Реагенты для лабораторной диагностики in vitro в эндокринологии (см. Приложение на 1 листе) — инструкция и характеристики

РУ: ФСЗ 2008/01566 от 26.05.2008 · класс риска 1

Производитель: "Монобайнд Инк." (Соединенные Штаты)

Вид изделия: Буферный разбавитель образцов ИВД, автоматические/полуавтоматические системы

Автоматически отфильтрованный фрагмент инструкции по применению (страницы, где похоже, что есть таблица технических характеристик) — не полный документ. Карточка РУ на портале Росздравнадзора →

Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ

Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.

Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.

Попробовать бесплатно

Текст инструкции: технические характеристики

РЕАГЕНТЫ;
А. Калибраторы чвломчаекой сыаоропт (1.0 шМпробирка) [Обоэмачания А - F]
Шесть (в) пробирок для сравнения со значением трийодтиронина для концектрации
0(A), 0.6(B), 1.0(0,2.5(D), 5(E), и 7.5(F) пд/т1 Хранить при температуре 2-8“С.
Коноераирующев аеи^ство добавлено.
B. Меченый реагент общего ТЗ *1S щипробирка
Одна (1) пробирка конъюгата пероксидазы из хрена на альбуминно^абилизованной
матрице, хранить при температуре 2-в*С,
Консера1фуюии»е вещество добавлено.
C. Буфер меченого индиотора общего ТЗ/Т4 ~ 13mt«
Одна (1) бутыль, содержащая буфер, красный краситель, консервант и
связывающие ингибиторы протеина. Хранить при 2-8*С.
0. Лунки для реакции е ТЗ- М лунок - Значок
белый микропланшет с 96 лунками, покрытыми овечьей антисывороткой и
упакованные в алюминиевую оболочку с осушающим реагентом. Хранить при
температуре 2*б*С.
С. Концентрат промывающего растаора - 20ml - значок ^
Одна (1) пробирка, содержащая сурфактант в забуференном растворе. Добавлен
консервант. Хранить при температуре 2'30*С (см. Раздел по подготовке реагентов),
F. Сигнальный реагент А - 7мл/пробирка - Обозначение
Одна (1) бутыль с люминалом в бу^ре. Хранить при температуре 2-8*С. (см. Раздел
по подготовке реа1внтов).
0. Сигналы«ый рмгент В - 7мл/лробиркв - Обозначение 8^
Одна (1) бутыль, содержащая перекись водорода (НгОз) в буфере.
XpamtTb при температуре 2<6**С (см. Раздел по подготовке реагентов).
1. Вкладыш а упакоику.
Примечание 1: Не используйте реагенты, у которых истек срок годности.
Примечание 2: Открытые реагенты стабильны в течение 60 дней при температуре 2-
Прммечание 3: Реагенты предназначены для использования вместе с планшетом с
9вно лунками.
J-
p
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Для диагностики In Vitro
Не предназначен дпя внутреннего или наружного употребление животными
или человеком.
Реагенты, содержащие cbieopoTicy крови человека, тестировались на наличие
антител к 8ИЧ 1 и 2. вирусу гепатита С, поверхностному антигену вируса гепатита В.
Были получены отрицательные результаты. Однако поскольку ни один тест не может
дать полной гарантии отсутствия инфекционных агентов, всю человеческую
сыворотку следует считать потенциально опасной и инфекционной и обращаться с
ней в соответствии с государственными нормами для биологически опасных веществ
2 фуппы. Подходящие лабораторные правила обращения с препаратами крови
можно найти в ‘’Biosafety In Microbiological and Biomedical Laboratories," 2-я редакция,
1988, HHS
СБОР И ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
Забор крови иэ вены руки следует производить согласно стандартной процедуре, с
соблюдением соответствующих мер предосторожности. Чтобы обеспечить
возможность сравнения с контрольными значениями, нужно собирать сыворотку у
пациента утром натощак. Для сбора крови используются простые пробирки с красной
крышкой без геля или
Дайте крови свернуться. Центрифугируйте препарат, чтобы отделить сыворотку от
клеток.
Дпя анализа можно использовать как свежепопученные образцы сыворотки крови,
так и образцы, хранившиеся при температуре от 2 до 8°С не более пяти (5) дней или
при температуре минус 20“С не более 30 дней. Не допускается повторное
замораживание<размораживание. приводящее к искажению результатов. Перед
тестом подождите, пока реагенты не нафеются до комнатной температуры (20-270)
При тестировании с дубликатами требуется 0.10 мл препарата.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ [НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ]:
1. Пипетка для раскапывания объема 50р1 с точностью выше 1.5%.
2. Диспенсер(ы) для многократного распределения объемов в 0.100ml и 0.300ml с
точностью выше 1.5%.
3. Диспенсеры с регупируемым объемом (20>200м1) и (200-1000(jl) для растворов
конъюгата и субстрата.
4. Промывающее устройство для микропланшетов или пластиковая бутыль
(дополнительно).
5. Люминометр с фотоумножителем для считывания световых единиц.
6. Пробирки для растворения конъюгата ферментов и субстратов А и В.
7. Абсорбирующая бумага для декантации лунок микропланшета.
8. Ппастиковая обопочка ипи крышка микроппаншета для проведения инкубации.
0. Вакуумный аспиратор (дополнительно) для промывания.
10. Таймер.
11. Материалы для контроля качества.
ПОДГОТОВКА И ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ:
1. Рабочий раствор меченого реагента и конъюгата ТЗ-ферментов
Растворите меченый реагент ТЗ 1:11 в буфером меченого реагента общего ТЗГГ4 в
подходящей емкости. Например, растворите 160р1 конъюгата в 1.6ml буфера для 16
лунок (получится небольшой избыток раствора).
Данный реагент надо использовать в течение 24 часов с момента приготовления.
Хранить при 2-8°С.
Общая формула:
Требуемый объем буфера = количество лунок * 0.1
Количество необходимого конъюгата ТЗ-ферментов - количество лунок * 0.01
например = 16 х 0.1 = 1.6ml для буфера конъюгата общего ТЗ/Т4.
16 X 0.01 S 0.16т1 (IBOpI) для конъюгата ТЗ-ферментов.
2. Промывной Буфер
Растворите концентрат промывающего раствора в подходящем контейнере в
дистиллированной или деионизированной воде, так чтобы его объем составлял 1000
мл. Храните при комнатной температуре (20-27“С) в течение 60 дней.
3. Рабочий раствор индикаторного реагента - готовить ежедневно
Смешайте равные объемы раствора *А’ и раствора ‘В’ в чистом контейнере.
Используйте в течение 60 минут после этого. Например, добавьте 1 мп А и 1 мл В в
два стрипа с восьмью лунками (получится небольшой избыток раствора. Выбросьте
неиспользованную долю раствора).
ПРОЦЕДУРА ТЕСТА
Перед проведением теста, доведите все реагенты, контропи и калибраторы
сыворотки до комнатной температуры (20 - 27'‘ С).
1. Подготовьте лунки микропланшета для калибраторов, контрольных проб и
препаратов пациента в дубликатах.
Поместите неиспользованные микрострипы обратно в алюминиевую упаковку,
закройте ее и храните при температуре 2-8“С.
2. Внесите 0.050 ml (50м1) калибраторов, контрольных проб и препаратов в
соответствующие лунки.
3. Добавьте 0.100 ml (100р1) рабочего раствора меченого реагента и конъюгата ТЗ-
ферментов в каждую лунку. Необходимо вносить все реагенты как можно ближе
ко дну лунки.
4. Осторожно поворачивайте планшет в течение 20-30 секунд, чтобы реагенты
перемешались. Закройте планшет пластиковой пленкой.
5. Инкубируйте в течение 45 минут при комнатной температуре.
6. Удалите содержимое лунок микропланшета при помощи декантирований или
аспирации. При декантировании тщательно удалите остатки жидкости из лунок при
использовании абсорбирующей бумаги.
7. Добавьте Э00р1 промывающего раствора (см. раздел о подготовке реагентов),
декантируйте или аспирируйте. Повторите еще два (2) раза (общее число
промываний - три (3)}. Можно использовать автоматическое или ручное
устройство для промывания планшетов. В таком случав следуйте инструкциям
производителя по эксплуатации. При использовании бутыли, наполняйта
каждую лунку доверху, сжимая контейнер. Избегайте появлений пузырьков.
Декантируйте и повторите еще два (2) раза.
в. Добавьте 0.100 ml (100^1) раствора субстрата во все лунки.
(см. рлздйп о подшотовкл рмшлнтой). Всегда добавляйте реагенты в одном и
том же порядке, чтобы минимизировать разницу времени реакции у различных
лунок.
9. Инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти (б) минут в темноте.
10. Считайте RLU (относительные световые единицы) при помощи люминометра на
96 лунок (0.5-1.0 секунды на лунку). Измерение должно проводиться в течение
тридцати (30) минут после остановки реакции.
Примечание: Для повторного анализа препаратов с концентрацией выше 750na/dl.
внесите 25р1 препарата и 25р1 О калибратора сыворотки а лунку для пробы (для
поддержания равномерной концентрации белков). Умножьте полученное значение на
2, чтобы получить концентрацию трийодтиронина.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна проверять контроли а низком, среднем и
диапазоне для мониторинга проведения теста. Значение этих контролей следует
определять во время каждой процедуры теста. Необходимо составлять графики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходящих статистических методов. Значительное отклонение от обычных
показателей указывает на незамеченное изменение в условиях проведения теста
или на деградацию реагентов в наборе. В этом случае используйте свежие реагенты,
чтобы определить причину отклонений.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для нахождения неизвестной концентрации трийодтиронина в препаратах
используется кривая дозовой зависимости.
1. Запишите RLU (интенсивность сигнала люминесценции), указанную в распечатке
микропланшетного анализатора (Образец 1).
2. Постройте на миллиметровой бумаге график зависимости
калибраторов от концентрации ТЗ в ng/dl. (не усредняйте лш
перед построением графика).
3. Проведите через точки на фафике наиболее подходящую
4. Чтобы определить неизвестную концентрацию 13, oi
препарата на вертикапьной оси фафика, найдите точку
горизонтальной оси графика определите концентрацию (в ng/ml) (можно найти
среднее для дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией). В приведенном
нижа примере, среднее RLU (37807) пересекает калибровочную кривую при
концентрации ТЗ 3.13 ne/ml. (См. рисунок 1).
Примечание 1: Для обработки данных можно использовать профвммное
обеспечение для иммунолюминометричесхих тестов, (найдите среднее для
дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией) (см. риа 1).
Примечание 2: MonotHnd штвт оказать помощь в покупке и установке
оборудования/профамм для расчета и интерпретации результатов
иммунолюминометричеосого теста.
Рас, 1
Значки» ТЭапдЛл!
* Данные на образце 1 и на рисунке 1 представлены только для демонстрации
и не должны использоваться вместо кривой дозовой зависимости, составляемой при
проведении каждого теста. Кроме того, RLU калибраторов нормализованы до
а100,000 RLU для калибратора W (самый интенсивный сигнал). Такое
преобразование ликвидирует разницу в способности различных приборов
определять интенсивность света.
ОБРАЗЕЦ 1
ПАРАМЕТРЫ QC (КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА)
Результаты анализа считаются достоверными при выполнении следующих
условий:
1. Кривая доэового ответа (пересечения в 80%; 50% и 20%) должна находиться в
установленных пределах.
2. Четыре из шести контролей должны находиться в установленном диапазоне.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
A. Проведение теста
1. Время реакции во всех лунках должно быть одинаковым, чтобы обеспечить
воспроизводимость результатов.
2. Пипетирование проб не должно занимать более десяти (10) минут во избежание
смещения результатов теста.
3. При использовании более одного (1) планшета, рекомендуется повторять
построение кривой доэового ответа.
4. Недостаточное промывание лунок планшета при аспирации или декантации
может привести к получению искаженных результатов.
5. Используйте компоненты из одного набора. Не смешивайте реагенты из разных
наборов.
B. Интерпретация
1. При использовании компьютерной программы для интерпретации результатов
теста, требуется, чтобы протозируемые значения калибраторов оказывались в
пределах 10% от соответствующих концентраций.
2. Общая концентрация трийодтиронина в сыворотке зависит от множества
факторов: функции щитовидной железы и ее регуляции, концентрации
тироксинсвязывающего глобулина (TBG) и связывания трийодтиронина с TBG (3, 4).
Поэтому только показателя концентрации трийодтиронина недостаточно для оценки
клинического состояния пациента.
3. Снижение общего содержание трийодтиронина может быть вызвано потерей
белков, определенными заболеваниями печени, приемом тестостерона, дифенина
или салицилатов. Список лекарств и состояний, которые влияют на концентрацию
общего трийодтиронина был составлен Journal of the
American Association of Clinical ChemistsS.
Для определение ожидаемых результатов теста ТЗ CIA было проведено изучение
населения с нормальной функцией щитовидной железы. Полученные среднее (R),
стандратное отклонение (о) и примерные ожидаемые значение (±2 о) указаны в
таблице 1. Общее количество проведенных тестов -105.
ТАБЛИЦА!
Ожидаемые результаты теста ТЗ CIA
<в ng/dl)
Среднее (X) ~тш..................................................
Стандартное отклонение (8) 33.4
Ожидаемые результаты теста (±2 s) S2 -185
Помните, что нахождение диапазона нормальных значений для популяции зависит от
множества факторов: специфичности метода, тестируемой популяции и точности
метода, используемого лаборантом. Поэтому любая лаборатория должна
использовать указанный производителем диапазон только до тех лор, пока
выработает собственные пределы нормальных значений, основываясь на
результатах анализов людей, живущих там же, где расположена лаборатория.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
А. Сходимость
Внутри- и межаналитическая точность системы оценивалась при помощи анализов
на трех различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для кахцой пробы
контрольной сыворотки приведены в таблицах 2 и 3.
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.изм. ng/d!)
ПРОБА N X а ^c.v.
низкий 16 77.8 6.2 7.9%
средний 16 192.0 10.4 5.4%
высокий 16 355.0 14.1 3.9%
ТАБЛИЦА 3
Межаналитическая сходимость (ед.изм. - ng/dl)
иаш ш ш ЕШ X 0
низкий 10 75.9 6.8 8.9%
средний 10 185.4 12.5 6.7%
высокий 10 342.5 15.3 4.5%
Жданные получены в течение 10 дней в 10 экспериментах с использованием
дубликатов.
В.Точность
Было проведено сравнение Monobind ТЗ С1А^ со стандартным
радиоиммунологическим методом путем анализа препаратов с
гиперфункцией поджелудочной железы (диапазон значений от 1
Общее количество исследованных препаратов -120. Уравнение регрессии методом
наименьших квадратов и коэффициент корреляции были рассчитаны для
трийодтиронина CIA по сравнению с обычным методом. Полученные данные
представлены в таблице 4.
Таблица 4.
Регрессия
методом Коэффициент
Метод Среднее (X)
наименьших корреляции
квадратов
Этот метод 162
Метод для у»3.8+0.947(х) 0.987
188
сравнения
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному методу
(ТЗ CIA™) и стандартному методу. Метод наименьших квадратов и коэффициент
корреляции показывают отличную согласованность методов.
С. Специфичность
Перекрестная реактивность антител трийодтиронина на выбранные вещества
оценивалась путем добавления дополнительных веществ в матрицу сыворотки в
указанных ниже концентрациях. Для определения перекрестной чувствительности
рассчитывается отношение между дозой дополнительного вещества и дозой
трийодтиронина, необходимых для вытеснения одного и того же объема меченого
реагента.
Вещество Перекрестная Концентрация
реактивность
1-Трийодтиронин 1.0000 -
1-Тироксин < 0.0002 10 \iQlm\
Йодотирозин < 0.0001 10pg/ml
Дийодотирозин < 0.0001 10 цд/ml
Дийодотиронин <0.0001 10 цд/ml
Фенилбутазон < 0.0001 10 цд/ml
Салицилат натрия < 0.0001 10 ug/ml
D. Чувствительность
Чувствительность теста на Трийодтиронин равна 4.0 ng/dl.
Чувствительность (предел обнаружения) оценивается при определении
вариабельности калибратора сыворотки с концентрацией О ng/dl при использовании
статистики 2о (95% точности) для расчета минимальной дозы.
Immobtllzed complex - сэндвичевый комплекс на сплошной поверхности.
После достижения равновесия, фракцию антиген-антитело отделяют от несвязанных
антигенов при помощи декантации или аспирации. Активность ферментов в фракции
связанных антител прямо пропорциональна концентрации нативного антигена.
Используя несколько различных известных контрольных показателей антигена,
можно построить кривую дозовой зависимости и найти с ее помощью неизвестную
концентрацию антигена.
РЕАГЕНТЫ:
A. Калибраторы тироглобулииа 2.0 ml/пробирка [Обозначения А * F]
Шесть (6) пробирок для сравнения со значением антигена миоглобина для уровней
антигена 0(A), 2.0(B), 10.0(C). 40(D), 100(E). и 250(F) ng/ml.
Консервирующее вещество добавлено.
Примечание: не существует известного, принятого во всем мире стандарта
тиреоглобулина. Тд в калибраторах - это высокоочищемный (9в%) человеческий Тд,
откалиброванный гравиметрически по # CRM 457.
B. Антитело к Тд, меченное биотином —13 типробирка ^
Одна (1) пробирка, содержащая очищенное антитело, меченное ферментами,
биотинилированный моноклональный мышиный IgG в буфере с красителем и
консервантом. Хранить при температуре 2-8°С.
C. Антитело к Тд, меченое ферментами —13 ml/пробирка
Одна (1) пробирка, содержащая очищенное антитело IgG к Тд с перокскдаэой из
хрена (HRP) в буфере с красителем и консервантом.
Хранить при температуре 2-8“С.
D. Лунки со Стрептавидином - 96 лунок - Значок U
Белый микропланшет с 96 лунками, покрытыми стрептавидином и упакованные в
алюминиевую оболочку с осушающим реагентом. Хранить при температуре 2-8°С.
E. Концентрат промывающего раствора - 20т1 - значок ^
Одна (1) пробирка, содержащая сурфактант в эабуференном растворе. Добавлен
консервант. Хранить при температуре 2-ЗОХ (см. Раздел по подготовке реагентов).
F. Сигнальный реагент А - 7мл/пробирка > Обозначение
Одна (1) бутыль с тетраметилбензидином в буфере. Хранить при температуре 2-8*С.
(см. Раздел по подготовке реагентов).
G. Сигнальный реагент В - 7мл/пробирка - Обоэначонив
Одна (1) бутыль, содержащая перекись водорода (Н2О2) в буфере.
Хранить при температуре 2-8°С (см. Раздел по подготовке реагентов).
STOP . . . .
H. Стоп-реагент ' 8.0т1/пробирка «обоэнячанио'
Одна бутыль с сильной кислотой (1N HCI). Хранить при 2-30®С.
I. Вкладыш В упаковку. \
Примачаниа 1; Не используйте реагенты, у которых истек срок годности.
Примечание 2: Открытые реагенты стабильны в течение 60 дней при температуре 2-
8'С,
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ tHE ПОСТАВЛЯЕМЫЕ]:
1. Пипетка для раскапывания объема 50 и 100 с точностью выше 1.5%.
2. Дисленсер(ы) для многократного распределения объемов в 0.100ml и О.ЭООт! о
точностью выше 1.5%.
бутыль
3. Промывающее устройство для микропланшетов или пластиковая
(дополнительно).
4. Считыватель микропланшетов для определения абсорбции на длинах волн 450 й
620 пт (фильтр 620 пт не обязателен).
5. Абсорбирующая бумага для декантации лунок микропланшета.
6. Пластиковая оболочка или крышка микропланшета для проведения инкубации.
7. Вакуумный аспиратор (дополнительно) для промывания.
В. Таймер.
9. Диспенсер для многократного распределения объема 200-1000
Ю.Контейнер для хранения буфера для промывания.
11. Дистиллированная или деионизированная вода.
12. Материалы для ксжтроля качества.
13. Контейнер для смешивания реагентов (см. ниже)
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Для диагностики In Vitro
Не предназначен для внутраниего или иаружно1Ч) употребление животными
или человеком.
Реагенты, содержащие сыворотку крови человека, тестировались на наличие
антител к ВИЧ 1 и 2, вирусу гепатита С. поверхностному антигену вируса гепатита В.
Были получены отрицательные результаты. Однако поскольку 14И один тест не мШГ
дать полной гарантии отсутствия инфекционных агентов, всю человеческую
сыворотку следует считать потенциально опасной и инфекционной и обращаться с
ней в соответствии с государственными нормами для биологически опасмьм «ещесге
2 группы. Подходящие лабораторные правила обращения с препаретаШ крови
можно найти в "Biosafety In Microbiological and Biomedical Latraratoriea," 2^ редакция,
1988, HNS
и
СВОР ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
Забор крови из вены руки следует производить согласно стандартной процедуре, с
соблюдением соответствующих мер предосторожности. Чтобы обеспечить
возможность сравнения с контрольными значениями, нужно собирать сыворотку у
пациенте утром натощак. Для сбора крови используются простые пробирки с красной
крышкой без геля или добавок.
Дайте крови свернуться. Центрифугируйте препарат, чтобы отделить сыворотку от
клеток.
Для анализа можно использовать как свежеполученные образцы сыворотки крови,
так и образцы, хранившиеся при температуре от 2 до в^С не более пяти (5) дней или
при температуре минус 20"С не более 30 дней. Не допускается повторное
замораживание-размораживание, приводящее к искажению результатов. При
тестировании с дубликатами требуется 0.100 мл препарата.
ПОДГОТОВКА И ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ:
1. Промывной Буфер
Растворите концентрат промывающего раствора в подходящем контейнере в
дистиллированной или деионизированной воде, так чтобы его объем составлял 1000
мл. Храните при комнатной температуре {20-27*С) в течение 60 дней.
2. Рабочий раствор субстрата
Перелейте содержимое пробирки 'А' в пробирку 'В'. Смешайте и храните при
температуре 2’8°С. Используйте в течение 60 дней.
Определите необходимое количество реагента и подготовьте его, смешав равные
порции субстрата А и субстрата В в подходящем контейнере. Например, добавьте 1
мл А и 1 мл В в два стрипа с восьмью лунками (получится небольшой избыток
раствора. Выбросьте неиспользованную долю раствора).
Примечание: не используйте раствор, если он стал синим.
ПРОЦЕДУРА ТЕСТА
Перед прошедвнием теста, доведите все реаавнты, нонтроли и калибраторы
сыаоротш до комнвтноИ температуры (20 - 27' С).
1. Подготовьте лунки микропланшета для калибраторов, контрольных проб и
препаратов пациента в дубликатах.
Поместите неиспользованные микрострипы обратно в алюминиевую упаковку,
закройте ее и храните при температуре 2>В‘С.
2. Внесите О.ОбО ml (SOpI) калибраторов, контрольных проб и препаратов в
ооответстеующие лунки.
3. Добавьте 0.100 ml (100р1) биотинилированного моноклонального антитела в
каждую лунку. Необходимо вносить все реагенты как можно ближе ко дну лунки.
4. Осторожно поворачивайте планшет в течение 20-30 секунд, чтобы реагенты
перемешались. Закройте планшет пластиковой пленкой.
5. Инкубируйте в течение 16-20 часов при комнатной температуре.
6. Удалите содержимое лунок микропланшета при помощи декантирования или
аспирации. При декантировании тщательно удалите остатки жидкости из лунок при
использовании абсорбирующей бумаги.
7. Добавьте 300р1 промывающего раствора (см. раздел о подготовке реагентов),
декантируйте или аспирируйте. Повторите еще два (2) раза (общее число
промываний -> три (3)). Можно использовать автоматическое или ручное
устройство для промывания планшетов. В таком случав следуйте инструкциям
производителя по эксплуатации. При использовании бутыли, наполняйте
каждую лунку доверху, сжимая контейнер. Избегайте появления пузырьков.
Декантируйте и повторите еще два (2) раза.
8. Добавьте 0.100 ml (100р1) раствора антитела Тд, меченого ферментами, во все
лунки.
9. Осторожно поворачивайте планшет в течение 20-30 секунд, чтобы реагенты
перемешались. Закройте планшет пластиковой пленкой.
10. Повторите пункты 6 и 7.
11. Добавьте 0.100 ml (lOOpI) раствора субстрата во все лунки.
(си. раздел о подготовив рваавнтое). Всегда добавляйте реагенты в одном и
том же порядке, чтобы минимизировать разницу времени реакции у различных
лунок.
12. Осторожно поворачивайте планшет в течение 20-30 секунд, чтобы реагенты
перемешались. Закройте планшет пластиковой пленкой.
13: Инкубируйте при комнатной температуре в течение пятнадцати (15) минут.
14. Добавьте 0.050 ml (SOpI) стол-реагента во все лунки и осторожно перемешивайте
в течение 15-20 секунд.
15. Считайте абсорбцию в камздой лунке при 405nm (используя
волны в20-а30пт для поправки на несовершенство лунок),
проводиться в течение тридцати (30) минут после
реагента.
АЛЬТЕРНАТИВНАЯ КОРОТКАЯ ПРОЦЕДУРА ПРОВЕДЕНИЯ ТЕСТА:
Для проведения данной процедуры необходим лабораторный
гематологический шейкер. Уровни абсорбции будут несколько ниже, но на
результат теста это не повлияет.
1. Подготовьте лунки микропланшета для дубликатов калибраторов, контрольных
проб и препарата пациента. Поместите неиспользованные микрострипы обратно
в алюминиевую упаковку, закройте ее и храните при температуре 2>8*‘С.
2. Внесите 0.050 ml (50р1) калибраторов, контрольных проб и препаратов в
соответствующие лунки.
3. Добавьте 0.100 ml (ЮОр!) биотин ил ироваиного моноклонального антитела в
каждую лунку. Необходимо вносить все реагенты как можно ближе ко дну лунки.
4. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 часов при постоянном
встряхивании в гематологическом шейкере на скорости 150 оборотов в минуту.
5. Следуйте пунктам 6-15 «Процедуры теста», описанной
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна проверять контроли в низком, среднем и высоком
диапазоне для мониторинга проведения теста. Значение этих контролей следует
определять во время каждой процедуры теста. Необходимо составлять фафики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходящих статистических методов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для нахождения неизвестной концентрации тиреоглобулина в препаратах
используется кривая дозовой зависимости.
1. Запишите абсорбцию, указанную в распечатке микропланшетного анализатора
(Образец 1).
2. Постройте на миллиметровой бумаге фафик зависимости абсорбции каждого
дупликата калибраторов от концентрации тиреоглобулина в ng/ml. (найдите среднее
абсорбции каждого дубликата калибраторов перед построением фафика).
3. Проведите через точки на фафике наиболее подходящую кривую.
4. Чтобы определить неизвестную концентрацию найдите точку пересечения его
абсорбции с кривой и по горизонтальной оси фафика определите концентрацию (в
ng/ml). (См. рисунок 1).
Рис.1
Ifdl*.
* Данные на образце 1 и на рисунке 1 представлены только для демонстрации и не
должны использоваться вместо кривой дозовой зависимости, составляемой при
проведении каждого теста.
| (А | | | | |
| | | § м | | 1 |
| ь / и f Ф | = | > | I f I S = | |
| | А1 | 0.031 | | |
| Са1А | | | 0.027 | 0 |
| | В1 | 0.024 | | |
| | С1 | 0.103 | | |
| Са1В | | | 0.101 | 2 |
| | D1 | 0.098 | | |
| | 61 | 0.309 | | |
| Са1С | | | 0.328 | 10 |
| | F1 | 0.348 | | |
| | G1 | 1.269 | | |
| СаЮ | | | 1.157 | 40 |
| | Н1 | 1.044 | | |
| | А2 | 2.230 | | |
| Са1Е | | | 2.17Э | 100 |
| | В2 | 2.127 | | |
| | С2 | 2.826 | | |
| Са1 F | | | 2.857 | 250 |
| | D2 | 2.888 | | |
| | Е2 | 0.069 | | |
| Conti | | | 0.066 | 1.04 |
| | F2 | 0.063 | | |
| | G2 | 0.401 | | |
| Cont2 | | | 0.405 | 12.8 |
| | Н2 | 0.435 | | |
| | АЗ | 0.050 | | |
| Patient 1 | | | 0916 | 314 |
| | ВЗ | 0.883 | | |
ОБРАЗЕЦ 1
£
g
ПАРАМЕТРЫ QC (КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА)
Результаты анализа считают достоверными при соблкщении следующих
условий;
1. Абсорбция калибратора ‘"А" ng/dt должны быть ^ 0.1
2. Абсорбция калибратора Т* ng/dl должны быть 2 1.3
3. Четыре из шести контрольных смесей должны находиться в установленном
диапазоне.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
А. Проведение теста
1. Время реакции во всех лунках должно быть одинаковым, чтобы обеспечить
воспроизводимость результатов.
2. Пипетирование проб не должно занимать более десяти (10) минут во
избежание смещения результатов теста.
3. При использовании более одного (1) планшета, рекомендуется повторять
построение кривой дозового ответа.
4. Добавление раствора субстрата вызывает кинетическую реакцию, которая
прекращается после добавления конечного реагента. Поэтому добавлять
субстрат и конечный реагент нужно в одинаковом порядке, чтоб
минимизировать разницы во времени реакции.
5. Не допускается использование препаратов с сильной микробной
контаминацией, с повышенным содержанием липидов и гемолизированных
препаратов.
6. Измерение проводится вертикально. Не прикасайтесь к дну лунок.
7. Недостаточное промывание лунок планшета при аспирации или декантации
может привести к получению искаженных результатов.
8. Используйте компоненты из одного набора. Не смешивайте реагенты из
разных наборов
9. Пробы с концентрацией тироглобулина выше 250 ng/ml можно разбавить в
нулевом калибраторе и протестировать повторно. Чтобы получить
концентрацию миоглобина, умножьте результат теста на коэффициент
разбавления.
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
На основе результатов проведенных тестов Monobind Inc. и литературных
источников, составлен нормальный диапазон значений: 5-40 ng/ml
уровень Тд повышен при фолликулярной и папиллярной карц
железы, аденоме щитовидной железы, подостром тироидите,
бопеани Грейвса.
Диапазон нормальных значений для популяции зависит от
специфичности метода, тестируемой популяции и точности
пабораитом. Поэтому любая лаборатория выработать собственные пределы
нормальных значений.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
А. СхоАимостъ
Внутри- и межаналитичесхая точность системы оценивалась при помощи анализов
на трех различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффи14иент вариации для каждой пробы
контрольной сыворотки гфиаедены в табтцах 2 и Э.
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитичесяая сходимость (ед иэм. - пд/т1)
ПРОБА N X 9 C.V.
Смесь 1 20 11.6 0.93 8.0%
Смесь 2 20 398 1.96 4.9%
Смесь 3 20 117.8 6.00 5.1%
ТАБЛИЦА 3
Межаналитичесхая сходимость (ед.изм. - ng/ml)
ПРОБА In X C.V.
Сме<% 1 J20 11.6 0.93 80%
Смео>2 120 398 196^“4Ж
Смесь 3 \20 1178 6.00 5:1%
‘данные получены в течение 7 дней в 10 экспериментах с использованием
дубликатов.
В. Точж>сть
Было проведено сравнение Monobind Thyroglobutin МйторШе ELISA^ с
радиоиммуным тестом путем анализа пр«п|Ц>атов (симптоматических и
бессимптомных) Общее количество исследованных препаратов - 202. Диапазон
полученных зна< жий ~ от О до 110 пдЫ. Полученные данные представлены в
таблице 4.
Таблица 4.
Регрессий
методом Коэффмциемг
«•«ад Средне* (X) каимемынмх юррммцмм
вваммтов
Этотм«таА(у) 13.8
Мвтоддпя у-2.8М.908(х) 0.978
11.4
....
V
Ч
Есть лишь мвбольшвя разница в средних значениях, полученных по данному методу
и методу лпя сраанения. Метод наименьших кидратое и «оэффицмеит «оррвлиций
показывают отлич»^ю сотасоам4ностъ методов.
D. Специфичность
Перекрестная реактивность метода ThyrogtobuNn ELI8A на выОр^инме ее1м0стм
оценивалась путем добавления дополнительных веиюств а матрицу сыворотки в
указанных ниже концентрациях. Для определения перекрестной чувствитвльмоети
расоттыеается отношение мтцду дозой дополнительного вещества и домй
тиреоглобулина. необходимых дляполучемийодинаковой абсорбции.
ПмммпмстмаяР»юптоеп,
Вем<есшо Коицентрецця
100пй/т1
Тироглобулин
10661^
Тироксин TOOOi^df Не огф«д1|т«гаГ
i06nj|/mi~ Неопуадел^в^
Тиротеинсеяэывакнц*^ глобулин
Е. Сверх1ЧИовый *яу|И»зффевк
Поскольку тест лослодоватвльный, высокие концетрацин Тд не приводяг к
сверхдоэоеому эффекту. Пробы с коицентрвцией 50,000 пдЫ демометрируют
отличную абсорбцию.
СПИСОК Ст»АООЧИОЙ Л«ГгеРАТУ1»Ы
1 Beever. К . Bradbury. J., РНМра» О . е( Ы. Ъ1дЫу тпШ¥» Ы
шиЬт\Ш>оФ9Ш <0 T^ymgtbbuAft шпй ТНутШ РштякШт" СНп. Chtm. Ш 1»4«^
1954.1989.
2 Ladeneon. Р W. •ОрШШ ШЬогшкжу ШшИпд йэг <ia0notte тШ тогШШд
по€М»9, ffoH»r, тк/1ЬуюМшювг.''СИп.СЬвт.^ЛШЗ’1В7. ^9ЯВ.
3. Мауо ШФЫ Uboratortet: 1997. test Cataloe. RoechBBter. MN.
4. Spencer. СД.ТакеисЬо. M, Kazarotyn, М., Хштеле мШШ mtd р$г9агтпо» 90Ш
Ьг89гиттуюдк>ЬШшилу» ‘‘С^. Chem. 42 184-173,199в
5. TIete.N. Ed: OMoa/GiiWttoLaboraiory Teals. 3rd£d.
6 PNIadelphbi Saunders. 1905.
7. Surtft, M.I., Chopra. U., MarM. C.N./’Atmrtcmt Щ т Ш Ш осМ оп ^
имЫШ>огш1огуШШ1п(Ь^Ф»аШш.-4ША,.. 2вЗ; 1529^1532,1990.
8. Ng. М., A., ЮмМ, B. Tntymm immunomMtar ^ айтийвтюиа
^ ---—------^ - * - - - * ллкмЛ ш^тштмлшшьжш. 1м
пШтШиПНТШпш от тип/тпШММШШ Щ/ШИМ тугЩ/КЮтП ШПО WfjfUfQ IIIMUPUillVJ 1П
»шт.-С11п Chem., 33:2286-22», 1987
9. Spencer, СЛ Tateuc^. М. Кашовуп М. Wang СС, Oulller НВ, Singer РД т «I.'
Serum тутдк)ЫШп асАмпМкхЯаа. prwatence, Штпош on aerum tfQU’ogtaMrt
meaitiremen(t. ancf pmgnotiie tignBoBno» in р»Ь»Ыя wHh ОШшЫШШ ffiyvoM
cwoHorria/J CUn Endocrinol Malab 199в;83;1121^27.
(направленные на различные участки эпитопа лютеинизирующего гормона), и
реагенты смешивают. В результате реакции между различными антителами LH и
нативным LH формируется сандвичевый комплекс, который не отделяется от лунки.
После окончания необходимого периода инкубации, несвязанные антитела с
ферментами отделяют от связанного конъюгата антител LH при помощи декантации
или аспирации. Для определения активности ферментов на поверхности лунки
добавляют подходящий субстрат, и измеряют люменометром уровень
люминесценции.
Используя несколько известных различных контрольных показателей концентрации
пролактина, можно построить кривую дозовой зависимости и найти с ее помощью
неизвестную концентрацию лютеинизирующего гормона.
ПРИНЦИП
Иммуноферментный тест:
Необходимые реагенты для иммуноферментного анализа включают:
высокоафинные и специфичные антитела (связанные ферментами и
иммобилизованные), с различным и четким распознаванием эпитопа, в избытке,
и нативный антиген.
