"УТВЕРЖДАЮ"
авлвню!
®ГМП РФ
^Ввльгов
i 994г.
ИНСТРУКЦИЯ
по применению набора реагентов д\я определения активности
аспартатамжнотраясферазы в сыворотке крови ( Ас.\Т — ИМГЬ\КТ].
Рекомендована к утверждению комиссией по лабораторным реактивам Коытатвга по
новой медицинской технике М3 и МП РФ. Протокол N 5 от 23 мая 1994г.
Н&бор реагентов “АсАТ — ИМПАКТ" пре^азЕшчен для определения активности
аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови по конечной точке методом Райтмана —
Френкеля в реакп;ии с 2,4 — динитрофенилгидразином-
Набор рассчитан на 160 определений при суммарном расходе рабочих реагентов 3,0 мл
на 1 анализ.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Аспартатаминотрансфераза катализирует реакцию:
L —аспартат + а —кетоглутарат ....... L — глугамат + Оксалацетат
Оксалацетат-----> самопроизвольное декарбоксилирование-----> Пируват
Пируват + 2,4 —Динитрофенилгидразин-----> Динитрофенилгидразон
Метод определения АсАТ основан на фотомеггрическом определении окрашенного в
щелочной среде гидразона пировиноградной кислоты:. ИзмврвЕшя проводят ори длине волны
490 — 540 нм-
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА
Коэффициент вариации не превышает 1 %.
Чувствительность — не более 100 нмоль/с^л.
Линейность определения: активности АсАТ — в диапазоне от 117 до 1170 нмоль/с*a.
Опклонение от линейности — не более 7%.
Нормальные величины; 28 — 190 нмоль/с*л при 37^^ С (0,1 — 0,68 мкмоль/ч*мл,
1 мкмоль/ч^мл соответствует 278 нмоль/с*л).
Составлена: кл:.н.Журавлевой Н.И, — ст.н.сотр. МП “ИМПАКТ";
проф.Титовым В.Н. — руководиталем лаборатории КНЦ PANIH.
КОПНЯ tibPHA
^^ИРЕНГОР
ООО" Pf.^WAn г " вояиор л о
2
- -
СОСТАВ НАБОРА.
1.Реагент 1 — АсАТ, субстрат 50 мл
(L—аспартат ОД моль/л, а —кетоглугарат 2 ммоль/л, фосфатный буфер 0,1 моль/л).
2.Рвагент 2 — АлАТ/АсАТ, индикатор 50 мл
{2,4 — дшштрофенилгадразин I ммоль/л в HCL 1 моль/л). Допускается на.\ичие ме\кодисп:ерснъос
примесей.
3.Реагвнт S — ПБфуват натрия 2,5 мл
(Натрий пировинограднокисльш 2 ммоль/л).
4.Реагент 4 ~ NaOH 8,0 г
(Едкий натр для приготовления мл 0,4 моль/л раствора].
ПОДГОТОВКА К РАБОТЕ
Реагенты 1, 2, 3 готовы к употреблению. Допускается хранение гос после вскрьггия в
течение 2 недель при 2 —8° С.
Содержимое флакона с Реагентом 4 растворить в 500 мл дистиллированной воды.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Компоненты набора £№ггоксичны. При работе с Реагентом 2 и Реагентом 4 следует
соблюдать правила техники безопасности при работе с кислотами и щелочами.
При работ© с набором необходимо надевать резиновые или пластиковые перчатки, так
как образцы сыворотки крови человека являнугся потенциально инфицированными (ВИЧ, вирус
гепатита В или другие инфекционные заболевании].
НЕОБХОДИМОЕ ОБОРУДОВАНИЕ
Фотометрическое оборудование, обеспечивающее гомервние оптической плотности при
490 — 540 нм в диапазоне О — 1,0 ед. опт. плотности, кювета с длиной оптического пути 10
мм (для фотомеггров типа КФК, ФЭК), микропипеткк для отбора проб и рабочих реагентов
0,05 — 0,25 1ЙЛ, пипетка для отбора щелочи 5 мл, водяной термостат (допускается
использование сухо воздушного термостата с принудительной циркул5щией воздуха}, секундомер.
ПРОВЕДЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Определение проводят на отечеств енньо; или зарубежных фотометрах или
автоматических или полуавтоматических биохимических анализаторах.
а) Вьихолнение определения ка фотометрах
Для построения калибровочного графика в пять пробирок внести последовательно
дистиллированную воду. Реагент 3> и Реагент 1 в соответствии с таблицей 1. После добавления:
Реагента 2 содержимое пробьфок перемелгать и спустя 20 мин. добавить раствор NaOH,
перемешать. Через 10 мин. измерить оптическую плотность растворов N“№ 2 — 5 против раствора
N^1 при длине волны — 505 нм. Построить калибровочш^хй график.
Таблица 1
MQ Диет, вода Реагент 3 Реагент 1 Реагент 2 NaOH Активность
п/п мл мл мл мл мл нмоль/ с*л
к i 0,1 — 0,50 0,5 5,0 -
2 ОД 0,05 0,45 0,5 5,0 2?8
3 од ОДО 0,40 0,5 5,0 556
4 од 0Д5 0,35 0,5 5,0 834
5 од 0,20 0,30 0,5 5,0 U12
- 3 -
ВЫПОЛНЕНИЕ АНАЛИЗА:
Использовать сыворотку крови, свободную от гемолиза.
Схема проведения определения;
Контрольная проба Опьггная проба
Реагент 1 (мл) 0,25 0,25
Диет.вода (мл] 0,05
Сьюоротка (мл) ~ 0,05
Перемешать и инкубировать 30 мин. при 37° С на водяной бане
Реагент 2 (мл) 0,25 0^5
Перемешать и оставить при комнатной температуре на 20 мин.
NaOH 0,4 моль/л (мл) 2,5 2,5
Перемешать и через 10 мин. измерить оптическую плотность пробы против контрольной пробы
при длине волны 505 нм.
Измерения проводить в течение 30—40 мин.
РАСЧЕТЫ
По оптической плотности опытной пробы на калибровочном графике найти активность
.АсАТ в сыворотке крови.
б) Выполнение определения на анализаторах.
ПАРАМЕТРЫ ДЛЯ ФП - 901
Определение — стандарт ( КТ } Единица — 1 ( мкмоль/л ]
Фильтр — 5 ( 540 нм ) Стандарт — i
Концентрация стандарта — 2 ммоль/л
СХЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Раствор Контр.проба Станд. Проба
мкл мкл мкл
Сыворотка — ~ 15
Дист.вода 15 —
Реагент 1 (37° С) 75 75 75
Перемешать 15 сек, и инкубировать 30 мин. при 37° С
Реагент 2 75 75 75
Перемешать 15 сек. и инвсубировать 20 мин. при комнатной температуре.
NaOH 0,4 моль/л 750 750 750
Перемешать 15 сек., инкуй5фовать 10 мин. при комнатной температуре и измерить оптическую
плотность.
УСЛОВИЯ ЭКСПЛУАТАЦИИ
Набор хранить в тёмном холе дном месте при 2 — 8'^ С в течение 12 месяцев м.
-4 -
Для больных диабетом необходимо поставить холостую пробу, в которую сыворотку
внести после добавления Реагента 2, так как повышенная концентрация ве]цсств, содержатцих
кетогрухшу, вызывает ложное завышение активности фермента.
По вопросам, связанным с качеством и поставками набора, обращаться по адресу;
127018, г.Москва, ул.Двинцев, 6, МП "ИМПАКТ"
Телефон для справок: 289“79”’59