«УТВЕРЖДАЮ»
Генеральный директор
ИНСТРУКЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ
для персонала клинико-диагностических лабораторий
Реагенты in vitro для иммуно-ферментного анализа
производства компании: Institut VirionVSerion GmbH (Германия)
г. Москва, 2011 г.
1
SERION ELISA classic Adenovirus IgG/IgM/IgA
ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
2. ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
3. ПРИНЦИП РАБОТЫ SERION ELISA classic
4. СОДЕРЖИМОЕ И СОСТАВ УПАКОВКИ ТЕСТА
5. ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ
6. ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ РЕАГЕНТОВ
7. ПРОВЕДЕНИЕ ТЕСТА SERION ELISA classic
7.1 Общие указания
7.2 Подготовка и хранение проб
7.3 Подготовка реагентов
7.4 Краткий порядок проведения теста
7.5 Проведение теста
8 ОБРАБОТКА ДАННЫХ ТЕСТА
.
8.1 Количественное измерение сывороток по 4 параметрам логарифмической модели
(4PL)
8.2 Критерии действительности теста
8.3 Обработка данных теста SERION ELISA classic Adenovirus IgG/IgM/IgA
(количественный)
8.4 Интерпретация результатов
I ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ЧЕРТЫ
II Точность
12 Чувствительность и специфичность
[0. МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ
0. 1 Предостережения и меры предосторожности
[0.2 Утилизация
1. ЛИТЕРАТУРА
Данная версия № V 11.04Д2-1 (предыдущая версия: vio.04/03-i)
SERION ELISA classic Adenovirus IgG/IgM/IgA
Иммуноферментный набор для определения антител к иммуноглобул1
человека ('IgG/IgM/IgA') - только для диагностики in vitro
Набор Adenovirus IgG (количественный) № для заказа: ESR128 G
Набор Adenovirus IgM (количественный) № для заказа: ESR128 М
Набор Adenovirus IgA (количественный) № для заказа: ESR128 А
Тесты одобрены: Dade Behring ВЕР ® III/ВЕР ® 2000, DSX, в ручном режиме
1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Иммуноферментные тест-наборы SERION ELISA classic Adenovirus IgG/Ig
предназначены для качественного и количественного выявления антител чело
сыворотке или плазме ко всем гуманопатогенным серотипам аденовирусов. Выя
IgG/IgM/IgA дает возможность применения дифференциальной диагностики и
установления острого респираторного заболевания.
2. ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Аденовирусы были описаны в 50-тые годы прошлого столетия как ла
персистирующие возбудители из миндалин и лимфоидных тканей, а так же как возбу
острых инфекций дыхательных путей. Аденовирусы вызывают забол
многочисленных органов и систем (дыхательного тракта, желудочнокишечного тракт
мочеполового тракта).
1, Вход
2. КЬнъюктавит,
фарингит,
гастроэнтерит
3. Выход
Рис. 1: Патогенез аденовирусных заболеваний (источник:
http:/ / gsbs.utmb.edu/microbook/ch067.htm)
направленные против человеческих иммуноглобулинов пробы пациента, которые
положительном случае связаны с антигеном. При добавлении субстра
(паранитрофенилфосфата) в результате реакции фермента и субстрата происхо
окрашивание раствора в желтый цвет. Интенсивность желтой окраски измеряе
фотометрическим способом; она пропорциональна уровню содержания специфичеси
антител.
4. СОДЕРЖИМОЕ И СОСТАВ УПАКОВКИ ТЕСТА
Колич./
Компоненты теста и состав
объем
Отрывные микрострипы, каждая с 8 отдельными лунками с 12
антигенным покрытием (всего 96), 1 тестовый держатель
Напыленный материал деактивирован
Стандартная сыворотка (готовая к употреблению) 2x2 мл
Человеческая сыворотка в фосфатном буфере с протеином;
отрицательная в отношении антител к HIV, антигенов HBs -Ag
(поверхностных антигенов вируса гепатита В) и антител к HCV;
консервант: < ОД % азид натрия Краситель: Amaranth О
Отрицательная контрольная сыворотка (готовая к 2 мл
употреблению) Человеческая сыворотка в фосфатном буфере
с протеином; отрицательная в отношении антител к HIV,
антигенов HBs -Ag (поверхностных антигенов вируса гепатита
В) и антител к HCV; консервант: < ОД % азид натрия Краситель:
Lissamin-зеленый V
Конъюгаты к человеческим IgG, IgA, IgM (готовые к 13 мл
употреблению) Поликлональные козьи антитела направленные
против человеческих IgG, IgA, IgM, конъюгированные со
щелочной фосфатазой, стабилизированные протеиновым
стабилизирующим раствором Консервант: 0,01 %
метилизотиазолон 0,01 % бромнитродиоксан
Концентрат раствора для промывания (достаточно для 1000 мл) 33,3 мл
Раствор хлорида натрия с Tween 20,30 mM Tris Консервант: <
ОД % азид натрия
Буфер для разведения Фосфатный буфер с протеином и Tween 2 х 50 мл
20; Консервант: < ОД % азид натрия 0,01 r/л бромфеноловой
голубой соли натрия
Стоп-реагент 1,2 N натровый щелок 15 мл
Субстрат (готовый к употреблению) паранитрофенилфосфат, 13 мл
буфер без растворителя, Консервант: < ОД % азид натрия
Сертификат контроля качества со стандартной кривой и 1
таблицей значений (количественное выражение антител в
мЕд/мл или Ед/мл)
, ( 1
5. ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ
• Обычное лабораторное оборудование
• Для выявления IgM: специальный SERION Rf-абсорбент (Nr. для заказа
Z200/20ml)
• Спектрофотометр для микротитровальных стрипов с фильтром, длина волны
405 нм, рекомендуемая длина эталонной волны в пределах от 620 нм до 690
нм (например, 650 нм)
• Термостат инкубатор 37°С
• Влажная камера
• Дистиллированная вода
6. ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ РЕАГЕНТОВ
Реактив Хранение Срок годноси
Микротитровальные После вскрытия упаковки при 2-8°С при 4 недели
стрипы (антиген) использовании осушителя, в закрытом виде
Следует обратить внимание на то, чтобы
неиспользованные лунки хранились в сухих
условиях и герметично в специальном пакете
из композитной алюминиевой пленки
Контрольные/стандар После вскрытия упаковки при 2-8°С До окончани
тные сыворотки срока хране
24 месяца с
даты выпуск
Конъюгат Готовый к употреблению раствор при 2-8°С До окончани
Следует избегать заражения (стерильные срока хране
наконечники!) 28 месяца с
даты выпуск
Разбавляющий буфер После вскрытия упаковки при 2-8°С 24 месяца
Помутневшие растворы использовать не
следует До окончани
срока хране
В неоткрытом виде 36 месяцев!