При этой процедуре иммобилизация происходит во время теста на поверхности
лунки микропланшета при взаимодействии стрептавидина сверху и добавления
извне моноклонального антитела к LH (АЬ).
При смешивании моноклонального антитела, антитела, помеченного ферментами, и
сыворотки, содержащей нативный антиген, происходит реакция между нативным
антигеном и антителами, без конкуренции или стерического несоответствия, в
результате которой формируется растворимый сандвичевый комплекс.
Взаимодействие описывается следующим уравнением:
К,
EnzAi, ^ ^ апл1, — EnzAbtp.-Ag^-^Ahiw
an
- биотинилированное монокланальное антитело (в избытке)
Aolh - нативный антиген
~ антитело, помеченное ферментами (в избытке)
^’^АЬ[р)-Ао сандвичевый комплекс антиген-антитело
постоянная скорость ассоциации
к.
- постоянная скорость диссоциации
Одновременно комплекс оседает в лунке благодаря реакции высокого сродства
между стрегтгавидином и биотинилированным антителом.
Эта реакция показана ниже:
^^^Abip)-AgLH'“^Abtm) + Streptavidif>:,w, =» immobilized complex
Streptavldliv vv “ иммобилизованный стрептав1адин на поверхности лунки
Immobilized complex “ сэндвичевый комплекс на поверхности лунки
После достижения равновесия, фракция антиген-антитело отделяется от
несвязанного антигена при помощи декантации или аспирации. Активность
ферментов в фракции связанных антител прямо пропорциональна концентрации
нативного антигена. Добавляется субстрат для определения интенсивности
люминесценции при помощи люминометра. Интенсивность света прямо
пропорциональна концентрации пролактина в пробе. Используя несколько различных
известных контрольных показателей антигена, можно построить кривую доэовой
зависимости и найти с ее помощью неизвестную концентрацию антигена.
РЕАГЕНТЫ И МАТЕРИАЛЫ:
А. Калибраторы LH 1.0 mi/пробирка (высушенные) [Обозначения А - F]
Шесть (6) пробирок для сравнения с значением PRL для уровней антигена 0(A), 5(B),
25(C), 50(D), 100(E), и 200(F) mlU/ml. Хранить при температуре 2-8Х.
Консервирующее вещество добавлено.
Примечание: калибраторы на основе человеческой сыворотки были откалиброваны
при использовании эталонного препарата, составленного по WHO IRP (68/40).
B. Меченый реагент LH—13 т1/пробир1са
Одна (1), содержащая моноклональное антитело, меченное ферментами,
биотинилированный моноклональный мышиной IgG в буфере с красителем и
консервантом.
Хранить при температуре 2-8°С.
C. Лунки со Стрептавидином - 96 лунок - Значок U
Белый микропланшет с 96 лунками, покрытыми стрептавидином и упакованные в
алюминиевую оболочку с осушающим реагентом. Хранить при температуре 2‘8Х.
D. Концентрат промывающего раствора - 20mi - значок ^
Одна (1) пробирка, содержащая сурфактант в забуференном растворе. Добавлен
консервант. Хранить при температуре 2-30'’С (см. Раздел по подготовке реагентов).
E. Сигаальный реагент А - 7мл/пробирка - Обозначение
Одна (1) бутыль с люминалом в буфере. Хранить при температуре 2-8"С. (см. Раздел
по подготовке реагентов).
F. Сигнальный реагент В •> 7мл/про6ирка • Обозначение 3
Одна (1) бутыль, содержащая перекись водорода (Н2О2} в буфере.
Хранить при температуре 2-8'С (см. Раздел по подготовке реагентов).
H.Вкладыш в упаковку.
Примечание 1: Не используйте реагенты, у которых истек срок годности.
Примечание 2: Открытые реагенты стабильны в течение 60 дней при температуре
2-8"С.
Примечание 3: Реагенты предназначены для использования вместе с планшетом с
96-ю лунками.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ СНЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ]:
I. Пипетка для раскапывания объема 50р1 с точностью выше 1.5%.
2. Диспенсер(ы) дня многократного распределения объемов в O.IOOtnl и 0.300ml с
точностью выше 1.5%.
3. Промывающее устройство для микропланшетов или пластиковая бутыль
(дополнительно).
4. Микропланшетный люминометр.
5. Абсорбирующая бумага для декантации лунок микропланшета
6. Пластиковая оболочка или крышка микропланшета для проведения инкубации.
7. Вакуумный аспиратор (дополнительно) для промывания.
8. Таймер.
9. Материалы для контроля качества.
10. Пробирки для смешивания субстратов А и В.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Дпя виашмостики In Vitro
He првдмазначм для йнутр9ннав0 или наружново употр«бЛ9ни9жилйтмыШ1
или Ч9Л09ЛК0М.
Реагенты, содержащие сыворотку крови человека, тестировались на наличие
антител к ВИЧ 1 и 2, вирусу гепатита С, поверхностному антмгену вируса гепатита В.
Были получены отрицательные результаты. Однако поскольку ни один тест но может
дать полной гарантии отсутствия инфекционных агентов, всю человеческую
сыворотку следует считать потенциально опасной и инфекционной и обращаться с
ней в соответствии с государственными нормами для биологически опасных веществ
2 группы. Подходящие лабораторные правила обращения с препаратами крови
можно найти в "Biosafety In Microbiologlcei and Biomedical laboratories," 2^ редакций.
1988, HHS
СБОР И ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
Забор крови из вены руки следует производить согласно стандартной процедуре, с
соблюдением соответствующих мер предосторожности. Чтобы обеспечить
возможность сравнения с контрольными значениями, нужно собирать сыворотку у
пациенте утром натощак. Для сбора крови используются простыв пробирки с красной
крышкой без геля или добавок. Дайте крови свернуться. Центрифугируйте препарат,
чтобы отделить сыворотку от клеток.
Для анализа можно использовать как саежеполученные образцы сыворотки крови,
так и образцы, хранившиеся при температуре от 2 до 8°С не более пяти (5) дней или
при температуре минус 20°С не более 30 дней. Не допускается повторное
замораживание-размораживание, приводящее к искажению результатов. При
тестировании с дубликатами требуется 0.100 мл препарата.
ПОДГОТОВКА И ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ:
Промывной Буфер
Растворите концентрат промывающего раствора в подходящем контейнере в
дистиллированной или деионизированной воде, так чтобы его объем составлял 1000
мл. Храните при комнатной температуре (20>27*’С) в течение 60 дней.
2. Рабочий раствор индикаторного реагента - готовить ежедневно
Смешайте равные объемы раствора 'А' и раствора ‘В’ в чистом контейнере.
Используйте в течение вО минут после этого. Например, добавьте 1 мл А и 1 мл В в
два стрила с восьмью лунками (получится небольшой избыток раствора. Выбросьте
неиспользованную долю раствора).
ПРОЦЕДУРА ТЕСТА
Пвр9б прошвй9ни0м теста, доведите все реаавнты, контроли и калибраторы
сыаоротни до комнатной тампвратуры (20 - 27* С).
1. П(«готовьте лунки микропланшета для калибраторов, контрольных проб и
препаратов пациента в дубликатах.
Поместите неиспользованные микрострипы обратно в алюминиевую упаковку,
закройте ее и храните при температуре 2-8‘^С.
2. Внесите О.ОбО ml {50р1) калибраторов, контрольных проб и препаратов в
соответствующие лунки.
3. Добавьте 0.100 ml (ЮОмО конъюгата LH-ферментов в каждую лунку. Необходимо
вносить все реагенты как можно ближе ко дну лунки.
4. Осторожно поворачивайте планшет в течение 20-30 секунд, чтобы реагенты
перемешались. Закройте планшет ппастиковой пленкой.
5. Инкубируйте в течение 45 минут при комнатной температуре.
6. Удалите содержимое лунок микропланшета при помощи декантирования или
аспирации. При декантировании тщательно удалите остатки жидкости из лунок при
использовании абсорбирующей бумаги.
7. Добавьте 300р1 промывающего раствора <см. раздел о подготовке реагентов),
декантируйте или аспирируйте. Повторите еще два (2) раза (общее число
промываний - три (3)). Можно использовать автоматическое или ручное
устройство для промывания планшетов. В таком случав следуйте инструкциям
производителя по эксплуатации. При использовании бутыли, наполняйте
каждую лунку доверху, сжимая контейнер. Избегайте появления пузырьков.
Декантируйте и повторите еще два (2) раза.
8. Добавьте 0.100 ml (lOOpI) раствора сигнального реагента во все лунки.
(см. раздел о подготовке реагентов;. Всегда добавляйте реагенты в одном и
том же порядке, чтобы минимизировать разницу времени реакции у различных
лунок.
9. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут.
10. Считайте RLU (относительные световые единицы) при помощи
микроппаншетного люминометра на 96 лунок (минимум 0.5 - 1 секунда на лунку).
Измерение должно проводиться в течение тридцати (30) минут после
добавления субстрата.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна проверять контроли в низком, среднем и высоком
диапазоне для мониторинга проведения теста. Значение этих контролей следует
опредепять во время каждой процедуры теста. Необходимо составпять графики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходящих статистических методов. Значительное отклонение от обычных
показателей указывает на незамеченное изменение в условиях проведения теста
ипи на дефадацию реагентов в наборе. В этом случае используйте свежие реагенты,
чтобы определить причину отклонений.
РАСЧЕТ И РЕЗУЛЬТАТЫ
Для нахождения неизвестной концентрации LH в препаратах используется кривая
доэовой зависимости.
1. Запишите RLU (интенсивность ситала люминесценции), указан».,
микропланшетного анализатора (Образец 1). .^eHiro
2. Постройте на миллиметровой бумаге график зависимости RLI '
калибраторов от концентрации LH в mlU/ml (не усредняйте
перед построением графика). °
3. Проведите через точки на графике наиболее подходящую
4. Чтобы определить неизвестную концентрацию LH, отложите среднее RLU каждого
препарата на вертикальной оси фафика. найдите точку пересечения с кривой и по
горизонтальной оси графика определите концентрацию (в mlU/ml) (можно найти
среднее для дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией). В приведенном
ниже примере, среднее RLU (12010) пересекает калибровочную кривую при
концентрации LH 23.8 mlU/ml (См. рисунок 1).
Пр1 внио 1; Для обработки данных можно использовать профаммное
обеспечение для иммунолюминометрических тестов, (найдите
среднее для дубликатов препаратов с неизвестной
концентрацией) (см. рис. 1).
Примечание 2: Monobind может оказать помощь в покупке и установке
оборудования/профамм для расчета и интерпретации
результатов иммунолюминометрического теста.
Рис.1
Значения LH в mlU/ml
* Данные на образце 1 и на рисунке 1 представлены только для демонстрации и не
должны использоваться вместо кривой дозовой зависимости, составляемой при
проведении ка)кдого теста. Кроме того, RLU калибраторов нормализованы до
=100,000 RLU для калибратора V (самый интенсивный сигнал). Такое
преобразование ликвидирует разницу в способности различных приборов
определять интенсивность света.
ОБРАЗЕЦ 1
I s
b 1 С
-^■1
ПАРАМЕТРЫ QC (КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА)
Результаты анализа считают достоверными при соблюдении следующих
условий:
1. Кривая дозового ответа (пересечения в 80%; 50% и 20%) должна находиться в
установленных пределах.
2. Четыре из шести контролей должны находиться в установленном диапазоне.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
A. Проведение теста
1. Время реакции во всех лунках должно быть одинаковым, чтобы обеспечить
воспроизводимость результатов.
2. Пипетироввние проб не должно занимать более десяти (10) минут во избежание
смещения результатов теста.
3. При использовании более одного (1) планшета, рекомендуется повторять
построение кривой дозового ответа,
4. Недостаточное промывание лунок планшета при аспирации или декантации
может привести к получению искаженных результатов.
5. Используйте компоненты из одного набора. Не смешивайте реагенты из разных
наборов.
B. Интерпретация
1. При использовании компьютерной программы для интерпретации результатов
теста, требуется, чтобы прогнозируемые значения калибраторов оказывались в
пределах 10% от соответствующих концентраций.
2. Ш подавляется эстрогеном, но у женщин, принимающих оральные контрацептивы,
концентрация может быть низкой или нормальной. Голодание и потеря веса
приводят к снижению концентрации гонадотропина.
3. Уровень лютеинизирующего гормона зависит от множества различных факторов,
помимо гомеоствзв гипофиза. Поэтому только результата данного теста для оценки
клинического состояния недостаточно.
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Для определения ожидаемых результатов теста LH CIA были проанализированы
препараты крови нормальных здоровых людей.
ТАБЛИЦА!
Ожидаемые результаты теста CIA на лютеинизирующий гормон
(в mlU/ml)
Женщниы
Фолликулярная фаза 0.5-10,5
Середина цикла 18.4-61,2
Лютеиновая фаза 0.5-10,5
После менопаузы 8.2-40.8
Мужчины
0.7-7.4
Помните, что нахождение диапазона нормальных значений для популяции зависит от
множества факторов: специфичности метода, тестируемой популяции и точности
метода, используемого лаборантом. Поэтому любая лаборатория должна
использовать указанный производителем диапазон только до тех пор, пока
выработает собственные пределы нормальных значений, основываясь на
результатах анализов людей, живущих там же, где расположена лаборатория.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
А. Сходимость
Внутри- и межаналитическая точность системы оценивалась при помощи анализов
на трех различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для каждой пробы
контрольной сыворотки приведены в таблицах 2 и 3.
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.изм. - mlU/ml)
ПРОБА N X о C.V.
Уровень 1 20 2.8 0.15 5.4%
Уровень 2 20 15.2 0.65 4.2%
Уровень 3 20 48.5 2.35 4.8%
ТАБЛИЦА 3
Межаналитическая сходимость (ед.изм. - mlU/m!)
ПРОБА N X о C.V.
Уровень 1 10 3.1 0.17 5.5%
Уровень 2 10 15.4 0.81 5.3%
Уровень 3 10 47.9 2.86 6.0%
Жданные получены в 10 экспериментах с использованием д
в. Точиость
Было проведено сравнение Monobind LH Micropiate CIA^ со стакдартным
радиоиммуным тестом с применением биологических препаратов (здоровых и
беременных людей). Общее 1юличество исследованных препаратов - 110.
Полученные данные представлены в таблице 4.
Таблица 4.
" .................. 1 Регрессия
методом Коэффициент
Метод Среднее (X) наименьших корреляции
квадратов
Этот метод 14.В
Метод для у»0.081 + 0.93 (X) 0.989
15.1
сравнения
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному методу
(LH CIA) и стандартному методу. Метод наименьших квадратов и коэффициент
корреляции показывают отличную согласованность методов.
С. Чувствительность
Чувствительность теста на лютеинизирующий гормон равна 0,04 mlU, что
эквивалентно пробе с концентрацией 0.8 mlU/ml.
D. Специфичность
Перекрестная реактивность антител LH на выбранные вещества оценивалась путем
добавления дополнительных веществ в матрицу сыворотки в указанных ниже
концентрациях. Для определения перекрестной чувствительности рассчитывается
отношение между дозой дополнительного вещества и дозой LH, необходимых для
равной абсорбции.
Вещество Перекрестная Концетрация
реактивность
Лутропин (hLH) 1.0000 -
Тиротропин (hTSH) <0.0001 1000 ng/ml
Фоллитропин (hFSH) < 0.0001 1000 ng/ml
Хорионический гонадотропин <0.0001 1000 nfl/ml
Субъединица 3-LH <0.0001 1000 ng/ml
СПИСОК СПРАВОЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Kosasa T.S., •Measurement of Human Luteinizing Hornione.** Journal of
ReproducbvB Medicine, 26 (1981) pg. 201-6.
Danzer H., Braunstein G.D., et al., "Maternal Serum Human Chorionic Gonadotropic
Concentrations and Fetal Sex Predictions." Fertility and StBrHity. 34 (1980) pg. 336-
40.
MONOBIND, INC.
Costa Mesa. CA 92627 (USA)
Инсулин
Chcmifumtnescence Assay
Хемилюминесцентные тесты CIA
Код товара; 2476-300
Н азначение;
Количественное определение концентрации инсулина в человеческой
сыворотке при помощи иммунолюминометрического теста.
Инсулин человека - пептид, который производится в бета-клетках поджелудочной
железы и отвечает за метаболизм и хранение углеводов. Как результат
биологической обратной связи, уровень инсулина увеличивается после приема
сахаров и снижается, когда сахара для абсорбции немного. При диабете нарушается
механизм выработки инсулина из-за генетической предрасположенности {Тип /) или
иЭ'За образа жизни и/или наследственных факторов (Гоп //). В этих случаях
производство инсулина провоцируют при помощи лекарств или вводят инсулин в
организм оральным или внутривенным путем. Количественное определение
инсулина помогает в назначении дозы инсулина пациенту.
С другой стороны, уровень циркулирующего инсулина может оказаться очень
высоким у пациентов с опухолями поджелудочной железы. Опухолевые клетки
вырабатывают аномально высокое количество инсулина, что вызывает
тпогликвмию. Соответственно, тпогликемия натощак одновременно с
несоразмерно высокой концентрацией инсулина позволяет с большой долей
вероятности предположить наличие опухоли островных клеток (инсулиномы). Чтобы
отличить инсулиному от фактической гипогликемии вследствие введения инсулина,
требуется анализ концентрации С-лептида в сыворотке. (См. тест на опрвдепвнив
Отптидш, МопоЫпИ ОРлрШ Microwelf СМ СаМ2725-300). Инсулиномы можно
локализовать внутривенным вливанием толбутамида и кальция.
ПРИНЦИП
Иммуноферментный тест:
Необходимые реагенты для иммуноферментного анализа включают:
высокоафинные и специфичные антитела (связанные ферментами и
иммобилизованные), с различным и четким распознаванием эпитопа, в избытке,
и нативный антиген.
При этой процедуре иммобилизация происходит во время теста на поверхности
лунки микропланшета при взаимодействии стрептавидина сверху и добавления
извне моноклонального антитела к инсулину (АЬ).
При смешивании моноклонального антитела, антитела, помеченного ферментами, и
сыворотки, содержащей нативный антиген, происходит реакция между нативным
антигеном и антителами, без конкуренции или стерического несоответствия, в
результате которой формируется растворимый сэндвичевый комплекс.
Взаимодействие описывается следующим уравнением:
К,
- биотинилированное монокланальное антитело (в избытке)
Afliuft - нативный антиген
Enz^ V ' помеченное ферментами (в избытке)
^*^^т)-Адцз “’АЬ( ) • “ ндвичевый комплекс антиген-антитело
постоянная скорость ассоциации
^-а . постоянная скорость диссоциации
Одновременно комплекс оседает в лунке благодаря реакции высокого сродства
между стрептавидином и биотинилированным антителом.
Эта реакция показана ниже:
+ SAvMIqsw =» ImmoMlized complex
Sliscia^c.w - иммобилизованный стрелтавидин на поверхности лунки.
]lT)ITI9ti4NZ?^ - сэндвичевый комплекс на поверхности лунки.
После достижения равновесия, фракция антиген-антитело
несвязанного антигена при помощи декантации или
ферментов в фракции связанных антител прямо п
нативного антигена. Добавляется субстрат для
люминесценции при помощи люминометра.
пропорциональна концентрации инсулина в пробе. И
известных контрольных показателей антигена, можно построить кривую дозовой
зависимости и найти с ее помощью неизвестную концентрацию антигена.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Для диагностики In Vitro
Не предназначен для внутреннего или наружного употребление животными
или человеком.
Реагенты, содержащие сыворотку крови человека, тестировались на наличие
антител к ВИЧ 1 и 2, вирусу гепатита С. поверхностному антигену вируса гепатита В.
Были получены отрицательные результаты. Однако поскольку ни один тест не может
дать полной гарантии отсутствия инфекционных агентов, всю человеческую
сыворотку следует считать потенциально опасной и инфекционной и обращаться с
ней в соответствии с государственными нормами для биологически опасных веществ
2 группы. Подходящие лабораторные правила обращения с препаратами крови
можно найти в 'Biosafety in Microbiological and Bionfiedical Laboratories," 2-я редакция,
1988, HHS
СБОР И ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
Забор крови из вены руки следует производить согласно стандартной процедуре, с
соблюдением соответствующих мер предосторожности. Чтобы обеспечить
возможность сравнения с контрольными значениями, нужно собирать сыворотку у
пациента утром натощак. Для сбора крови используются простые пробирки с красной
крышкой без геля или
Дайте крови свернуться. Центрифугируйте препарат, чтобы отделить сыворотку от
клеток.
Для анализа можно использовать как свежеполученные образцы сыворотки крови,
так и образцы, хранившиеся при температуре от 2 до в“С не более пяти (5) дней или
при температуре минус 20**С не более 30 дней. 1Не допускается повторное
замораживание-размораживание, приводящее к искажению результатов. При
тестировании с дубликатами требуется 0.100 мл препарата.
РЕАГЕНТЫ И МАТЕРИАЛЫ:
А. Калибраторы инсулина - 2,0 т1/пробиркв (высушенные) (Обозначения А > F]
Шесть (6) пробирок для сравнения с значением инсулина для уровней антигена 0(A),
5(B), 25(C), 50(D), 100(E), и 300(F) ng/ml. Добавьте в каждую пробирку 2мл
дистиллированной или деионизированной воды. Восстановленные калибраторы
можно хранить в течение 60 дней при температуре 2-8°С.
Консервирующее вещество добавлено.
Примечание; калибраторы на основе человеческой сыворотки были откалиброваны
при использовании эталонного препарата, составленного по WHO 1st IRR 66/304.
V «
е,- ■
B. Меченый реагент инсулин*»»13 ml/vlal Е
Одна (1) пробирка, содержащая моноклональное мышиное антитело, меченнм
ферментами, биотинилированный моноклональный мышиной IgG сухой,
консервированный, буфер
Хранить при температуре 2-8Х.
C. Лунки со Стрептавидином - 9в лунок - Значок U
Белый микропланшет с 96 лунками, покрытыми стрелтавидином и упакованные в
алюминиевую оболочку с осушающим реагентом. Хранить при температуре 2-в*С.
D. Концентрат промывающего раствора ~ 20т1 - значок ^
Одна (1) пробирка, содержащей сурфактант в эабуференном растеоре. Добавлен
консервант. Хранить при температуре 2-30"С (см. Раздел по подготовке реагентов).
E. Сигнальный реагент А - 7мл/провирка • Обозначение
Одна (1) бутыль с люминалом в буфере. Хранить при температуре 2>в°С. (см. Раздел
по подготовке реагентов).
F. Сигнальный реагент В - 7мл/пробирка - Обозначение 8°
Одна (1) бутыль, содержащая перекись водорода (НгОа) в буфере.
Хранить при температуре 2-8**С (см. Раздел по подготовке реагентов).
Н.Вкладыш в упаковку.
Примечание 1: Не используйте реагенты, у которых истек срок «адиости.
Примечание 2: Открытые реагенты стабильны в течение вО дней при температуре 2-
8"С.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ [НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ]:
1. Пипетка для раскапывания объема SOpI с точностью выше 1.5%.
2. Диспенсер(ы) для многократного распределения объемов а 0.100ml и О.ЗООш! с
точностью выше 1.5%.
3. Промывающее устройство для микропланшетов или пластиковая бутыль
(дополнительно).
4. Микролланшетный люминометр.
5. Абсорбирующая бумага для декантации лунок микропланшета.
6. Пластиковая оболочка или крышка микропланшета для проведения инкубации.
7. Вакуумный аспиратор (дополнительно) для промывания.
8. Таймер.
9. Материалы для контроля качества.
ПОДГОТОВКА И ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ:
1. Промывной Буфер
Растворите концентрат промывающего раствора в подходящем контейнере в
дистиллированной или деионизированной воде, так чтобы его объем составлял 1000
мл. Храните при комнатной ттипературе (20-27°С) в течение 60 дней.
Z Рабочий раствор индикаторного реагента - готовить ежедневно
Смешайте равные объемы раствора 'А' и раствора ‘В’ в чистом контейнере.
Используйте в течение 60 минут после этого. Например, добавьте 1 мл А и 1 мл В в
два Сфипв с восьмью лунками (получится небольшой избыток раствора. Выбросьте
неиспользованную долю раствора).
Примечание 1: Не используйте реагенты, у которых истек срок годности.
Примечание 2: Открытые реагенты стабильны в течение 60 дней при температуре 2-
8»С.
ПРОЦЕДУРА ТЕСТА
перед про90д0нивм шста, доводите все реагенты, контроли и калибраторы
сыеоротни до комнатной температуры (20 - 27* С).
1. Подготовьте лунки микропланшета для калибраторов, контрольных проб и
препаратов пациента в дубликатах.
Поместите неиспользованные микрострипы обратно в алюминиевую упаковку,
закройте ее и храните при температуре 2-8“С.
2. Внесите 0.050 ml (50р1) калибраторов, контрольных проб и препаратов в
соответствующие лунки.
3. Добавьте 0.100 ml (lOOpI) меченого реагента инсулина в каждую лунку.
Необходимо вносить все реагенты как можно ближе ко дну лунки.
4. Осторожно поворачивайте планшет в течение 20-30 секунд, чтобы реагенты
перемешались. Закройте планшет пластиковой пленкой.
5. Инкубируйте в течение 120 минут при комнатной температуре.
6. Удалите содержимое лунок микропланшета при помощи декантирования или
аспирации. При декантировании тщательно удалите остатки жидкости из лунок при
использовании абсорбирующей бумага.
7. Добавьте 300р1 промывающего раствора (см. раздел о подготовке реагентов),
декантируйте или аслирируйте. Повторите еще два (2) раза (общее число
Промываний - три (3)). Можно использовать автоматическое или ручное
устройство для промывания планшетов. В таком случае следуйте инструкциям
производителя по зксплуатации. При использовании бутыли, наполняйте
ммэдую лунку доверху^ сжимая контейнер. Избегайте появления пузырьков.
Декантируйте и повторите еще два (2) раза.
8. Добавьте 0.100 т) (100м1) раствора субстрата во все лунки.
(«м. раздал о лодаотовке рмаентов). Всегда добавляйте реагенты в одном и
том же порядке, чтовы минимизировать разницу времени реакции у различных
лунок.
9. Инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти (5) минут в темноте.
10. Считайте RLU (относительные световые единицы) при помощи
микропланшетного люминометра на 96 лунок (0.2-1.0 секунды на лунку). Измерение
должно проводиться в течение тридцати (30) минут после остановки реакции.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна проверять контроли в низком, среднем и высоком
диапазоне для мониторинга проведения теста. Значение этих контролей следует
определять во время каждой процедуры теста. Необходимо составлять фафики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходящих статистических методов Значительное отклонение от обычных
показателей указывает на незамеченное изменение в условиях проведения теста
или на дефадацию реагентов в наборе. В этом случае используйте свежие реагенты,
чтобы определить причину отклонений.
РАСЧЕТ И РЕЗУЛЬТАТЫ
Для нахождения неизвестной концентрации инсулина в препаратах используется
кривая дозовой зависимости.
1. Запишите RLU (интенсивность сигнала люминесценции), указанную в распечатке
микропланшетного анализатора (Образец 1).
2. Постройте на миллиметровой бумаге график зависимости RLU каждого дупликата
калибраторов от концентрации инсулина в plU/mi (не усредняйте значения
калибраторов перед построением графика),
3. Проведите через точки на фафике наиболее подходящую кривую.
4. Чтобы определить неизвестную концентрацию инсулина, отложите среднее RLU
каждого препарата на вертикальной оси графика, найдите точку пересечения с
кривой и по горизонтальной оси фафика определите концентрацию (в piU/ml) (можно
найти среднее для дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией). В
приведенном ниже примере, среднее RLU (31436) пересекает калибровочную кривую
при концентрации инсулина 91 piU/ml (См. рисунок 1).
Примечание 1: Для обработки данных можно использовать программное
обеспечение для иммунолюминометрических тестов, (найдите среднее для
дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией) (см. рис. 1).
Примечание 2: Monobind может оказать помощь в покупке и установке
оборудования/профамм для расчета и интерпретации результатов
иммунолюминометрического теста.
Рмс.1
* Данные на образце 1 и на рисунке 1 представлены только для демонстрации и не
должны использоваться вместо кривой дозовой зависимости, составляемой при
проведении каждого теста. Кроме того, RLU калибраторов нормализованы до
=100,000 RLU для калибратора 'F' (самый интенсивный сигнал). Такое
преобразование ликвидирует разницу в способности различных приборов
определять интенсивность света.
ПАРАМЕТРЫ QC (КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА)
Результаты анализа считают достоверными ари соблюдении следующих
условий;
1. Кривая дозового ответа (пересечения в 60%; 50% и 20% ) должна находиться в
установленных пределах.
2. Четыре из шести контролей должны находиться в установленном диапазоне.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
1. Время реакции во всех лунках должно быть одинаковым, чтобы обеспечить
воспроизводимость результатов.
2. Пипетирование проб не должно занимать более десяти (10) минут во избежание
смещения результатов теста.
3. При использовании более одного (1) планшета, рекомендуется повторять
построение кривой дозового ответа.
4. Недостаточное промывание лунок планшета при аспирации или декантации
может привести к получению искаженных результатов.
5.. Не допускается использование препаратов с сильной микробной контаминацией, с
повышенным содержанием липидов и гемолизированных препаратов.
6. Пробы пациентов с содержанием инсулина выше 300plU/ml нужно разбавить при
помощи нулевого калибратора и проанализировать повторно. Чтобы получить
корректное значение, умножьте результат повторного анализа на коэффициент
разбавления,
7. Используйте компоненты из одного набора. Не смешивайте реагенты из разных
наборов.
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Показатели инсулина всегда выше в плазме, чем в сыворотке, поэтому
предпочтительнее анализ сыворотки. По сравнению с показателями концентрации
инсулина у пациентов с нормальным весом и без диабета, уровень инсулина выше у
пациентов с ожирением, не больных диабетом, и ниже у тренированных
спортсменов. Хотя проинсулин реагирует на большинство тестов на инсулин,
перекрестная реакция с проинсулином при использовании теста Monobind Insulin
Microwell CIA™ меньше 1 %.
Каждой лаборатории рекомендуется найти собственный диапазон нормальных и
анормальных значений, поскольку они всегда зависят от местоположения,
популяции, лаборатории, оборудования и особенностей метода.
На основе клинических данных, собранных Monobind и указанных в специальной
литературе, были определены следующие пределы;
(только для справки)
Дети < 12 лет <10 pU/ml
Взрослые (нормальный диапазон) 0.7 - 9.0 pU/ml
Диабет (Тип И) 0.7 - 25 pU/ml
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
А. Сходимость
Внутри- и межаналитическая точность системы оценивалась лри помощи анализов
на двух различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для каждой пробы
контрольной сыворотки приведены в таблицах 2 и 3.
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.иэм. - ng/ml)
ПРОБА N X о C.V.
Смесь 1 20 12.1 0.82 6.8%
Смесь 2 20 36.5 2.11 5.8%
Смесь 3 20 1^4.2 7.12 5.3%
ТАБЛИЦА 3
Межаналитическая сходимость (ед.изм. - ng/m!)
ПРОБА N X а C.V.
Смесь 1 20 11.8 1.03 8.8%
Смесь 2 20 37.4 1.94 5.2%
Смесь 3 20 127.6 8.11 6.4%
*данные получены в течение 7 дней в 10 экспериментах с использованием
дубликатов.
В. Точность
Было проведено сравнение Monobind Insulin Microplate CIA™ со стандартным
иммуноферментным тестом {Elisa) с применением биологических препаратов
(бессимптомных и симптоматических) (диапазон показателей от 0.01plU/mi -
129plU/nnl). Общее количество исследованных препаратов - 115. Полученные
данные представлены в таблице 4.
Таблица 4.
Регрессия
методом
Метод Среднее (х)
наименьших
квадратов
^от метод 13.6
Метод для у>2.в+0.91(х)
11.4
сравнения________
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному методу
(CIA™ Insulin) и стандартному методу. Метод наименьших квадратов и коэффициент
корреляции показывают отличную согласованность методов.
C. Чувствительность
Чувствительность (предел обнаружения) оценивается при определении
вариабельности калибратора сыворотки с концентрацией О ng/ml при испопьзовании
статистики 2о (95% точности) для расчета минимальной дозы. Чувствительность
данного теста оказалась равной 0.025 ng/ml.
D. Специфичность
Перекрестная реактивность метода Insulin С1А^ на выбранные вещества
оценивалась путем добавления дополнительных веществ в матрицу сыворотки в
указанных ниже концентрациях. Для определения перекрестной чувствительности
рассчитывается отношение между дозой дополнительного вещества и дозой
инсулина, необходимых для получения одинаковой абсорбции.
Вещество Перекрестная Концентрация
реактивность
Инсулин 1.0000
Проинсупин 0.0078 100 ng/ml
С-пептид (не определяется) 75 ng/ml
Глюкагон (не определяется) 150 ng/ml ______
Е. Свврхдозовый ”хук”-эффокт:
На точность теста не влияют концентрации инсулина до 10,000 plU/ml в сыворотке.
Однако пробы с предполагаемым уровнем концентрации выше 300 plU/ml
необходимо растворять в нормальной смешанной человеческой сыворотке в
соотношениях 1:10 и 1:100 для получения базового значения. При определении
скорректированной концентрации инсулина в пробе нужно учитывать базовое
значение и коэффициент разбавления.
СПИСОК СПРАВОЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Eastham, R.D.: Biochemical Values in Clinicai Medicine, 7*' Ed. Bristol. England. John
Wright & Sons, Ltd, 1985.
2. Gerbitz, VKD, Pancreatische B-zellen Peptide: Kinetic and KonzentrBtion von Proinsulin
insulin and C-peptide in Plasma and Urin Probfeme dor Meznwthoden Klinische und
Uteraturubersicht J. din. Chem. Biochem, 18; 313-326 (1980).
3. Boehm TM, Lebovltz HE, Statisticaf enefysts of Gfucose and insulin responses to
intravenous tolbutamide: evaluation of hypoglycemic and hyperinsulinemic states:
