 0,2 мл (куполообразная крышка) (например, «Ахудеп», США) -  для 
приборов для ПЦР в реальном времени с детекцией через крышку (например, 
«105», «МхЗОООР»).
ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА
Перед началом работы следует ознакомиться с методическими рекомендациями
«Взятие, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР- 
диагностики», разработанными ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва, 2008 г.
Для проведения анализа используется следующий материал:
- плазма (сыворотка) периферической крови;


--- стр. 19 ---
ВАРИАНТ FEP
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ
ПЦР-исследование состоит из следующих этапов:
- Экстракция (выделение) РНК из исследуемых образцов,
- Проведение обратной транскрипции и амплификации.
- Флуоресцентная детекция продуктов амплификации по 
«конечной точке».
- Интерпретация результатов.
информация по процедуре проведения ПЦР-исследования в 
от используемого оборудования изложена в методических 
рекомендациях ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора по применению набора реагентов 
«АмплиСенс® HAV-fL»  Вариант FEP.
Детальная
зависимости
ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ
(проводится в ЗОНЕ-1 -  помещении для обработки исследуемого материала).
Для экстракции РНК используются комплекты реагентов:
- «РИБО-преп» (входит в состав форм 1  и 2). Объем плазмы (сыворотки) крови и 
образцов концентратов (элюатов) воды для выделения РНК -  0,1 мл; объем 
осветленного экстракта фекалий для выделения РНК -  0,05 мл. Порядок работы 
см. в Приложении А.
- «МАГНО-сорб» вариант 100-1000 (входит в состав формы 3). Объем плазмы 
(сыворотки) крови и образцов концентратов (элюатов) воды для выделения РНК
-  1,0 мл. Порядок работы см. в Приложении Б пункт Б1.
- «МАГНО-сорб» вариант 100-200 (входит в состав формы 4). Объем плазмы 
(сыворотки) крови и образцов концентратов (элюатов) воды для выделения РНК
-  0,2 мл. Порядок работы см. в Приложении Б пункт Б2.
- автоматическая станция «NucliSENS® easyMAG™». Возможно использование 
протоколов, позволяющих проводить экстракцию (выделение) РНК из 100 мкл 
исследуемого образца (плазма (сыворотка) периферической крови, 
концентраты (элюаты) проб воды). Процедура выделения проводится в 
соответствие с инструкцией к автоматической станции «NucliSENS® easyMAG™». 
Допускается использование режимов лизиса на борту прибора («On-board») и вне 
прибора («Off-board»). Обязательным условием является внесение ВКО в 
образцы до начала выделения в объёме 10 мкл на одну пробу. Программируемый 
объем элюции -  55 мкл, объем магнитной силики -  20 мкл. После окончания 
выделения РНК, извлечь пробирки из прибора


--- стр. 20 ---
ВАРИАНТ FEP
ВНИМАНИЕ! ОТ-ПЦР рекомендуется поставить в течение 30 мин после выделения 
РНК! Очищенные РНК можно хранить до 8 ч при температуре от 2 до 8 °С, более 
длительно -  при температуре не выше минус 68 °С.
ВНИМАНИЕ! Для работы с РНК необходимо использовать только одноразовые 
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку 
«RNase-free», «DNase-free».
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ
(проводится в ЗОНЕ 2 - помещении для проведения реакции обратной транскрипции 
и ПЦР-амплификации).
Общий объем реакции - 25 мкл, объем РНК-пробы -10 мкл.
ВНИМАНИЕ! При работе с РНК/ДНК необходимо использовать только одноразовые 
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку 
«RNase-free», «DNase-free».
А. Подготовка пробирок для проведения амплификации
Выбор пробирок для амплификации зависит от используемого  
амплификатора.
Для внесения в пробирки реагентов, проб РНК и контрольных образцов  
используются одноразовые наконечники с фильтрами.
ВНИМАНИЕ! Компоненты реакционной смеси следует смешивать непосредственно 
перед проведением анализа. Смешивать реагенты из расчета на необходимое 
число реакций, включающее тестирование исследуемых, контрольных и фоновых 
(«Фон») образцов, необходимо согласно расчетной таблицы (см. приложение В). 
Следует учитывать, что для тестирования даже одного исследуемого или  
контрольного образца РНК необходимо проводить постановку двух контролей  
этапа ОТ-ПЦР и двух пробирок «Фон». Рекомендуется смешивать реагенты для 
четного числа реакций с целью более точного дозирования реагентов.
1. До начала работы разморозить, тщательно перемешать на вортексе все 
реагенты набора и осадить капли с крышек пробирок.
2. Отобрать необходимое количество пробирок для амплификации с учетом 
количества исследуемых, контрольных образцов (два контроля выделения (ОК и 
ПК), два контроля амплификации (К- и К+/ВК+)) и пробирок «Фон». Тип пробирок 
выбрать в зависимости от используемого прибора.
3. Для приготовления реакционной смеси в случае необходимости подготовки 
пробирок «Фон» необходимо в отдельной стерильной пробирке смешать из
/