даты выпус
Буфер для Концентрат после вскрытия упаковки при 2-8°С До окончани
промывания срока хране
Готовый раствор при 2-8°С 2 недели
Готовый раствор при комнатной температуре 1 недели
Емкость для готового раствора следует
регулярно промывать!
Помутневшие растворы использовать не
следует
Субстрат Готовый раствор при 2-8°С, хранить в До окончани
защищенном от света месте срока хране
24 месяца с
Избегайте загрязнения микробами! При наличии даты выпуск
интенсивной желтой окраски (экстинкция
дистиллированной воды > 0,25) не использовать.
'■г '^F# ‘ ' ! '. , ^
Стоп-реагент После вскрытия упаковки при комнатной До окончания
температуре. срока хранения;
4 .. • .-'
‘И
7
7. ПРОВЕДЕНИЕ ТЕСТА SERION ELISA classic
7.1 Общие указания
Необходимо использовать исключительно реагенты SERION ELISA classic, поскольку!
адаптированы друг к другу внутри системы, и не заменять их реагентами друй
производителей. Стандартные и контрольные сыворотки, а также конъюгаты в зависима
от партии адаптированы к конкретному тест-набору и не могут использоваться в та
наборах других партий. Разбавляющий буфер, буфер для промывывания, стоп-реагеи
раствор субстрата могут использоваться во всех тестах SERION ELISA classic независима
партий и наборов.
Для каждого класса иммунглобулина имеются три разных концентрации конъюгат!
НИЗКАЯ, СРЕДНЯЯ И ВЫСОКАЯ.
Классификацию конъюгата можно распознать на этикетках по следующим обозначениям;
Напр. IgG + IgG-конъюгат низкой концентрации
IgG ++ IgG-конъюгат средней концентрации
IgG +++ IgG-конъюгат высокой концентрации
Чтобы сохранить высокое качество наших тест-наборов, необходимо в отдельных случа
применять особые конъюгаты. Это особые партии и они не имеют обозначений «i
Специальные конъюгаты нельзя заменять другими конъюгатами.
Пожалуйста, всегда обращайте внимание на надписи на этикетках!
Все компоненты теста ELISA classic следует использовать до истечения срока годности (с
указания на этикетке) при соблюдении правильных условий хранения. Не применя
реагенты после истечения срока годности. По этому поводу см, также п.6 "ХРАНЕНИЕ
СРОК ГОДНОСТИ РЕАГЕНТОВ" 1
Неверное разбавление реагентов может привести к потерям чувствительности.
Реагенты теста во время хранения и инкубации необходимо защищать от яркого свет
После использования плотно закрыть упаковку во избежание высыхания и бактериально
загрязнения.
При повреждении пакета из алюминиевой пленки или неплотной упаковке пакета, дг
хранения неиспользованных лунок, их не следует использовать для теста.
Все реагенты теста перед его началом необходимо довести до комнатной температуры.
При извлечении порции реактива, во избежание загрязнения их микробами следует всегд
соблюдать правила стерильности. Во избежание ложноположительных результата
наконечник пипетки при вводе конъюгата ни в коем случае не должен касаться и смачта
верхний край лунок. При закрытии флаконов необходимо следить за тем, чтобы для этол
использовалась соответствующая данному флакону крышка. I
Воспроизводимость результатов зависит, кроме прочего, и от тщательного перемешивания
соответствующих реагентов. Перед забором контрольной сыворотки и конъюгата емкости
необходимо хорошо встряхнуть. Растворы проб перед вводом необходимо хорошо
размешать мономиксером (например, Vortex).
они Необходимо следить за аккуратным заполнением лунок и соблюдением указанных времени
угих температуры инкубации. Значительные различия во времени между заполнением первой
ости «последней лунок при добавлении проб/контрольных сывороток, конъюгата и субстрата
ест- родит к различиям "прединкубационного периода", которые могут значительно повлиять
нт и ia точность и воспроизводимость измеренных значений.
о от
'ишь строгое соблюдение рабочей инструкции теста SERION ELISA classic обеспечивает
эдильность результатов.
та:
Результаты теста можно учитывать лишь в том случае, если соблюдены все условия в
зависимости от партии, приведенные в сертификате контроля качества, прилагаемом к
набору.
Давильная промывка препятствует неспецифичности теста:
Следует выполнять руководство к применению используемых промывателей. В тесте
SERION ELISA classic используются плоские планшеты. Важно равномерное наполнение
лунок буфером для промывки и его полное удаление после промывки (возможны
|ях неконтролируемые эффекты при разбавлении). Избегать образования пены! Не
ь>. I повреждать покрытие лунок!
7,2 Подготовка и хранение проб
м. Липидные, гемолизированные, а также иктеричные пробы (сыворотка или плазма) следует
ть использовать лишь с оговоркой, хотя в ходе наших исследований не было замечено
И негативного влияния. Пробы, загрязненные бактериями, использовать не следует.
’Пригодными для исследований материалами являются пробы сыворотки или плазмы
I (EDTA, цитрат, гепарин), полученные стандартными лабораторными методами.
а. Пробы нельзя деактивировать термическим способом.