Diabetes Care. 479-490 (1979).
4. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Procedures for the collection of
diagnostic blood specimens by venipuncture: approved standards. 4th Ed. NCCLS
Document H3-A4. Wayne, PA: 1998
одной третьей - половины нормального. У взрослых повышение GH постепенно
приводит к акромегалии, то есть грубому утолщению костей черепа, рук и ног.
При проведении данного теста, сначала калибратор hGH, препарат пациента или
контроль вносят в лунку, покрытую стрептавидином. Добавляют биотинипированное
моноклональное антитело и антитела, меченые ферментами (направленные на
различные участки эпитопа гормона роста), и реагенты смешивают. В результате
реакции между различными антителами hGH и нативным hGH формируется
сандвичевый комплекс, который не отделяется от лунки.
После окончания необходимого периода инкубации, несвязанные антитела с
ферментами отделяют от связанного конъюгата антител hGH при помощи
декантации или аспирации. Для определения активности ферментов на поверхности
лунки добавляют подходящий субстрат, и измеряют люминометром уровень
люминесценции.
Используя несколько известных различных контрольных показателей
концентрации гормона роста, можно построить кривую дозовой зависимости и найти
с ее помощью неизвестную концентрацию гормона.
ПРИНЦИП
Иммунофврментный тест:
Необходимые реагенты для иммуноферментного анализа включают:
Необходимые реагенты для иммуноферментного анализа включают;
высокоафинные и специфичные антитела (связанные ферментами и
иммобилизованные), с различным и четким распознаванием эпитопа, в избытке,
и нативный антиген.
При этой процедуре иммобилизация происходит во время теста на поверхности
лунки микропланшета при взаимодействии стрептавидина сверху и добавления
извне моноклонального антитела к hGH (АЬ).
При смешивании моноклонального антитела, антитела, помеченного ферментами, и
сыворотки, содержащей нативный антиген, происходит реакция между нативным
антигеном и антителами, без конкуренции или стерического несоответствия, в
результате которой формируется растворимый сэндвичевый комплекс.
Взаимодействие описывается следующим уравнением;
К.
Enz
' биотинипированное монокланальное антитело (в избытке)
Аден - нативный антиген
' антитело, помеченное ферментами (в избытке)
EnzA-ul^ *-GH)-AgoH- П’AАbК( m) - сэндвичевый комплекс антиген-антитело
^ - постоянная скорость ассоциации
- постоянная скорость диссоциации
Одновременно комплекс оседает в лунке благодаря реакции высокого сродства
между стрепта вид ином и биотинилированным антителом.
Эта реакция показана ниже;
^”^АЬ(я.сн)-Адсн-“'АЬ(т) + Streptc.w =>immobilized complex
Streptavidirt w ' иммобилизованный стрептавидин на поверхности лунки
Immobilized comptex - сэндвичевый комплекс на поверхности лунки
После достижения равновесия, фракция антиген-антитело отделяется от
несвязанного антигена при помощи декантации или аспирации. Активность
ферментов в фракции связанных антител прямо пропорциональна концентрации
нативного антигена. Добавляется субстрат для определения интенсивности
люминесценции при помощи люминометра. Интенсивность света прямо
пропорциональна концентрации hGH в пробе. Используя несколько различных
известных контрольных показателей антигена, можно построить кривую дозовой
зависимости и найти с ее помощью неизвестную концентрацию антигена.
РЕАГЕНТЫ И МАТЕРИАЛЫ:
А. Калибраторы гормона роста -1.0 ml/пробирка (высушенные) [Обозначения А
Шесть (6) пробирок для сравнения с значением hGH для уровней антигена 0(A), 5(B),
10(C), 25(D), 50(E), и 150(F) \кЮШ. Восстановленные калибраторы можно хранить в
течение 60 дней при температуре 2-8°C.
Консервирующее вещество добавлено.
Примечание; калибраторы на основе человеческой сыворотки были откалиброваны
при использовании эталонного препарата, составленного по WHO 2rd IS (96/574).
B. Меченый реагент hGH—13 ml/пробирка
Одна (1) пробирка, содержащая моноклональное антитело, меченное ферментами,
биотинилированный моноклональный мышиной IgG сухой, консервированный, буфер
Хранить при температуре 2-8”С.
C. Лунки со Стрептавидин ом - 96 лунок - Значок И
Белый микропланшет с 96 лунками, покрытыми стрептавидином и упакованные в
алюминиевую оболочку с осушающим реагентом. Хранить при температуре 2-8“С.
D. Концентрат промывающего раствора ~ 20т1 - значок ^
Одна (1) пробирка, содержащая сурфактант в эабуферемном растворе. Добавлен
консервант. Хранить при температуре 2-ЗОХ (см. Раздел по подготовке реагентов),
E. Сигнальный реагент А - 7мл/пробирка • Обоэначение
Одна (1) бутыль с люминалом в буфере. Хранить при температуре г-в^С. (см. Раздел
по подготовке реагентов).
F. Сигнальный реагент В - 7|мл/про6нрка - Обозначение 3°
Одна (1) бутыль, содержащая перекись водорода (Н2О2) в буфере.
Хранить при температуре 2-8"С (см. Раздел по подготовке реагентов).
Н.Вкладыш в упаковку.
Примечание 1: Не используйте реагенты, у которых истек срок годности.
Примечание 2: Открытые реагенты стабильны в течение 60 дней при температуре
2-8“С.
Примечание 3: Реагенты предназначены для использования вместе с планшетом с
96-ю лунками.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ [НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ]:
1 Пипетка для раскапывания объема 25 с точностью выше 1.5%.
2. Диспенсер(ы) для многократного распределения объемов в 0.100ml и 0.300ml с
точностью выше 1.5%.
3. Промывающее устройство для микропланшетов или пластиковая бутыль
(дополнительно).
4. Микропланшетный люминометр.
5. Абсорбирующая бумага для декантации лунок микропланшета
6. Пластиковая оболочка или крышка микропланшета для проведения инкубамии.
7. бакуумный аспиратор (дополнительно) для промывания.
8. Таймер.
9. Материалы для контроля качества.
10. Пробирки для смешивания субстратов А и В.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Для диашностиии In Vitro
Не предназначен для внутреннего или нарутного употребление жиеотными
или человеком.
Реагенты, содержащие сыворотку крови человека, тестировались на наличие
антител к ВИЧ 1 и 2, вирусу гепатита С. поверхностному антигену вируса гепатита В.
Были получены отрицательные результаты. Однако поскольку ни один тест не может
дать полной гарантии отсутствия инфекционных агентов, всю человеческую
сыворотку следует считать потенциально опасной и инфекционной и обращаться с
ней в соответствии с государственными нормами для биологически опасных веществ
2 группы. Подходящие лабораторные правила обращения с препаратами крови
можно найти в "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories," 2>я редакция,
1988, HHS
СБОР И ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
Забор крови из вены руки следует производить согласно стандартной процедуре, с
соблюдением соответствующих мер предосторожности. Чтобы обеспечить
возможность сравнения с контрольными значениями, нужно собирать сыворотку у
пациента утром натощак. Для сбора крови используются простые пробирки с красной
крышкой без геля или добавок. Дайте крови свернуться. Центрифугируйте препарат,
чтобы отделить сыворотку от клеток.
Для анализа можно использовать как свежел слученные образцы сыворотки крови,
так и образцы, хранившиеся при температуре от 2 до 8“С не более пяти (5) дней или
при температуре минус 20"С не более 30 дней. Не допускается повторное
замораживание^размораживание, приводящее к искажению результатов. При
тестировании с дубликатами требуется 0.050 мл препарата.
ПОДГОТОВКА И ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ:
1. Промывной Буфер
Растворите концентрат промывающего раствора в подходящем контейнере в
дистиллированной или деионизированной воде, так чтобы его объем составлял 1000
мл. Храните при комнатной температуре (20-27Х) в течение 60 дней.
2. Рабочий раствор индикаторного реагента ~ готовить ежедневно
Смешайте равные объемы раствора 'А' и раствора 'В' в чистом контейнере.
Используйте в течение 60 минут после этого. Например, добавьте 1 мл А и 1 мл В в
два стрипа с восьмью лунками (получится небольшой избыток раствора. Выбросьте
неиспользованную долю раствора).
ПРОЦЕДУРА ТЕСТА
Пород проведением теста, aoeedume все рвадвнты, контроли и калибраторы
сыворотки до комнатной температуры (20 - 27" С;.
1. Подготовьте лунки микропланшета для калибраторов, контрольных проб и
препаратов пациента в дубликатах.
Поместите неиспользованные микрострипы обратно в алюминиевую упаковку,
закройте ее и храните при температуре 2-8°С.
2. Внесите 0.025 ml (25р1) калибраторов, контрольных проб и препаратов в
соответствующие лунки.
3. Добавьте 0.100 ml (ЮОр!) раствора конъюгата GH в ка^^ую лунку. Необходимо
вносить все реагенты как можно ближе ко дну лунки.
4. Осторожно поворачивайте планшет а течение 20-30 секунд, чтобы реагенты
перемешались. Закройте планшет пластиковой пленкой.
5. Инкубируйте в течение 45 минут при комнатной температуре.
6. Удалите содержимое лунок микропланшета при помощи декантирования или
аспирации. При декантировании тщательно удалите остатки жидкости из лунок при
использовании абсорбирующей бумаги.
7. Добавьте 300р1 промывающего раствора (см. раздел о подготовке реагентов),
декантируйте или аспирируйте. Повторите еще два (2) раза (общее число
промываний - три (3)). Можно использовать автоматическое или ручное
устройство для лромывания лланшотов. В таком случае следуйте инструкциям
производителя по эксплуатации. При использовании бутыли, наполняйте
каждую лунку доверху, сжимая контейнер. Избегайте появления пузырьков.
Декантируйте и повторите еще два (2) раза.
8. Добавьте 0.100 ml (lOOpI) раствора субстрата во все лунки.
(см. раздел о подготовке реагентов). Всегда добавляйте реагенты в одном и
том же порядке, чтобы минимизировать разницу времени реакции у различных
лунок.
9. Инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти (5) минут в темноте.
10. Считайте RLU (относительные световые единицы) при помощи
микропланшетного люминометра на 96 лунок (0.2 секунды на лунку). Измерение
должно проводиться в течение тридцати (30) минут после остановки реакции.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна проверять контроли в низком, среднем и высоком
диапазоне для мониторинга проведения теста. Значение этих контролей следует
определять во время каждой процедуры теста. Необходимо составлять графики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходящих статистических методов. Значитепьное отклонение от обычных
показателей указывает на незамеченное изменение в условиях проведения теста
или на деградацию реагентов в наборе. В этом случае используйте свеж1№с№агенты,
чтобы определить причину отклонений.
п о
Iqia Продан
РАСЧЕТ И РЕЗУЛЬТАТЫ
Для нахождения неизвестной концентрации гормона роста в препаратах
используется кривая дозовой зависимости.
1. Запишите RLU (интенсивность сигнала люминесценции), указанную в распечатке
микропланшетного анализатора (Образец 1).
2. Постройте на миллиметровой бумаге график зависимости RLU каждого дупликата
калибраторов от концентрации hGH в MlU/nr^l (не усредняйте значения калибраторов
перед построением графика).
3. Проведите через точки на графике наиболее подходящую кривую.
4. Чтобы определить неизвестную концентрацию hGH, отложите среднее RLU
каждого препарата на вертикальной оси графика, найдите точку пересечения с
кривой и по горизонтальной оси графика определите концентрацию (в цЮ/т!) (можно
найти среднее для дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией).
Рис.1
Чнжчсния hOM в nlU/ml
| | | Яг- | | |
| | | С | | |
| | 1 ^ | | | 1 |
| | | | If | |
| | | > | ГО ® | 1 |
| <5* | | | | |
| | A1 | 703 | | |
| Са!А | | | 679 | 0 |
| | B1 | 665 | | |
| | C1 | 3132 | | |
| Са1В | | | 3044 | 2.0 |
| | D1 | 2956 | | |
| | El | 12752 | | |
| Gate | | | 12574 | 10.0 |
| | F1 | 12397 | | |
| | G1 | 26744 | | |
| CalD | | | 26784 | 25.0 |
| | HI | 26824 | | |
| | A2 | 53936 | | |
| CalE | | | 57636 | 50.0 |
| | 82 | 61338 | | |
| | C2 | 112907 | | |
| CalF | | 1 | 11921 | 150.0 |
| | 02 | 110934 | | |
| | E2 | 3794 | | |
| Ctrll | | | 3919 | X7 |
| | F2 | 4044 | | |
| | G2 | 12358 | | |
| Ctrl 2 | | | 12685 | io.e |
| | H2 | 13012 | | |
| | A3 | 31415 | | |
| Patient | | | 32010 | 31.0 |
| | B3 | 32005 | | |
| Данные на об | разце 1 и на | рисунке 1 пр | едставлены | только |
ОБРАЗКЦ 1
Я
^
^
* Д длй демонстрации и не
должны использоваться вместо кривой доэовой зависимости, составлйемой при
проведении каждого теста.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
А. Проведение теста
1. Время реакции во всех лунках должно быть одинаковым, чтобы обеспечить
воспроизводимость результатов.
2. Пипетирование проб не должно занимать более десяти (10) минут во избежание
смещения результатов теста.
3. При использовании более одного (1) планшета, рекомендуется повторять
построение кривой дозового ответа.
4. Недостаточное промывание лунок планшета при аспирации или декантации
может привести к получению искаженных результатов.
5. Используйте компоненты из одного набора. Не смешивайте реагенты из разных
наборов.
6. Препараты с концентрациями от SOpJU/nil до 1Q00pJU/ml дают результат выше, чем
стандарт 50ng/d!. поэтому их нужно разбавлять и анализировать повторно.
7. Пациенты, получающие заместительную терапию GH могут вырабатывать
антитела к GH, что затрудняет анализ и искажает результаты. Генетические
вариации или дефадация реагентов могут повлиять на связывание антител и
соответственно на конечный результат. Тестирование таких препаратов дает разные
результаты при использовании наборов реагентов с различными антителами.
В. Интерпретация
1. При использовании компьютерной программы для интерпретации результатов
теста, требуется, чтобы прогнозируемые значения калибраторов оказывались в
пределах 10% от соответствующих концентраций.
2. Секреция гормона роста имеет суточный ритм. GH выделяется импульсами,
чередующимися в течение дня с периодами, когда гормон роста не определяется.
Самый высокий уровень (достигаемый двумя главными выбросами) обычно
наступает через 1*2 часа после засыпания. Другими физиологическими стимулами
гормона роста являются стресс, физические нагрузки, высокобелковая диета и
гипогликемия.
3. Гиперглихемия препятствует секреции гормона роста. Возраст сильно влияет на
концентрацию гормона. После рождения концентрация GH очень высока и
постепенно снижается с возрастом, за исключением фазы роста в подростковый
период. У женщин концентрация обычно на 50% выше, чем у ровесников-мужчин.
4. Поскольку гормон роста вырабатывается неравномерно в течение дня (и имеет
короткий период полужизни). тест одной пробы сыворотки обычно не несет полезной
клинической информации. Для решения этой проблемы используются
провокационные физиологические или фармацевтические стимулы для увеличения
или снижения секреции гормона роста. Г1оэтому только результатов теста на гормон
роста недостаточно для оценки клинического статуса.
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Поскольку секреция гормона роста неравномерна и нерегулярна, приводить
диапазон нормальных значений бессмысленно. Однако в норме концентрация
гормона редко превышает 150 mlU/ml.
У хорошо отдохнувших людей, концентрация GH натощак (через 12 часов после
последнего приема пищи) должна составлять менее 60 mlU/ml.
С учетом этого были протестированы препараты 75 явно здоровых взрослых.
Результаты приведены в таблице 1.
ТАБЛИЦА I
Ожидаемые результаты тоста CIA на гормон роста (в mlU/ml)
Количество Среднее Диапаюи
Мрепараты 175 9.1 0-55
Обычно используются провокационные тесты на выработку GH для оценки функции
передней доли гипофиза. Стимулирующие процедуры позволяют определить
способность передней доли гипофиза секретировать hGH. Таким процедурам
подвергают детей, у которых подозревают задержку роста. Существует несколько
динамических тестов для стимуляции выброса GH: (3) физические упражнения,
назначение L-дофа (4), тест на толерантность к инсулину (5) и вливание аргинина (6).
Каждая лаборатория должна выработать собственные показатели ожидаемых
значений, но пиковый выброс GH, превышающий 24plU/mt , обычно соответствует
норме во всех случаях.
Тесты на оценку подавления выброса hGH из переднего отдела гипофиза
проводится для определения избытка гормона роста и диагностики гигантизма или
акромегалии. Тест на толерантность к глюкозе - это динамический тест на оценку
избытка гормона роста. Отсутствие падения GH ниже 1plU/ml а течение 60-120 минут
указывает на избыток секреции гормона роста.
Помните, что нахождение диапазона нормальных значений для популяции зависит от
множества факторов: специфичности метода, тестируемой популяции и точности
метода, используемого лаборантом. Поэтому любая лаборатория должна
использовать указанный производителем диапазон только до тех пор, пока
выработает собственные пределы нормальных значений, основываясь на
результатах анализов людей, живущих там же, где расположена лаборатория.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
А. Сходимость
Внутри- и межаналитическая точность системы оценивалась при помощи анализов
на трех различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации
контрольной сыворотки приведены в таблицах 2 и 3. ^ 'V;
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.изм. - \\ЮШ)
ПРОБА ^n' Гх 0 C.V.
Уровень 1 12 9.0 0.30 3.3
Уровень 2 12 23,7 1.2 5.0
Уровень 3 12 39.3 1.5 3.8%
ТАБЛИЦА 3
Межа нал итическая сходимость (ед.изм. - цЮ/т!)
ПРОБА N X а C.V.
Уровень 1 10 8.7 0.39 4.5%
Уровень 2 10 25.2 1.65 6.5%
Уровень 3 1 10 38.4 2.16 5.6%
•данные получены в 10 экспериментах с использованием дубликатов.
В. Точность
Было проведено сравнение Monobind hGH Microplate CIA™ со стандартным
радиоиммунологическим тестом с применением биологических препаратов (с
нормальной и повышенной концентрацией). Общее количество исследованных
препаратов - 80. Полученные данные представлены в таблице 4.
Рефессия
методом Коэффициент
Метод Среднее (*)
наименьших корреляции
квадратов
t^oT метод 15:2
Метод для y«0.09U0.98(x) 0.96S
15.4
сравнения
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному методу
(CIA™ hGH) и стандартному методу. Метод наименьших квадратов и коэффициент
корреляции показывают отличную согласованность методов.
C. Чувствительность
Чувствительность теста на гормон роста равна 0.0125 mIU, что эквивалентно пробе с
концентрацией 0.5 MlU/ml.
D. Специфичность
Перекрестная реактивностъ антител гормона роста на выбранные вещества
оценивалась путем добавления дополнительных веществ в матрицу сыворотки в
указанных ниже концентрациях. Для определения перекрестной чувствительности
рассчитывается отношение между дозой дополнительного вещества и дозой hGH с
одинаковой абсорбцией.
Вещество Перекрестная реактивность
Гормон роста (GH) 1.0000
Лютеинизирующий гормон (LH)___ < 0.0001
Фоллитропйн (FSH) <0.0001
Хорионический гонадотропин (CG) <0.0001
Тиротропин (TSH) <0.6001
Пролактин (PRL) < 0.0001
список СПРАВОЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Lewis, U.J., et al. Peed/efr, 128. 399 (1994).
2. Henry. J.D.. C/mfca/ Diagnosis and Managamnt of Laboratory Mathods. W.B.
Saunders Company, 324 (199в).
3. Frasier, S.D., Ped/efrfea . вЗ, 929 (197B),
4. Chevenne. D., et at, Horn. Res., 40.168 (1993).
5. Dattani,M.T.,etaUendocfTnoA133,447(1992).
6. Merimee,T.J., Btal.NEng JМел, 276,434((967).
7. Kraemer RR, Blair MS, McCaferty R, Castracane VD. Runnlnglnduced aUeratiorra in
growth hormone, prolactin, triiodothyronine, and thyroxine concentrations in trained
and untrained men and women. Res Q Exerc Sport 1993:64:69-74.
8. Winer LM. Shaw MA, Baumann G. Basal plasma growth hormone levels In man:
new evidence for rtiythmidty of growth hormone secreUon. J Clin Endocrinol Metab
1990;70:1678-1686.
9. Van der Berg G, Veldhuis JO, FrOllch M. Roelfsema F. An amplitude'Spedflc
divergence In the pulsatile mode of growth hormone (GH) secretion undefltes the
gender difference in mean GH concentrations in men and premenopausal women. J
Clin Endocrinol Metab 1996;81:24в0-2467.
10. Albertseon-Wikland K, Rosberg S, Karlberg J. Groth T. Analysis of 24-hour growth
honnone profiles in healthy boi« and girls of normal stature: relation to puberty. J
Clin Endocrinol Metab 1994;78:1195^201
Редакция: 2. Date: 08.30.02
cat# 1775^00.
M on ob in d Inc.
Г20 Wott 16th Street
Costa Мма. CA 92827
Tel: 949-642^830
Fax: 949-650-8459
Email: lnfo^|monobind.com
Вебсайт: www.nronoblnd.com
Пожалуйста, посетите наш вебсайт, чтобы узнать больше о предоставляемых
на1ми товарах и услугах.
MONOBIND, INC.
Cosla Mesa, CA «2627 (USA)
Cat# 375-300
Тиреотропный гормон (TSH)
Chemiluminescence Assays
Хемилюминосцонтные тесты CiA
Код товара: 375-300
Назначение:
Количественное определение концентрации тиреотропного гормона в
человеческой сыворотке при помощи хемилюминесцентного
иммуноферментного теста.
ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ И ОПИСАНИЕ ТЕСТА
Намерение концентрации в сыворотке тиреотропного гормона fTSH), глюкопротеина
с мопекупярным весом 28,000 дальтонов, вырабатываемого передней допей
гмлофиза, считается самым чувствительным методом диагностики первичного и
вторичного (гипофизарного) гипотиреоза (1,2). Человеческий тиреотропин сходен по
структуре с шпофизарным и плацентарным гонадотропинами, а-цепь с 89
аминокислотными остатками одинакова у всех этих гормонов. Специфичность этих
гормонов определяется Ь-цепью. Ь-цепь TSH состоит из 115 аминокислотных
остатков. Производство двух цепей регулируется отдельно, общее число а-
субъединиц превышает количество Ь-субъединиц. Молекула TSH имеет линейную
структуру и состоит из белкового ядра и углеводных цепей. Вес последних
составляет 16% веса молекулы,
Увеличение в сыворотке концентрации TSH. который прямо отвечает за синтез и
высвобождение тироцдных гормонов - ранний и чувствительный индикатор снижения
тироидных резервов. Если оно сопровождается уменьшением концентрации
тироксина 0*4), можно диагностировать первичный шпотиреоэ. Ожидаемое
увеличение концентрации TSH демонстрирует классическую отрицательную
обратную связь между гипофизом и щитовидной железой. То есть при первичной
недостаточности щитовидной железы снижается секреция тироидных гормонов, что в
свою очередь стимулирует высвобождение TSH из гипофиза.
Кроме того, измерение TSH позволяет дифференцировать вторичный и третичный
(гипоталамический) гипотиреоз от первичной патологии щитовидной железы.
Высвобождение TSH из гипофиза регулируется тиреотропин-высвобождающим
гормоном (TRH). который секретируется гипоталамусом, и прямым взаимодействием
Т4 и трийодтироинина (ТЗ), тироидных гормонов, в гипофизе. Увеличение
концентрации ТЗ и Т4 снижает ответ гипофиза на стимулирующий эффект TRH. При
вторичном и третичном гипотиреозе концентрации Т4 обычно низкие, а уровень TSH
низкий или нормальный. Это вызвано дефицитом TSH в гипофизе (вторичный
гипотиреоз) или недостаточной стимуляцией гипофиза тиреотропин-
высвобождающим гормоном (третичный гипотиреоз). Тест на стимуляцию TRH
позволяет дифференцировать эти состояния. При вторичном гипотиреозе ответ TSH
на тиреотролин-высвобождающий гормон слабый, при третичном - ответ
нормальный или запаздывающий.
Применение иммуноферментных тестов позволило лабораториями с достаточной
чувствитепьностью дифференцировать гипотиреоз от нормальной функции и
расширить область применения анализа TSH. Это метод второго поколения, который
позволяет диагностировать гипотиреоз.
При проведении данного теста, калибратор TSH, препарат пациента и контроли
сначала добавляют в лунку. покрытую стрептавидином. Добавляют
биотинилированное моноклональное антитело и антитела, меченые ферментами, и
реагенты смешивают. В результате реакции между различными антителами TSH и
нативным TSH формируется сандвичевый комплекс, который не отдепяется от
лунки.
После окончания необходимого периода инкубации, несвязанные антитела с
ферментами отделяют от связанного конъюгата антител TSH при помощи
декантации или аспирации. Для определения активности ферментов на поверхности
лунки добавляют подходящий субстрат, и измеряют пюминометром уровень
люминесценции.
Используя несколько известных различных контрольных показателей концентрации
TSH, можно построить кривую дозовой зависимости и найти с ее помощью
неизвестную концентрацию тиреотропного гормона.
свйэа1«4ых аит>1твп грямо прооорфюмапьна конмвитряции нятм»иого •Hfwwe.
Испольэуй жкжолыю различмыж ттасгнш шошропмыж пом «гелей аигшшш,
можно построить кривую ДОЭОМЙ МвИСИМОСТИ и нейти с ев ПОМОЩЫО HOHJM»Ct)4ytO
кондвитрвмию амтиг«и1
РЕАГЕНТЫ:
А. Калмбраторм mptorponima (ТН5» 1.0 пШщяйтрк») (Обо>«1«««»1«мя А - 01
Семь (6) пробирок дпя срвимвтт с конментрецивй вн1ж«мв tSH дпй уровней
антигене 0(A), О 5(В). 2.S(C). S O(D}, 10(E). и 20(F) и 40(0) nQ/ml Хреиить ?|рм
темперетуре 2-в*С
Консервируюи^ eeuiecno добмпено.
Примечание 1салибрвторы на основе чеповвчесжой оыеоротки были откапиброееиы
при использовании эталонного препарата, оостаапенного по IR1* WWI/5SI
8. Меченый рмгентТвН ■мп1г«нй*1Э т¥п|юО«|мш^
Одна (1) пробирка, оодер)нви4ая антитело r^Af. меченное ф<фмеит1ми,
биотинилированный моноклональный мышиной igG сухой, коноареироеенимй. буфер
Хранить при температуре 2-в*С
С. Лункм со Стрептавцдмиом • 96 луиоа • Зменоа ^
Белый ммсрогшаншет с 96 лунками, покрытыми стрептааидином и упашманные а
алюминиевую о6огк>«у с осушакнцим реагентом Хранить при темперетуре 2*ИХ.
О. Конценгрет проммееюа^его рест»о|»а ~ 20т1 - эмачоа ^
Одна (1) пробирка, содерясащай сурфмтаит а эебуфврмеюм растворе. Добмпвн
коноереакт. Хранить п(т температуре 2>30*С (см Раадел по подготовке ремвитов).
Е. Стпшпьны» peere»fT А - ГшипраЛщ^ • ООомитениа
Оя»« (1) бутыль с люминалом а буфере Хранить при температуре 2-8Х (см. Раэдел
по подготоетв реагешоа)
F СигнапьнмЙ реегекг В » 7мл/про(й1|жа • Обозначение S*
Одна (1) бутылк. содержащей первююь водорода (НА) в буфере
Хрнвнитъ ори температуре 2-бХ (см Раадел по подтотовае реагентов) I
О. Вкпад|>иа в упаковку.
Примечанм 1: Не используйте реятнты, у которых мст срт годности
примечание 2: Отфытые релгтгш стабилы^ы « течение 60 дней при температуре 2*
ГС
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ (НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ, НО НЕОБХОДИМЫЕ]:
1 Пипетка для раскалывания обьема 50 и 100 с точностью выше 1.5%
2. Дислвисвр(ы) для шюгохратного распределения объемов в О lOOml и 0 300ml с
точностью выш« 1.5%.
Э Промыаакнцее устройство для микроплаишетов или лластиковвй бутыль
(допопнитвпьио)
4. Диспенсеры с регупируекшм объемом (200-1000р1).
5. Мн1фолланш«тныЙ люминометр.
6. Контейнер для смешивания реагентов (см. ниже)
7. Абсорбирующая бумага для декантации лунок микропланшета.
8. Пластиковая оболочка или крышка микропланшета для проведения инкубации.
9. вакуумный аспиратор (дополнительно) для промывания.
10. Таймер.
11. Контейнер для хранения промывного буфера
12. Дистиллированная или деионизированная вода
13 Материалы дпя контроля качества.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Для дмагностики In Vitro
Не предназначен для внутреннего или наружного употребление животными
Реагенты, содержащие сыворотку крови человека, тестировались на наличие
аитнтел к ВИЧ 1 и 2, вирусу гепатита С. поверхностному антигену вируса гепатита В.
Были получены отрицательные результаты. Однако поскольку ни один тест не может
дать полной гарантии отсутствия инфем.(и0инык агентов, всю человеческую
шаоротку следует с^тать потенциально опасной и инфекционной и обращаться с
ней а ооотаетстами с государственными нормами дпя биологически опасных веществ
2 группы Подходящие лабораторные правила обращения с препаратами крови
штаю найти в "Btoaafety In MIcrotootogical and Biomedical Laboratones,** 2 я редакция.
HHS
СБОР И ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
Забор крови м вены руки следует производить соглаош стандартной процедуре, с
ообпкщением соответствующих мер предосторожности. Чтобы обеспечить
возможность <^>а«н«тн| с контрольными значениями, »«ужно собирать сыворотку у
гааам»нта утром натощак. Для сбора кроем испопьэуются простые пробирки с красной
крышкой без геля или
Дайте крови свернуться. Центрифугируйге препарат, чтобы отделить сыворотку от
клеток.
Дпя анвлшв можно использовать как свежеполуменные образцы сьюоротки крови,
так и образцы, хражиштеся при темтюратуре от 2 до 8‘С не более пяти (5) дней или
при температуре минус 20*0 не более 30 дней Не допускается повторное
замораживание-размораживание, приводящее к искажению результатов. При
тестировании с дубликатами требуется 0.100 мл препарата
ПОДГОТОВКА И ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ:
1. Промывной Буфер
Растворите концентрат промывающего раствора в подходящем контейнере в
дистиллированной или деионизированной воде, так чтобы его объем составлял 1000
мл. Храните при комнатной температуре (20-27®С) в течение 60 дней
2. Рабочий раствор индикаторного реагента - готовить ежедневно
Смешайте равные объемы раствора А' и раствора '8' в чистом контейнере.
Используйте в течение 60 минут после этого. Например, добавьте 1 мл А и 1 мл В в
два стрила с восьмью лунками (получится небольшой избыток раствора Выбросьте
неиспользованную долю раствора).
ПРОЦЕДУРА ТЕСТА
Перед проведвниви теста, доведите все рвааемты, контроли и калибраторы
сыворотки до коинатной твипературы (20 • 27* С).
1. Подготовьте лунки микропланшета для калибраторов, контрольных проб и
препаратов пациента в дубликатах.
Поместите неиспользованные микрострипы обратно в алюминиевую упаковку,
закройте ее и храните при температуре 2-8"С.
2 Внесите 0.050 ml (50р1) калибраторов, контрольных проб и препаратов в
соответствующие лунки
3. Добавьте 0.100 ml (lOOpI) меченого реагента TSH в каждую лунку Необходимо
вносить все реагенты как можно ближе ко дну лунки.
4. Осторожно ловорамивайте планшет в течение 20-30 секунд, чтобы реагенты
перемешались. Закройте планшет пластиковой пленкой.
5 Инкубируйте в течение 45 минут при комнатной температуре.
6. Удалите содержимое лу»юк микропланшета при ломощи декантирования или
аспирации. При декантировании тщательно удалите остатки жидкости из лунок при
использовании абсорбирующей бумаги
7. Добавьте ЗООр! промывакхцего раствора (см раздел о подгот тов),
декантируйте или асттирируЯте Повторите еще два (2)
промываний - три (3» Можно использовать автомат
устройство для промывания планшетов. В таком случав
производителя по эксплуатации. При использовани
каждую лунку доверху, сжимая контейнер. Избегайте появления пузырьков.
Декантируйте и повторите еще два (2) раза.
8. Добавьте 0.100 ml (ЮОр!) раствора субстрата во все лунки,
(см. раздел о подготовке реагентов). Всегда добавляйто реагенты в одном и
том же порядке, чтобы минимизировать разницу времени реакции у различных
лунок.
9. Инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти (5) минут в темноте.
10. Считайте RLU (относительные световые единицы) при помощи
микропланшетного люминометра на 96 лунок (0.2 секунды на лунку). Измерение
должно проводиться в течение тридцати (30) минут после остановки реакции.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна проверять контроли в низком, среднем и высоком
диапазоне для мониторинга проведения теста. Значение этих контролей следует
определять во время каждой процедуры теста. Необходимо составлять графики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходящих статистических методов. Кривая дозового ответа (пересечения
в 80%: 50% и 20%) должна находиться в установленных пределах. Максимальная
абсорбция должна соответствовать полученной при предыдущих тестах.
Значительное отклонение от обычных показателей указывает на незамеченное
изменение в условиях проведения теста или на деградацию реагентов в наборе. В
этом случае используйте свежие реагенты, чтобы определить причину отклонений.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для нахождения неизвестной концентрации тиротропина в пробе используется
кривая доэовой зависимости.
1. Запишите RLU (интенсивность сигнала люминесценции), указанную в распечатке
микропланшетного анализатора (Образец 1).
2. Постройте на миллиметровой бумаге график зависимости RLU каждого дупликата
калибраторов от концентрации TSH в ^lU/ml.
3. Проведите через точки на графике наиболее подходящую кривую.
4. Чтобы определить неизвестную концентрацию TSH, отложите среднее RLU
каждого препарата на вертикальной оси фафика, найдите точку пересечения с
кривой и по горизонтальной оси графика определите концентрацию (в ulU/ml) (можно
найти среднее для дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией.
Примечание 1: Для обработки данных можно использовать программное
обеспечение для иммунолюминометрических тестов.
ОБРАЗЕЦ 1
A S t <
Г" & С
g
е s 1 1
И
> w ”
Л1
(,'al Л 421 0
И1 4S6
(1 0327
( ill П 65()7 0.5
m 6()S7
С I'l 270‘M 2ЩПЮ
(All 2.5
2mA
11
%\(^1
t ill I) 5И2Н 5.0
m 53S‘K>
Л2 103849
( ill I. 104514 10.0
H2 105178
17Ш2
(■2
C'al !■ 1S07(>N 20.U
1)2 INIW4
2X49.U
12
Cul (J 2S7053 40.0
2W174
1-2
<i2 l*)K22 Ш
(onin'l 1 }У211)
txm
112
ЛЗ 1‘)52Ю 22J
( ‘ontnij 2 1^)4060
Ю 104655
n 21655 1.91
I'aticm 1 2U.3I
m 2UiH6
* Данные на образце 1 и на рисунке 1 представлены только для демонстрации и не
должны использоваться вместо кривой дозовой зависимости, составляемой при
проведении каждого теста.
ПАРАМЕТРЫ QC (КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА)