--- стр. 21 ---
ВАРИАНТ FEP
расчета на 1  реакцию: 10 мкл ОТ-ПЦР-смесь-1-FEP/FRT HAV, 5 мкл ОТ-ПЦР-  
смесь-2-FEP/FRT и 0,25 мкл RT-G-mix-2 (см. также приложение В, пункт В1).
Тщательно перемешать смесь на вортексе и осадить капли с крышки пробирки.
4. Добавить в две пробирки «Фон» по 15 мкл приготовленной смеси (без 
полимеразы (TaqF) и ТМ-Ревертазы (MMIv)) и по 10 мкл РНК-буфера,  
перемешать пипетированием. Сверху раскапать по 1  капле минерального 
масла для ПЦР.
ВНИМАНИЕ! После проведения амплификации образцы «Фон» можно хранить в 
течение 1  мес при температуре от 2 до 20 °С и использовать многократно. 
Многократное использование пробирок «Фон» допускается при условии их 
использования с набором реагентов той же серии, того же типа выделительных 
реагентов и того же типа ПЦР-пробирок.
5. В оставшуюся часть реакционной смеси добавить из расчета на 1  пробу 0,5 мкл 
полимеразы (TaqF) и 0,25 мкл ТМ-Ревертазы (MMIv) (см. также  
приложение В, пункт В1). Тщательно перемешать смесь на вортексе и осадить 
капли с крышки пробирки.
ВНИМАНИЕ! Количество добавляемых в реакционную смесь ферментов 
полимеразы (TaqF) и ТМ-Ревертазы (MMIv), указанное в расчетной таблице  
приложения В (пункт В1), приведено с учетом уже отобранных 30 мкл
реакционной смеси для двух пробирок «Фон».
6. В случае повторного использования образцов «Фон» необходимо в 
отдельной стерильной пробирке смешать из расчета на 1  реакцию: 10 мкл ОТ- 
ПЦР-смесь-1-FEP/FRT HAV, 5 мкл ОТ-ПЦР-смесь-2-FEP/FRT, 0,25 мкл RT-G-  
mix-2, 0,5 мкл полимеразы (TaqF) и 0,25 мкл ТМ-Ревертазы (MMIv) (см. также  
приложение В, пункт В2). Тщательно перемешать смесь на вортексе и осадить 
капли с крышки пробирки.
7. Внести в оставшиеся пробирки по 15 мкл готовой реакционной смеси. Сверху 
раскапать по 1 капле минерального масла для ПЦР.
8. Под масло или непосредственно на поверхность масла в пробирки с реакционной 
смесью добавить по 10 мкл РНК-пробы, выделенной из клинических или 
контрольных образцов, используя отдельный наконечник с аэрозольным 
барьером для каждой пробы.
9. Поставить контрольные реакции амплификации;
а) отрицательный контроль ПЦР (К-) -  внести в пробирку 10 мкл РНК-буфера.
б) положительный контроль ПЦР (К+/ВК+) - контроль ПЦР-амплификации
1