о
Ш Разбавление проб
я Перед началом теста, пробы (VI) растворить в разбавляющем буфере (V2):
М
V1 + V2 = 1+500:
• по 10 мкл пробы пациента на каждые 1000 мкл разбавляющего буфера (1+100)
• 50 мкл из первого разбавления на каждые 200 мкл разбавляющего буфера (1+4)
ш. 1 *
VI + V2 = 1 + 500:
9
0>
• по 10 мкл пробы пациента на каждые 1000 мкл разбавляющего буфера (1+100)
• 50 мкл из первого разбавления на каждые 1000 мкл разбавляющего буфера (1+2(1
После каждого разбавления и перед отбором, пробы следует хорошо размешать
мономиксером (например, Vortex) для получения гомогенного раствора.
Интерференция ревматоидного фактора
Антитела ревматоидного фактора в большинстве являются ауто-антителами класса Ig)
которые в основном связываются с иммунными комплексами IgG. Специфическое
выявление IgM антител из-за этих ревматоидных факторов может иметь
ложноположительные результаты. Кроме того, существует возможность, вытеснения IgN
антител с более слабыми связями IgG-антителами с более сильными связями.
Обнаружение IgM в этом случае может оказаться ложноотрицательным. По этой причин
пробы для определения IqM необходимо предварительно обработать абсорбентом
ревматоидного фактора. (SERION-Rheumafaktor-Absorbens, Nr. для заказа Z200 (20 мл/1
определений)).
Сначала производится разбавление абсорбента ревматоидного фактора (V1)
разбавляющим буфером (V2) в соотношении 1+4.
IqM
V1 + V2 = 1 + 4:
• по 200 мкл Rf-абсорбента на каждые 800 мкл разбавляющего буфера
Затем пробы пациента (V4) разбавляются в смеси Rf и разбавляющего буфера (V3)
V4 +V3 = 1+100:
• по 10 мкл сыворотки пациента на каждые 1000 мкл Rf разбавляющего буфера
7.2.2 Хранение проб
Пробы пациентов хранятся не более 7 дней при температуре 2-8°С. Более длительное
хранение проб возможно при температуре < -20°С.
Следует избегать повторных циклов замораживания и оттаивания.
Разбавленные образцы могут храниться при 2-8°С в течение одной недели.
7.3. Приготовление реагентов
7.3.1 Микротитровальные стрипы
Титровальные стрипы или лунки теста упакованы вместе с осушителем. Ненужные
лунки следует извлечь из рамки держателя и снова положить в специальный пакет,
который закрывается герметически.
7.3.2 Контрольные сыворотки/стандартные сыворотки
Контрольная и стандартная сыворотки готовы к употреблению и не требуют
дальнейшего разбавления. Они могут непосредственно использоваться в тесте. 1
При каждом тесте независимо от количества использованных титровальных стрипов
должны проводиться у контрольных сывороток простой и Cut-off, ay стандартных
сывороток двойной анализ.
Контрольные сыворотки не обрабатывать абсорбентом ревматоидного фактора!
Ш Конъюгат к человеческим IgG, IgA или IgM-AP (готовый к употреблению)
Конъюгаты различных партий (номера лотов) нельзя менять, поскольку они
адаптированы к соответствующему антигенному покрытию микротитровальных
стрипов. Конъюгаты взаимозаменяемы, как описано в пункте 7.1 Строго избегать
бактериального заражения готового к употреблению конъюгата (не производить
забора непосредственно из бутылочки с конъюгатом).
73.4 Буфер для промывки
Концентрат буфера для промывки (Vi) разбавить дистиллированной водой в
соотношении 1:30 до конечного объема (V ).
2
Пример:
Концентрат буфера для промывки (VI) Конечный объем (V2)
33,3 мл 1000 мл
1,0 мл 30 мл
7.3.5 Разбавляющий буфер для проб (готовый к употреблению)
7.3.6 Субстрат (готовый к употреблению)
Во избежание загрязнения бактериями используйте перчатки. Для забора раствора
субстрата используйте только стерильные наконечники пипеток!
7.3.7 Стоп-реагент (готовый к употреблению)
7.4 Краткий порядок проведения теста
Adenovirus IgG/IgM/IgA
количественный
Для определения 1дМ антител провести предварительную Rf абсорбцию проб
Разбавление проб
(пробы пациентов) IgG: 1+2000 IgA: 1+500
Добавление разбавленных проб и готовых к употреблению контрольных/стандартных
сывороток (100 мкл)
ИНКУБАЦИЯ 60 мин./37°С влажная камера
ПРОМЫВКА
Добавление раствора конъюгата (100 мкл)
ИНКУБАЦИЯ 30 мин./37°С влажная камера
*
ПРОМЫВКА
Добавление раствора субстрата (100 мкл)
ИНКУБАЦИЯ 30 мин./37°С влажная камера
Добавление стоп-реагента (100 мкл)
ИЗМЕРЕНИЕ ПОГЛОЩЕНИЯ при 405 нм
7.5 Проведение теста
1. Установить необходимое количество лунок в тестовую рамку и закрепить лист
протокола.
2. По 100 мкл разбавленных проб или готовых к употреблению контролей ввести
пипеткой в соответствующие лунки титровальных стрипов. Одну лунку необходимо
оставить для холостого значения, например:
IgG/IgM/IgA количественный:
Антигенные лунки
Лунка А1 Холостое значение субстрата
Лунка В1 Отрицательный контроль
Лунка С1 Стандартная сыворотка
Лунка D1 Стандартная сыворотка
Лунка Е1 Пациент 1...
3. Инкубация образцов 60 минут (+/-5 мин.) при 37°С (+/-1°С) во влажной камере.
4. По истечении времени инкубации, лунки промойте (в промывателе или вручную):
аспирируйте инкубационную жидкость или удалите ее из лунок вытряхиванием
• в каждую лунку введите по 300 мкл водного раствора
• аспирируйте буфер для промывки или удалите его вытряхиванием
• повторите процедуру 3 раза (т.е. всего промойте 4 раза)
• вытряхните планшет на бумажные салфетки
5 Добавление конъюгата
100 мкл готового к употреблению IgG/IgM/IgA конъюгата ввести в соответствующие
лунки (кроме холостого значения субстрата).