Минимальный RLU (40}jlU/ml)« > 70.000 RLU
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
A. Проведение теста
Время реакции во всех лунках должно быть одинаковым, чтобы обеспечить
воспроизводимость результатов. Пипетирование проб не должно занимать более
десяти (10) минут во избежание смещения результатов теста. При использовании
более одного (1) планшета, рекомендуется повторять построение кривой дозового
ответа. Недостаточное промывание лунок планшета при аспирации или декантации
может привести к получению искаженных результатов. Не допускается
использование препаратов с сильной микробной контаминацией, с повышенным
содержанием липидов и гемолизированных препаратов. Пробы пациентов с
содержанием TSH выше 40 цЮ/т! нужно разбавить в нулевом калибраторе и
проанализировать повторно. Чтобы получить корректное значение, умножьте
результат повторного анализа на коэффициент разбавления. Используйте
компоненты из одного набора. Не смешивайте реагенты из разных наборов.
B. Интерпретация
При использовании компьютерной профаммы для интерпретации результатов теста,
требуется, чтобы прогнозируемые значения капибраторов оказывались в пределах
10% от соответствующих концентраций.
Концентрация TSH в сыворотке зависит от множества факторов; функции
гипоталамуса, щитовидной железы, и реакции гипофиза на тиротропин-
высвобождающий гормон. Поэтому только анализа концентрации тиротропина
недостаточно для оценки клинического состояния пациента.
Повышение уровня TSH в сыворотке может быть вызвано приемом
фармакологических препаратов, таких как домперидон, амиодарон, йодид,
фенобарбитал и фенитоин. Пропранолол, метимазол, допамин и d-тироксин снижают
концентрацию TSH (4). Генетические вариации или деградация TSH на субъединицы
могут повлиять на связывание антител и исказить конечный результат. Концентрация
в таких пробах обычно оказывается разной при использовании различных наборов
реагентов из-за различий в реактивности применяемых антител.
"НЕ ПРЕДНАЗНАЧЕН ДЛЯ МОНИТОРИНГА НОВОРОЖДЕННЫХ"
Для определения ожидаемых результатов теста TSH CIA было проведено изучение
населения с нормальной функцией щитовидной железы. Количество тестов и
диапазон значений приведены в таблице 1. Использовался непараметрический
метод.
ТАБЛИЦА I
Ожидаемые результаты теста TSH CIA
(в pg/ml)
Количество 139
Нижний предел 0.39
Верхний предел 6.16
70 % доверительный интервал для процентили 2,5
Низкий диапазон 0.28-0.53
Высокий диапазон 5.60 ^ 6.82
Помните, что нахождение диапазона нормальных значений для популяции зависит от
множества факторов: специфичности метода, тестируемой популяции и точности
метода, используемого лаборантом. Поэтому любая лаборатория должна
использовать указанный производителем диапазон только до тех пор, пока
выработает собственные пределы нормальных значений, основываясь на
результатах анализов людей, живущих там же, где расположена лаборатория.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
А. Сходимость
Внутри- и межаналитическая точность метода оценивалась при помощи анализов на
трех различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для каждой пробы
контрольной сыворотки приведены в таблицах 2 и 3.
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.изм. - nlU/ml)
ПРОБА N X V C.V.
Смесь 1 24 1.69 0.07 4.1%
Смесь 2 24 13.75 0.54 4.0%
Смесь 3 24 39.40 1.95 4.9%
ТАБЛИЦА 3
Межаналитическая сходимость (ед.изм. - ptlU/ml)
ПРОБА N X о C.V.
Смесь 1 24 1.69 0.07 4.1%
Смесь 2 24 13.75 0.54 4.0%
Смесь 3 24 39.40 1.95 4.9%
•данные получены в течение 7 дней в 10 экспериментах с использованием
дубликатов.
В. Точность
Было проведено сравнение Monobind TSH CIA™ со стандартным
имунноферментным методом (ИФА) путем анализа препаратов с нормальной, гипс и
гиперфункцией поджелудочной железы (диапазон значений от 0.01 \i\\J /ml до
14MlU/ml).
Общее количество исследованных препаратов - 181. Уравнение регрессии методом
наименьших квадратов и коэффициент корреляции были рассчитаны для TSH CIA по
сравнению с обычным методом. Полученные данные представлены в таблице 4.
Таблица 4.
Регрессия
методом Коэффициент
Метод Среднее (х)
наименьших корреляции
квадратов
Этот метод 4.54_______
Метод для у=0.47+0.968(х) 0.995
4.21
сравнения
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному методу
(TSH CIA™) и стандартному методу. Метод наименьших квадратов и коэффициент
корреляции показывают отличную согласованность методов.
С. Чувствительность
Чувствительность (предел обнаружения) оценивается при определении
вариабельности калибратора сыворотки с концентрацией О pg/ml при использовании
статистики 2а (95% точности) для расчета минимальной дозы.
Для инкубации в течение I часа = 0.078 plU/ml
Для инкубации в течение 2 часов = 0.027 plU/ml
D. Специфичность
Перекрестная реактивность антител тиреотропина на выбранные вещества
оценивалась путем добавления дополнительных веществ в матрицу сыворотки в
указанных ниже концентрациях. Для определения перекрестной чувствительности
рассчитывается отношение между дозой дополнительного вещества и дозой TSH,
необходимых для равной абсорбции.
Вещество Перекрестная Концентрация
реактивность
Тиреотропный гормон (hTSH) 1.0000 -
Фоллитропии (hFSH) <0.0001 1000 цдШ
Лутропин (hLH) < 0.0001 1000 nQ{m\
Хорионический гонадотропин < 0.0001 1000 цд/ml
СПИСОК СПРАВОЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hopton M.R., & Нап-ар, J.J., Immunoradiometric assay of thyrotropin as a 4\rs\ line
thyroid function tes in the routine leboralofy*. Clinica! Chemistry: 32,691 (1986)..
2. Caldwell, G. et. Al., “A new siradegy for thyroid function lestlng-.Lancef, 1.1117,
(1985).
3. Young. D.S., Pestaner, L C,. and Gilberman, U., "Effects of Drugs on Clinical
Laboratory Tests." Clinicat Chemistry, 21,3660 (1975).
4. Spencer, CA, et al., “Interlaboretory/lntemiethod differences In Functional Sensitivity
of Immunometric Assays of Thyrotropin (TSH) and Impact on Reliability of
Measurement of Subnormal Concentrations of TSH”, Clinical Chemistry, 41,367
(1995).
5. Bravemian, LE.;"Evaluatlon of thyroid status in patients with thyrotoxicosis."
Clin.Chem., 42; 174-178.1996.
6. Bravemian, LE„ Utigen, RD., Eds.: Wemer and Ingbar’s ‘The Thyroid - A
Fundamental and Clinical Text’ 7th Ed. Philadelphia. Lippinscott-Raven. 1996.
7. Degroot, LJ., Larsen, PR., Hennemenn, G.: Eds.’The Thyroid and Its Diseases.* 6th
Ed. New York. Churchill Livingstone. 1096.
8. Fisher, DA.:Thyslologlcal variations In thyroid honnones: Physiological and
Pathophysiological considerations." Clin.Chem., 42:135-139.1996.
9. BecK‘Peccoz, P., PersanI, L.: Л/аПаЫе biological activity of thyroid stimulating
hormone.- Eur.J.Endo., 131:331-340.1994.
10. Becker, DV., Blgos, ST., Qaitan, E.: 'Optimal use of blood tests for assessment of
thyroid function.” JAMA., 269:2736-2740.1989.
11. Fisher DA, Klein AH: ‘Thyroid development and disorders of thyroid function In the
newborn.’ NEJM. 304:702-712.1981.
12.Burtis CA. Ashwood ER (Ed): TIetz Textbook of Clinical Chemistry. 2nd. Ed. WB
Saunders Company. Philadelphia. 1994. p 2208.
РЕАГЕНТЫ:
А. Калибраторы человеческой сыворотки (1.0 mi/пробирка) [Обозначения A-F]
Шесть (6) пробирок для сравнения со значением тироксина для концентрации 0(A),
2(B). 5(C), 10(D), 15(E), и 25(F) цд/dl. Хранить при температуре 2-8Х.
Консервирующее вещество добавлено.
B. Меченый реагент общего Т4 —1.5 ml/пробирка
Одна (1) пробирка конъюгата пероксидаэы из хрена на альбуминно-стабилизованной
матрице. Хранить при температуре Z-8X.
Консервирующее вещество добавлено.
C. Буфер меченого индикатора общего ТЗ/Т4 - 13т1 -
Одна (1) бутыль, содержащая буфер, красный краситель, консервант и
связывающие ингибиторы протеина. Хранить при 2~в’’С.
D. Лунки для реакции с Т4- 96 лунок - Значок
Белый микропланшет с 96 лунками, покрытыми овечьей антисывороткой и
упакованные в алюминиевую оболочку с осушающим реагентом. Хранить при
температуре г-В^С.
E. Концентрат промывающего раствора - 20т1 - значок ^
Одна (1) пробирка, содержащая сурфа1стант в забуференном растворе. Добавлен
консервант. Хранить при температуре 2-30*С (см. Раздел по подготовке реагентов).
F. Сигнальный реагент А - 7мп/пробирка - Обозначение
Одна (1) бутыль с люминалом в буфере. Хранить при температуре 2-8Х. (см. Раздел
по подготовке реагентов).
G. Сигнальный реагент В - 7мл/пробирка - Обозначение S®
Одна (1) бутыль, содержащая перекись водорода (Н2О2) в буфере.
Хранить при температуре 2-8Х (см. Раздел по подготовке реагентов).
I. Вкладыш в упаковку.
Примечание 1: Не используйте реагенты, у которых истек срок годности.
Примечание 2: Открытые реагенты стабильны в течение 60 дней при температуре 2-
8°С.
Примечание 3: Не используйте мутные реагенты, поскольку они могут быть
загрязнены.
Примечание 4: Не используйте реагенты из различных наборов.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Для диагностики In Vitro
Не предназначен для внутреннего или наружного употребление животными
или человеком.
Реагенты, содержащие сыворотку крови человека, тестировались на наличие
антител к ВИЧ 1 и 2, вирусу гепатита С, поверхностному антигену вируса гепатита В.
Были получены отрицательные результаты. Однако поскольку ни один тест не может
дать полной гарантии отсутствия инфекционных агентов, всю чеповеческую
сыворотку следует считать потенциально опасной и инфекционной и обращаться с
ней в соответствии с государственными нормами для биологически опасных веществ
2 группы. Подходящие лабораторные правила обращения с препаратами крови
можно найти в "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories," 2-я редакция,
1988, HHS
СБОР И ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
Забор крови из вены руки следует производить согласно стандартной процедуре, с
собпгодением соответствующих мер предосторожности. Чтобы обеспечить
возможность сравнения с контрольными значениями, нужно собирать сыворотку у
пациента утром натощак. Для сбора крови используются простые пробирки с красной
крышкой без геля или добавок.
Дайте крови свернуться. Центрифугируйте препарат, чтобы отделить сыворотку от
клеток.
Для анализа можно испопьзовать как свежеполученные образцы сыворотки крови,
так и образцы, хранившиеся при температуре от 2 до 8Х не бопее 48 часов или при
температуре минус 20Х не бопее 30 дней. Не допускается повторное
замораживание-размораживание, приводящее к искажению результатов. Перед
тестом подождите, пока реагенты не нафеются до комнатной температуры (20-270)
При тестировании с дубликатами требуется 0.050 мл препарата.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ [НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ]:
1. Пипетка для раскапывания объема 25pl с точностью выше 1.5%.
2. Диспенсер(ы) для многократного распределения объемов в 0.100ml и О.ЗООш! с
точностью выше 1.5%.
3. Диспенсеры с регулируемым объемом (20-200м1) и (200-1 ОООмО для растворов
конъюгата и субстрата.
4. Промывающее устройство для микропланшетов или пластиковая бутыль
(дополнительно).
5. Люминометр с фотоумножителем для считывания световых единиц.
6. Пробирки для растворения конъюгата ферментов и субстратов А и В.
7. Абсорбирующая бумага дпя декантации лунок микропланшета.
В. Пластиковая оболочка или крышка микропланшета для проведения инкубации.
9. Вакуумный аспиратор (допопнительно) для промывания.
10. Таймер.
11. Материалы для контроля качества.
ПОДГОТОВКА И ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ:
1. Рабочий раствор меченого реагента и конъюгата ТЗ-ферментов
Растворите меченый реагент Т4 1:11 в буфером меченого реагента общего ТЗЯ4 в
подходящей емкости. Например, растворите 160р1 конъюгата в 1.6mt буфера для 16
лунок (получится небольшой избыток раствора).
Данный реагент надо использовать в течение 24 часов с момента приготовления.
Хранить при 2-8“С.
Общая формула:
Требуемый объем буфера *= количество лунок * 0.1
Количество необходимого конъюгата Т4-ферментов = количество лунок * 0.01
например = 16 х 0.1 = 1.6ml для буфера конъюгата общего ТЗЯ4.
16 X 0.01 ~ 0.16ml (160р1) для конъюгата Т4-ферментов.
2. Промывной Буфер
Растворите концентрат промывающего раствора в подходящем контейнере в
дистиллированной или деионизированной воде, так чтобы его объем составлял 1000
мл. Храните при комнатной температуре (20-27°С) в течение 60 дней.
3. Рабочий раствор индикаторного реагента - готовить ежедневно
Смешайте равные объемы раствора ‘А’ и раствора ‘В’ в чистом контейнере.
Используйте в течение 60 минут после этого. Например, добавьте 1 мл А и 1 мл В в
два стрипа с восьмью лунками (получится небольшой избыток раствора. Выбросьте
неиспользованную долю раствора).
ПРОЦЕДУРА ТЕСТА
Перед проведением теста, доведите все реааенты. контроли и калибраторы
сыворотки до комнатной температуры (20 -27“ С).
1. Подготовьте лунки микроппаншета для калибраторов, контрольных проб и
препаратов пациента в дубликатах.
Поместите неиспользованные микрострипы обратно в алюминиевую упаковку,
закройте ее и храните при температуре 2-8“С.
2. Внесите 0.025 ml (25р1) калибраторов, контрольных проб и препаратов в
соответствующие лунки.
3. Добавьте 0.100 ml (lOOpI) рабочего раствора меченого реагента и конъюгата ТА-
ферментов в каждую лунку. Необходимо вносить все реагенты как можно ближе
ко дну лунки.
4. Осторожно поворачивайте планшет в течение 20-30 секунд, чтобы реагенты
перемешались. Закройте планшет пластиковой пленкой.
5. Инкубируйте в течение 45 минут при комнатной температуре.
6. Удалите содержимое лунок микропланшета при помощи декантирования или
аспирации. При декантировании тщательно удалите остатки жидкости из лунок при
использовании абсорбирующей бумаги.
7. Добавьте 300р1 промывающего раствора (см. раздел о подготовке реагентов),
декантируйте или аспирируйте. Повторите еще два (2) раза (общее число
промываний - три (3)). Можно использовать автоматическое или ручное
устройство для промывания планшетов. В таком случае следуйте инструкциям
производителя по эксплуатации. При использовании бутыли, наполняйте
каждую лунку доверху, сжимая контейнер. Избегайте появления пузырьков.
Декантируйте и повторите еще два (2) раза.
8. Добавьте 0.100 ml (ЮОр!) раствора субстрата во все лунки.
(см. раздел о подготовив реагентов/ Всегда добавляйте реагенты в одном и
том же порядке, чтобы минимизировать разницу времени реакции у различных
лунок.
9. Инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти (5) минут в темноте.
10. Считайте RLU (относительные световые единицы) при помощи люминометра на
96 лунок (0.5-1.0 секунды на лунку). Измерение должно проводиться в течение
тридцати (30) минут после остановки реакции.
Примечание: Для повторного анализа препаратов с концентрацией выше 25pl/dl,
внесите 25р1 препарата и 25р1 О калибратора сыворотки в лунку для пробы (для
поддержания равномерной концентрации белков). Умножьте полученное значение на
2, чтобы получить концентрацию тироксина.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна проверять контроли в низком, среднем и высоком
диапазоне для мониторинга проведения теста. Значение этих контролей следует
определять во время каждой процедуры теста. Необходимо составлять фафики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходящих статистических методов. Кривая дозового ответа (пересечения
в 80%; 50% и 20%) должна находиться в установленных пределах. Максимальная
абсорбция должна соответствовать полученной при предыдущих тестах.
Значительное отклонение от обычных показателей указывает н«
изменение в условиях проведения теста или на деградацию реаг
этом случае используйте свежие реагенты, чтобы определить npi ‘
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для нахождения неизвестной концентрации тироксина в препаратах используется
кривая доэовой зависимости.
1 Запишите RLU (интенсивность сижала люминесценции), ^аэанную в раслечатке
микроппвншетиого анализатора (Обраэем 1)
2 Постройте на миллиметровой бумаге график зависимости RLU каждого дупликата
калибраторов от концентрации Т4 в pg/dl
3 Проведите через точки на графике наиболее подходящую кривую
4. Чтобы определить неизвестную концентрацию Т4, отложите среднее RLU каждого
препарата на вертикальной оси графика, найдите точку пересечения с кривой и по
горизонтальной оси графика определите концентрацию (в pp/dl) (можно найти
среднее для дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией). В приведенном
ниже примере, среднее RLU (47432) пересекает калибровочную кривую при
концентрации Т4 7.0 (См. рисунок 1).
Примечание 1; Для обработки данных можно использовать программное
обеспечение для иммунолюминометричесхих тестов, (найдите среднее для
дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией) (см. рис. 1).
Примечание 2 Monobind может оказать помощь в поступке и установке
оборудования/профамм для расчета и интерпретации результатов
иммунолюминометрического теста.
| | A1 | 97208 | | |
| рд1 А | | | | 0и |
| | B1 | 95512 | | |
| | Cl | 77085 | | |
| Cat в | | | 77103 | 2 |
| | D1 | 77121 | | |
| | E1 | 55543 | | |
| Са1 С | | | 55879 | 5 |
| | FI | 56216 | | |
| | G1 | 39CM0 | | |
| ГWйo1t DL/ | | | 39252 | 10 |
| | H1 | 39464 | | |
| | A2 | 28145 | | |
| ГЧ/яа(( РС | | | 28921 | 15 |
| | 82 | imn | | |
| | C2 | 16315 | | |
| Гя! F | | | 16254 | 25 |
| | D2 | 16253 | | |
| | E2 | 68757 | | |
| Ctrt 1 | | | ©9206 | гм |
| | F2 | 69&5S | | |
| | G2 | 30048 | | |
| rwilfl iI с?. | | | 30049 | 14M |
| | И2 | Э0050 | | |
| Patient | A3 | 47546 | | 7.00 |
| 1 | B3 | 47318 | 47432 | |
ОИРЛ”}! :! ! J
z
в I
^ й
1 s» I I
-
B3
Рис. I
■Ьи-лни* Т4 » ц9/«И
* Данные на образце 1 и на рисунке 1 представлены только для демонстрации и не
должны использоваться вместо кривой дозовой зависимости, составлиемой при
проведении каждого теста. Кроме того. RLU калибраторов нормализованы до
3100,000 RLU для калибратора ’А’ (самый интенсивный сигнал). Такое
преобразование ликвидирует разницу в способности различных приборов
определять интенсивность света.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
А. Лр<нмм|#ни« теста
1. Время реакции во всех пунках должно быть одинаковым, чтобы обеспечить
«ослроизводимостъ результатов.
2 Пип«тиров«>л№ проб не должно занимать более десяти (10) минут во избежание
сами|ения результатов теста
3. При использовании более одного (1) планшета, рекомендуется повторять
лоороенме кривой дошвого ответа.
4. Недостаточное промывание лужм планшета при аспирации или декантации
м<шет привести к попучению искаженных результатов
5. Используйте кошюнвнты из одного набора Не смешивайте реагенты из разных
наборов.
В, Иитв|1пр«твцмя
При использовании компьютерной программы для интерпретации результатов теста,
требуется, чтобы прогнозируемые значения калибраторов оказывались в пределах
104 от соответствующих концентраций.
06u4im концентрация тироко«на в шворотхе зависит от множества факторов
фунп^и щитовидной железы и ее регупяк^ии, концектрации тирохсинсвязывающего
глобулина (TBG) и связывания тироксина с TBG (3. 4). Поэтому только показателя
концентрации тироксина недостаточно для оценки клинического состояния пациента.
Уровень общего тироксина в сыворотке может быть ловышен при беременности или
при приеме оральных контрацептивов. Для оценки относительной концентрации
TBG можно провести тест на ТЗ-саязывающую способность, что позволит
определить, вызвано ли повышение Т4 изменением уровня TBG.
Снижение содержания общего тироксина может быть вызвано потерей белков,
определенными заболеваниями печени, приемом тестостерона, дифенина или
салицилатов. Список лекарств и состояний, которые влияют на концентрацию
общего тироксина был составлен Journal of the American Association of Clinical
Chemists3.
HE ПРЕДНАЗНАЧЕН ДЛЯ МОНИТОРИНГА НОВОРОЖДЕННЫХ"
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Для определение ожидаемых результатов теста Т4 CIA было проведено изучение
населения с нормальной функцией щитовидной железы. Полученные среднее (R),
стандратное отклонение (а) и примерные ожидаемые значение (±2 о) указаны в
таблице 1.
ТАБЛИЦА)
Ожидаемые результаты тоста CIA на общий Т4
(в MQ/dl)
Мужчины Женщины (61 тест)
(46
препаратов)
вреднее .. ZILlirZ l ...... '.... 7 6 ■8,2
Стандартное отклонение (о) 16 1.7
Ожидаемые результаты теста (t2 п) 4 4-10 8 4 8 - 116
*Здоровые пациенты с пош уровнем TBG В1слючены в выборку (кроме
беременных).
Помните, что нахождение диапазона нормальных значений для популяции зависит от
множества факторов: специфичности метода, тестируемой популяции и точности
метода, используемого лаборантом Поэтому любая лаборатория должна
использовать указанный производителем диапазон только
выработает собственные пределы нормальшх значений
результатах анализов людей, живущих там же, где pacnt
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
А. Сходимость
Внутри- и межаналитическая точность системы оценивалась при помощи анализов
на трех различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для каждой пробы
контрольной сыворотки приведены в таблицах 2 и 3.
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.изм. - ng/dl)
ПРОБА N X V C.V.
низкий 16 3.7 0.25 6.8%
средний 16 0.6 0.31 3.6%
высокий 16 14.5 0.82 5.7%
ТАБЛИЦА 3
Межаналитическая сходимость (ед.изм. - ид/dl)
ПРОБА N X в C.V.
низкий 10 3.4 0.22 6.4%
средний 10 8.8 0.37 4.3%
высокий 10 14.2 077 5.5%
•данные получены в течение 10 дней в 10 экспериментах с использованием
дубликатов.
В.Точность
Было проведено сравнение Monobind JA С1А™ со стандартным методом ИФА путем
анализа препаратов с нормальной, гипо и гиперфункцией щитовидной железы
(диапазон значений от 0.8 цд/dl до 25 jig/dl).
Общее количество исследованных препаратов -120. Уравнение регрессии методом
наименьших квадратов и коэффициент корреляции были рассчитаны для -щроксина
CIA по сравнению с обычным методом. Полученные данные представлены в
таблице 4.
Таблица 4.
Регрессия
методом Коэффициент
Метод Среднее (х)
наименьших корреляции
квадратов
^от метод 8.07
Метод для у»0.39+0.952(х) 0.934
8.06
сравнения
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному методу
(Т4 С1А^) и стандартному методу. Метод наименьших квадратов и коэффициент
корреляции показывают отличную согласованность методов.
C. Чувствительность
Чувствительность теста на тироксин равна 25 рд, что эквивалентно пробе с
концентрацией 0.1 цд/dl
Чувствительность (предел обнаружения) оценивается при опредепвнии
вариабельности калибратора сыворотки с концентрацией О при использовании
статистики 2о (95% точности) для расчета минимальной дозы.
D. Специфичность
Перекрестная реактивность антител тироксина на выбранные вещества оценивалась
путем добавления дополнительных веществ в матрицу сыворотки в указанных ниже
концентрациях. Для определения перекрестной чувствительности рассчитывается
отношение между дозой дополнительного вещества и дозой тироксина, необходимых
для вытеснения одного и того же объема меченого реагента.
Вещество Перекрестная Концентраций
реа1гтивность
1-Тироксин 1.0000 -
d-Тироксин 0.9800 10 ug/mi
d-Трийодтиронин 0.0150 100 наш
1-Трийодтиронин 0.0300 100 цд/т1
Йодотирозин 0.0001 1lOOjig/rnl______________
Дийодотирозин 0.0001 '1бОйд/т1
Дийодотиронин 0.0001 ‘ 100 jig/ml
СПИСОК СПРАВОЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Barker, S.B., "Determination of Protein Bound Iodine." Journal Biological Chemletry,
173, 175(1948).
2. Chopra, I.J., Solomon, D.H., an Ho, R.S., "A Radioimmunoassay of Thyroxine," J.
Clinical Endocrinol, 33. 865 (1971).
3. Young, D.S., Peataner, L.C., and Gllbemian, U., "Effects of Drugs on Clinical
Laboratory Tests.*' Clinical Ctiemlstry, 21. 3660 (1975).
4. Sterling. L., Diagnosis and Treatment of Thyroid Disease, Cleveland CRC Press, P.
19-51 (1975).
5. Rae P, Fan^ar J. Beckett G. Toft A. ‘Assessment of thyroid status In elderly people.'
British Med. Jour 1993; 307:177-100.
6. Charkes ND, "The many causes of subdinical hyperthyroidism.'* Thyroid
1996;6:391-396.
7. Chou FF, Wang PW. Huang SC, ‘results of Subtotal Thyroidectomy for Gravee’
disease.’Thyrold;9:253-256.
8. Muzzaffari EL. Gharib H, “Thyroxine suppressive therapy In patients with nodular
thyroid disease.* Ann intern Med 1998; 128:386^394.
9. Attwood EC, Seddon RM, Probert DE; "The TAU3G ratio and the investigation of
thyroid function." Clin Biochem 1978; 11:218.
10.Jain R, Isaac RM, GottschalK ME et ai: ITransient central hypothyroidism as a
cause of failure to thrive in newborns and infants.’ J. Endocrinology Invest. 1994;
17:631-637.
Редакция: 3. Date: 05.24.04
Cat# 275-300.
Monobind Inc.
729 West 16th Street
Costa Mesa. CA 92627
Tel; 949-642-4830
Fax: 949 650-8459
Email: info@monobind.com
Вебсайт: www.monobind.com
Пожалуйста, посетите наш вебсайт, чтобы узнать больше о предоставляемых
нами товарах и услугах.
2!12ВШ||и=А. = immobilized compte»
Streptavldlrt vv • иммобилизованный стрвптавидин на поверхности лунки.
Immobilized complex - сэндвичевый комплекс на сплошной поверхности.
После достижения равновесия, фракцию антиген-антитело отделяют от несвязанных
антигенов при помощи декантации или аспирации. Активность ферментов в фракции
связанных антител прямо пропорциональна концентрации нативного антигена.
Используя несколько различных известных контрольных показателей антигена,
можно построить кривую дозовой зависимости и найти с ее помощью неизвестную
концентрацию антигена.
Конкурентный иммуноферментный тест (EIA) - Т4:
Необходимые реагенты для иммуноферментного теста включают иммобилизованное
антитело, конъюгат антигена-ферментов и нативный антиген. После смешивания
иммобилизованного антитела, конъюгата ферментов и антигена и сыворотки с
нативным антигеном, происходит реакция конкуренции между нативным антигеном и
конъюгатом ферментов и антигена за ограниченное количество нерастворимых
связывающих участков.
Взаимодействие описывается следующим уравнением:
к,
+ Ад + Abcw. AgAbc.w + ^^^AgAbcw
дЬс ‘ моноспецифичное иммобилизованное антитело (постоянное количество)
^9 - нативный антиген (любое количество)
Еп2дд - конъюгат ферментов и антигенов (постоянно количество)
AgAbc.w,
- комплекс антиген-антитело
Еп2дд ^ - комплекс конъюгата антигена-ферментов и антител
^ - постоянная скорость ассоциации
- постоянная скорость диссоциации
К = / к_^ - равновесная постоянная
После достижения равновесия, фракцию связанных антител отделяют от
несвязанных антигенов при помощи декантации или аспирации. Активность
ферментов во фракции связанных антител обратно пропорциональна концентрации
нативного антигена. Используя несколько различных известных контрольных
показателей концентрации антигена, можно построить кривую дозовой зависимости и
найти с ее помощью неизвестную концентрацию антигена.
РЕАГЕНТЫ:
A. Калибраторы TSH/T4 (1.0 т1/про6ирка) [Обозначения А - F]
Шесть (6) пробирок для сравнения со значением тироксина для концентрации 0(A),
2(B), 5(C). 10(D), 15(E), и 25(F) цд/dl и TSH для уровней антигена 0(A), 0.5(B). 2.5(C).
6.0(D), 10(E), и 20(F) и 40(G) nlU/ml. Хранить при температуре 2-8“С.
Консервирующее вещество добавлено.
Примечание; калибраторы на основе человеческой сыворотки были откалиброваны
при использовании эталонного препарата, составленного по IRP #80/558 для TSH.
B. Конъюгат форме нтовч1нтитвл TSH/ Биотин ил ирован нов антитело TSH —1.0
т1/про6ирка
Одна (1) пробирка, пробирка с точно откалиброванным содержанием реагента
содержащая антитело, меченное ферментами, биотинилированный моноклональный
мышиной IgG в буфере с красителем и консервантом.
Хранить при температуре 2-8°С.
С. Лунки покрытые Стрептавидином/ Антителами к Т4 • 96 лунок - Значок ^
Микропланшет с 48 лунками (бесцветными), покрытыми стрептавидином, и 48
лунками (синего цвета), покрытыми овечьей анти-Т4 сывороткой, упакованный в
алюминиевую оболочку с осушающим реагентом. Хранить при температуре 2-8“С.
D. Конъюгат фермвнтов-Т4 —1.0 т1/про6ирка
Одна (1) пробирка конъюгата тироксина и пероксидазы из хрена на альбуминно-
стабилизованной матрице (красного цвета). Хранить при температуре 2-8“С.
Консервирующее вещество добавлено.
E. Буфер конъюгата общего ТЗГГ4 - 10ml - ®
Одна (1) бутыль, содержащая буфер, красный краситель, консервант и
связывающие ингибиторы протеина. Хранить при 2-8“С.
D. Концентрат промывающего раствора - 20п»1 - значок ^
Одна (1) пробирка, содержащая сурфактант в забуференном растворе. Добавлен
консервант. Хранить при температуре г-ЗО^С (см. Раздел по подготовке реагентов).
О. Субстрат-12 ml/пробирка - Обозначение S
Одна (1) пробирка, пробирка с точно откалиброванным содержанием
тетраметипбензидина (ТМВ) в буфере. Хранить при 2-8"С.
Гк1оЛ
H. Стоп-реагент - 5.0т1/пробирка - Обозначение
Одна (1) пробирка, пробирка с точно откалиброванным содержанием сильной
кислоты (1N HCI). Хранить при 2-30“С.
I. Вкпадыш в упаковку.
Примечание 1: Не используйте реагенты, у которых истек срок годности.
Примечание 2: Открытые реагенты стабильны в течение 60 дней при температуре
2-8Х.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Для диагностики In Vitro
He предназначен для внутреннего или наружного употребление животными
или человеком.
Реагенты, содержащие сыворотку крови человека, тестировались на наличие
антител к ВИЧ 1 и 2, вирусу гепатита С, поверхностному антигену вируса гепатита В.
Выли получены отрицательные результаты. Однако поскольку ни один тест не может
дать полной гарантии отсутствия инфекционных агентов, всю человеческую
сыворотку следует считать потенциально опасной и инфекционной и обращаться с
ней в соответствии с государственными нормами для биологически опасных веществ
2 группы. Подходящие лабораторные правила обращения с препаратами крови
можно найти в "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories," 2-я редакция,
1988, HHS
СБОР И ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
Забор крови из вены руки следует производить согласно стандартной процедуре, с
соблюдением соответствующих мер предосторожности. Чтобы обеспечить
возможность сравнения с контрольными значениями, нужно собирать сыворотку у
пациента утром натощак. Для сбора крови используются простые пробирки с красной
крышкой без геля или добавок.
Дайте крови свернуться. Центрифушруйте препарат, чтобы отделить сыворотку от
клеток.
Для анализа можно использовать как свежеполученные образцы сыворотки крови,
так и образцы, хранившиеся при температуре от 2 до 8°С не более 5 (пя^цДдибд^фи
при температуре минус 20“С не более 30 дней. Не дс
замораживание-размораживание, приводящее к искажению
тестом подождите, пока реагенты не нафеются до комнатной
При тестировании с дубликатами требуется 0.050 мл препарата
TSH.
МАТЕРИАЛЫ:
Поста влй«мы«:
1. Шесть пробирок с калибраторами TSH / Т4.
2. Одна (1) пробирка биотинилированиого и меченого ферментами антитела к TSH.
3. Одна (1) пробирка концентрированного конъюгата Т4*ферментов.
4. Одна (1) бутыль буфера конъюгата общего ТЗ/Т4.
5 Один (1) микролланшет с 96-ю лунхами с антителами Т4 и стрелтавидином.
6 Одна (1) пробирка с концентратом буфера для промывки.
7 Одна (1) пробирка субстрата
8. Одна (1) бутыль стоп-реагента.
9. Инструкции.
Дополнительные материалы (но поставляомые]:
1 Пипетка для раскапывания объема 25pi и 50 (it с точностью выше 1.5%
2 Дисленсер(ы) для многократного распределения объемов 0.100ml и 0.300ml с
точностью выше 1.5%.
3. Промывающее устройство для микролланшетов или пластиковая бутыль
(дополнительно).
4. Считыватель микролланшетов для определения а6сор5ф1И на длинах волн 450 и
620 пт (фильтр 620 пт не обязателен).
5. Абсорбирующая бумага для декантации лунок микропланшета
6. Пластиковая оболочка или крышка микроплвншета для проведения инкубации
7 Вакуумный аспиратор (дополнительно) для промывания
8. Таймер
9. Материалы для контроля качества.
10. Диспенсеры с регулируемым объемом (200-1000р1) для растворов конъюгата и
субстрата
11 Пробирки для растворения конъюгата ферментов.
12 Дистиллированная или деионизированная вода.
13. Контейнер для смешивания реагентов.
ПОДГОТОВКА И ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ:
1. Рабочий раствор конъюгата Т4-ф«рм«нтов (только для Т4)
Растворите конъюгат ферментов-Т4 1:11 в буфере конъюгата обидего ТЗ/Т4 в
подходящей емкости Например, растворите 160р1 конъюгата в 1.6ml буфера для 16
лунок (получится небольшой избыток раствора)
Данный реагент надо использовать в течение 24 часов с момента приготовления.
Хранить при 2-вХ,
Общая формула
Требуемый объем буфера == количество лунок • 0.1
Количество необходимого конъюгата Т4-ферментов * количество лунок * 0.01
например * 16 X О 1 * 1 вт1 для буфера конъюгата общего ТЗ/Т4,
16 X 0.01 3 0.16т1 (160р1) для конъкката T44|>epMeHT0B.
2. Промывной Буф«р
Растворите концентрат промывающего растворв в поджодтцем контейнере •
дистиллированной или деионизироаанной воде, так чтобы его объем составлйл 1000
мл. Храните при комнатной тештратуре (20-27Х) в теченмв вО дней/ все
компоненты буфера должны рест»ормты:м. Дпи удепеипя «|>мстш11Ю«
достаточно нагревание в течение 5 минут • «одной вене при темперегу|1е Э7*С
или хранения концентрата растеоре при комнатной температуре.
ПРОЦЕДУРА ТЕСТА
Перед проеедемием тесте, доведите есе решвенты. компрот и ттбршпорш
сыеоро/ти до комрщтноИ температуры (20-2Г с;.
1 Подготовьте пуихи микропланшета для калибраторов, контрольных проб и
препаратов памиента в дубшкатах.
Поместите неиспользованные микрострипы обратно в алюминиевую упаковку*