--- стр. 28 ---
ВАРИАНТ FRT
К комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа выделения:
Реактив Отште Объем (мл) Кол-во
ОКО Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,5 4 пробирки
ПКО HAV-FL-rec Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,1 2 пробирки
ВКО STI-248-rec Прозрачная бесцветная 
жидкость 0.5 2 пробирки
Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-50 F -  комплект реагентов для 
проведения реакции обратной транскрипции РНК и ПЦР-амплификации кДНК вируса 
гепатита А (HAV) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме 
«реального времени» включает:
Реактив Описание <  ‘ Объем (мл) Кол-в0 ^
RT-G-mix-2 Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,015 1  пробирка
ОТ-ПЦР-смесь-1-FEP/FRT HAV Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,6 1  пробирка
ОТ-ПЦР-смесь-2-FEP/FRT Прозрачная бесцветная 
жидкость 0.3 1  пробирка
Полимераза (TaqF) Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,03 1  пробирка
ТМ-Ревертаза (MMIv) Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,015 1  пробирка
ПКО кДНК HAV-FUBKO Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,1 1  пробирка
РНК-буфер Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,6 1  пробирка
Комплект реагентов рассчитан на проведение 55 реакций обратной транскрипции и 
амплификации, включая контроли. 1  комплект входит в состав форм 2 и 6.
К комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа выделения:
Реактив Описание Объем (MJfj^ Кол-00
ОКО Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,5 2 пробирки
ПКО HA\AFL-rec Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,1 1  пробирка
ВКО STI-248-rec Прозрачная бесцветная 
жидкость 0,5 1  пробирка
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ
ПЦР-исследование состоит из следующих этапов:
- Экстракция (выделение) РНК из исследуемых образцов.
- Проведение обратной транскрипции и амплификации.
- Флуоресцентная детекция продуктов амплификации по «конечной точке».
- Интерпретация результатов.


--- стр. 29 ---
ВАРИАНТ FRT
Детальная информация по процедуре проведения ПЦР-исследования в 
зависимости от используемого оборудования изложена в методических 
рекомендациях ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора по применению набора реагентов 
«АмплиСенс® HAV-FL» Вариант FRT.
ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ
(проводится в ЗОНЕ-1 -  помещении для обработки исследуемого материала).
Для экстракции РНК используются комплекты реагентов:
- «РИБО-преп» (входит в состав форм 1  и 2). Объем плазмы (сыворотки) крови и 
образцов концентратов (элюатов) воды для выделения РНК -  0,1 мл; объем 
осветленного экстракта фекалий для выделения РНК -  0,05 мл. Порядок работы 
см. в Приложении А.
- «МАГНО-сорб» вариант 100-1000 (входит в состав формы 3). Объем плазмы 
(сыворотки) крови и образцов концентратов (элюатов) воды для выделения РНК -  
1,0 мл. Порядок работы см. в Приложении Б пункт Б1.
- «МАГНО-сорб» вариант 100-200 (входит в состав формы 4). Объем плазмы 
(сыворотки) крови и образцов концентратов (элюатов) воды для выделения РНК -  
0,2 мл. Порядок работы см. в Приложении Б пункт Б2.
- автоматическая станция «NucliSENS® easyMAG™». Возможно использование 
протоколов, позволяющих проводить экстракцию (выделение) РНК из 100 мкл 
исследуемого образца (плазма (сыворотка) периферической крови,  
концентраты (элюаты) проб воды). Процедура выделения проводится в 
соответствие с инструкцией к автоматической станции «NucliSENS® easyMAG™». 
Допускается использование режимов лизиса на борту прибора («On-board») и вне 
прибора («Off-board»). Обязательным условием является внесение ВКО в образцы 
до начала выделения в объёме 10 мкл на одну пробу. Программируемый объем 
элюции -  55 мкл, объем магнитной силики -  20 мкл. После окончания выделения 
РНК, извлечь пробирки из прибора
ВНИМАНИЕ! ОТ-ПЦР рекомендуется поставить в течение 30 мин после выделения 
РНК! Очищенные РНК можно хранить до 8 ч при температуре от 2 до 8 °С, более 
длительно -  при температуре не выше минус 68 °С.
ВНИМАНИЕ! Для работы с РНК необходимо использовать только одноразовые 
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку 
«RNase-free», «DNase-free».
(,