Инкубация конъюгата 30 минут (+/-1 мин.) ‘ при 37°С (+/-1°С) во влажной камере.
По истечении времени инкубации промойте лунки (см. выше).
8, Добавление субстрата
По 100 мкл готового к употреблению раствора субстрата введите во все лунки (в т.ч. и в
лунку для холостого значения субстрата).
Инкубация субстрата 30 минут (+Д мин.)*при 37°С (+Д°С) во влажной камере.
10. Остановка реакции
По 100 мкл останавливающего раствора введите во все лунки, микротитровальный
планшет слегка встряхните.
11. Измерение поглощения
В течение 60 мин. при 405 нм к холостому значению субстрата, эталонная длина волны
в пределах 620-690 нм (например, 650 нм).
t
J
Учтите, пожалуйста, что в особых условиях работы может возникнуть необходимость лабораторной
13
8. ОБРАБОТКА ДАННЫХ ТЕСТА SERION ELISA classic Adenovirus IgG/ IgM/ IgA
(количественный)
8.1 Количественное измерение сыворотки по методу 4PL
Определение концентрации антител в тесте SERION ELISA classic производится по
"логистической логарифмической модели с 4 параметрами (4PL)", математическая фун
которой описывается следующей формулой:
D - А
OD = А + -----------------------------------
^ g В(С - In конц.)
Параметры А, В, С и D точно передают ход кривой и определяют
1. нижнюю асимптоту d ) параметр А
2. подъем кривой w параметр В
3. точку перегиба кривой щ ) параметр С
4. верхнюю асимптоту параметр D
Институт BnpnoH\Serion ГмбХ (Вюрцбург) для каждой партии наборов определят
стандартные кривые в нескольких тестах при соблюдении оптимальных условий !
пользователя отпадает необходимость в дорогостоящем и занимающем много времен
построении стандартной кривой.
Для расчетов результатов хода теста пользователь в каждой упаковке теста получае
соответственно адаптированную к партии стандартную кривую в виде графика и таблиц
значений. Соответственное программное обеспечение для оценки предоставляется вотв
на запрос.
Для выравнивания колебаний тестов и проверки качества хода теста в поставку включен
т.н. стандартная сыворотка. Этой контрольной сыворотке при контроле качеств
присваивается номинальное значение и область применения, в пределах которо!
возможна точная и надежная обработка результатов теста. Стандартная сыворотка»
имеет функции положительной контрольной сыворотки и в отдельных ELISA-тестах мода
оцениваться, как предельная или отрицательная.
8.2 Критерии действительности теста
• Холостое значение субстрата должно иметь значение OD < 0,25.
• Отрицательный контроль при оценке теста должен быть отрицательным.
• При количественном варианте SERION ELISA classic среднее значение OD
стандартной сыворотки, после вычета значения холостого субстрата, должно
быть в пределах области применения, указанной в сертификате контроля
качества данной партии.
• При качественном варианте SERION ELISA classic среднее значение OD
положительного контроля, после вычета значения холостого субстрата должно
быть в пределах области применения, указанной в сертификате контроля
качества данной партии.
• Отдельные значения OD не должны расходиться более чем на 20%.
Если эти критерии не выполняются, тест является недействительным и его необходимо
повторить.
8.3 Обработка данных теста SERION ELISA classic Adenovirus IgG/IgM/IgA
(количественный)
8.3.1 Неавтоматизированная обработка
Для обработки результатов теста прилагаются стандартная кривая, а также таблица
значений, при помощи которых каждому полученному в результате теста значению OD
может быть определена соответствующая активность антител. В таблице оценки
приведено "номинальное значение" стандартной сыворотки, а также область его
применения.
Холостое значение субстрата (прозрачного) необходимо до обработки данных
вычитать из всех результатов измерений.
з Метод 1: Качественный расчет
Для установления области Cut-off в OD среднее значение измеренного стандартного OD
умножают на числовое значение, указанное в сертификате качества (см. формулы для
специальных систем оценок), например: OD = 0,502 х MW(STD) при верхнем значении Cut
off OD = 0,352 х MW(STD) при нижнем значении Cut-off Если, например, среднее значение
поглощения стандартной сыворотки равно 0,64, получается, что область Cut-off находится в
пределах от 0,225 до 0,321.
Метод 2: Бесступенчатое определение активности антител при помощи стандартной
кривой.
Колебания тестов, в зависимости от того или иного дня или лаборатории (т.н. межпробная
дисперсия) выравниваются за счет умножения текущей измереной величины пробы
пациента на поправочный коэффициент F.
15
§
F = Номинальное значение OD стандартной сыворотки / значение OD стандартной
сыворотки в определенный день
Сначала путем расчета коэффициента необходимо исправить суточные колебания:
1 Из двух значений поглощения стандарта образовать среднее значение и проверил
находится ли полученное значение в допустимых пределах.
2 Расчет коэффициента "F": Указанное номинальное значение стандарта делится нг
среднее значение поглощения: 1
F= номинальное значение стандарта / среднее значение поглощения стандарта.
3 Все измеренные величины проб пациентов умножаются на "F".
4 На основании откорректированных измеренных величин при помощи стандартной
кривой считываются значения активности антител в мЕд/мл или Ед/мл. I
Обобщение для SERION ELISA Adenovirus IgG у детей:
Положительный результат теста >10 Ед/мл
Пограничный результат теста 8-10 Ед/мл
Отрицательный результат теста <8 Ед/мл
Обобщение для SERION ELISA Adenovirus IgG у взрослых:
Положительный результат теста >13 Ед/мл |
Пограничный результат теста 10-13 Ед/мл
Отрицательный результат теста <10 Ед/мл
Обобщение для SERION ELISA Adenovirus IgA у детей:
Положительный результат теста >10 Ед/мл
Пограничный результат теста 8-10 Ед/мл
Отрицательный результат теста <8 Ед/мл
Обобщение для SERION ELISA Adenovirus IgA у взрослых:
Положительный результат теста >14 Ед/мл |
Пограничный результат теста 11-14 Ед/мл
Отрицательный результат теста <11 Ед/мл
ае пограничного результата, тест следует провести параллельно с новыми
ами (парных сывороток), взятыми с интервалом в 1-2 недели.