закройте ее и храните при температуре 2-в*С.
2. Внесите 0.050 ml (50р1) (для TSH) или 0.025 ml {25р1) (для Т4) калибраторов,
контрольных проб и препаратов в соответствующие лунки. Лунки для Т4 *- голу($ые,
для TSH - бесцветные,
3. Добавьте 2 капли биотнилированных/меченыэ ферментами антител TSH в лунки
TSH и 0.100 т) (lOOpI) рабочего реагента 2. конъюгата тироксинац|>ерментов в лунки
для Т4. (см, раздел по подготовке реагентов). Вносите реагенты бли1ка ко дну
лунку, раскалывайте их в центр лунки.
4 Осторожно поворачивайте планшет в течение 20*30 секунд, чтобы реагенты
перемешались Закройте планшет пластиковой пленкой.
5 Инкубируйте в течение 60 мю^ут юэмнатмой температуре.**
6 Удалите содержимое лунок микропланшета при помойки декантирования мпи
астфвцм!. При декантироваим4 тщательно удалите остатки жидкости иа лунок при
использовании абсорб»ФующеЙ бумаги
7. До6а№те 300м( промывающего раствора (ом. раздел о подготовке ревгвнтов).
декантируйте или аспирируйте. Повторите еще две (2) раза (общее чиспо
промываний - три (3)). Можно использовать автоматическое или ручное
устройство для промывания планшетов. В таком случае следуйте инструкциям
производитепя по эксплуатации. При использовании бутыли, наполняйте
каждую лунку доверху, сжимая 1гонтейнер. Избегайте появления пузырьков.
Декантируйте и повторите eute два (2) раза.
8 Добавьте во все лунки три (3) капли раствора субстрата вносите n&k реагенты т
центр лунки. Всегда добавляйте реагенты в одном и том же порядке, чтобы
минимизировать разницу времени реакции у различных лунок.
9. Ижубируйте при комнатной температуре в течение пятнадцати (15) минут.
10. Добавьте в каждую лунку одну (1) каппю стоп-реагента и перемешайте реагенты
так. чтобы они все окрасились в ровный желтый цвет. Вносите все реагенты в
центр лунки. Всегда добавляйте реагенты в одном и том же порядке, чтобы
минимиэировать разницу времени реакции у различных лунок.
11. Считайте абсорбцию в каждой лунке при 405nm (используя результат при длине
волны 620^30nm для поправки на несовершенство лунок). Измерение должно
проводиться в течение тридцати (30) минут после добавление конечного
реагента.
•* Для лучшей чувствительности на нижнем предепв (< О 5м1и/т1) инкубируйте 120
Mvwyr при комнатной температуре. Калибратор 40ptU/ml можно исключить, поскольку
абс<^ция будет больше 3 0 единиц.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лабораторий должна проверять коктроли а низком, среднем и высоком
диапазоне для мониторинга проведения теста. Значение зтих коктролей следует
определять во время каждой процедуры теста. Необходимо составлять фафики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходяи4ИХ статистических методов. Кривая дозового ответа (пересечения
В 80%; 504 и 20%) должна находиться в установленных пределах. Максимальная
абсорбция должна соответствовать полученной при предыдущих тестах.
Значительное отклонение от обычных показателей указывает на незамеченное
мзмстенне а условиях проведения теста или на деградацию реагентов в наборе В
атом случае используйте свежие реагенты, чтобы определить причину отклонений.
РАСЧЕТ И РЕЗУЛЬТАТЫ
Дга1 »«ах(шдения неизвестной концентрации тиротролина и тироксина в препаратах
используется кривая дозовой зависимости.
1 Запишите абсорбцию, указанную в распечатке микропланшетного анализатора
(Образец 1). (образец для 120-минутной инкубации выделен курсивом)
2. Посгроте на миллиметровой бумаге фафик зависимости абсорбции каждого
дуплииата калибраторов от концентрации TSH в цЮ/т! или Т4 в pg/di (не усредняйте
3N«4ei«m калибраторов перед построением графика)
3. Проведите через точки на графике наиболее подходящую кривую
4. Чтобы определить иеиавестную концентрацию TSH ипи Т4, отложите среднюю
абсорбцию каждого препарата на вертикальной оси графика, найдите точку
пересечения с кривой и по горизонтальной оси графика определите концентрацию
(TSH в или Т4 в pg/di) (можно найти среднее для дубликатов препаратов с
иеиместной ко««^1НтрациеЙ). В приведенном ниже примере, средняя абсорбция
(1,019) пересекает калибровочную кривую при концентрации TSH 15.3 ц1и/т1 (См
рисунок 1), и средняя абсорбция (1.123) пересекает калибровочную кривую при
концентрации Т4 8.1 pg/dl (См. рисунок 2). Для обработки данных можно
использовать программное обеспечение для тестов IEMA и EIA.
ОЫ>Л31-Ц 1
TSH ELISA
INCUBATION TIME
TSH 60MIN. 120 Min. T4EIA T4
Well COMBICAL Abs. Abs. Abs. COMBICAL
1 0.0 MlU/nH 0.011 0.008 2.374 0 Mo/fll
2 O.OMlU/ml 0.009 0.009 2.358 0 мд/<11
3 0.5\1ЮЫ 0,034 0.065 1.843 2 pg/dl
4 0,5 plU/nil 0033 0.065 1.897 2 \)Qld\
5 2.5 MtU/ml 0.177 0.375 1.409 5
5 2.5 MlU/n^ 0.175 0.375 1.303 5 MQ/dl
7 lO.OplU/ml 0.743 1.448 0.952 10 MO/dl
3 10.0|ilU/ml 0.748 1.412 1012 10
9 20,0 iJlU/ml 1.452 2.619 0.757 15 pg/dl
) 20 0MlU/ml 1.431 2.498 0 752 15 ма/d*
40.0 |itU/nil 2.633 NA 0 474 25 pg/dl
1 40.0MlU/ml 2.530 NA 0.502 25 pg/dl
Unknown Avg Value.
Well 1.0. O.D. 0.0.
15 Unk#1 1028(1.105) 15.3plU/ml
16 Unk tfl 1011(1.142) 1,019(1.123) 8.1 pg/dl
* Данные на образце 1 и на рисунках 1,2 представлены только для демонстрации и
не должны использоваться вместо кривой доэовой зависимости, составляемой при
проведении казцдого теста.
Рис 1
Значения TSH в ulU/dl
Рис.2
Значения Т4 п ^g/dl
ПАРАМЕТРЫ QC (КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА)
Максимальная абсорбция (40plU/ml или 14 О pg/dl) = > 1.2А
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
А. Проведение теста
Время реакции во всех лунках должно быть одинаковым, чтобы обеспечить
воспроизводимость результатов.
Пипетирование проб не должно занимать более десяти (10) минут во избежание
смещения результатов теста.
При использовании более одного (1) планшета, рекомендуется повторять построение
кривой дозового ответа.
Недостаточное промывание пунок планшета при аспирации или декантации может
привести к получению искаженных результатов.
Используйте компоненты из одного набора. Не смешивайте реагенты из разных
наборов.
Добавление раствора субстрата вызывает кинетическую реакцию, которая
прекращается после добавления конечного реагента. Поэтому добавлять субстрат и
конечный реагент нужно в одинаковом порядке, чтоб минимизировать разницы во
времени реакции.
Измерение проводится вертикально. Не прикасайтесь ко дну лунок.
Если капли вытекают из пробирки без надавливания (когда вы переворачиваете ее),
переверните пробирку обратно и сожмите, чтобы снизить внутреннее давление. Не
рекомендуется трясти и смешивать содержимое пробирок перед использованием,
так как это создает внутреннее давление.
Калибраторы сыворотки и контроли не должны становиться мутными. Не
используйте мутные реагенты.
Неиспользованные микрострипы можно убрать обратно в алюминиевую упаковку и
закрыть ее на замок.
Пробы пациентов с содержанием TSH выше 40 uiU/mt нужно разбавить в нулевом
калибраторе и проанализировать повторно. Чтобы попучить корректное значение,
умножьте результат повторного анализа на коэффициент разбавления.
В. Интерпретация
При использовании компьютерной программы для интерпретации результатов теста,
требуется, чтобы прогнозируемые значения калибраторов оказывались в пределах
10% от соответствующих концентраций.
Концентрация TSH в сыворотке зависит от множества факторов: функции
гипоталамуса, щитовидной железы, и реакции гипофиза на тирот^ин^
высвобождающий гормон. Поэтому только анализа концентрации тиротропина
недостаточно для оценки клинического состояния пациента.
Повышение уровня TSH в сыворотке может быть вызвано приемом
фармакопогических препаратов, таких как домперидон, амиодарои, йодид,
фенобарбитал и фенитоин.
Пропранопоп, метимазоп, допамин и d-тироксин снижают концентрацию Т8Н (4).
Генетические вариации или деградация TSH на субъединицы могут повлиять на
связывание антител и исказить конечный результат. Концентрация в таких пробах
обычно оказывается разной при использовании различных наборов реагентов из>за
различий в реактивности применяемых антител.
Общая хоицентрация тироксина в сыворотке зависит от множества факторов:
функции щитовидной железы и ее регуляции, концентрации тироксинсвязывающего
глобулина (TBG) и связывания тироксина с TBG (4, 5). Поэтому только показателя
концентрации тироксина недостаточна для оценки клинического состояния пациента.
Уровень общего тироксина в сыворотке может быть повышен при беременности или
при приеме оральных контрацептивов. Для оценки относительной концентрации
TBG можно провести тест на ТЗ-связывающую способность, что позволит
определить, вызвано ли повышение Т4 изменением уровня TBG.
Снижение содержания общего тироксина может быть вызвано потерей белков,
определенными заболеваниями печени, приемом тестостерона, дифенина или
салицилатов. Список лекарств и состояний, которые влияют на концентрацию
общего тироксина был составлен Journal of the American Association of Clinical
Chemlsts3.
HE ПРЕДНАЗНАЧЕН ДЛЯ СКРИНИНГА НОВОРОЖДЕННЫХ"
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Для определение ожидаемых результатов теста TSH IEMA и Т4 EIA было проведено
изучение населения с нормальной функцией щитовидной железы. Полученные
среднее (R), стандрат><ов отклонение (а) и примерные ожидаемые значение (±2 о)
указаны в таблицах 1 и 2.
ТАБЛИЦА i
Ожидаемые результаты теста Т8Н Е1А
(в Р9/тИ
Itonii^WCTBo ____ 139
Нижний предел____ 0.39^
Верхний предеп 6.16
J70 % доверит^ьный 1 интервал для процентили 2.5
Низкий диапазон 0.28-0.53
Высокий диапазон 5.60 - 6.В2
ТАБЛИЦА 2
Ожидаемые результаты теста на общий Т4
(в ид/dl)
Мужчины Женщины
(42 препарата) (58 препаратов)
Среднее (X) 7.6 8.2
Стандартное отклонение(п) 1.6 1.7
Ожидаемые результаты теста (±2 ст) 4.4-10.8 4.8-11.6
•Здоровые пациенты с высоким уровнем TBG включены в выборку (кроме
беременных).
Помните, что нахождение диапазона нормальных значений для популяции зависит от
множества факторов: специфичности метода, тестируемой популяции и точности
метода, используемого лаборантом. Поэтому любая лаборатория должна
использовать указанный производителем диапазон только до тех пор, пока
выработает собственные пределы нормальных значений, основываясь на
результатах анализов людей, живущих там же, где расположена лаборатория.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
А. Сходимость
Внутри- и межаналитичесхая точность системы оценивалась при помощи анализов
на трех различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для каждой пробы
контрольной сыворотки приведены в таблицах 3 и 4 для TSH, и 4 и 5 для Т4.
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.изм. - |itU/ml)
ПРОБА N X о C.V.
Смесь 1 24 1.69 0.07 4.1%
Смесь 2 24 13.75 0.54 4.0%
Смесь 3 24 39.40 1.95 4.9%
ТАБЛИЦА 3
Межаналитическая сходимость (ед.изм.
ПРОБА N X а C.V.
Смесь 1 10 1.78 0.11 5.9%
Смесь 2 10 12.98 0.54 4.2%
Смесь 3 10 42.41' 2.08 4.9%
‘данные получены в течение 7 дней в 10 экспериментах
дубликатов.
ТАБЛИЦА 5
Внутрианалитическая сходимость (ед.изм. - ^g/di)
ПРОБА____ N X" о c.Vr~]
Низкий 16 3.1 0.21 6.7%
Средний 16 8.9 0.27 3.0%
Высокий 16 16.5 0.73 4.4%
ТАБЛИЦА 6
Межаналитическая сходимость (ед.изм. - цд/dl)
ПРОБА N X 0
Низкий 10 3.0 0.25 8.3%
Средний 10 8.7 0.32 3.7%
Высокий 10 16.3 0.69 4.2%
•данные получены в течение 10 дней в 10 экспериментах с использованием
дубликатов.
В. Точность
Было проведено сравнение Monobind TSH IEMA со хемилюминисцентным методом
(CIA) путем анализа препаратов с нормальной, гипо и гиперфункцией поджелудочной
железы (диапазон значений от 0.01 цШ /mi до 41ц1и/т1).
Общее количество исследованных препаратов - 170. Уравнение регрессии методом
наименьших квадратов и коэффициент корреляции были рассчитаны для TSH по
сравнению с хемилюминесцентным методом. Полученные данные представлены в
таблице 4.
Таблица 4.
Регрессия
методом Коэффициент
Метод Среднее (х)
наименьших корреляции
квадратов
^от метод _____ 4.54
Метод для у*0.47+0.ЭвВ(х) 0.995
4.21
сравнения
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному методу
(TSH IEMA) и методу для сравнения. Метод наименьших квадратов и коэффициент
корреляции показывают отличную согласованность методов.
Было проведено сравнение Monobind 14 EIA с радиоиммунологическим методом
путем анализа препаратов с нормальной, гипо и гиперфункцией щитовидной железы
(диапазон значений от 0.8 мд/dl до 25 ^lg/dl).
Общее количество исследованных препаратов -131. Уравнение регрессии методом
наименьших квадратов и коэффициент корреляции были рассчитаны для тироксина
по сравнению с обычным методом. Полученные данные представлены в
таблице 7.
Таблица 7.
Регрессия
методом Коэффициент
Метод Среднее (х)
наименьших корреляции
квадратов
Этот метод 8.07
Метод для у-0.Э9+0.952(х) 0.934
8.08
сравнения
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному Методу
(Т4 EIA) и стандартному методу. Метод наименьших квадратов и коэффициент
корреляции показывают отличную согласованность методов.
C. Чувствительность
Для оценки чувствительности (предела обнаружения) теста TSH определяется
вариабельность калибратора сыворотки с концентрацией О pg/ml при использовании
статистики 2о (95% точности) для расчета минимальной дозы.
Для инкубации 8 течение I часа = 0.078 plU/ml
Для инкубации в течение 2 часов = 0.027 plU/ml
Чувствительность теста на тироксин равна 80 рд, что эквивалентно пробе с
концентрацией 0.4 цд/dl. Чувствительность (предел обнаружения) оценивается при
определении вариабельности калибратора сыворотки с концентрацией О при
использовании статистики 2о (95% точности) для расчета минимальной дозы.
D. Специфичность
Перекрестная реактивность антител тиреотропина на выбранные вещества
оценивалась путем добавления дополнительных веществ в матрицу сыворотки в
указанных ниже концентрациях. Для определения перекрестмой чувствительности
рассчитывает(эт отношение между дозой дополнительного вещества и дозой TSH,
необходимых для равной абсорбции.
Вещество Перекрестная
реактивность
Тиреотропный гормон (hTSH) 1.0000 -
Фоллитролин (hFSH) < 0.0001 1000 йд/т1
Лутропин (hLH) < 0.0001 1000t^/ml
Хорионический гонадотропин <6.0001...... iOOO ng/nil ' ^
Перекрестная реактивность антител тироксина на выбранные вещества оценивалась
путем добавления допопнительных веществ в матрицу сыворотки в указанных ниже
концентрациях. Для определения перекрестной чувствительности рассчитывается
отношение между дозой дополнительного вещества и дозой тироксина, необходимых
для вытеснения одного и того же объема меченого реагента.
Вещество Перекрестная Концентрация
реактивность
1-Тироксин 1.0000
d-T ироксин 0.9800 10
d-Трийодтиронин 0.0150 100 цдУт!
1-Трийодтиронин 0.0300 100 цд/т1
йржтдали.” _ 0.0001 100 ug/ml______
Дийодотирозин ___ 0.0001 100
Дийодотиронин 0.0001 100'ug/ml "
Низкая перекрестная реактивность антител позволяет использовать
комбинированные калибраторы благодаря нулевой перекрестной реакции.
Е. Корреляция результатов, полученные при инкубации в течение 1 и 2 часов,
(для Т8Н EUSA)
Было проведения сравнение процедур инкубации в течение 1 часа и 2 чассю при
использовании 30 биологических препаратов (с диапазоном концентрации TSH от 0.1
до 18.5 plU/ml) were used. Уравнение, рассчитанное методом наименьших квадратов,
коэффициент корреляции показывают отличную согласованность методов - 2-х
часового (у) и 1-часового (х).
Y = 0.986 (х) +0.119
Коэффициент корреляции: 0.998
СПИСОК СПРАВОЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Barker, Biological Chemistry, 173, 175, (1948).
2. Chopra. IJ.. et al., J. Clinical EndocrinoL. 33. 865 (1971)
3. Young, D.S et. al., Clinical Chemistry, 21, 3660 (1975).
4. Sterling. L., Cteveland,CRC Prese, P. 19-51 (1975).
5. Spencer, CA, et al.. '•Clinical Chemistry, 41, 367 (1995).
6. Sterling. L„ Cleveland ,CRC Press, P. 19-51 (1975).
РЕАГЕНТЫ:
А. Калибраторы человеческой сыворотки <1.0 гл1/пробирка} [Обозначения А - F}
Четыре (4) пробирки для сравнения со значением сыворотки ненасыщенной
тироидными гормонами с примерными уровнями 1в (А), 25(B), 35(C), 47 (D). Хранить
при температуре 2-8“С.
Консервирующее вещество добавлено.
Точные уровни приведены на этикетках в наборе.
B. Конъюгат фермонтов-ТЗи “ 1.5 ml/пробирка
Одна (1) пробирка конъюгата трийодтиронина-пероксидаэы из хрена и тироксина на
альбуминно-стабилизованной матрице. Хранить при температуре 2-8Х.
Консервирующее вещество добавлено.
C. Буфер конъюгата T3-U--13 ml - Обозначение
Одна (1) бутыль реагента, содержащая буфер, оранжевый краситель и консервант.
Хранить при 2-8°С.
D. Лунки с антителами • 96 лунок - Значок
Белый микропланшет с 96 лунками, покрытыми овечьей антисывороткой и
упакованные в алюминиевую оболочку с осушающим реагентом. Хранить при
температуре 2-8'’С.
E. Концентрат промывающего раствора ~ 20т1 - значок ^
Одна (1) пробирка, содержащая сурфактант в забуференном растворе. Добавлен
консервант. Хранить при температуре 2-ЗОХ (см. Раздел по подготовке реагентов).
E. Сигнальный реагент А > 7мл/про6ирка - Обозначение
Одна (1) бутыль с тетраметилбензолом (ТМВ) в буфере. Хранить при температуре 2-
8°С. (см. Раздел по подготовке реагентов).
F. Сигнальный реагент В - 7мл/пробирма - Обозначение S®
Одна (1) бутыль, содержащая перекись водорода (Н2О2) в буфере.
Хранить при температуре 2-8“С (см. Раздел по подготовке реагентов).
0
О. Стоп-реагент - 8,0т1/пробирка - обозначение
Одна бутыль с сильной кислотой (1N HCi). Хранить при 2-30°С.
КВкладыш в упаковку.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ [НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ]:
1. Пипетка для раскапывания объема 25 р1 с точностью выше 1.5%.
2. Диспвнсвр(ы) для многократного распределения объемов в 0.100т! и 0.300ml с
точностью выше 1.5%.
3. Промывающее устройство для микропланшетов или пластиковая бутыль
(дополнительно).
4. Считыватель микропланшетов для определения абсорбции на длинах волн 450 и
620 пт.
5. Абсорбирующая бумага для декантации лунок микропланшета.
6. Пластиковая оболочка или крышка микропланшета для проведения инкубации.
7. Вакуумный аспиратор (дополнительно) для промывания.
8. Таймер.
9. Диспенсер для многократного распределения объема 20-200ц1 и 200-1000 ц1.
10. Материалы для контроля качества.
11. Пробирки для растворения конъюгата и субстратов А и В.
Примечание 1: Не используйте реагенты, у которых истек срок годности.
Примечание 2: Открытые реагенты стабильны в течение 60 дней при температуре 2-
8“С.
Примечание 3: Реагенты предназначены для использования вместе с планшетом с
96-ю лунками.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Для диагностики In Vitro
Но предназначен для внутреннего или наружного употребление животными
или человеком.
Реагенты, содержащие сыворотку крови человека, тестировались на наличие
антител к ВИЧ 1 и 2, вирусу гепатита С, поверхностному антигену вируса гепатита В.
Были получены отрицательные результаты. Однако поскольку ни один тест не может
дать полной гарантии отсутствия инфекционных агентов, всю человеческую
сыворотку следует считать потенциально опасной и инфекционной и обращаться с
ней в соответствии с государственными нормами для биологически опасных веществ
2 группы. Подходящие лабораторные правила обращения с препаратами крови
можно найти в '’Biosafety In Microbiological and Biomedical Laboratories," 2-я редакция,
1988, HHS
СБОР И ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
Забор крови из вены руки следует производить согласно стандартной процедуре, с
соблюдением соответствующих мер предосторожности, Чтобы обеспечить
возможность сравнения с контрольными значениями, нужно собирать сыворотку у
пациента утром натощак. Для сбора крови используются простые пробирки с красной
крышкой без геля или добавок.
Дайте крови свернуться. Центрифугируйте препарат, чтобы отделить сыворотку от
клеток.
ПОДГОТОВКА И ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ:
1. Рабочий раствор реагента А и конъюгата ТЗ-фврментов
Растворите конъюгат ферментов -ТЗ 1:11 в буфере конъюгата ТЗ в подходящей
емкости. Например, растворите 160р1 конъюгата в 1.6ml буфера для 16 лунок
(получится небольшой избыток раствора).
Данный реагент надо использовать в течение 24 часов с момента приготовления.
Хранить при 2-8“С.
Общая формула:
Требуемый объем буфера = количество лунок * 0.1
Количество необходимого конъюгата ТЗ-ферментов = количество лунок * 0.01
например = 16 х 0.1 = 1.6ml для буфера конъюгата общего ТЗ/Т4.
16 X 0.01 = 0.16ml (IBOpl) для конъюгата ТЗ-ферментов.
2. Промывной Буфер
Растворите концентрат промывающего раствора в подходящем контейнере в
дистиллированной или деионизированной воде, так чтобы его объем составлял 1000
мл. Храните при комнатной температуре (20-27°С) в течение 60 дней.
3. Рабочий раствор индикаторного реагента - готовить ежедневно
Смешайте равные объемы раствора ‘А' и раствора ‘В’ в чистом контейнере.
Используйте в течение 60 минут после этого. Например, добавьте 1 мл А и 1 мл В в
два стрипа с восьмью лунками (получится небольшой избыток раствора. Выбросьте
неиспользованную долю раствора).
Примечание: не используйте раствор, если он стал синим.
ПРОЦЕДУРА ТЕСТА
Перед проведением теста, доведите все реагенты, контроли и калибраторы
сыворотки до комнатной температуры (20 - 27“ С).
1. Подготовьте лунки микропланшета для калибраторов, контрольных проб и
препаратов пациента в дубликатах. Поместите неиспользованные микрострипы
обратно в алюминиевую улаковку, закройте ее и храните при температуре 2-
8“С.
2. Внесите 0.025 ml (25р1) калибраторов, контрольных проб и
соответствующие лунки.
3. Добавьте 0.100 ml (lOOpI) рабочего реагента А, раствора
лунку. Необходимо вносить все реагенты как можно ближе
4. Осторожно поворачивайте планшет в течение 20-30 секунд, чтобы реагенты
перемешались. Закройте планшет крышкой.
5. Инкубируйте в течение 60 минут при комнатной температуре.
6. Удалите содержимое лунок микропланшета лри помощи декантирования или
аспирации. При декантировании тщательно удалите остатки жидкости из лунок при
использовании абсорбирующей бумаги.
7. Добавьте ЗООр! промывающего раствора (см. раэдеп о подготовке реагентов),
декантируйте или аслирируйте. Повторите еще два (2) раза (общее число
промываний - три (3)). Можно использовать автоматичаское или ручное
устройство для промывания планшетов. В таком случае следуйте инструкциям
производителя по эксплуатации. При использовании бутыли, наполняйте
каждую лунку доверху, сжимая контейнер. Избегайте появления пузырьков.
Декантируйте и повторите еще два (2) раза.
8. Добавьте 0.100 ml (lOOpI) раствора субстрата во все лунки. Всегда добавляйте
реагенты в одном и том же порядке, чтобы минимизировать разницу времени
реакции у различных лунок.
9. Инкубируйте при комнатной температуре в течение пятнадцати (15) минут.
10. Добавьте 0.050 ml (50р1) стоп-реагента во все лунки и осторожно перемешивайте
в течение 15-20 секунд. Всегда добавляйте реагенты в одном и том же порядке,
чтобы минимизировать разницу времени реакции у различных лунок.
11. Считайте абсорбцию в каждой лунке при 405nm (используя результат при длине
волны 620-630nm для поправки на несовершенство лумок^ Измерение должно
проводиться в течение тридцати (30) минут после добавление конечного
реагента.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна проверять контроли в низком, среднем и высоком
диапазоне для мониторинга проведения теста. Значение этих контролей следует
определять во время каждой процедуры теста. Необходимо составлять фафики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходящих статистических методов. Значительное отклонение от обычных
показателей указывает на незамеченное изменение в условиях проведения теста
или на дефадацию реагентов в наборе. В этом случае используйте свежие реагенты,
чтобы определить причину отклонений,
ПАРАМЕТРЫ QC (КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА)
Результаты анализа считают достоверными при соблюдении следующих
условий:
1. Абсорбция калибратора "А" должны быть 2 1.3
2. Четыре из июсти контрольных смесей должны находиться в установленном
диапазоне.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для нахождения неизвестной концентрации миоглобина в препаратах используется
кривая дозовой зависимости.
1. Запишите абсорбцию, указанную в распечатке микропланшетиого анапизатора
(Образец 1).
2. Постройте на миллиметровой бумаге график зависимости абсорбции каждого
дупликата калибраторов от % связывания ТЗ (U%). (не усредняйте абсорбции
каждого дубликата калибраторов перед построением графика).
3. Проведите через точки на графике наиболее подходящую кривую.
4. Чтобы определить неизвестный % связывания, найдите точку пересечения его
абсорбции с кривой и по горизонтальной оси графика определите % (жяэывания.
(См. рисунок 1). (можно найти среднее для дубликатов препаратов с иеизвесшой
концентрацией) В приведенном ниже примере, средняя абсорбция (1.690)
пересекает калибровочную кривую при 26.6%U.
Рис,1
Т-и можно также представить в вцде отношения T-uptake Ratio. Для этого разделите
%и на 30%.
ПРИМЕР 2
27.3%и / 30% 0.910
* Данные на образце 1 и на рисунке 1 представлены толыго для демомстрации и не
должны использоваться вместо кривой дозовой зависшлости, составляемой при
проведении каждого теста
ПРИМЕР 1
M«en
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
А. Проведение теста
Время реакции во всех лунках должно быть одинаковым, чтобы обеслечить
воспроизводимость результатов.
Пипетирование проб не должно занимать более десяти (10) минут во
избежание смещения результатов теста.
При использовании более одного (1) лланшета, рекомендуется повторять
построение кривой дозового ответа.
Добавление раствора субстрата вызывает кинетическую реакцию, которая
прекращается после добавления конечного реагента. Поэтому добавлять
субстрат и конечный реагент нужно в одинаковом порядке, чтоб
минимизировать разницы во времени реакции.
Измерение проводится вертикально. Не прикасайтесь к дну лунок.
Недостаточное промывание лунок планшета при аспирации или декантации
может привести к получению искаженных результатов.
Используйте компоненты из одного набора. Не смешивайте реагенты из
разных наборов
В. Интерпретация
Результат теста ТЗ-Uptake зависит от множества факторов; функции и регуляции
щитовидной железы, концентрации тироксинсвязывающего глобулина и от
связывания тироидиых гормонов с TBG. Поэтому только теста T3U недостаточно для
оценки клинического статуса.
Для более точной оменки состояния щитовидной железы используется индекс
свободного тироксина (FTI). составленный из показателей отношения T3U и общей
концентрации тироксина (9). На FTI не влияют беременность или прием экстрагенов,
которые приводят к изменению уровня TBG иТ4, но не затрагивают метаболизма
продукции щитовидной железы.
Таблица лекарств и состояний, влияющих на тест T3L), была составлена Journal of
the American Association of Clinical Chemists (10).
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Для определение ожидаемых результатов теста T3U было проведено изучение
населения с нормальной функцией щитовидной железы (85 препаратов).
»1ИТ0ВИЛ110Й жслсчы % CBI чывающей сгкк:о6н(кпи (T3U)
2505"
J ____
Гииогирсо! или н чбыючиос i <25
свячмвамис TIKi
1ипсртнрсо1 или иасыщсииеТПО j >35
Помните, что нахождение диапазона нормальных значений для популяции зависит от
множества факторов: специфичности метода, тестируемой популяции и точности
метода, используемого лаборантом. Поэтому любая лаборатория должна
использовать указанный производителем диапазон только до тех пор, пока
выработает собственные пределы нормальных значений, основываясь на
результатах анализов людей, живущих там же, где расположена лаборатория.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
А. Сходимость
Внутри- и межаиалитическая точность системы оценивалась при помощи анализов
на трех различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для каждой пробы
контрольной сыворотки приведены в таблицах 2 и 3.
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.изм. - %U)
ПРОБА N X ff C.V.
низкий 24 28.7 0.393 1.37%
средний 24 37.8 0.515 1.36%
высокий 24 45.4 6332 0.73%
ТАБЛИЦА 3
Межа нал итическая сход ИМ0СТ1. (ед.изм
ПРОБА N X в c7v~
низкий 10 2в:4 0.45 1.6%
средний 10 37.1 0.65 1.8%
высокий 10 45;? 0.52 ■1:1%
♦данные получены в течение 10 дней в 10 экспериментах с использованием
дубликатов.
В. Точность
Было проведено сравнение МопоЫпд T3U с радиоимунным методом путем анализа
препаратов с нормальной, гипо и гиперфункцией поджелудочной железы и
беременных (диапазон значений от 14% - 48%).
Общее количество исследованных препаратов - 120. Полученные данные
представлены в таблице 4.
Таблица 4.
Регрессия
методом Коэффициент
Метод Среднее (х)
наименьших корреляции
квадратов
Этот метод 29.3
Метод дня у«1.66+0.988(х) 0.972
29.0
сравнения
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному методу
и методу для сравнения. Метод наименьших квадратов и коэффициент корреляции
показывают отличную согласованность методов.
СПИСОК СПРАВОЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Inada, М., and Sterling, К.. J. Clin. Invest. 46,1442 (1967).
2. Murphy, В., 1968, Radioisotopes in Medicine, U.S. Atomic Energy CommiMlon,
Technical Information Center, Tennessee.
3. Hollander, C.S. and Shenkman, L., 1974, Methods of Hormone Radioimmunoassay,
Academic Press, New York.
4 Hamolsky, M.W., Stein, M. and Freedberg, S.A., J. Clin. Endocrinol., 17,33 (1957).
5. Hebert, V., U.S. Patent Office #3,442,819 (1971).
6. Mitchell, M.L., Harden, A.B. and O'Rourke, M.E.. J. Clin. EndoainoL, 20,1474
(I960).
7. Rolleri, E., Buzzigoli, G., and Plassio, 0., J Nucl. Med., *13. 892 (1972)
8. Nusynowitz, M.L., and WallszewskI, Am. J. Clin. Pathol. 68.523 (1971).
9. Clark, F. and Horn, D.B., J. Clin. Endocrinol. Metab.. 28, 39 (1966)
70. Young. D.S., Pestaner, L.C. and Glberman, U., Clinical Chemistry, 21. 3660 (1975)
Редакция: 2. Date; 03.13.02
Cat# 828-300.
Monobind Inc.
729 West 18th Street
Costa Mesa. CA 92627
Tel: 949-642-4830
Fax: 949-650-8459
Email; lnfo@monoblnd.com
Вебсайт; www.monobtndxom
Пожалуйста, посетите наш вебсайт, чтобы узнать больше о предоставляемых
нами товарах и услугах.
MONOBIND, INC.
Costa Mesa, CA 92627 (USA)
Пролактин (PRL)
Chemlluminescence Assays
Хемилюминвсцвнтные тесты CIA
Код товара: 775-300
Назначение:
Количественное определение концентрации пролактина в человеческой
сыворотке при помощи хемилюминесцентного иммуноферментного
теста.
ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ И ОПИСАНИЕ ТЕСТА
Пролактин, (PRL), секретируемый лактотрофами передней доли гипофиза,
представляет собой протеин, который состоит из одной полипептидной цепи,
содержащей окопо 200 аминокислот. Основные биологические функции пролактина
- это стимуляция роста молочной железы, образование и поддержание
производства молока. Есть свидетельства, что пролактин совместно с
лютеинизирующим гормоном участвует в синтезе стероидных гормонов. Высокий
уровень пролактина препятствует выработке стероидов, а также синтезу
лютеиниэирующего и фолликулостимулирующего гормонов в гипофизе. Клиническая
польза измерения концентрации пролактина состоит в подтверждении диагноза
пролактинемии и последующем мониторинге эффективности назначенного лечения.
При проведении данного теста, калибратор PRL, препарат пациента и контрол и
сначала добавляют в лунку, покрытую стрептавидином. Добавляют
биотинилировакное монокпонапьное антитепо и антитепа, меченые ферментами
(направленные на разпичные участки эпитопа пропактина), и реагенты смешивают. В
результате реакции между различными антителами PRL и нативным PRL
формируется Сандвичевый комплекс, который не отделяется от лунки.
После окончания необходимого периода инкубации, несвязанные антитела с
ферментами отделяют от связанного конъюгата антител PRL при помощи
декантации или аспирации. Для определения активности ферментов на поверхности
лунки добавляют подходящий субстрат, и измеряют люминометром уровень
люминесценции.
Используя несколько известных различных контрольных показателей концентрации
пролактина, можно построить кривую дозовой зависимости и найти с ее помощью
неизвестную концентрацию гормона пролактина.
ПРИНЦИП
Иммуноферментный тест:
Необходимые реагенты для иммуноферментного анализа включают:
высокоафинные и специфичные антитела (связанные ферментами и
иммобилизованные), с различным и четким распознаванием эпитопа, в избытке,
и нативный антиген.
При этой процедуре иммобилизация происходит во время теста на поверхности
лунки мифопланшета при взаимодействии стрептавидина сверху и добавления
извне моноклонального антитела к инсулину (АЬ).
При смешивании моноклонального антитела, антитела, помеченного ферментами, и
сыворотки, содержащей нативный антиген, происходит реакция между нативным
антигеном и антителами, без конкуренции или стерического несоответствия, в
результате которой формируется растворимый сэндвичевый комплекс.
Взаимодействие описывается следующим уравнением;
К.
+ AgpHL + *^Ab(m) ^^^Ab(ppAgpRL-“’Ab(ni)
к-а
“*Ab(m) ■ биотинилированное монокланальное антитело (в избытке)
AQprl - нативный антиген
Enz*u - антитело, помеченное ферментами (в избытке)
^^Ab(prAgpRL-^Ab(mj . сэндвичевый комплекс антиген-антитело
^ - постоянная скорость ассоциации
- постоянная скорость диссоциации
Одновременно комплекс оседает в лунке благодаря реакции высокого сродства