--- стр. 30 ---
ВАРИАНТ FRT
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО 
ВРЕМЕНИ»
(проводится в ЗОНЕ 2 - помещении для проведения реакции обратной транскрипции 
и ПЦР-амплификации).
Общий объем реакции - 25 мкл, объем РНК-пробы -10 мкл.
ВНИМАНИЕ! При работе с РНК/ДНК необходимо использовать только одноразовые 
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку 
«RNase-free», «DNase-free».
А. Подготовка пробирок для проведения амплификации
Выбор пробирок для амплификации зависит от используемого  
амплификатора.
Для внесения в пробирки реагентов, проб РНК и контрольных образцов  
используются одноразовые наконечники с фильтрами.
ВНИМАНИЕ! Компоненты реакционной смеси следует смешивать непосредственно 
перед проведением анализа. Смешивать реагенты из расчета на необходимое 
число реакций, включающее тестирование исследуемых и контрольных образцов, 
необходимо согласно расчетной таблице (см. приложение Г). Следует учитывать, 
что для тестирования даже одного исследуемого или контрольного образца  
РНК необходимо проводить постановку двух контролей этапа ОТ-ПЦР.  
Рекомендуется смешивать реагенты для четного числа реакций с целью более 
точного дозирования реагентов.
1. До начала работы разморозить, тщательно перемешать на вортексе все 
реагенты набора и осадить капли с крышек пробирок
2. Отобрать необходимое количество пробирок для амплификации исследуемых и 
контрольных образцов РНК и кДНК. Тип пробирок, стрипов или плашек выбрать в 
зависимости от используемого прибора.
3. Для приготовления реакционной смеси необходимо в отдельной стерильной 
пробирке смешать из расчета на 1  реакцию: 10 мкл ОТ-ПЦР-смесь-1-FEP/FRT  
HAV, 5 мкл ОТ-ПЦР-смеси-2-FEP/FRT, 0,25 мкл RT-G-mix-2, 0,5 мкл  
полимеразы (TaqF) и 0,25 мкл ТМ-Ревертазы (MMIv) (см. также  
приложение Г). Тщательно перемешать смесь на вортексе и осадить капли с 
крышки пробирки.
4. Внести в пробирки по 15 мкл готовой реакционной смеси.
5. Используя отдельный наконечник с аэрозольным барьером для каждой пробы, 
добавить по 10 мкл РНК, выделенной из исследуемых и контрольных образцов, в
28 L  '


--- стр. 31 ---
ВАРИАНТ FRT
пробирки с реакционной смесью. Осторожно перемешать пипетированием.
6. Поставить контрольные реакции амплификации:
а) отрицательный контроль ПЦР (К-) -  внести в пробирку 10 мкл РНК-буфера.
б) положительный контроль ПЦР (К+/ВК+) - контроль ПЦР-амплификации 
кДНК HAV и детекции по каналу JOEA'ellow/HEX и контроль ПЦР- 
амплификации кДНК ВКО и детекции по каналу FAM/Green) -  внести в 
пробирку 10 мкл ПКО кДНК HAV-FUBKO.
Б. Проведение амплификации с детекцией в режиме «реального времени»
1. Установить пробирки в реакционный модуль.
2. Запрограммировать прибор для выполнения соответствующей программы 
амплификации и детекции флуоресцентного сигнала согласно описанию для 
данного прибора (см. табл. 4 и 5).
Таблица 4
Программа амплификации «АмплиСенс-2» для приборов роторного типа^
Этап Температура,
“С
р Продолжительность 
Этапа
.. Измерение . 
флуоресценции
Количество
циклов
1 50 30 мин — 1
2 95 15 мин - 1
3
95 5с -
560 20 с -
72 15с —
4
95 5 с —
4060 20 с FAM/Green,
JOE/Yellow/HEX
72 15с -
Таблица 5
Программа амплификации «АмплиСенс-2» для приборов планшетного типа°
Этап Температура,
°С
Продолжительность
этапа
Измерение
флуоресценции
Количество
циклов
1 50 30 мин — 1
2 95 15 мин — 1
3
95 5с —
560 20 с -
72 15с —
4
95 5с —
4060 30 с FAM,
HEX/JOE
72 15с
3. Запустить выполнение программы амплификации с детекцией флуоресцентного
^ Например, RotorGene 3000 и RotorGene 6000 (Corbett Research, Австралия) 
®  Например, iQiCycler, iQ5 (BioRad, США), МхЗОООР (Stratagene, США)