3.2 Автоматическая обработка теста при помощи программы SERION easy base
4PI/SERION evaluate
результате ввода 4 параметров и номинального значения стандартной сыворотки
■ь,
мивность антител после замеров исследуемого планшета рассчитывается специальной
гограммой для расчета.
случае, если значение выходит за рамки области применения, программа SERION easy
se4PL может выдать следующие сообщения об ошибках:
;тандарты выходят за пределы допусков"; и/или "Стандарты различаются более чем на
в7/0 ."
юбщение об ошибках программы SERION evaluate производится только на английском
ыке:
andard values out of ranges in following groups: Group 1-24. Standard value differ more
in 20% in following groups: Group 1-24."
лих случаях результат теста является недействительным и его следует повторить.
раметры и номинальное значение необходимо менять только при изменении партии
)раметры и номинальное значение приведены в таблице значений). Верность ввода этих
зисящих от партии значений можно проверить при помощи соответствующих
андартной сыворотке значений мЕд/мл или Ед/мл. Полученное среднее значение
лжно совпадать с указанным в сертификате партии значением. Корректировка значения
юра производится автоматически. На дисплее учета результатов появляется
дующий текст:
— именование пробы
ачение OD
4/мл или Ед/мл
дсчёт
17
16
и>
8.4 Интерпретация результатов
В пункте 8.3.1 даны пограничные результаты для определения концентраций антител IgG*
IgA к аденовирусу у детей и у взрослых. Если концентрация превышает пограничное
значение, следует исходить из того, что имеется острая инфекция. Если концентрар
лежит в пределах пограничных значений, то нельзя исключить наличия инфекции. Точную
информацию можно получить, если исследовать парные сыворотки на содержание
антител, которые следует забирать с интервалом в несколько недель. Из-за большого
индивидуального различия иммуных реакций, концентрация IgG при наличие острой
инфекции может быть выше или ниже пограничных результатов.
Для определения пограничных значений были исследованны 250 неотобранных сыворото
доноров и 38 (IgG) и 34 (IgA) сывороток маленьких детей. Из данных следует, что в тест
SERION ELISA classic Adenovirus IgG были у взрослых 94% (дети 87%)отрицательными,1,2'
(5,3%) пограничными и 3,9% (7,9%) положительными на антитела к аденовирус)
Соответственно на антитела IgA к аденовирусу были получены следующие данные: 94!
(85%), 2,3% (5,9%) и 3,8% (8,8%).
9. ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ЧЕРТЫ
9.1 Точность
Точность в пределах сыворотки была определена при использовании сывороток
различной реактивностью многократно (п = 20) в планшете с антигенным покрытием. Дг
определения точности в пределах сыворотки пробы сыворотки с различной реактивности
испытывались в 10 независимых друг от друга опытах.
Стандартное отклонение
Коэффициент вариации (КВ) = -----------------------------------------------------хЮО
Среднее значение
SERION ELISA classic Adenovirus IgA:
Среднее Внутрипробное
значение (Intraassay) (КВ
поглощения %)
(O D )
Проба пограничная 0,338 7,8
положительная 0,456 5,2
резкоположительная 0,676 7Д
9,2 Чувствительность и специфичность
Для определения чувствительности и специфичности IgG ELISA аденовируса были
проанализированны 170 отдельных сывороток лиц в возрасте от 1 года до 78 лет, а так же
156 парных сывороток лиц в возрасте от 1 года до 80 лет тестом IgG ELISA аденовирус в
сравнении с реакцией связывания комплемента. Корреляция 482 проб сывороток в обеих
тестовых системах была хорошей. 97,3% сывороток совпадали.
SERION ELISA classic
Adenovirus
IgG-выявление
Чувствительность 96,7 %
Специфичность 97,8 %
• IgA-антитела в реакции связывания комплемента не выявляются. Чувствительность и
специфичность относительно РСК были рассчитаны при условие, что образование антител
IgA после инфекции проходит параллельно образованию антител связывания
комплемента.
Между обеими тестовыми системами наблюдалась хорошая корреляция: 80 из 90
сывороток были охарактеризованы одинаково. Без учета пограничных сывороток была
определена чувствительность в 80,0% и специфичность в 90,1%. Немного низкая
чувствительность ELISA по сравнению с РСК зависела от сывороток, которые в РСК были
определены как слабоположительные (на одну ступень титра выше, чем пограничный титр).
Такой слабый титр может быть результатом давней инфекции. В SERION ELISA classic
Adenovirus IgA такие сыворотки характеризуются в основном как отрицательные.
В другом исследование SERION ELISA classic Adenovirus IgG был сравнен с имеющейся в
* продаже Adenovirus IgG ELISA (ELISA А). В данном исследование 88 сывороток были
i сравнены с известным результатом РСК. Результаты данного сравнения представлены в
1 следующей таблице:
Результаты
SERION ELISA classic Adenovirus
Результаты ElisaA Положит. Пограничн. Отрицат.
! Положит. 40 16 12
Пограничн. 0 0 1
Отрицат. 0 0 19
BSERION ELISA classic Adenovirus IgG 12 сывороток были определены как отрицательные,
которые в ELISA А были определены как положительные. В РСК 11 из этих сывороток были
j отрицательными или пограничными, а 12-ая была слабоположительная. Следует исходить
[изтого, что в ELISA А часть здоровых лиц определяется как сероположительные.