между стрептав^ином и биотииилированным антителом.
Эта реакция показана ниже.
+ S»reptflvtdlrtw =» immdilRzed complex
Streptavklitt w ' иммобилизованный стрептавидин на поверхности лунки
1тпюЫ1ге<.1 complex - сэндвичевый комплекс на поверхности луики
После достижения равновесия, фракция антиген^антитело отделится от
несвязанного антигена при помощи декантации или аспирации Активность
ферментов в фракции связанных антител прямо пропорционагьна концентрации
нативного антигена. Добавляется субстрат для определения интенсивности
люминесценции при помощи люминометра. Интенсивность света прямо
пропорциональна концентрации пролактина в пробе. Используя несколько различных
известных контрольных показателей антишна, можно построить фивую дозовой
зависимости и найти с ее помощью неизвестную концентрацию антигена.
РЕАГЕНТЫ И МАТЕРИАЛЫ:
А. Калмбр«торы пролаггмма- 2.0 mi/пробмрю (высуштиыа) [Обозначояия А -
П
Шесть (6) пробирок для сравнения с значением PRL для уровней антигена 0<А), 5(B),
10(C). 2^0), 50(E). и 100(F) ng/ml Восстановпемныв калибраторы можно хранить в
течение 60 дней при температуре 2-8'С.
Консервирующее вещество добавлено.
Прммвчамме: калибраторы на основе человеческой сыворотки были откалиброваны
при ислопьэовании этапониого преларата, составленного по WHO 3rd IS (64/500).
B. Меченый реагент пролактина—13 тУлробирка
Одна (1) пробирка, содержащая моноклональное антитело, мечемюе ферментами,
биотинилироаанный моноклональный мышиной IgG сухой, консервированный, буфер
Хранить при температуре 2-8*С
C. Лунш со Стрептавидином • 96 лунок • Значок U
Белый микролланшет с 96 лунками, покрытыми стрептавидином и упакованные в
алюминиевую обопочку с осушающим реагентом Хранить при температуре 2-8Х
О. Концентрат промывающего раствора - 20т1 - значок ^
Одна (1) пробирка, содержащая сурфактант в забуференном растворе Добавлен
консервант. Хранить при температуре 2-30*С (см Раздел по подготовке реагентов)
E. СмгаальныЙ рмгент А •* Гмл/пробмрм > ООоэначсмм» ^
Одна (1) бутыль с люминалом ш буфере. Хранить при темгафатуре г-в^С. (см. Раадел
по подготовке реагеитоа).
F. Ситальмый pearetrr В - 7мл/п|ювмр|1а • Обозмачаниа
Одна (1) бутъшь. содержащей перекись водорода (H?Oj> в буфере
Хранить при температуре 2*6*С (см. Раздел по подготовь реагеитоа)
H.Внпадыш ■ упакоаку.
Примечание 1: Не испопмуйтв ревгвмты, у «оторы* истек срок годности.
Прммемаиме 2: Открытые реагенты стабилы^ы а течение 80 дней при тшмперат^фе
2-в*С.
Примечание 3: Реагенты преднаэначет для испольэоаания аместе с планшетом с
96-ю лунками
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ [НЕ ЛОСТАВЛЯЕМЫЕЗ:
I. ГЪшетка д/т раскапывания объема 50р1 с тонностъю аыше 1 5%.
2. Диспем(»р{ы) для миогсжратного рвсгфедепеиия обынмов в О 100ml и 0.300mi с
точностью выше 1 5%.
3. Промьтающее устройство для микроплаништоа или пластиковая бутыль
(допопнитепьно).
4. Мм(роппаншет)«^й люминометр.
5 Абсорбирующая бумага для декантации лунок микртшаншета
в. Пластиковая оболочка или крышка микропланшега дпя проведения иикуб«4ии.
7. Вакуумный acmtpaiop (допол)«1тельно) дпя промыван!^
8. Таймер
9 Материалы дпй конт^юля качества.
10. ГНюбирки для смеитвания субстратов А и 8.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Дт дивгностини In Vftn
Не прфдмвзнлчем дпя вмутрт4тло или нарутмошо употршбпту жч9отныт»
или у*оо««тм.
Реагенты, содержащие сыворотку хроаи человека, тестировапись на 1шпичие
антител к ВИЧ 1 и 2, вирусу гепатита С. поверхностному антигену вируса шпвтит* 8,
Были получены отрицательные реэультаты. Одиако поскольку ни один тест не мом»?
дать полной гарантии отсутствия инфею^>«ны* агентов, вою человечеоеу»
сыворотку следует считать гютет|иат1Но опасной и инфек14Ионной и обращатьси t
ней в соответствии с государственными дпя биожкически опаонш вещвС1»
2 группы. Подходящие лабораторные правила обра1мения с препаратами крови
можно найти а 'Bioaafety in Microbioioolc^ and 8lome<«ca( Uboratorte»,* 2-я редакция,
19вв, HHS
СБОР И ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
Забор 1фовм иэ йены руки следует производить согласно стандартной промедуре, с
соблюдением соответствующих мер предосторожности Чтобы обеспечить
возможность сравнения с контрольными значениями, нужно собирать сыворотку у
пациента утром натощак. Для сбора крови используются простые пробирки с красной
|фышкой без геля или добавок. Дайте крови свернуться. Центрифугируйте препарат,
чтобы отделить сыворотку от клеток.
Для аналиэа можно использовать как свежвполученныв образцы сыворотки крови,
так и образцы, хранившиеся при температуре от 2 до 8‘'С не более пяти (5) дней или
при температуре минус 20'*С не более 30 дней. Не допускается повторное
замораживание-размораживание, приводящее к искажению результатов. При
тестировании с дубликатами требуется 0.100 мл препарата.
ПОДГОТОВКА И ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ:
1. П|Юмы«мой Буфер
Растворите концентрат промывающего раствора в подходящем контейнере а
дисгтиллированной или деионизированной воде, так чтобы его объем составлял 1000
мл. Храните при комнатной температуре (20>27°С) в течение 60 дней.
2. Рабочий |>аствор мидикаториого реагента - готовить ежедневно
Смешайте равные объемы раствора 'А' и раствора в чистом контейнере.
Испопмуйте в течение 60 минут после этого. Например, добавьте 1 мл А и 1 мл В в
два стрила с восьмью лунками (получится »юбопьшой избыток раствора. Выбросьте
неиспользованную долю раствора)
Примечание 1: Не используйте реагенты, у которых истек срок годности.
П|М1Мечаи1«е 2: Открытые реагенты стабильны а течение 60 дней при температуре 2-
8*0
ПримФнлми9: Растиор субстрата следует испопьзоешть в течение 2-3 часов
после при9отоепения. Избытом рлстеоря нушмо утилизовать.
ПРОЦЕДУРА ТЕСТА
Перед проеедениеи теста, доведите все рееаенты, нонтропи и калибраторы
сыворотки до комнатной температуры (20 - 27* С).
1. Подготовьте лунки микропланшета для калибраторов, контрольных проб и
препаратов пациента в дубликатах.
Помостите неиспользованные микрострипы обратно в алюминиевую упаковку,
закройте ее и храните при температуре 2-8''С.
2. Внесите 0.050 ml (SOpI) калибраторов, контрольных проб и препаратов в
соответствующие лунки.
3. Добавьте 0.100 ml (100pi) меченого реагента инсулина в каждую лунку.
Необходимо вносить асе реагенты как можно ближе ко дну лунки.
4. Осторожно поворачивайте планшет в течение 20-30 секунд, чтобы реагенты
перемешались. Закройте планшет пластиковой пленкой.
5. Инкубируйте в течение 45 минут при комнатной температуре.
6. Удалите содержимое лунок микропланшета при помощи декантирования или
аспирации. При декантировании тщательно удалите остатки жидкости из лунок при
использовании абсорбирующей бумаги.
7. Добавьте 300р1 промывающего раствора (см. раздел о подготовке реагентов),
декантируйте или аспирируйте. Повторите еще два (2) раза (общее число
промываний - три (3)). Можно использовать автоматичоскоо или ручное
устройство для промывания планшетов. В таком случае следуйте инструкциям
производитепя по эксплуатации. При использовании бутыли, наполняйте
каждую лунку доверху, сжимая контейнер. Избегайте появления пузырьков.
Декантируйте и повторите еще два (2) раза.
8. Добавьте 0.100 mt (lOOpI) раствора субстрата во все лунки.
(см. раздел о подаотоаке реааемтот). Всегда добавляйте реагенты в одном и
том же порядке, чтобы минимизировать разницу времени реакции у различных
луиок.
9. Считайте RLU (относительные световые единицы) при помощи микропланшетного
пюминометра на 96 луиок (минимум 0 2 секунды на лунку) Измерение должно
проводиться в течение тридцати (30) минут после остановки реакции.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна проверять контроли в низком, среднем и высоком
диапазоне для мониторинга проведения теста. Значение этих контролей следует
определять во время каждой процедуры теста. Необходимо составлять фафики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходящих статистических методов. Значительное отклонение от обычных
показателей указывает на незамеченное изменение в условиях проведения теста
или на дефадацию реагентов в наборе. В этом случае используйте свежие реагенты,
чтобы определить причину отклонений.
РАСЧЕТ И РЕЗУЛЬТАТЫ
Для нахождения неизвестной концентрации пролактина в препаратах используется
кривая дозовой зависимости.
1. Запишите RLU (интенсивность сигнала люминесценции), указанную в распечатке
микропланшетного анализатора (Образец 1).
2. Постройте на миллиметровой бумаге график зависимости RLU каждого дупликата
калибраторов от концентрации пролактина в ng/ml (не усредняйте значения
калибраторов перед построением графика).
3. Проведите через точки на графике наиболее подходящую кривую.
4. Чтобы определить неизвестную концентрацию пролактина, отложите среднее RLU
каждого препарата на вертикальной оси фафика, найдите точку пересечения с
кривой и по горизонтальной оси графика определите концентрацию (в ng/ml) (можно
найти среднее для дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией).
Примечание 1: Для обработки данных можно использовать программное
обеспечение для иммунолюминометрических тестов, (найдите среднее для
дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией) (см. рис. 1).
Рис.1
Значения нролаггннв и ng/mt
* Данные на образце 1 и на рисунке 1 представлены только для демонстрации и не
должны использоваться вместо кривой доэовой зависимости, составляемой при
проведении каждого теста.
ПАРАМЕТРЫ QC (КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА)
Результаты анализа считают достоверными при соблюдении следующих
условий:
1. Интенсивность сигнала люминесценции (относительные световые единицы - RLU)
калибратора 100 ng/ml должна быть > 70,000.
2. Четыре из шести контрол ей должны находиться в установленном диапазоне.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
A. Проведение теста
1. Время реакции во всех лунках должно быть одинаковым, чтобы обеспечить
воспроизводимость результатов. Пипетирование проб не должно занимать более
десяти (10) минут во избежание смещения результатов теста.
2. При использовании более одного (1) планшета, рекомендуется повторять
построение кривой дозового ответа.
3. Недостаточное промывание лунок планшета при аспирации или декантации
может привести к получению искаженных результатов.
4. Используйте компоненты из одного набора. Не смешивайте реагенты из разных
наборов.
B. Интерпретация
При использовании компьютерной профаммы для интерпретации результатов теста,
требуется, чтобы прогнозируемые значения калибраторов оказывались в пределах
10% от соответствующих концентраций.
2. Очень высокое содержание пролактина в препарате может вызвать
саерхдозовый "хук''-эффект (парадоксально низкий показатель абсорбции). В таком
случае растворите препарат в О капибраторе в соотношении 1/100 и повторите тест
(умножьте результат на 100), Однако пробы с содержанием гормона до 3000ng/ml
показывают абсорбцию выше, чем абсорбция самого высокого калибратора.
3. Пациенты, получающие для диагностики или лечения препараты из мышиных
моноклональных антител, могут вырабатывать человеческие антимышиные антитела
(НАМА), что приводит к искажению результатов теста на пролактин.
4. Беременность, лактация и прием оральных контрацептивов могут приводить к
повышению концентрации пролактина.
5. Такие лекарства, как морфин, резерпин, и психотропные средства усиливают
секрецию пролактина (5,6,7).
в. Поскольку концентрация пролактина зависит от множества факторов помимо
гомеостаза гипофиза, результата данного теста недостаточно для оценки
клинического состояния пациента.
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Для определения ожидаемых результатов теста Prolactin CIA были
проанализированы препараты крови нормальных здоровых людей. Ожидаемые
значения (95% доверительный интервал) представлены в таблице 1.
ТАБЛИЦА I
Ожидаемые результаты теста CIA на пролактин
(в ng/ml)
Женщины
Взрослые (количество = 70) 1.2-19.5
После менопаузы (количество = 70) 1.5-18.5
Мужчины
Взрослые (количество = 50) 1.8 -17 0 .....
Помните, что нахождение диапазона нормальных значений для популяции зависит от
множества факторов: специфичности метода, тестируемой популяции и точности
метода, используемого лаборантом. Поэтому любая лаборатория должна
использовать указанный производителем диапазон только до тех пор, пока
выработает собственные пределы нормальных значений, основываясь на
результатах анализов людей, живущих там же, где расположена лаборатория.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
А. Сходимость
Внутри* и межаналитическая точность системы оценивалась при помощи анализов
на трех различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для каждой пробы
контрольной сыворотки приведены в таблицах 2 и 3.
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.изм. - цд/dl)
ПРОБА N X а C.V.
Уровень 1 24 10.6 0.35 3.3%
Уровень 2 24 28.6 0.84 1о%
Уровень 3 24 77.5 1.93 2.5%
ТАБЛИЦА 3
Межаналитическая сходимость (ед.изм. - мд/d!)
ПРОБА N X 0 C.V.
Уровень 1 10 11.5 0.19 1.7%
Уровень 2 10 27.8 0.50 1.8%
Уровень 3 10 78.5 2.32 3.0%
Жданные получены в 10 экспериментах с использованием дуб.
в. Точность
Было проведено сравнение Monobind Pmlactin Micfoplate CIA^ со стандартным
иммуноферментным тестом {Elfsa) с применением биологических препаратов
(нормальных и аномальных). Общее количество исследованных препаратов ~ 187.
Полученные данные представлены в таблице 4.
Таблица 4.
Регрессия
методом Коэффициент
Метод Среднее (х) наименьших корреляции
квадратов
Этот метод 19.0
Метод для У*1.в3+1.01(Х) 0.973
17.3
сравнения
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному методу
(CiA^ Prolactin) и стандартному методу. Метод наименьших квадратов и
коэффициент корреляции показывают отличную согласованность методов.
C. Чувствительность
Чувствительность теста на пролактин равна 0.04 ng, что эквивалентно пробе с
концентрацией 0.8 ng/ml.
D. Специфичность
Перекрестная реактивность антител пролактина на выбранные вещества
оценивалась путем добавления дополнительных веществ в матрицу сыворотки в
указанных ниже концентрациях. Для определения перекрестной чувствительности
рассчитывается отношение между дозой дополнительного вещества и дозой
пролактина с одинаковой абсорбцией.
Вещество Перекрестная реактивность Концентрация
-
Пролактин (PRL) 1.0000
Лютеинизирующий гормон (LH) < 0.0001 1000 ng/ml
Фоллитропин (FSH) < 0.0001 iobo пд/тГ ‘
Хорионический гонадотропин (CG) < 0,0001 1000 ng/ml
Тиротролин (TSH) < 0.0001 1000 ng/ml
Гормон роста < 0.0001 1000 ng/ml
MONOBIND, INC.
Costa Meta. CA 92627 (USA)
CaW 2625-300
T4 Новорожденных (Тироксин)
Chemiliimlnescence Assays
ХомипюминвсцФнтмыв тесты CIA
Hod то0арл: 2625’300
Назначение:
Количественное определение концентрации общего тироксина (Т4)
человека (новорожденного) в крови при помощи хемилюминесцентного
иммуноферментного теста.
ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ И ОПИСАНИЕ ТЕСТА
Выяшмжме гипотиреоза в первые дни после рО)цдвния признано Американской
ТироцдопогическоЙ Ассоциацией самым важным диатостичесхим тестом у
ноиорсщденныд Необходимость ранней диагностики и лечения привела к созданию
скрининговых центров упрйяленмйми здравоохранения федерации и штатов.
в нАчале 70-х годов ш Квебеке, Канаде была начата программа ранней проверки
новоро11ОД»«4ых на врождвишй гилотиумоэ Длй взятия проб использовали сухие
крови на фильтрованной бумаге. Вскоре профамму стали применять в других
медицинских унремэдениях Канады и США. К 1978 году на врожденный гипотиреоз
проеврипи около 1 миллиона ноеорожденных. и установили частоту эабопеаания как
примерно 1 к 7000
Вромэдвнный гипотиреоз служит, вероятно, единственной часто встречающейся
причиной предотвратимого отставания в умствен»юм развитии. Чтобы >ie допустить
тяжелого отставания в психическсм развитии, диагностику и ле^юние врожденного
гипотиреоза необходимо начать через 1-2 месяца после рождения ребенка
Данная методология мифопланшетного иммуноферментного анализа обеспечивает
оптимальную чувствительность при минимуме действий оператора. Сначала в лунку
вносят калибраторы сыворотки, препарат пациента и контроли, составленные и
высушенные в цельной крови. Добавляют буфер с инфедиентами, изолирующими 14
от белков крови. За ночь кровь с фильтрованной бумага растворяется в буфере. ТА
отделяется от протеинов сыворотки (крови) и связывается с антителом, которое
иммобилизовано на поверхности лунки. На следующий день избыток крови удаляют
при помощи промывания. Добавляют конъюгат Т4'ферментов. Происходит реакция
конкуренции между конъюгатом ферментов и нативным тироксином за офаниченное
количество антитело-комбинирующих участков, иммобилизованных на поверхности
лунки. После окончания указанного периода инкубации связанный антителами
конъюгат Т4 и ферментов отделяют от несвязанного конъюгата Т4-ферментов при
помощи аспирации или декантации. Добавляют субстрат для определения
активности ферментов на поверхности лунки.
Используя несколько известных различных контрольных показателей концентрации
тироксина, можно построить кривую дозовой зависимости и найти с ее помощью
неизвестную концентрацию 14.
ПРИНЦИП
Необходимые реагенты для иммуноферментного теста включают иммобилизованное
антитело, конъюгат антигена-ферментов и нативный антиген. После смешивания
иммобилизованного антитела и крови с нативным антигеном, происходит реакция
конкуренции между нативным антигеном за офаниченное количество нерастворимых
связывающих участков.
Взаимодействие описывается следующим уравнением;
К,
Ад + Abcw т:— AQAbcw
АЬс W ‘ монослецифичное иммобилизованное антитело (постоянное количество)
^9 - нативный антиген (любое количество)
АО^>с W ' комплекс антиген-антитело
- постоутиая скорость ассоциации
-а - постоянная скорость диссоциации
Непрореапг1ровавший нативный антиген отделяют при промыва
добавляют коньюгированный ферментами антиген. Конъюгат
антитела, свободными от нативного антигена.
'“ Ag+ Abcw, ^ ™AgAbow.
'-b
Enz A - конъюгат ферментов и антигенов (постоянно количество)
f\g
EnZAg ^ - комплекс конъюгата антигена-ферментов и антител
После короткого периода инкубации, фракцию связанных антител отделяют от
несвязанных антигенов при помощи декантации или аспирации. Активность
ферментов во фракции связанных антител обратно пропорциональна концентрации
нативного антигена. Используя несколько различных известных контрольных
показателей концентрации антигена, можно построить кривую дозовой зависимости и
найти с ее помощью неизвестную концентрацию антигена.
РЕАГЕНТЫ:
A. Калибраторы крови [Обозначения А - F]
Шесть (6) калибраторов для тироксина в различных концентрациях в цельной крови
на фильтрованной бумаге S&S {Cat# 903) в сумке на молнии с десиккантом.
Концентрации калибраторов указаны на этикетке на сумке. Хранить при температуре
2-8"С. Консервирующее вещество добавлено.
B. Контроли цельной крови - (I, И & 1И)
Три контроля для тироксина в различных концентрациях в цельной крови на
фильтрованной бумаге S&S (Cat# 903) в сумке на молнии с десиккантом. Диапазоны
контролей указаны на этикетке на сумке. Хранить при температуре 2-8"С.
Консервирующее вещество добавлено.
C. Буфер для элюции Neo-T4:
Одна пробирка (1), содержащая 13 т! буфера со связывающими белок
ингибиторами, сурфактантами и консервантами. Хранить при 2-8®С.
D. Растворитель моченого реагента Neo-T4:
Одна пробирка, содержащая 13 mi буфера, красного красителя, сурфактантов и
консервантов. Хранить при 2-8“С.
E. Меченый реагент T4-HRP - 1.5т1/пробирка - обозначение
Одна (1) пробирка конъюгата пероксидазы из хрена на альбуминно-стабилизованной
матрице. Хранить при температуре 2-8Х.
Консервирующее вещество добавлено.
F. Лунки для реакции с Т4- 96 лунок - Значок
Белый микропланшет с 96 лунками, покрытыми очищенным мышиным
аититироксииом IgG, упакованный в алюминиевую оболочку с осушающим
реагентом. Хранить при температуре 2‘ВХ.
G. Концентрат промывающего раствора - 20тI - значок ^
Одна (1) пробирка, содержащая сурфактант в забуференном растворе. Добавлен
консервант. Хранить при температуре 2~30'’С (см. Раздел по подготовке реагентов).
H. Сигнальный реагент А •> 7мл/лробирка - Обозначение
Одна (1) бутыль с люминалом в буфере. Хранить при температуре 2-8®С. (см. Раздел
по подготовке реагентов).
I. Сигнальный реагент В - 7мл/пробирка • Обозначение
Одна (1) бутыль, содержащая перекись водорода (НгОа) в буфере.
Хранить при температуре 2-в"С (см. Раздел по подготовке реагентов).
К. Вкладыш в упаковку.
Примечание 1; Не используйте реагенты, у которых истек срок годности.
Примечание 2; Открытые реагенты стабильны в течение 60 дней при температуре 2-
8“С.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ [НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ]:
1. Пипетка для раскапывания объема ЮОр! с точностью выше 1.5%.
2. Дисленсер(ы) для многократного распределения объемов 0.300ml с точностью
выше 1.5%.
3. Диспенсеры с регулируемым объемом (20-200мО и (200-1000р1) для растворов
конъюгата и субстрата.
4. Промывающее устройство для микропланшетов или пластиковая бутыль
(дополнительно).
5. Люминометр с фотоумножителем для считывания световых единиц.
6. Пробирки для растворения конъюгата ферментов и субстратов.
7. Абсорбирующая бумага для декантации лунок микропланшета.
В. Пластиковая оболочка или крышка микропланшета для проведения инкубации.
9. Вакуумный аспиратор (дополнительно) для промывания.
10. Таймер.
11. Материалы для контроля качества,
12. дырокол для пробивания отверстия 1/в дюйма
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Для диагностики in Vitro
He лрвдназначен для внутреннего или наружного употребление животными
или человеком.
Реагенты, содержащие сыворотку крови человека, тестировались на наличие
антител к ВИЧ 1 и 2, вирусу гепатита С, поверхностному антигену вируса гепатита В.
Были получены отрицательные результаты. Однако поскольку ни один тест не может
дать полной гарантии отсутствия инфекционных агентов, всю человеческую
сыворотху следует считать потенциально опасной и инфекционной и обращаться с
ней в соответствии с государственными нормами для биологически опасных веществ
2 группы. Подходящие лабораторные правила обращения с препаратами крови
можно найти в "Biosafety In Microbiological and Biomedical Laboratories,” 2-я редакция,
1988, HHS
СБОР И ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
Для взятия пробы прокалывают пятку новорожденного и берут достаточно крови,
чтобы заполнить отмеченный круг на фильтрованной бумаге S&S (Cat# 903). Бумага
должна высохнуть за ночь при комнатной температуре в прохладном сухом месте.
После этого препарат помещают в пластиковую влагонепроницаемую сумку с
десиккантом и отправляют в лабораторию. Кровь нужно брать через 3-7 дней после
рождения, следует указать возраст, вес новорожденного, сообщить о многоплодных
или преждевременных родах. Эта информация необходима врачу для правильной
оценки состояния щитовидной железы ребенка.
Высушенные препараты крови можно хранить при 2-в''С в течение 2-3 недель в
пластиковой сумке на молнии с десикантами.
ПОДГОТОВКА И ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ;
1. Рабочий раствор конъюгата фермвитов-Т4
Растворите меченый реагент Т4 в разбавителе реагента 1:11 в подходящем чистом
контейнере. Например, растворите 160р1 конъюгата в 1.6ml буфера для 16 лунок
{получится небольшой избыток раствора).
Данный реагент надо использовать в течение 24 часов с момента приготовления.
Общая формула:
Требуемый объем буфера * количество лунок ♦ 0.1
Количество необходимого меченого реагента Т4 = количество лунок * 0.01
например * 16 х 0.1 = 1.6ml для буфера T4-HRP
1в X 0.01» 0.1бт1 (leOpI) для меченого реагента Т4
2. Промывной Буфер
Растворите концентрат промывающего раствора в подходящем контейнере в
дистиллированной или деионизированной воде, так чтобы его объем составлял 1000
мл. Храните при комнатной температуре (гО-г/^’С) в течение 60 дней.
3. Рабочий раствор индикаторного реагента - готовить ежедневно
Смешайте равные объемы раствора ‘А’ и раствора 'В' в чистом контейнере.
Используйте в течение 60 минут после этого. Например, добавьте 1 мл А и 1 мл В в
два стрипа с восьмью лунками (получится небольшой избыток раствора. Выбросьте
неиспользованную долю раствора).
ПРОЦЕДУРА ТЕСТА
Перед проведением теста, доведите все реагенты, контроли и калибраторы
сыворотки до комнатной температуры (20 - 27“ С).
1. Подготовьте лунки микропланшета для калибраторов, контрольных проб и
препаратов пациента в дубликатах.
Поместите неиспользованные микрострипы обратно в алюминиевую упаковку,
закройте ев и храните при температуре 2-8°С.
2. Внесите 1/8 дюйма пятна крови калибраторов, контрольных проб и препаратов в
соответствующие лунки. {Примечание: не прокалывайте дырки около края
пятна крови или там, где есть напечатанные линии).
3. Добавьте 0.100 ml (lOOpI) буфера для элюции во все лунки.
4. Осторожно поворачивайте планшет в течение 20-30 секунд, чтобы реагенты
перемешались. Закройте планшет пластиковой пленкой. (Примечание:
убедитесь,что все элементы с кровью полностью погружены в жидкость, а не
прилипли к стенкам лунки.)
5. Инкубируйте ночь (16-20 часов) при комнатной температуре.
6. Удалите содержимое лунок микропланшета при помощи декантации или
аспирации. При декантации тщательно удалите остатки жидкости из лунок при
использовании абсорбирующей бумаги.
7. Добавьте 300р1 промывающего раствора (см. раздел о подготовке реагентов),
декантруйте или аспирируйте. Повторите еще два (2) раза (общее число
промываний - три (3)). Можно использовать автоматическое или ручное
устройство для промывания планшетов. В таком случае следуйте инструкциям
производителя по эксплуатации. При использовании бутыли, наполняйте
каждую лунку доверху, сжимая контейнер. Избегайте появления пузырьков.
Декантируйте и повторите еще два (2) раза. Примечание: В лунках не должно
остаться точек бумаги с кровью.
8. Добавьте 0.100 ml (lOOpI) раствора меченого реагента 14 во все лунки^
(си. раздел о подготовке рвагвнтов N91).
9. Осторожно поворачивайте планшет в течение 20-30 секунд, АтоО^реагенты
перемешались. Закройте планшет и инкубируйте 60 минут |прц^
температуре. о
10. Повторите пункты 6 и 7.
11. Добавьте 0.100 ml (ЮОр!) раствора сигнального реагента во все лунки, (см.
раздел о подготовке реагентов №1).
12. Инкубируйте при комнатной температуре 5 минут в темноте.
13. Считайте RLU (относительные световые единицы) (0.2-1.0 секунды на лунку).
Измерение должно проводиться в течение тридцати (30) минут после
остановки реакции.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для нахождения неизвестной концентрации тироксина в препаратах используется
кривая доэовой зависимости.
1. Запишите RLU (интенсивность сигнала люминесценции), указанную в распечатке
микропланшетного анализатора (Образец 1).
2. Постройте на миллиметровой бумаге график зависимости RLU каадого дупликата
калибраторов от концентрации Т4 в pl/dl.
3. Проведите через точки на фафике наиболее подходящую кривую
4. Чтобы определить неизвестную концентрацию Т4, отложите среднее RLU каждого
препарата на вертикальной оси графика, найдите точку пересечения с кривой и по
горизонтальной оси фафика определите концентрацию (в pl/dl) (можно найти
среднее для дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией). В приведенном
ниже примере, среднее RLU (47432) пересекает калибровочную кривую при
концентрации Т4 7.0 pl/dl. (См. рисунок 1).
Примечание 1; Для обработки данных можно использовать программное
обеспечение дляи ммунолюминометрических тестов, (найдите
среднее для дубликатов препаратов с неизвестной
концентрацией) (см. рис. 1).
Примечание 2; Monobind может оказать помощь в покупке и установке
оборудования/профамм для расчета и интерпретации
результатов иммунолюминометрического теста.
ОБРАЗЕЦ \
f
Рис. 1
:^начс|{кя Т4 в цд/dt
* Данные на образце 1 и на рисунке 1 представлены только для демонстрации и не
должны использоваться вместо кривой дозовой зависимости, составляемой при
проведении каждого теста. Кроме того, RLU калибраторов нормапизованы до
^100,000 RLU для калибратора 'А' (самый интенсивный сигнал). Такое
преобразование ликвидирует разницу в способности различных приборов
определять интенсивность света.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна проверять контроли в низком, среднем и высоком
диапазоне для мониторинга проведения теста. Центры по контролю заболеваемости
имеют отличные программы для мониторинга тестов щитовидной железы
новорожденных.
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
На основе результатов проведенных тестов Monobind Inc. и литературных
источников, составлен нормальный диапазон значений 8-23 pg/dl.
Помните, что нахо)кдение диапазона нормальных значений для популяции зависит от
множества факторов: специфичности метода, тестируемой популяции и точности
метода, используемого лаборантом. Поэтому любая лаборатория должна
использовать указанный производителем диапазон только до тех пор, пока
выработает собственные пределы нормальных значений, основываясь на
результатах анализов людей, живущих там же, где расположена лаборатория.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
А. Сходимость
Внутри- и межаналитическая точность системы оценивалась при помощи анализов
на трех различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для ка>кдой пробы
контрольной сыворотки приведены в таблицах 2 и 3.
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.иэм. - цд/dl)
ПРОБА N X (Т C.V.
низкий 20 3.43 0.28 8.2%
средний 20 7.81 0.68 8.7%
высокий 20 14.11 1.06 7.5%
ТАБЛИЦА 3
Межаналитическая сходимость (ед.иэм. - цд/dl)
ПРОБА N X v C.V.
НИЗКИЙ 10 3.16 0.22 6.9%
средний 10 8.11 0.73 9.1%
высокий 10 13.61 1.33 9.7%
Жданные получены в течение 10 дней в 10 экспериментах с использованием
дубликатов.
В. Точность
Было проведено сравнение Monobind NNT4 CIA™ с автоматическим
флюоресцентным методом путем анализа препаратов с нормальной, гипо и
гиперфункцией щитовидной железы (диапазон значений от 0.5 ng/dl до 46 цд/dl).
Общее количество исследованных препаратов - 376. Уравнение регрессии методом
наименьших квадратов и коэффициент корреляции были рассчитаны для тироксина
CIA по сравнению с обычным методом. Полученные данные представлены в
таблице 4.
Таблица 4.
Регрессия
методом
Метод Среднее (х)
наименьших
квадратов
3r0TjyieT0A 15.63
Метод для у°0.604-»-0.941(х)
15.96
сравнения
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному методу
(Т4 CIA™) и стандартному методу. Метод наименьших квадратов и коэффициент
корреляции показывают отличную согласованность методов.
C. Чувствительность
Чувствительность теста на тироксин равна 0.5 М9^^1.
Чувствительность (предел обнаружения) оценивается при определении
вариабельности калибратора сыворотки с концентрацией О pg/dl при использовании
статист11ки 2о (95% точности) для расчета минимальной дозы.
D. Специфичность
Перекрестная реактивность антител тироксина на выбранные вещества оценивалась
путем добавления дополнительных веществ в матрицу сыворотки в указанных ниже
концентрациях. Для определения перекрестной чувствительности рассчитывается
отношение между дозой дополнительного вещества и дозой тироксина, необходимых
для вытеснения одного и того же объема конъюгата.
Вещество Перекрестная Концентрация
реактивность
1-Тироксин 1.0000
d-Тироксин 0.9800 10 цдШ
d-Трийодтиронин 0.0150 100 ijg/ml
1-Трийодтиронин 0.0300 100 цд/т1
Иодотирозин 0.0001 100 цд/mt
Дийодотирозин _______ 0.000 Г 100 [ig/ml
Ди"йодЪтиронин ____ 0.0001 ___ ___100 цд/ml
Т BG (тироксинсвяэывающий Не определяется 40 Mfl/ml
глобулин)
Альбумин ______ Не определяется 40 цд/ml
Фенилбутазон Не определяется 10 tig/тГ
Фенитоин Не определяется 40ji^ml__
Свлицилаты Не определяется 500 цд/ml
СПИСОК СПРАВОЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Harrison 'Internal Medicine* Mosby Printing Philadelphia 12*^ Ed.
2. Dussault JH, Coloumbe C, Laberge C, Latarte J, Guyde H and Khoury K,
'‘Preliminary report on Mass Screening Prograrn for neonatal Hypothyroidism", J
Pediatr, 86; 670-25674 (1975).
3. Dussault, JH, & Laberge, C, “Thyroxine (T4) detemiination in dried blood by
radioimmunoassay: A screening Method for Neonatal Hypothyroidism" Union Med.
Con, 102, 2062-2064 (1973).
4. Fisher, D.A., Neonatal Thyroid ScrBening, Pediatric Clinics of North America, 25,
423-430(1978).
5. Klein. A... and TP. Foley. (1974). Lancet 2:77.
6. Biosafety in Biomedical and Microbiological laboratories, 4thed, U.S. Departmeftt of
Heaith and Human Services, HHS Publication No (CDC) 93-8395, Washington DC.
USA (1999).
7. Young, DS, Pestaner, L.C, and GIbberman V, Clin C/iem, 21;5((1975).
Редакция: 3. Date: 06.24.04
Cat# 2875-300.
MonobInd Inc.
729 West 16th Street
Costa Mesa. CA 92627
Tel: 949-642-4830
Fax: 949*650-8459
Email: info@monobind.com
Вебсайт: www.monobind.com
Пожалуйста, посетите наш вебсайт, чтобы узнать больше о предоставляемых
нами товарах и услугах.
Прим«ч«н1м 1: Не ислопьэуйте реагенты, у которых истек срок годности.
ГТрмммчание 2: Открытые реагенты стабильны в течение вО дней при температуре
г-в^с.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Цпц диалноетини In Vitro
Нш прфднёзн»ч9м для онутрмнмо цли наружново употрвблвниа жиеотныии
или Ч0ЛО09НОМ.
Реагенты, содержащие сыворотку крови человека, тестировались на наличие
антител к ВИЧ 1 и 2, вирусу гепатита С, поввржностному антигену вируса гепатита В.
Были получены отрицательные результаты Однако поскольку ни один тест не может
дать полной гарантии отсутствия инфекционных агентов, всю человеческую
сыноротку следует считать потем^иапьно опасной и инфекционной и обращаться с
ней а соответствии с государственными нормами для биологически опасных веществ
2 группы Подходящие лабораторные правила обращения с препаратами крови
можно найти в "в1е»а(е(у in Microbiological and Biomedicat Laboratories,** 2-я редакция,
1&88, HHS
СБОР И ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
Забор крови иэ В€жы руки следует производить согласно стандартной процедуре, с
соблюдением соотаетствукэщих мер предосторожности. Чтобы обеспечить
аоммшность сравнения с контрольными значениями, нужно (юбьфать сыворотку у
п«1«йента утром натощак Для сбора крови используются простые пробирки с красной
крышкой без геля или добавок Дайте крови свернуться Центрифугируйте препарат,
чггобы отделить сыаоротку от клеток.
Для анализа можно использовать как свежепопученные образцы сыворотки крови,
так и образцы, хранившиеся при температуре от 2 до 8”С не более пяти (5) дней ипи
при температуре минус 20*С не более 30 д»«й. Не допускается повторное
замораживаниеразморажиеание, привод miiee к искажению результатов При
теспфоеании с дубликатами требуетаи 0.100 мл препарата.
«АТЕРИАПЫ;
Пскгтавл немые:
t. Шбсп» пробирок с калибраторами сыворотки LH / FSH
2. Две пробирки (2) с б«отнилированиым монопклональным антителом и реагентом,
меченным ферментами (Один дпя LH и один Г8Н)
3 Один (t) микроплатшат с 9в-ю лунками, покрытыми стрептааидином
4 Одна (1) пробирка с кон1№нтрагом буфера для промыаки.
5 Одна 0) г^юбирка субстрата.
6- Одна О) бутыль стоп-реагента
7 Имструкфт
Дополнительны* материалы [не поставляемые]:
1. Пипетка для раскапывания объема 50р1 и 100 р1 с точностью выше 1.5%.
2. Дисленсер(ы) для многократного распределения объемов 0.300ml с точностью
выше 1.5%
3 Промывающее устройство для микропланшетов или пластиковая бутыль
(дополнительно).
4. Считыватель микропланшетов для определения абсорбции на длинах волн 450 и
620 лт (фильтр 620 nnrt не обязателен).
5. Абсорбирующая бумага для декантации лунок микропланшета
6. Пластиковая оболочка или крышка микропланшета для проведения инкубации.
7. Вакуумный аспиратор (дополнительно) для промывания.
В. Таймер.
9. Материалы для контроля качества.
10.Контейнер для хранения буфера для промывания.
11. Дистиллированная или деионизированная вода.
ПОДГОТОВКА И ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ:
1. Промывной Буфер
Растворите концентрат пр(шывающего раствора в подходящем контейнере в
дистиллированнс^ или деионизированной воде, так чтобы его объем составлял 1000
мл. Храните при комнатной температуре до даты истечения, указанной на этикетке
Все компоненты буфера должны раствориться. Для удаления кристаллов
достаточно нагревания в течение 5 минут в водной бане при температуре 37Х
или хранения концентрата раствора при комнатной температуре.
ПРОЦЕДУРА ТЕСТА
Перед проведением теста, доведите все реааемты, коитроли и калибраторы
сыворотки до комнатной температуры (20 -27' С)
1 Подготовьте лунки микролланшета для калибраторов, контрольных проб и
препаратов пациента в дубликатах
Поместите неиспользованные микрострипы обратно в алюминиевую упаковку,
закройте ее и храните при температуре 2>8*С.
2 В^юсите 0 050 ml (50р1) калибраторов, контрольных проб и препаратов в
соответствующие пунки
3. Добавьте 2 капли биотинилированжэ1х меченых ферментами антител [LN (желтых)
для определения LH или FSH (фиолетовых] для определений FSH].
реагенты в центр лунки - h
4 Осторожно поворачивайте планшет в течение 20-30 секуш.'.лчт
перемешались. Закройте планшет ппастиковой пленкой 3
5. Инкубируйте в течение 60 минут при комнатной температуре.
6. Удалите содержимое лунок микропланшета при помощи декантирования или
аспирации. При декантировании тщательно удалите остатки жидкости из лунок при
использовании абсорбирующей бумаги,
7. Добавьте ЗООр! промывающего раствора (см. раздел о подготовке реагентов),
декантируйте или аспирируйте. Повторите еще два (2) раза (общее число
промываний - три (3)). Можно использовать автоматическое или ручное
устройство для промывания планшетов. В таком случае следуйте инструкциям
производителя по эксплуатации. При использовании бутыли, наполняйте
каждую лунку доверху, сжимая контейнер. Избегайте появления пузырьков.
Декантируйте и повторите еще два (2) раза.
8- Добавьте во все лунки три (3) капли раствора субстрата. Вносите все реагенты в
центр лунки. Всегда добавляйте реагенты в одном и том же порядке, чтобы
минимизировать разницу времени реакции у различных лунок.
9. Инкубируйте при комнатной температуре в течение пятнадцати (15) минут.
10. Добавьте в каждую лунку одну (1) каплю стоп-реагента и перемешайте реагенты
так, чтобы они все окрасились в ровный желтый цвет. Вносите все реагенты в
центр лунки. Всегда добавляйте реагенты в одном и том же порядке, чтобы
минимизировать разницу времени реакции у различных лунок.
11. Считайте абсорбцию в каждой лунке при 405пт (используя результат при длине
волны 620'630nm для поправки на несовершенство лунок). Измерение должно
проводиться в течение тридцати (30) минут после добавление конечного
реагента.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна проверять контроли в низком, среднем и высоком
диапазоне для мониторинга проведения теста. Значение этих коитролей следует
определять во время каждой процедуры теста. Необходимо составлять графики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходящих статистических методов. Кривая дозового ответа (пересечения
в 80%; 50% и 20%) должна находиться в установленных пределах. Максимальная
абсорбция должна соответствовать полученной при предыдущих тестах.
Значительное отклонение от обычных показателей указывает на незамеченное
изменение в условиях проведения теста или на деградацию реагентов в наборе. В
этом случае используйте свежие реагенты, чтобы определить причину отклонений.
РАСЧЕТ И РЕЗУЛЬТАТЫ
Для нахождения неизвестной концентрации LH или FSH в препаратах используется
кривая дозовой зависимости.
1. Запишите абсорбцию, указанную в распечатке микропланшетного анализатора
(Образец 1).
2. Постройте на миллиметровой бумаге фвфик зависимости абсорбции каждого
дупликата калибраторов от концентрации LH или FSH в mlU/ml (не усредняйте
значения калибраторов перед построением фафика).
3. Проведите через точки на графике наиболее подходящую кривую.
4. Чтобы определить неизвестную концентрацию LH или FSH, отложите среднюю
абсорбцию каждого препарата на вертикальной оси графика, найдите точку
пересечения с кривой и по горизонтальной оси графика определите концентрацию (в
mUJ/ml) (можно найти среднее для дубликатов препаратов с неизвестной
концентрацией). В приведенном ниже примере, средняя абсорбция (0.578)
пересекает калибровочную кривую при концентрации LH 43 mlU/ml (См. рисунок 1), и
средняя абсорбция (1.186) пересекает калибровочную кривую при концентрации FSH
42.2 mlU/ml (См. рисунок 2). Для обработки данных можно использовать программное
обеспечение для тестов ELISA.
ОВРАЗЕЦ 1
CALIBRATORS LH FSH
WELL (In mlU/ml) ABS. ABS.
1 OLH/OFSH 0.012 0.018
2 0 LH / 0 FSH 0.012 0.019
3 5LH/5FSH 0.065 0.171
4 5LH/5FSH 0.070 0.165
5 25 LHMOFSH 0.322 0.296
6 25LH/10FSH 0.350 0.288
7 50LH/25 FSH 0.(387 0.745
8 50 LH / 25 FSH 0.710 0.703
9 100 LH/50 FSH 1.325 1424
10 100 LH / 60 FSH 1.351 1.365
11 200 LH/100 FSH 2.495 2459
12 200 LH/100 FSH 2.403 2.406
Unknown Avg.
Well I. D. O.D. O.D. Value
13 Utik#1 0.575(1.206) 43mlU/mlLH
14 Unk#1 0.580(1.165) 0.578(1.186) (42 2IU/ml FSH)
Рис. I
uiemiu/mi
Рис2
Зпачсикя FSH » miU/ml
Данные на образце 1 и на рисунках 1, 2 представлены только для демонстрации и
не должны использоваться вместо кривой доаовой зависимости, составляемой при
Проведении каждого теста.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
A. Проведение теста
1. Время реакции во всех лунках должно быть одинаковым, чтобы обеспечить
воспроизводимость результатов.
2. Пипетирование проб не должно занимать более десяти (10) минут во избежание
смещения результатов теста.
3. При использовании более одного (1) планшета, рекомендуется повторять
построение кривой дозового ответа.
4. Недостаточное промывание лунок планшета при аспирации или декантации
может привести к получению искаженных результатов.
5. Используйте компоненты из одного набора. Не смешивайте реагенты из разных
наборов.
6. Добавление раствора субстрата вызывает кинетическую реакцию, которая
прекращается после добавления конечного реагента. Поэтому добавлять субстрат и
конечный реагент нужно в одинаковом порядке, чтоб минимизировать разницы во
времени реакции.
7. Измерение проводится вертикально. Не прикасайтесь ко дну лунок.
Если капли вытекают из пробирки без надавливания (когда вы переворачиваете ее),
переверните пробирку обратно и сожмите, чтобы снизить внутреннее давление. Не
рекомендуется трясти и смешивать содержимое пробирок перед использованием,
так как это создает внутреннее давление.
B. Интерпретация
1. При использовании компьютерной программы для интерпретации результатов
теста, требуется, чтобы прогнозируемые значения калибраторов оказывались в
пределах 10% от соответствующих концентраций.
2. LH/FSH подавляются эстрогеном, но у женщин, принимающих оральные
контрацептивы, концентрация может быть низкой или нормальной. Голодание и
потеря веса приводят к снижению концентрации гонадотропина.
3. Уровень лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов зависит от
множества различных факторов, помимо гомеостаза гипофиза. Поэтому только
результата данного теста для оценки клинического состояния недостаточно.
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Для определения ожидаемых результатов теста LH/FSH ELISA были
проанализированы препараты крови нормальных здоровых людей.
ТАБЛИЦА I
Ожидаемые результаты теста LH/FSH ELISA
(в mlU/ml)
Женщины LI1 FSI1
Фолликулярная фаза 0.5-10.5 3.0-12.0
Середина цикла 18.4-61.2 8.0-22,0
Лютей новая фаза 0,5-10.5 2,0-12,0
После менопаузы 8,2-40,8 35,0-151.0
Мужчины 0.7-7.4 1.0-14.0
Помните, что нахождение диапазона нормальных значений для популяции зависит от
множества факторов; специфичности метода, тестируемой популяции и точности
метода, используемого лаборантом. Поэтому любая лаборатория должна
использовать указанный производителем диапазон только до тех пор, пока
выработает собственные пределы нормальных значений, основываясь на
результатах анализов людей, живущих там же, где расположена лаборатория.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
А. Сходимость
Внутри- и межаналитическая точность системы оценивалась при помощи анализов
на трех различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для каждой пробы
контрольной сыворотки приведены в таблицах 2 и 3.
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.изм. - mlU/ml)
ПРОБА N LH X (FSH X) hUv^VSllo) LH C.V. (FSH C.V.)
Уровень 1 20' 2.8 (5.9) 0.15(0.25) 5.4% (4.3%)
Уровень 2 20 15.2(16.0) 0.65 (0,68) 4.2% (4.3%)
Уровень 3 20 48,5(41.3) 2.35 (1.18) 2.3% (2.9%)
ТАБЛИЦА 3
Межаналитическая сходимость (ед.изм. mlU/ml)
ПРОБА_____ N LH X (FSH X) LIl(f(FSIIe) LH C.V. (FSH C.V.)
Уровень j___ 10 3.1 (5.9) 0.17(0.41) 5.5% (6.9%)
Уровень 2 10 15!4(16:0) 6.81(0.48) 5.3% (3.0%)
Уровень^ 10 43.4 (40.9) 1.52(1.48J l3.5% (3.6%)
•данные получены в 10 экспериментах с использованием дубликатов.
в.Точность
Было проведено сравнение Monobind LH ELISA со стандартным радиоиммуным
тестом с применением биологических препаратов (с низкой, нормальной и высокой
концентрацией). Общее количество исследованных препаратов - 110. Полученные
данные представлены в таблице 4.
Таблица 4.
Регрессия
методом Коэффициент
Метод Среднее (X)
корреляции
квадратов
Этот метод 14.8
Метод дпя у»0.081 * 0.93 (X) 0.989
16.1
сравнения
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному методу
(LH ELISA) и стандартному методу. Метод наименьших квадратов и коэффициент
корреляции показывают отличную согласованность методов.
Было проведено сравнение МопоЬЫ FSH Mlcroplate С1А^ со стандартным
радиоиммуным тестом с применением биологических препаратов (с низкой и
высокой концентрацией) (диапазон значений от 0.1mlU/ml до133т1Шт1). Пробы с
концентрацией выше последнего калибратора растворяли в О калибраторе и
измеряли повторно. Общее количество исследованных препаратов - 126.
Полученные данные представлены в таблице 4.
Таблица 4.
Регрессия
методом Коэффициент
Метод Среднее (х)
наименьших корреляции
квадратов
Этот метод 18.0
Метод для у»0.93(х)-1.8 0.994
21.0
сравнения
С. Чувствительность
Чувствительность теста на лютеинизирующий гормон равна 0.02 mlU, что
эквивалентно пробе с концентрацией 0.8 mlU/ml. Чувствительность теста на
фолликулостимулирующий гормон равна 0.02 mlU, что эквивалентно пробе с
концентрацией 0.8 m!U/ml. Чувствительность (предел обнаружения) оценивается при
определении вариабельности калибратора сыворотки с концентрацией О ng/ml при
испопьзовании статистики 2о (95% точности) для расчета минимальной дозы.
D. Специфичность
Перекрестная реактивность антител LH на выбранные вещества оценивалась путем
добавления дополнительных веществ в матрицу сыворотки в указанных ниже
концентрациях. Для определения перекрестной чувствительности рассчитывается
отношение между дозой дополнительного вещества и дозой LH, необходимых для
создания равной абсорбции.
Вещество Перекрестная Концентрация
реактивность
Лутропин (hLH) 1.0000 -
Тиротропин (hTSH) < 0.0001 1000 ng/ml
Фоллитропин (hFSH) < 0.0001 1000 ng/ml
Хорионический гонадотропин < 0.0001 1000 ng/ml
Субъединица П-LH < 0.0001 1000 ng/ml
Перекрестная реактивность антител FSH на выбранные вещества оценивалась
путем добавления дополнительных веществ в матрицу сыворотки в указанных ниже
концентрациях. Для определения перекрестной чувствительности рассчитывается
отношение между дозой дополнительного вещества и дозой FSH с равной
абсорбцией.
Вещество Перекрестная Концентрация
jpeain-ивность
Фоллитропин (hFSH) I'.booo " -
ТироТропин (hTSH)' < 0.0001 1000 ng/ml
Лутропин (hLH) < 0.0001 1000 ng/ml
Хорионический гонадотропин < o.oodi 1000 ng/ml
Низкая перекрестная реактивность антител позволяет использовать
комбинированные калибраторы благодаря нулевой перекрестной реакции.
СПИСОК СПРАВОЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Kosasa T.S., J of Reproductive Medicine, 26,201 (1981).
2. Оапгвг И., Braunstein G.D., et al.FertHity and Sterility 34 (1980) pg. 336-40.
3. Braunstein G.D., et at., , American Journal of Obstetrics and Gynecology. 126
(1976) pg. 678-81.
4. Goldstein D.P., & Kosasa T.S.,Gyneco/ogy,6.145 (1975).
5. BaU:er F. Fertility and Sterility, 34 (1980) pfl. 1-12.
e. Braunstein, G.D., et a!.„ American Jourrial of Obs/eWcs andG ynecology, 131
(1978) pg. 25>32.
7. Lenten E., Neal L. and Sulalman R„ FerlHity and Sterility. 37 (1982) pg. 773-78.
8. Odell, W.D., Pariow, A.F.. et al, Jc/ш Invest. 47, 2551 (1981).
9. Saxema, B.B.. Demura. H.M.. et al, J Clin Endocrinol Metab, 28, 591 (1968).
а - постоянная скорость ассоциации
•а - постоянная скорость диссоциации
К = kg / К g - равновесная постоянная
После достижения равновесия, фракцию связанных антител отделяют от
несвязанных антигенов при помощи декантации или аспирации. Активность
ферментов во фракции связанных антител обратно пропорциональна концентрации
нативного антигена. Используя несколько различных известных контрольных
показателей концентрации антигена, можно построить кривую дозовой зависимости и
найти с ее помощью неизвестную концентрацию антигена.
РЕАГЕНТЫ:
А. Калибраторы человеческой сыворотки (1.0 т1/лробирка) [Обозначения А - F]
Шесть (6) пробирок для сравнения со значением свободного трийодтиронина для
концентрации 0(A), 0.4(B), 1.1(C), 2.2(D), 4.1(E), и 8.0 (F) ng/dl. Хранить при
температуре 2-8”С.
Консервирующее вещество добавлено.
Для перевода в единицы СИ: 1 ng/dl х 12.9 = pmol/L
В. Конъюгат фврментов-Т4—13 ml/пробирка
Одна (1) пробирка конъюгата пероксидазы из хрена на бычьей альбуминно-
стабилизованной матрице. Хранить при температуре 2-8°С.
Консервирующее вещество добавлено.
C. Лунки с антителами - 96 лунок - Значок
Белый микропланшет с 96 лунками, покрытыми овечьей антисывороткой и
упакованные в алюминиевую оболочку с осушающим реагентом. Хранить при
температуре 2-В°С.
D. Концентрат промывающего раствора ~ 20т1 - значок ^
Одна (1) пробирка, содержащая сурфактант в забуференном растворе. Добавлен
консервант. Хранить при температуре 2-30“С (см. Раздел по подготовке реагентов).
E. Субстрат А - 7мл/про6ирка - Обозначение
Одна (1) бутыль с точно откалиброванным содержанием тетраметилбензидина
(ТМВ) в буфере. Хранить при г-ВХ.
F. Субстрат В - 7мл/пробирка - Обозначение
Одна (1) бутыль, содержащая перекись водорода (Н2О2) в буфере.
Хранить при температуре 2-8"С (см. Раздел по подготовке реагентов).
О
Н. Стоп-реагент - В.ОтИпробирка - Обозначение
Одна (1) пробирка, пробирка с точно откалиброванным содержанием сильной
кислоты (1N HCI). Хранить при 2-30“С.
и.Вкладыш в упаковку.
Примечание 1: Не используйте реагенты, у которых истек срок годности.
Примечание 2: Открытые реагенты стабильны в течение 60 дней при температуре
2-8Х.
Примечание 3: Реагенты предназначены для использования вместе с планшетом с
96-ю лунками.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ [НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ]:
1. Пипетка для раскапывания объема 50р1 с точностью выше 1.5%.
2. Диспенсер(ы) для многократного распределения объемов в 0.100ml и 0,300т! с
точностью выше 1.5%.
3. Промывающее устройство для микропланшетов или пластиковая бутыль
(дополнительно).
4. Считыватель микропланшетов для определения абсорбции на длинах воли 450 И
620 пт (фильтр 620 пт не обязателен).
5. Абсорбирующая бумага для декантации лунок микропланшета.
6. Пластиковая оболочка или крышка микропланшета для проведения инкубации.
7. Вакуумный аспиратор (дополнительно) для промывания.
8. Таймер.
9. Материалы для контроля качества.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Дпя диагностики In Vf&o ,
Нв предназначен для енутреннеяо или наружноео употребление животными
или человеком.
Реагенты, содержащие сыворотку крови человека, тестировались на наличие
антител к ВИЧ 1 и 2, вирусу гепатита С, поверхностному антигену вируса гепатита В.
Были получены отрицательные результаты. Однако поскольку ни один тест не может
дать полной гарантии отсутствия инфекционных агентов, всю человеческую
сыворотку следует считать потенциально опасной и инфекционной и обращаться с
ней в соответствии с государственными нормами для биологически опасных веществ
2 группы. Подходящие лабораторные правила обращения с препаратами крови
можно найти в "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,” 2-я редакция,
1988, HNS
СБОР И ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
Забор крови из вены руки следует производить согласно стандартной процедуре, с
соблюдением соответствующих мер предосторожности. Чтобы обеспечить
возможность сравнения с контрольными значениями, нужно собирать сыворотку у
пациента утром натощак. Для сбора крови используются простыв пробирки с красной
крышкой без геля или добавок.
Дайте крови свернуться. Центрифугируйте препарат, чтобы отделить сыворотку от
клеток.
Для анализа можно использовать как свежеполученные образцы сыворотки крови,
так и образцы, хранившиеся при температуре от 2 до 8°С не более 48 часов или при
температуре минус 20°С не более 30 дней. Не допускается повторное
замораживание-размораживание, приводящее к искажению результатов. Перед
тестом подождите, пока реагенты не нагреются до комнатной температуры (20-27С)
При тестировании с дубликатами требуется 0.10 мл препарата.
ПОДГОТОВКА И ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ:
1. Промывной Буфер
Растворите концентрат промывающего раствора в подходящем контейнере в
дистиллированной или деионизированной воде, так чтобы его объем составлял 1000
мл. Храните при комнатной температуре (20-27°С) в течение 60 дней.
2. Рабочий раствор субстрата
Перелейте содержимое пробирки 'А' в пробирку ‘В‘. Смешайте и храните при
температуре 2-8“С. Используйте в течение 60 дней.
Определите необходимое количество реагента и подготовьте его, смешав равные
порции субстрата А и субстрата В в подходящем контейнере. Например, добавьте 1
мл А и 1 мл В в два стрипа с восьмью лунками (получится небольшой избыток
раствора, выбросьте неиспользованную долю раствора).
Примечание; не используйте раствор, если он стал синим.
ПРОЦЕДУРА ТЕСТА
Пород проведением теста, доведите все реавенты, контроли и калибраторы
сыворотки до комнатной температуры (20 - 27* С).
1. Подготовьте лунки микропланшета для калибраторов, контрольных проб и
препаратов пациента в дубликатах.
Поместите неиспользованные микрострипы обратно в алюминиевую упаковку,
закройте ее и храните при температуре 2’Ъ'*С.
2. Внесите 0.050 ml (50р1) калибраторов, контрольных проб и препаратов в
соответствующие лунки.
3. Добавьте 0.100 ml (100р1) конъюгата ГГЗ-ферментов в каждую лунку.
4. Осторожно поворачивайте планшет в течение 20-30 секунд, чтобы реагенты
перемешались. Закройте планшет пластиковой пленкой.
5. Инкубируйте в течение 60 минут при комнатной температуре.
6. Удалите содержимое лунок микропланшета при помощи декантирования или
аспирации. При декантировании тщательно удалите остатки жидкости из лунок при
использовании абсорбирующей бумаги.
7. Добавьте 300р1 промывающего раствора (см. раздел о подготовке реагентов),
декантируйте или аспирируйте. Повторите еще два (2) раза (общее число
промываний - три (3)}. Можно использовать автоматическое или ручное
устройство для промывания планшетов. В таком случае следуйте инструкциям
производителя по эксплуатации. При использовании бутыли, наполняйте
каждую лунку доверху, сжимая контейнер. Избегайте появления пузырьков.
Декантируйте и повторите еще два (2) раза.
8. Добавьте 0.100 ml (100^1) раствора субстрата во все лунки.
(СМ. раздел о подготовке реагентов). Всегда добавляйте реагенты в одном и
том же порядке, чтобы минимизировать разницу времени реакции у различных
лунок.
9. Инкубируйте при комнатной температуре в течение пятнадцати (15) минут.
10. Добавьте 0.050 ml (50р1) стоп-реагента во все лунки и осторожно перемешивайте
в течение 15-20 секунд.
11. Считайте абсорбцию в каждой лунке при 450лт (используя результат при длине
волны 620-630пт для поправки на несовершенство лунок). Измерение должно
проводиться в течение тридцати (30) минут после добавление конечного
реагента.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна проверять контроли в низком, среднем и высоком
диапазоне для мониторинга проведения теста. Значение этих контролей следует
определять во время каждой процедуры теста. Необходимо составлять графики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходящих статистических методов. Значительное отклонение от обычных
показателей указывает на незамеченное изменение в условиях проведения теста
или на дефадацию реагентов в наборе. В этом случае используйте^
чтобы определить причину отклонений.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для нахождения неизвестной концентрации свободного тироксина в препаратах
используется кривая дозовой зависимости.
1. Запишите абсорбцию, указанную в распечатке микропланшетного анализатора
(Образец 1).
2. Постройте на миллиметровой бумаге фафик зависимости абсорбции каждого
дупликата калибраторов от концентрации свободного 14 в pg/ml. (не усредняйте
значения калибраторов перед построением графика).
3. Проведите через точки на графике наиболее подходящую кривую.
4. Чтобы определить неизвестную концентрацию свободного Т4, отложите среднюю
абсорбцию каждого препарата на вертикальной оси графика, найдите точку
пересечения с кривой и по горизонтальной оси графика определите концентрацию (в
pg/ml).
Рис. I
Значения свободног о Т4 в ng/dl
* Данные на образце 1 и на рисунке 1 представлены только для демонстрации и не
должны использоваться вместо кривой дозовой зависимости, составляемой при
проведении каждого теста.
ОБРАЗЕЦ 1
ПАРАМЕТРЫ QC (КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА)
Результаты анализа считаются достоверными при выполнении следующих
условий:
1. Абсорбция калибратора "О” (максимальная абсорбция) должна бьп-ь ^ 1.3
2. Четыре из шести контролей должны находиться в установленном диапазоне.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
1. Время реакции во всех лунках должно быть одинаковым, чтобы обеспечить
воспроизводимость результатов.
2. Пипетирование проб не должно занимать более десяти (10) минут во избежание
смещения результатов теста.
3. При использовании более одного (1) планшета, рекомендуется повторять
построение кривой доэового ответа.
4. Недостаточное промывание лунок планшета при аспирации или декантации
может привести к получению искаженных результатов.
5. Используйте компоненты из одного набора. Не смешивайте реагенты из разных
наборов.
6. Добавление раствора субстрата вызывает кинетическую реакцию, которая
прекращается после добавления конечного реагента. Поэтому добавлять субстрат и
конечный реагент нужно в одинаковом порядке, чтоб минимизировать разницы во
времени реакции.
7. Измерение проводится вертикально. Не прикасайтесь к дну лунок.
КЛИНИЧЕСКИЕ ОГРАНИЧЕНИЯ ДЛЯ СВОБОДНОГО Т4 CIA™
1. Не допускается использование препаратов с сильной микробной контаминацией, с
повышенным содержанием липидов и гемолизированных препаратов.
2. Если концентрация пробы окажется последнего калибратора (например >7.4
ng/dl), не пытайтесь разбавить ее. Вариации TBG в различных матрицах не
позволяют серийно разбавлять свободный 14 гормон.
3. Концентрация свободного тироксина в сыворотке зависит от множества факторов:
функции и регуляции щитовидной железы, концентрации тироксин-связывающего
глобулина (TBG) и связывание тироксина и TBG (3,4). Поэтому только показателя
концентрации свободного Т4 недостаточно для оценки клинического состояния
пациента.
4. Уровень общего тироксина в сыворотке может быть повышен при беременности
или при приеме оральных контрацептивов.
5. Снижение содержания общего тироксина может быть связано с потерей белков,
определенными заболеваниями печени, приемом тестостерона, дифенина или
сапицилатов. Список лекарств и состояний, которые впияют на концентрацию
общего трийодтиронина был составлен Journal of the American Association of Clinical
Chemlsts3.
6. Прием пациентом лекарств, которые могут повлиять на связывание 14 и
тироидных белоков'переносчиков или на взаимодействие 13 и Т4, осложняет
интерпретацию результатов анализа.
7. При наличии у пациента тяжелых нетироидальных заболеваний, оценить
состояние щитовидной железы очень сложно. У таких больных может быть
сопутствующий первичный гипотиреоз или компенсаторный вторичный гипотиреоз. В
подобных случаях рекомендуется проводить чувствительную оценку TSH
(тиреотропного гормона). См. Monobind # 375-300.
8. В редких случаях при наличии значительных отклонений в способности
альбумина связывать 14 (семейная дисальбуминемическая гипертоксинемия)
непосредственное определение свободного 14 дает ошибочные результаты.
9. Наличие циркулирующих антител к Т4 и гормоносвязывающих ингибиторов может
повлиять на результаты теста.
10. Гепарин оказывает влияние in vivo и in vitro на концентрацию свободного Т4 (5).
Поэтому не проводите анализ препаратов, в которые был добавлен этот
антикоагулянт.
"НЕ ПРЕДНАЗНАЧЕН ДЛЯ СКРИНИНГА НОВОРОЖДЕННЫХ"
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Для определение ожидаемых результатов теста свободного Т4 EIA было проведено
изучение населения с нормальной функцией щитовидной железы. Полученные
среднее (R), стандратное отклонение (о) и примерные ожидаемые значение (±2 а)
указаны в таблице 1.
ТАБЛИЦА I
Ожидаемые результаты теста свободного Т4 EIA
(в ng/dl)
Взрослые (110 Беременные (75
препаратов) препаратов)
Среднее (X) 1.40 1.50
Стандартное отклонение (s) 0.30 0.37
Ожидаемые результаты теста (±2 s) 0.8-2.0 0.76-2.24
Помните, что нахождение диапазона нормальных значений для популяции зависит от
множества факторов: специфичности метода, тестируемой популяции и точности
метода, используемого лаборантом. Поэтому любая лаборатория должна
использовать указанный производителем диапазон только до тех пор, пока
выработает собственные пределы нормальных значений, основываясь на
результатах анализов людей, живущих там же. где расположена лаборатория.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
А. Сходимость
Внутри- и межаналитическая точность системы оценивалась
на трех различных уровнях смешанной контрольной сыво
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для каждой пробы
контрольной сыворотки приведены в таблицах 2 и 3.
Для оценки внутрианалитинеской сходимости теста FT4 EIA были исследованы 20
копий каждой из трех смесей сыворотки (на нижней, среднем и верхнем отрезке
кривой дозовой зависимости). Была получена внутрианалитическая сходимость от
3.25 до 10.98%.
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.изм. - ng/dl)
ПРОБА N X о C.V.
низкий 20 0.550 0.061 10.98%
средний 20 1.740 0.074 4.26%
высокий 20 3.250 0.106 3.25%
Для оценки межа нал итической сходимости теста FT4 EIA был проанализирован один
дубликат каждой из трех проб смешанной сыворотки (на нижней, среднем и верхнем
отрезке кривой дозовой зависимости) в 10 тестах, проведенных за 6 месяцев, что
потребовало пяти разных наборов реагентов и трех различных операторов. Была
получена межаналитическая сходимость от 6.01 до 10.81%.
ТАБЛИЦА 3
Межаналитическая сходимость (ед.изм. - ng/dl)
ГПРОБА N” X V C.V.
низкий ___ 10 0.480 0.052 10.81%
.средний^__ 10 1.410 0.085 6.01%
высокий 10 3.490 0.279 7.90%
В. Точность
Было проведено сравнение Monobind свободного 14 EIA со стандартным методом
ИФА путем анализа препаратов с нормальной, гипо и гиперфункцией щитовидной
железы (диапазон значений от 0.1 ng/dl до 8 ng/dl).
Общее количество исследованных препаратов - 197. Уравнение регрессии методом
наименьших квадратов и коэффициент корреляции были рассчитаны для тироксина
EIA по сравнению с обычным методом. Полученные данные представлены в
таблице 4.
Таблица 4.
Регрессия
методом
Метод Среднее (х)
наименьших
квадратов
С1А(Х)___________ 1.63
ysQ.0917+0.9339(x)
Н \А т _ . i.ei
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному методу
(Т4 EIA) и стандартному методу. Метод наименьших квадратов и коэффициент
корреляции показывают отличную согласованность методов.
C. Чувствительность
Чувствительность теста на тироксин равна 0.05 ng/dt.
Чувствительность (предел обнаружения) оценивается при определении
вариабельности калибратора сыворотки с концентрацией О ng/dl при использовании
статистики 2а (95% точности) для расчета минимальной дозы.
D. Специфичность
Перекрестная реактивность антител свободного тироксина на выбранные вещества
оценивалась путем добавления дополнительных веществ в матрицу сыворотки в
указанных ниже концентрациях. Для определения перекрестной чувствитш1ьности
рассчитывается отношение между дозой дополнительного вещества и дозой
тироксина, необходимых для вытеснения одного и того же объема конъюгата.
Вещество Перекрестная Концентрация
реактивность
1-Тироксин 1.0000 -
d-Тироксин 0.9в00 10 ^g/ml
d-Трийодтироиин 0.0160 100 мд/ml
1-Трийодтиронин 0.0300 100 Hfl/ml
Йодотирозин 0.0001 100 ug/mi
ДиЙодотирозин 0.0001 I00ua/ml
Дийодотиронин 0^0001____ 100 йд/mi
TBG не определяется 40 цд/ml
Альбумин не определяется 40 mg/ml
Фенилбутазон не определяется 10 цд/ml
Фенитоин не определяется 40 мд/nil
Салицилат не определяется 50Рмд/т1________________J
СПИСОК СПРАВОЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Barker, S.B., "Detennlnation of Protein Bound Iodine", Joumal Biological Chemistty,
173, 175, (1948).
2. Chopra, I.J., Solomon, D.H., and Ho, R.S., "A Radioimmunoassay of Thyroxine”, J.
Clinical Endocrinol, 33, B65 (1971).
3. Young, D.S., Pestaner, L.C., and Gtlberman, U., "Effects of Drugs on CHnlcal
Laboratofv Tests", Clinical Chemistry, 21.3660 (1975).
4. Sterting. L., Diagnosis and Treatment of Thyroid Disease, Cleveland, CRC Press, P.
19-51 (1975).
5. Halpem, EP and Bordens, RW, '‘Microancapsulatad antibodies in
radioimmunoassay. Determination of free Thyroxine”, Clinical Chemistry, 26, 1561-
1563 (1979).
которыми происходит сильный выброс гонадотропинов (LH and FSH). По мере
течения фолликулярной фазы, концентрация FSH снижается Во время овуляции, в
середине цикла, FSH (с меньшей амплитудой, чем LH) достигает максимального
уровня.
Измерение FSH позволяет оценить гомеостаз системы половые железы гипофиз-
гмпоталамус(1,2).
Для проведения данного теста, калибратор FSH, препарат пациента и коитроли
сначапа добавляют в лунку. покрытую стрептавидином Добавляют
биотинилированное моноклональное антитело и антитела, меченые ферментами
(направленные на различные участки эпитопа фолликулостимулирующего гормона),
и реагенты смешивают. В результате реакции между различными антителами FSH и
нативным FSH формируется сандвичевый комплекс, который не отделяется от лунки
После окончания необходимого периода инкубации, несвязанные антитела с