19
<1
10. МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ
10.1 Предостережения и меры предосторожности
Тест SERION ELISA classic предназначен только для использования специалис
безупречно владеющим необходимыми навыками.
При обращении с реагентами теста и пробами пациентов необходимо выполнение
общепринятых лабораторных правил:
• Упаковка теста содержит человеческие сыворотки. Хотя все контрольные
сыворотки имеют отрицательные значения содержания вирусов HBs-Ag,
гепатита С, а также ВИЧ, их следует рассматривать, как потенциально
инфекционно опасные материалы.
• Не набирайте растворы в пипетку при помощи рта.
• В помещениях, где ведется работа с реагентами теста и пробами пациентов,
не разрешается принимать пищу, пить или курить.
• При обращении с реагентами теста и пробами пациентов следует избегать
прямого контакта, поэтому следует использвать лабораторный халат,
одноразовые перчатки и защитные очки. Руки по окончании работы следует
тщательно мыть.
• Пробы пациентов и все потенциально инфекционные материалы поел
проведения теста следует е
обеззаразить.
• Реагенты необходимо хранить в месте, недоступном для детей.
• Стоп-реагент: едкий (С); R34: вызывает химические ожоги, необходимо
использовать защитные очки, перчатки и лабораторный халат
10.2 Утилизация
Пожалуйста, выполняйте предписания, предусмотренные действу|<
законодательством!
v i r i o n \ s e r i o n
Производитель
SERION ELISA Aspergillus antigen
Институт Вирион/Серион ООО SERION ELISA антиген аспергиллус
Фридрих-Бергиус-Ринг 19 Д- 97076
Вюрцбург Телефон: +49 (0) 9 31. 30 45 0
Факс: +49 (0) 9 31. 30 45 100 Эл. почта:
dialog@virion-serion.de Интернет:
www.virion-serion.de Инструкция по применению - русский язык
(Данная версия № V 8.09/09-2)
Russian
SERION ELISA Aspergillus antigen
SERION ELISA антиген аспергиллус
ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
2. ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
3. ПРИНЦИП РАБОТЫ SERION ELISA Aspergillus antigen
4. СОДЕРЖИМОЕ И СОСТАВ УПАКОВКИ ТЕСТА
5. ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ
6. ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ РЕАКТИВОВ
7. ПРОВЕДЕНИЕ ТЕСТА SERION ELIS A Aspergillus antigen
7.1 Общие указания
7.2 Исследуемый материал, подготовка и хранение проб
7.3 Подготовка реактивов
7.4 Краткий порядок проведения теста
7.5 Проведение теста
8. ОБРАБОТКА ДАННЫХ ТЕСТА
8.1 Критерии действительности теста
8.2 Обработка данных теста SERION ELISA Aspergillus antigen (количественный)
8.3 Обработка данных SERION ELISA Aspergillus antigen
8.4 Интерпретация результатов
9. ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ЧЕРТЫ
9.1 Чувствительность и специфичность
9.2 Точность
10. МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ
11. ЛИТЕРАТУРА
SERION ELISA Aspergillus antigen
Иммуноферментный набор для определения антигенов аспергилла б сыворотке
Только для диагностики in vitro
1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Иммуноферментный тест-набор SERION ELISA Aspergillus antigen является
иммуноферментным тестом по принципу сэндвича. Это количественный и
качественный тест для выявления антигенов аспергилла в сыворотке.
2. ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Aspergillus плесневые грибки относятся к аскомицетам. Эти организмы образуют
развлетвленные мицелии. Размножение грибка осуществляется через конидии, которые
ик особо стойкие постоянные формы освобождаются из мицелий. 20 видам Aspergillus
подходит гуманпатогенное значение оппортунистический возбудитель болезни, наиболее
мжной разновидностью является Aspergillus fumigatus.
тР Aspergillus fumigatus вызывает целый ряд аллергических и инвазивных заболеваний
I; человека. Бронхопульмональные заболевания относятся к наиболее распространенным
^явлениям инвазивных аспергилоз. У пациентов с персистирующей иммуной
щресией после операций по пересадке костного мозга или трансплантаций может
развиться тяжелая форма Aspergillose, например инвазивная Aspergillose лёгких (IAL). IAL
появляется как острая пневмония. Сопровождаясь высокой температурой возникают
эдиологически возрастающие пульмональные инфильтраты.
Патогенез инвазивных Aspergillus-инфекций происходит в несколько ступеней:
лиоковые споры передаются и воспринимаются по воздуху, так называемым
юаэрозольным способом. Благодаря своему размеру, прим. 3 мкм, они проникают до
точных альвеол. При инвазивных Aspergillose нити грибка проникают при помощи
иобожденных протеиназов в слизистую бронхов и паренхиму лёгкого. Aspergillen имеют
вденцию проникать в кровяные сосуды и поселяться после гематогенной диссеминации
йлдаленных тканях.
3. ПРИНЦИП РАБОТЫ SERION ELISA antigen
При сэндвичной технике ELISA микрострипы теста покрыты антителами
специфическому возбудителю. Находящиеся в пробе пациента имеющиеся антиг!
возбудителя связываются с антителами, образуя твёрдую фазу.
Для проявления реакции используют специфические возбудителю тестовые антите
помеченные пероксидазой, направленные против антигена. В положительном случае о
связывают антитела на антиген. При добавлении субстрата (перикиси водорода)
хромогена (тетраметилбензидин ТМБ) происходит ферментно-субстратно-хромогеш
реакция, дающая синюю окраску. После добавления стоп-реагента происходит изменен
цвета на жёлтый. Интенсивность жёлтой окраски измеряется фотометрическим способ!
она пропорциональна уровню содержания антигена.
4. СОДЕРЖИМОЕ И СОСТАВ УПАКОВКИ ТЕСТА
Компоненты теста и состав Штук/объем
'.Отрывные микротитровальные стрипы, каждый по 8 отдельных лунок,
12
покрытых специфическими возбудителю антигенами (всего 96)
Отрицательный контроль (готовый к использованию)
2x3 мл
Консервант: <0,09 % азид натрия
Стандартная сыворотка(готовая к использованию)
4x3 мл
Консервант: <0,01 % азид натрия
Конъюгат
Антитела к антигенам аспергилла, конъюгированные с пероксидазой,
стабилизированные протеиновым стабилизирующим раствором и
7,5 мл
детергентом.