ферментами отделяют от связанного конъюгата антител FSH при помощи
декантации или аспирации. Для определения активности ферментов на поверхности
лунки добавляют подходящий субстрат, и измеряют люменометром уровень
люминесценции.
Используя неосолько известных различных контрольных показателей концентрации
FSH, можно построить кривую дозовой зависимости и найти с ее помощью
неизвестную концентрацию фолликулостимулирующего гормона
ПРИНЦИП
Иммуноф«рм«нтным т»ст (IEMA):
Необходимые реагенты для иммуноферментного анализа включают:
высокоафинные и специфичные антитела (связанные ферментами и
иммобилизованные), с различным и четким распознаванием эпитопа, в избытке,
и нативный антиген.
При этой процедуре м4Мо6илиэаф«я происходит во время теста на поверхности
лунки мифопланшета при взаимодействии стрептавидина сверху и добавления
извне моноклонального антитела к FSH (АЬ),
При смешивании моно<1лоиального антитела, антигепа, помеченного ферментами, и
сыворотки, содержащей нативный антиген, происходит реакция между нативным
антигеном и антителами, без конкуренции или стеричесхого несоответствия, в
результате которой формируется растворимый сэндвичевый комплекс
Взаимодействие описывается следующим уравнением;
- нативный антиген
Enz*L - антитело, помеченное ферментами (в избытке)
AD(p)
^^^^АЬ(ргАдген**'АЬ(т) - сэндвичевый комплекс антиген-антитело
^ - постоянная скорость ассоциации
^-а - постоянная скорость диссоциации
Одновременно комплекс оседает в лунке благодаря реакции высокого сродства
между стрептавидином и биотинилированным антителом.
Эта реакция показана ниже;
^'^^Ab,p)-AgreM"“’Ab(n»+Streptavjdirtw. => 1тгтюЬШгес1 complex
Slreptavidht w “ иммобилизованный стрептавидин на поверхности лунки
Immobilized complex - сэндвичевый комплекс на поверхности лунки
После достижения равновесия, фракция антиген-антитело отделяется от
несвязанного антигена при помощи декантации или аспирации. Активность
ферментов в фракции связанных антител прямо пропорциональна концентрации
нативного антигена. Добавляется субстрат. Интенсивность света прямо
пропорциональна концентрации пролактина в пробе. Используя несколько различных
известных контрольных показателей антигена, можно построить кривую дозовой
зависимости и найти с ее помощью неизвестную концентрацию антигена.
РЕАГЕНТЫ И МАТЕРИАЛЫ:
А. Калибраторы FSH -1.0 т1/про6ирка (высушенные) [Обозначения А - F]
Шесть (6) пробирок для сравнения с значением антигена \ уровней FSH 0(A), 5(B),
10(C), 25(D), 50(E), и 100(F) mlU/ml. Хранить \ при температуре 2-8Х.
Консервирующее вещество добавлено.
Примечание: калибраторы на основе человеческой сыворотки были откалиброваны
при использовании эталонного препарата, составленного по WHO 2rd IRP (78/549).
В. Ферментный реагент FSH—13 ml/пробирка
Одна (1) пробирка, содержащая моноклональное антитело, меченное ферментами,
биотинилированный моноклональный мышиной IgG в буфере с красителем и
консервантом
Хранить при температуре 2-8“С.
с. Лунки со Стрептавидином - 96 лунок - Значок U
Белый микропланшет с 96 лунками, покрытыми стрептавидином и упакованные в
алюминиевую оболочку с осушающим реагентом. Хранить при температуре 2-в°С.
D. Концентрат промывающего раствора - 20т1 - значок ^
Одна (1) пробирка, содержащая сурфактант в эабуфереином растворе. Добавлен
консервант. Хранить при температуре 2-Э0**С (см. Раздел по подготовке реагентов).
E. Субстрат А - 7мл/пробирка - Обозначение
Одна (1) бутыль с точно откалиброванным содержанием тетраметилбвизидина
(ТМВ) в буфере. Хранить при 2-8Х.
F. Субстрат В - 7мл/пробирка - Обозначение S®
Одна (1) бутыль, содержащая перекись водорода (Н2О2) в буфере.
Хранить при температуре 2-в°С (см. Раздел по подготовке реагентов).
О
Н. Стоп-реагент - 8.0т1/пробирка - Обозначение ^
Одна (1) пробирка, пробирка с точно откалиброванным содержанием сильной
кислоты (1N НС1). Хранить при г-ЗО^С.
и.Вкладыш в упаковку.
Примечание 1: Не используйте реагенты, у которых истек срок годности.
Примечание 2: Открытые реагенты стабильны в течение 60 дней при температуре
2-8Х.
Примечание 3: Реагенты предназначены для использования вместе с планшетом с
96-ю лунками.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ [НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ}:
1. Пипетка для раскапывания объема 50ц1 с точностью выше 1.5%.
2. Диспвнсер(ы) для многократного распределения объемов в 0.100ml и 0.300ml с
точностью выше 1.5%.
3. Промывающее устройство для микропланшетов или пластиковая бутыль
(дополнительно).
4. Считыватель микропланшетов для определения абсорбции на длинах волн 460 и
620 пт (фильтр 620 пт не обязателен).
5. Абсорбирующая бумага для декантации лунок микропланшета
6. Пластиковая оболочка или крышка микропланшета для проведения инкубации.
7. Вакуумный аспиратор (дополнительно) для промывания.
В. Таймер.
9. Материалы для контроля качества.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Цпя диагностики In Vitro
Не предназначен для внутреннего или наружного употребление животными
или человеком.
Реагенты, содержащие сыворотку крови человека, тестировались на наличие
антител к ВИЧ 1 и 2, вирусу гепатита С, поверхностному антигену вируса гепатита В.
Были получены отрицательные результаты. Однако поскольку ни один тест не может
дать полной гарантии отсутствия инфекционных агентов, всю человеческую
сыворотку следует считать потенциально опасной и инфекционной и обращаться с
ней в соответствии с государственными нормами для биологически опасных веществ
2 группы. Подходящие лабораторные правила обращения с препаратами крови
можно найти в "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories," 2-я редакция,
19B8. HHS
СБОР И ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
Забор крови из вены руки следует производить cornaoio стандартной процедуре, с
соблюдением соответствующих мер предосторожности. Чтобы обеспечить
возможность сравнения с контрольными значениями, нужно собирать сыворотку у
пациента утром натощак. Для сбора крови используются простые пробирки с красной
крышкой без геля или добавок. Дайте крови свернуться. Центрифугируйте препарат,
чтобы отделить сыворотку от клеток.
Для анализа можно использовать как свежеполученные образцы сыворолси крови,
так и образцы, хранившиеся при температуре от 2 до 8“С не более пяти (5) дней или
при температуре минус 20“С не более 30 дней. Не допускается повторное
аамораживание-размораживание, приводящее к искажению результатов. При
тестировании с дубликатами требуется 0.100 мл препарата.
ПОДГОТОВКА И ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ:
1. Промывной Буфер
Растворите концентрат промывающего раствора в подходящем контейнере в
дистиллированной или деионизированной воде, так чтобы его объем составлял 1000
мл. Храните при комнатной температуре (20-27"С) в течение 60 дней.
2. Рабочий раствор субстрата
Перелейте содержимое пробирки 'А' в пробирку ‘В’. Смешайте и храните при
температуре 2-8”С. Используйте в течение 60 дней.
Определите необходимое количество реагента и подготовьте его, смешав равные
порции субстрате А и субстрата В в подходящем контейнере. Например, добавьте 1
мл А и 1 мл в в два стрипа с восьмью лунками (получится небольшой избыток
раствора. Выбросьте неиспользованную долю раствора).
Примечание; не используйте раствор, если он стал синим.
ПРОЦЕДУРА ТЕСТА
Перед проведением теста, доведите все реагенты, контроли и калибраторы
сыворотки до комнатной температуры (20 - 2Т С).
1. Подготовьте лунки микропланшета для калибраторов, контрольных проб и
препаратов пациента в дубликатах.
Поместите неиспользованные микрострипы обратно в алюминиевую упаковку,
закройте ее и храните при температуре 2-8°С.
2. Внесите 0.050 ml (50р1) калибраторов, контрольных проб и препаратов в
соответствующие лунки.
3. Добавьте 0.100 ml (100р1) конъюгата FSH-ферментов в каждую лунку. Необходимо
вносить все реагенты как можно ближе ко дну лунки.
4. Осторожно поворачивайте планшет в течение 20-30 секунд, чтобы реагенты
перемешались. Закройте планшет пластиковой пленкой.
5. Инкубируйте в течение 60 минут при комнатной температуре.
6. Удалите содержимое лунок микропланшета при помощи декантирования или
аспирации. При декантировании тщательно удалите остатки жидкости иэ лунок при
использовании абсорбирующей бумаги.
7. Добавьте 300р1 промывающего раствора (см. раздел о подготовке реагентов),
декантируйте или аспирируйте. Повторите еще два (2) раза (общее число
промываний - три (3)). Можно использовать автоматическое или ручное
устройство для промывания планшетов. В таком случае следуйте инструкциям
производителя по эксплуатации. При использовании бутыли, наполняйте
каждую лунку доверху, сжимая контейнер. Избегайте появления пузырьков.
Декантируйте и повторите еще два (2) раза.
8. Добавьте 0.100 ml (lOOpI) раствора субстрата во все лунки.
(см. раздел о подготовив реагентов). Всегда добавляйте реагенты в одном и
том же порядке, чтобы минимизировать разницу времени реакции у различных
лунок.
9. Инкубируйте при комнатной температуре в течение пятнадцати (15) минут.
10. Добавьте 0.050 ml (50р1) стоп-реагента во все лунки и осторожно перемешивайте
в течение 15-20 секунд.
11. Считайте абсорбцию в каждой лунке при 450nm (используя
волны 620-630nm для поправки на несовершенство лунок)
проводиться в течение тридцати (30) минут после
реагента.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна проверять контроли в низком, среднем и высоком
диапазоне для мониторинга проведения теста. Значение этих контролей следует
определять во время каждой процедуры теста. Необходимо составлять графики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходящих статистических методов. Значительное отклонение от обычных
показателей указывает на незамеченное изменение в условиях проведения теста
или на деградацию реагентов в наборе, В этом случае используйте свежие реагенты,
чтобы определить причину отклонений.
РАСЧЕТ И РЕЗУЛЬТАТЫ
Для нахождения неизвестной концентрации FSH в препаратах используется кривая
дозовой зависимости.
1. Запишите абсорбцию, указанную в распечатке микропланшетного анализатора
(Образец 1).
2. Постройте на миллиметровой бумаге график зависимости абсорбции Ka^tfAoro
дупликата калибраторов от концентрации FSH в mlU/ml (не усредняйте значения
калибраторов перед построением графика).
3. Проведите через точки на фафике наиболее подходящую кривую.
4. Чтобы определить неизвестную концентрацию FSH, отложите среднюю абсорбцию
каждого препарата на вертикальной оси фафика, найдите точку пересечения с
кривой и по горизонтальной оси графика определите концентрацию (в mlU/ml)
(можно найти среднее для дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией). В
приведенном ниже примере, средняя абсорбция (1.214) пересекает калибровочную
кривую при концентрации FSH 43.2 mlU/ml (См. рисунок 1).
Примечание 1: Для обработки данных можно использовать программное
обеспечение для тестов EL1SA.
Рис.1
Знамения FSH в mlU/mt
ОБРЛЗШД 1
z
g
i
* Данные на образце 1 и на рисунке 1 представлены только для демонстрации и не
должны использоваться вместо кривой дозовой зависимости, составляемой при
проведении каждого теста.
ПАРАМЕТРЫ QC (КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА)
Результаты анализа считают достоверными при соблюдении следующих
условий:
1. Абсорбция калибратора Т" (максимальная абсорбция) должна быть 'г 1.3
2. Четыре из шести контрол ей должны находиться в установленном диапазоне.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
А. Проведение теста
1. Время реакции во всех л^ках должно быть одинаковым, чтобы обеспечить
воспроизводимость результатов. Пилетирование проб не должно занимать более
десяти (10) минут во избежание смещения результатов теста.
2. При использовании более одного (1) планшета, рекомендуется ловторять
построение кривой дозового ответа.
3. Недостаточное промывание лунок планшета при аспирации или декантации
может привести к получению искаженных результатов.
4. Используйте компоненты из одного набора. Не смешивайте реагенты из разных
наборов.
5. Добавление раствора субстрата вызывает кинетическую реакцию, которая
прекращается после добавления конечного реагента. Поэтому добавлять субстрат и
конечный реагент нужно в одинаковом порядке, чтоб минимизировать разницы во
времени реакции.
6. Измерение проводится вертикально. Не прикасайтесь к дну лунок.
В. Интерпретация
1. При использовании компьютерной программы для интерпретации результатов
теста, требуется, чтобы прогнозируемые значения калибраторов оказывались в
предепах 10% от соответствующих концентраций.
2. FSH подавляется эстрогеном, но у женщин, принимающих оральные
контрацептивы концентрация может быть низкой или нормальной. Голодание и
потеря веса приводят к снижению концентрации гонадотропина.
3. Уровень фопликулостимулирующего гормона зависит от множества разпичных
факторов, помимо гомеостаза гипофиза. Поэтому только результата данного теста
для оценки клинического состояния недостаточно.
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Для определения ожидаемых результатов теста FSH CIA были проанализированы
препараты крови нормальных здоровых людей.
ТАБЛИЦА I
Ожидаемые результаты теста CIA на фолликулостимулирующий гормон
(в mlU/ml)
Женщины
фолликулярная фаяа 3.0-Т2'6
Середина цикла 8.0-22.0
Лютей новая фаза 2.0- 12.0
После менопаучы 35.0^ 1510
Мужчин]ы
J.0-14.0
Помните, что нахо>кдение диапазона нормальных значений для популяции зависит от
множества факторов: специфичности метода, тестируемой популяции и точности
метода, используемого лаборантом. Поэтому любая лаборатория должна
использовать указанный производителем диапазон только до тех пор, пока
выработает собственные пределы нормальных значений, основываясь на
результатах анализов людей, живущих там же, где расположена лаборатория.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
А. Сходимость
Внутри- и межаналитическая точность системы оценивалась при помощи анализов
на трех различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для каждой пробы
контрольной сыворотки приведены в таблицах 2 и 3.
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.изм. - mlU/ml)
ПРОБА N X C.V.
Уровень 1 16 5.9 0.25 4.3%
Уровень 2 16 16.0 068 4.3%
Уровень 3 16 41.3 1.18 2.9%
ТАБЛИЦА 3
Межаналитическая сходимость (ед.изм. - mlU/ml)
ПРОБА N X (Г C.V.
Уровень 1 10 5.9 0.41 6.9%
Уровень 2 10 16.0 0.48 'з:б%
Уровень 3 10 40.9 1.48 3.6%
Жданные получены в 10 экспериментах с использованием дубликатов.
В. Точность
Было проведено сравнение Monobind FSH Microplate ELISA со стандартным
радиоиммуным тестом с применением биологических препаратов (с низкой,
нормальной и высокой концентрацией). Общее количество исследованных
препаратов - 106. Полученные данные представлены в таблице 4.
Таблица 4.
Регрессия
методом Коэффициент
Метод Среднее (х)
наименьших корреляции
квадратов
Этот метод 17.4
Метод для у*0.98(х)-1.7 0.978
19.5
сравнения
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному методу
(FSH ELISA) и методу для сравнения. Метод наименьших квадратов и коэффициент
корреляции показывак5т отличную согласованность методов.
C. Чувствительность
Чувствительность теста на фолликулостимулирующий гормон равна 0.04 mlU, что
эквивалентно пробе с концентрацией 0.8 mlU/ml.
D. Специфичность
Перекрестная реактивность антител FSH на выбранные вещества оценивалась
путем добавления дополнительных веществ в матрицу сыворотки в указанных ниже
концентрациях. Для определения перекрестной чувствительности рассчитывается
отношение между дозой дополнительного вещества и дозой Г8Н, необходимых для
равной абсорбции.
Вещество Перекрестная Концентрация
реактивность
Фоллитропин (hFSTi) 1.0000 -
Тиротропин (hTSH) < 0.0001 1000 ng/ml
Лутролин (hLH) < 0.0001 1000 ng/ml
Хорионический гонадотропин ■<ь:ббо1 ТбОО ng/ml
список СПРАВОЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Odell.W.D., Parlow.A.F.etal, JC//n/nvesf.47, 2551 (1981).
2. Saxema, В.В., Demura, Н.М., et al, J Clin Endocrinol Metab.. 28.591 (1968).
Редакция: 07.22.02
Cat# 425-300.
Monobind Inc.
729 West 16th Street
Costa Mesa. CA 92627
Tel: 949-642-4830
Fax: 949-650-8459
Email; lnfo@monoblnd.com
Вебсайт: www.monoblnd.com
Пожалуйста, посетите наш вебсайт, чтобы узнать больше о предоставляемых
нами товарах и услугах.
которыми происходит сильный выброс гонадотропинов (LH and FSH). По мере
течения фолликулярной фазы, концентрация FSH снижается. Во время овуляции, в
середине цикла, FSH (с меньшей амплитудой, чем LH) достигает максимального
уровня.
Измерение FSH позволяет оценить гомеостаз системы половые железы-гипофиз-
гипоталамус(1,2).
Для проведения данного теста, калибратор FSH, препарат пациента и контроли
сначала добавлякэт в лунку, покрытую стрептавидином. Добавляют
биотинилированное моноклональное антитело и антитела, меченые ферментами
(направленные на различные участки эпитопа фолликулостимулирующего гормона),
и реагенты смешивают. В результате реакции между различными антителами FSH и
нативным FSH формируется сандвичевый комплекс, который не отделяется от лунки.
После окончания необходимого периода инкубации, несвязанные антитела с
ферментами отделяют от связанного конъюгата антител FSH при помощи
декантации или аспирации. Для определения активности ферментов на поверхности
лунки добавляют подходящий субстрат, и измеряют люменометром уровень
люминесценции.
Используя несколько известных различных контрольных показателей концентрации
FSH, можно построить кривую дозовой зависимости и найти с ее помощью
неизвестную концентрацию фолликулостимулирующего гормона.
ПРИНЦИП
Иммуноферментный тест (IEMA):
Необходимые реагенты для иммуноферментного анализа включают:
высокоафинные и специфичные антитела (связанные ферментами и
иммобилизованные), с различным и четким распознаванием эпитопа, в избытке,
и нативный антиген.
При этой процедуре иммобилизация происходит во время теста на поверхности
лунки микропланшета при взаимодействии стрептавидина сверху и добавления
извне моноклонального антитела к FSH (АЬ).
При смешивании моноклонального антитела, антитела, помеченного ферментами, и
сыворотки, содержащей нативный антиген, происходит реакция между нативным
антигеном и антителами, без конкуренции или стерического несоответствия, в
результате которой формируется растворимый сандвичевый комплекс.
Взаимодействие описывается следующим уравнением:
+ AgpsH + “"Ab^m)
-а
В№ - биотинилированное монокланальное антитело (в и
- нативный антиген
Еп2л. - антитело, помеченное ферментами (в избытке)
^р)
.— у. . .1^™ »
АЬ(р^-Адгзи-*'АЬ,т; - сэндвичевый комплекс антиген-антитело
^ - постоянная скорость ассоциации
''-а - постоянная скорость диссоциации
Одновременно комплекс оседает в лунке благодаря реакции высокого сродства
между стрептавидином и биотинилированиым антителом.
Эта реакция показана ниже;
^^Ab(p)-Agrefr“’Ab<n,)+Streptavjdiitw Imrirobtlized complex
Streptavidirfc vv ' иммобилизованный стрептавидин на поверхности лунки
Immobilized complex - сэндвичевый комплекс на поверхности лунки
После достижения равновесия, фракция антиген-антитело отделяется от
несвязанного антигена при помощи декантации или аспирации. Активность
ферментов в фракции связанных антител прямо пропорциональна концентрации
нативного антигена. Добавляется субстрат. Интенсивность света прямо
пропорциональна концентрации пролактина в пробе. Используя несколько различных
известных контрольных показателей антигена, можно построить кривую дозовой
зависимости и найти с ее помощью неизвестную концентрацию антигена.
РЕАГЕНТЫ И МАТЕРИАЛЫ:
А. Калибраторы F5H - 1.0 т1/про6ирка (высушенные) [Обозначения А - F}
Шесть (6) пробирок для сравнения с значением антигена \ уровней FSH 0(A), 5(B),
10(C), 25(D), 50(E), и 100(F) mlU/ml. Хранить \ при температуре 2-8“С.
Консервирующее вещество добавлено.
Примечание; калибраторы на основе человеческой сыворотки были откалиброваны
при использовании эталонного препарата, составленного по WHO 2rd !RP (78/549).
В. Ферментный реагент FSH—13 ml/пробирка
Одна (1) пробирка, содержащая моноклональное антитело, меченное ферментами,
биотинилированный моноклональный мышиной IgG в буфере с красителем и
консервантом
Хранить при температуре 2-8“С.
с. Луики со Стрвптавйдином - 96 лунок - Значок ^
Белый микропланшет с 96 лунками, покрытыми стрептав»адином и упакованные а
алюминиевую оболочку с осушающим реагентом. Хранить при температуре 2>в*С.
D. Концентрат промывающего раствора - 20т1 - значок ^
Одна (1) пробирка, содержащая сурфактант а эабуференном растворе. Добавлен
консервант. Хранить при температуре 2-30°С (см. Раздел по подготовке реагентоа).
E. Субстрат А - 7мл/пробирка • СМюэиаченив
Одна (1) бутыль с точно откалиброванным содержанием тетраметилбвкзидина
(ТМВ) в буфере. Хранить при 2-вХ.
F. Субстрвт В - 7мл/пробирк« - Обозначение S®
Одна (1) бутыль, содержащая перекись водорода (HjO?) в буфере.
Хранить при температуре г-вХ (см. Раздел по подготовке реагентов).
©
Н. Стоп-реагент — 8.0т1/пробиркв - Обозначение
Одна (1) пробирка, пробирка с точно откалиброванным содержанием сильной
кислоты (1N HCI). Хранить при 2-30’С.
и.Вкпадыш в упаковку.
Примечание 1: Не используйте реагенты, у которых истек срок годности.
Примечание 2: Открытые реагенты стабильны в течение 60 дней при температуре
2-8“С.
Примечание 3: Реагенты предназначены для использования вместе с планшетом С
96-ю лунками,
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ [НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ]:
1. Пипетка для раскапывания объема 50р1 с точностью выше 1.5%.
2. Диспвнсер(ы) для многократного распределения объемов в 0.100ml и О ЗООщ} с
точностью выше 1.5%.
3. Промывающее устройство для михропланшетов или пластиковая бутыль
(дополнительно).
4. Считыватель микропланшетов для определения абсорбции на длинах волн 450 и
620 ran (фильтр 620 пт не обязателен).
5. Абсорбирующая бумага для декантации лунок микропланшетв
6. Пластиковая оболочка или крышка микропланшета длй проведения инкубации.
7. Вакуумный аспиратор (дополнительно) для промывания,
8. Таймер.
9. Материалы для контроля качества.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Дт диагностики /л Wfro
Но лредндлначен для внутреннего или наружного употребление жиоотными
или челолпком.
Реагенты, содержащие сыворотку крови чеповека, тестировались ка наличие
антител к ВИМ 1 и 2, вирусу гепатита С, поверхностному антигену вируса гепатита В
Были получены отрицательные результаты. Однако поскольку ни один тест не может
дать полной гарантии отсутствия инфекционных агентов, всю человеческую
сыворотку следует считать потенциально опасной и инфекционной и обращаться с
ней в соответствии с государственными нормами для биологически опасных веществ
2 группы Подходящие лабораторные правила обращения с препаратами крови
можно найти в "Biosafety 1л Microbiological and Biomedical Laboratories." 2-я редакция,
1986. HHS
СБОР И ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
Забор крови из вены руки следует производить согласно стандартной процедуре, с
соблюдением соответствующих мер предосторожности. Чтобы обеспечить
возможность сравнения с контрольными значениями, нужно собирать сыворотку у
пациента утром натощак. Для сбора крови используются простые пробирки с красной
крышкой без геля или добавок Дайте крови свернуться. Центрифугируйте препарат,
чтобы отделить сыворотку от клеток.
Для анализа можно использовать как саежеполученные образцы сыворотки крови,
так и образцы, хранившиеся при температуре от 2 до В”С не более пяти (5) дней или
при температуре минус 20”С не более 30 дней. Не допускается повторное
ммораживание-размораживание, приводящее к искажению результатов. При
тестироаамии с дубликатами требуется 0.100 мл препарата.
ПОДГОТОВКА И ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ:
1 П|юмьп1ной Буфер
Растворите концентрат промывающего раствора в подходящем контейнере в
дистиллированной или деионизированной воде, так чтобы его объем составлял 1000
мл. Храните при комнатной температуре (20-27"С) в течение 60 дней,
2. Рабочий раствор субстрата
Перелейте содержимое пробирки А’ а пробирку ‘В*. Смешайте и храните при
температуре 2~В“С. Используйте в течение 60 дней.
Определите необходимое количество реагента и подготовьте его. смешав равные
порции субстрата А и субстрата В в подходящем контейнере Например, добавьте 1
мл А и 1 мл В в два стрила с восьмью лунками (получится небольшой избыток
раств<фа Выброояте неиспользованную долю раствора).
Примечание: не используйте раствор, если он стал о<ним.
ПРОЦЕДУРА TECTA
Перед проведением теста, доведите все реагенты, контроли и калибраторы
сыворотки до комнатной температуры (20 - 27' CJ.
1. Подготовьте лунки микропланшета для калибраторов, контрольных проб и
препаратов пациента а дубликатах.
Поместите неиспользованные микрострипы обратно в алюминиевую упаковку,
закройте ее и храните при температуре 2-8°С.
2. Внесите 0.050 ml (50р1) калибраторов, контрольных проб и препаратов в
соответствующие лунки.
3. Добавьте 0.100 ml (100р1) конъюгата FSH-ферментов в каждую лунку. Необходимо
вносить все реагенты как можно ближе ко дну лунки.
4. Осторожно поворачивайте планшет в течение 20-30 секунд, чтобы реагенты
перемешались. Закройте планшет пластиковой пленкой.
5. Инкубируйте 8 течение 60 минут при комнатной температуре.
6. Удалите содержимое лунок микропланшета при помощи декантирования или
аспирации. При декантировании тщательно удалите остатки жидкости из лунок при
использовании абсорбирующей бумаги.
7. Добавьте ЗООр) промывающего раствора (см. раздел о подготовке реагентов),
декантируйте или аспирируйте. Повторите еще два (2) раза (общее число
промываний - три (3)). Можно использовать автоматическое или ручное
устройство для промывания планшетов. В таком случае следуйте инструкциям
производителя по эксплуатации. При использовании бутыли, наполняйте
каждую лунку доверху, сжимая контейнер. Избегайте появления пузырьков.
Декантируйте и повторите еще два (2) раза.
8. Добавьте 0.100 mi (lOOpI) раствора субстрата во все лунки.
(см. раздел о подаотовке реагентов). Всегда добавляйте реагенты в одном и
том же порядке, чтобы минимизировать разницу времени реакции у различных
лунок.
9. Инкубируйте при комнатной температуре в течение пятнадцати (15) минут
10. Добавьте 0.050 ml (50у1) стоп-реагента во все лунки и осторожно перемешивайте
в течение 15-20 секунд.
11. Считайте абсорбцию в ка)цдой лунке при 450пт (используя ре
волны 620-630пт для поправки на несовершенство лунок),
проводиться в течение тридцати (30) минут после
реагента.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна проверять контрол и в низком, среднем и высоком
диапазоне для мониторинга проведения теста. Значение этих контролей следует
определять во время каждой процедуры теста. Необходимо составлять фафики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходящих статистических методов. Значительное отклонение от обычных
показателей указывает на незамеченное изменение в условиях проведения теста
или на деградацию реагентов в наборе. В этом случае используйте свежие реагенты,
чтобы определить причину отклонений.
РАСЧЕТ И РЕЗУЛЬТАТЫ
Для нахождения неизвестной концентрации FSH в препаратах используется кривая
дозовой зависимости.
1. Запишите абсорбцию, указанную в распечатке микропланшетного анализатора
(Образец 1).
2. Постройте на миллиметровой бумаге график зависимости абсорбции каждого
дупликата калибраторов от концентрации FSH в mlU/ml (не усредняйте значения
калибраторов перед построением графика).
3. Проведите через точки на графике наиболее подходящую кривую.
4. Чтобы определить неизвестную концентрацию FSH, отложите среднюю абсорбцию
каждого препарата на вертикальной оси графика, найдите точку пересечения с
кривой и по горизонтальной оси графика определите концентрацию (в mlU/ml)
(можно найти среднее для дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией). В
приведенном ниже примере, средняя абсорбция (1.214) пересекает калибровочную
кривую при концентрации FSH 43.2 mlU/ml (См. рисунок 1).
Примечание 1; Для обработки данных можно использовать программное
обеспечение для тестов ELISA.
Рис.1
:1наче11Ия FSH в mlU/ml
ОБРАЗЕЦ 1
z
S
^
* Данные на образце 1 и на рисунке 1 представлены только для демонстрации и не
должны использоваться вместо кривой дозовой зависимости, составляемой при
проаедении ка)цдого теста.
I
ПАРАМЕТРЫ QC (КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА)
Результаты анализа считают достоверными при соблюдении следующих
условий;
1 Абсорбция калибратора “F" (максимальная абсорбция) должна быть & 1.3
2. Четыре из шести контролей должны находиться в установленном диапазоне.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
A. Проведение теста
1. Время реакции во всех лунках должно быть одинаковым, чтобы обеспечить
воспроизводимость результатов. Пипетирование проб не должно занимать более
десяти (10) минут во избежание смещения результатов теста.
2. При использовании более одного (1) планшета, рекомендуется повторять
построение кривой дозового ответа.
3. Недостаточное промывание лунок планшета при аспирации или декантации
может привести к получению искаженных результатов.
4. Используйте компоненты из одного набора. Не смешивайте реагенты из разных
наборов.
5. Добавление раствора субстрата вызывает кинетическую реакцию, которая
прекращается после добавления конечного реагента. Поэтому добавлять субстрат и
конечный реагент нужно в одинаковом порядке, чтоб минимизировать разницы во
времени реакции.
6. Измерение проводится вертикально. Не прикасайтесь к дну лунок.
B. Интерпретация
1. При использовании компьютерной программы для интерпретации результатов
теста, требуется, чтобы прогнозируемые значения калибраторов оказывались в
пределах 10% от соответствующих концентраций.
2. FSH подавляется эстрогеном, но у женщин, принимающих оральные
контрацептивы концентрация может быть низкой или нормальной. Голодание и
потеря веса приводят к снижению концентрации гонадотропине.
3. Уровень фолликулостимулирующего гормона зависит от множества различных
факторов, помимо гомеостаза гипофиза. Поэтому только результата данного теста
для оценки клинического состояния недостаточно.
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Для определения ожидаемых результатов теста FSH С1А были проанализированы
препараты крови нормальных здоровых людей.
ТАБЛИЦА I
Ожидаемые результаты теста CIA на фолликулостимулирующий гормон
(в т1Шгл1)
Женщкиы
Фолликулярная фача 3.0- J2.0
Середииа цикла 8.0-22.0
Лкугеиноаая фаза 2.0- 12.0
После менопаузы 35.0-151.0
Мужчины
1.0-14.0
Помните, что нахождение диапазона нормальных значений для популяции зависит от
множества факторов: слецифичности метода, тестируемой популяции и точности
метода, используемого лаборантом. Поэтому любая лаборатория должна
использовать указанный производителем диапазон только до тех пор, пока
выработает собственные пределы нормальных значений, основываясь на
результатах анализов людей, живущих там же, где расположена лаборатория.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
А. Сходимость
Внутри- и межаналитическая точность системы оценивалась при помощи анализов
на трех различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для каждой пробы
контрольной сыворотки приведены в таблицах 2 и 3.
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.изм. - mlU/ml)
ПРОБА N X а C.V.
Уровень 1 16 5.9 0.25 4.3%
Уровень 2 16 16.0 0.68 ■4.3%“
Уровень 3 16 41.3 1.18 2.9%
ТАБЛИЦА 3
Межаналитическая сходимость (ед.изм. - mlU/ml)
ПРОБА N X и C.V.
Уровень 1 10 5.9 6.41" ё.9%
Уровень 2 10 16.0 0.40 ■3.0%"
Уровень 3 10 40.9 1.48 3.6%
•данные получены в 10 экспериментах с использованием дубликатов.
В. Точность
Было проведено сравнение Monobind FSH Microplate ELISA со стандартным
радиоиммуным тестом с применением биологических препаратов (с низкой,
нормальной и высокой концентрацией). Общее количество исследованных
препаратов - 106. Полученные данные представлены в таблице 4,
Таблица 4.
Регрессия
методом Коэффициент
Метод Среднее (х)
наименьших корреляции
квадратов
Этот метод 17.4
Метод для у=0.98(х)-1.7 0.978
19.5
сравнения
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному методу
(FSH ELISA) и методу для сравнения. Метод наименьших квадратов и коэффициент
корреляции показывают отличную согласованность методов.
C. Чувствительность
Чувствительность теста на фолликулостимулирующий гормон равна 0.04 mlU, что
эквивалентно пробе с концентрацией 0.8 mlU/ml.
D. Специфичность
Перекрестная реактивность антител FSH на выбранные вещества оценивалась
путем добавления дополнительных веществ в матрицу сыворотки в указанных ниже
концентрациях. Для определения перекрестной чувствительности рассчитывается
отношение между дозой дополнительного вещества и дозой FSH, необходимых для
равной абсорбции.
Вещество Перекрестная Концентрация
реактивность
Фоллитропин (hPSH) 1.0000 -
Тиротропин (hTSH) < 0.0001 1000 ng/ml
Лутропин (hLH) < 0.0001 1000 ng/ml
Хорионический гонадотропин < 0.0001 1000 ng/ml

Реагенты для лабораторной диагностики in vitro в эндокринологии (см. Приложение на 1 листе) — инструкция и характеристики

Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ

Текст инструкции: технические характеристики

Хочу такой подбор для своей номенклатуры

Покажу сервис за 15 минут