Консервант: 00,2 % метилизотиазолон, 0,1% катон CG, 0,02 %
|ромнитродиоксан
Промывочный концентрат (доводится до 500 мл)
Раствор хлористого натрия с твин 20 25 мл
Консервант: ОД % катон CG
[Дер для проб
15 мл
Кислый раствор без консерванта.
дщ-реактив
12 мл
5 N серная кислота
[МБ-раствор субстрата (готовый к использованию)
}1Б с перекисью водорода 11 мл
Кзнсервант: <0.1 % азид натрия
[ертификат контроля качества 1
| • | Обычное лаборато |
| • | Спектрофотометр |
| | нм, рекомендуема |
| | (например, 650 нм) |
| • | Термостат инкубат |
| • | В лажная камера |
| • | Дистиллированная |
5. ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ
рное оборудование
для микротитровальных стрипов с фильтром, длина волны 405
я дшна эталонной волны в пределах от 620 нм до 690 нм
ор 37°С
вода
' г-----
{ ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ РЕАКТИВОВ
Реактив Хранение Срок
годности
Шикротитровальные После вскрытия упаковки при 2-8°С при 4 недели
* арилы (специфические к использовании осушителя, в закрытом виде
1 возбудителю антитела)
Невскрытая упаковка До истечения
срока годности
Следует обратить внимание на то , чтобы
неиспользованные лунки хранились в сухих
условиях и герметично в специальном пакете из
композитной алюминиевой пленки
Контрольные/стандартные После вскрытия упаковки при 2-8°С До окончания
сыворотки срока
хранения;
24 месяца с
даты выпуска
Аьнъюгат Готовый к употреблению раствор при 2-8°С 24 месяца с
Следует избегать заражения (стерильные даты выпуска
наконечники!)
Разбавляющий буфер После вскрытия упаковки при 2-8°С 6 месяцев
В неоткрытом виде До окончания
срока
Помутневшие растворы использовать не хранения; 24
следует месяца с даты
выпуска
Буфер для промывания Концентрат после вскрытия упаковки при До окончания
2-8°С срока
хранения;
Готовый раствор при 2-8°С 2 недели
Готовый раствор при комнатной температуре 1 недели
1 Емкость для готового раствора следует
(! регулярно промывать!
Помутневшие растворы использовать не
следует
Субстрат Готовый раствор при 2-8°С, хранить в До окончания
защищенном от света месте срока
хранения;
Избегайте загрязнения микробами! При 24 месяца с
наличии интенсивной желтой окраски даты выпуска
(экстинкция дистиллированной воды > 0,25)
не использовать.
I [топ-реактив после вскрытия упаковки при 2-8°С До окончания
срока
хранения;
г
{ 6
7. ПРОВЕДЕНИЕ ТЕСТА SERION ELISA Aspergillus antigen
7.1 Общие указания
Следует использовать исключительно реактивы SERION ELISA a n tig e n , поскольк
адаптированы друг к другу внутри системы, и не заменять их реактивами д
производителей. Конъюгаты в зависимости от партии адаптированы к конкре'
тест-набору и не могут использоваться в тест-наборах других партий. Буфе]
промывания, стоп-реактив и раствор субстрата могут использоваться во всех тестах SI
ELISA antigen независимо от партий и наборов.
Все компоненты теста SERION ELISA antigen следует использовать до истечения
годности (см. указания на этикетке) при соблюдении правильных условий хранен!
применять реактивы после истечения срока годности. Об этом см. также п. 6 "ХРАН
И СРОК ГОДНОСТИ РЕАКТИВОВ"
Неверное разбавление реактивов может привести к потерям чувствительности.
Реактивы теста во время хранения и инкубации необходимо защищать от яркого
После использования плотно закрыть упаковку во избежание высыхания и бактериат
загрязнения.
Специальный пакет для лунок микротитровального стрипа следует разрезать то:
предусмотренных для этого местах, отмеченных насечками. При повреждении пак
алюминиевой пленки или неплотной упаковке пакета, для хранения неиспользов
лунок, их не следует использовать для теста.
ТМБ-раствор субстрата чувствителен к окисляющим веществам и тяжелым металл
использовать пипеток с металлическими деталями). Его следует всегда содер>
защищённом от света месте. ТМБ-раствор субстрата открывать непосредственно
использованием по возможности при наименьшем освещении. Этот раствор
окрашен в зелено-голубой цвет. Избегать контакта кожных покровов с раств
субстрата и стоп-реакгива!
Воспроизводимость результатов зависит, кроме прочего, и от тгцате;
перемешивания соответствующих реактивов. Перед забором контрольных матери
конъюгата емкости необходимо хорошо встряхнуть и соответствующие разбавления
пипетированием необходимо хорошо перемешать мономиксером (например, Vortex)
Необходимо следить за аккуратным заполнением лунок и соблюдением указанных
времени и температуры инкубации.
Во избежание ложноположительных результатов наконечник пипетки при
конъюгата ни в коем случае не должен касаться и смачивать верхний край
(осторожно при использование пипеток с загнутым наконечником или многокаш
пипеток).
Значительные различия во времени между заполнением первой и последней лунок
приводит к различиям "прединкубационного периода", которые могут значительно
повлиять на точность и воспроизводимость измеренных значений.
Правильная промывка препятствует неспецифичности теста: После выполнения
инкубационных этапов раствор, находящийся в лунках, следует во избежании
неспецифических реакций субстрата отсасывать, а не вытряхивать. Следует выполнять
руководство к применению используемых промывателей. Важно равномерное
наполнение лунок буфером для промывания и его полное удаление после промывки
^(возможны неконтролируемые эффекты при разбавлении). Избегать образования пены!
^ Не повреждать покрытие лунок!
Лишь строгое соблюдение рабочей инструкции теста SERION ELISA Aspergillus antigen
обеспечивает правильность результатов.
П Подготовка проб и хранение
7.2.1 Исследуемый материал:
Липидные, гемолизированные, а также иктеричные пробы следует использовать лишь с
оговоркой, хотя в ходе наших исследований не было замечено негативного влияния.
^ |ригодными для исследований материалами являются пробы сыворотки, полученные
щартными лабораторными методами.
722 Подготовка проб
Перед началом теста, пробы (пациентов, стандартные и контрольные) (Vi) обработать
буфером проб (V2):
SERION ELISA Aspergillus antigen:
?:+V2 = 300 мкл сыворотки + 100 мкл буфера проб
I
t)6bi следует хорошо размешать мономиксером (например, Vortex) для получения
огенного раствора.
В заключение пробы нагревать при 100°С в течение 5 минут. Обратить обязательно
внимание на выдержку времени и температуры!
Обычные реактивные сосуды для термолиза не пригодны; мы рекомендуем
реакционные сосуды с предохранительным или с завинчивающимся затвором.
Обратите внимание: при использование термостата блока нагрева проверить
настройку температуры на 100 °С -120° С откалиброванным термометром; при
отклонениях соответственно отрегулировать термометр блока нагрева.
Образуется белый плотный осадок.
Отцентрифугировать пробу в течение 10 минут в настольной центрифуге при 10 000
об/мин.
Надосадочную жидкость использовать в дальнейшем ходе теста.
7.2.3 Хранение проб
Подготовленные таким образом пробы хранят максимально 24 часа при температуре
2-8°С.
Не обработанные пробы пациентов хранятся не более 7 дней при температуре 2-8°С.
длительное хранение проб возможно при температуре < -20°С.
Следует избегать повторных циклов замораживания и оттаивания.
7.3 Подготовка реактивов
7.3.1 Микротитровальные стрипы
Титровальные стрипы или лунки теста упакованы вместе с осушителем.
Ненужные лунки следует извлечь из рамки держателя и снова положить в
специальный пакет, закрывающийся герметически нажатием в
предусмотренных местах.
7.3.2 Контрольные сыворотки/стандартные сыворотки
Контрольные и стандартные сыворотки следует развести буфером проб и затем
денатурировать (см. раздел 7.2.2)
При каждом тесте независимо от количества использованных титровальных
стрипов должны проводиться у контрольных сывороток простой, ау
стандартных сывороток двойной анализ.
7.3.3 Готовый к применению конъюгат
Конъюгат готов к применению
7.4 Краткий порядок проведения теста SERION ELISA Aspergillus antigen
Подготовка проб
Смесь сыворотки с буфером проб
(300 мкл сыворотки + 100 мкл буфера проб)
ИНКУБАЦИЯ 5 мин./ 100-120° С
центрифугировать, настольная центрифуга Эппендорфа,
10 мин./10000 об/мин.
Ход теста
Заполнение лунок готовым к применению раствором конъюгата (по 50мкл) j
Добавление надосадочных жидкостей (по 50 мкл) (обработанные буфером проб сыворотки
пациентов или контроли)
й
ИНКУБАЦИЯ 90 мин./37°С влажная камера
а
ПРОМЫВКА (5 х 300 мет)
Д
Добавление ТМБ-раствора субстрата (100 мкл)
ИНКУБАЦИЯ 30 мин./18-25°С Защищенная от света
а
Стоп-реактив (100 мки)
И
ИЗМЕРЕНИЕ ПОГЛОЩЕНИЯ при 450 нм
^Проведение теста
1 Обработка сывороток (стандартных, контрольных, пациентов) как описано в разделе
2 Оставить или установить необходимое количество лунок в планшет и закрепить лист
' протокола. Предусмотреть одну лунку пустую (холостое значение субстрата).
3. Накапать по 50 мкл готового к применению раствора конъюгата в лунки (но не в
холостое значение субстрата).
1 Накапать по 50 мкл надосадочных жидкостей отрицательных контролей, стандартных
(двойное приготовление) и сывороток пациентов в конъюгат. Например:
Лунка А1 Пустая (холостое значение субстрата)
Лунка В1 Отрицательный контроль
Лунка С1 Стандартная
Лунка D1 Стандартная
, Лунка Е1 Проба!...
I Инкубация проб в течение 90 минут (+/- 5 мин.) при 37°С (+/-1°С) во влажной камере.
Шо истечении времени инкубации промыть лунки (в промывателе или вручную):
• аспирировать инкубационную жидкость из лунок
• ввести в каждую лунку по 300 мкл буфера для промывания
• аспирировать буфер для промывания
• повторить процедуру 4 раза (т.е. всего промыть 5 раз)
• вытряхнуть планшет на бумажные салфетки
П Добавление субстрата
I По 100 мкл готового к употреблению ТМБ-раствора субстрата ввести во все лунки
(вт.ч. и в лунку для холостого значения субстрата).
Инкубация субстрата в течение 30 минут (+/-1 мин.) при18-25°С (+/-1°С), защищенно от
и.
IОстановка реакции
Ввести по 100 мкл стоп-раствора во все лунки, слегка встряхнуть планшет.
' Измерение поглощения
В течение 60 минут при 450 нм к холостому значению субстрата, эталонная длина
волны в пределах 620 нм и 690 нм (напр. 650 нм).
/9
4 .
8. ОБРАБОТКА ДАННЫХ ТЕСТА
8.1 Критерии действительности теста
Холостое значение субстрата (прозрачного) необходимо вычитать из результатов
измерений.
• Холостое значение субстрата должно иметь значение OD < 0,25.
• Отрицательный контроль при оценке теста должен быть отрицательным.
• При количественном варианте SERION ELISA antigen среднее значение OD
стандартной сыворотки, после вычета значения холостого субстрата, должно быть в
пределах области применения, указанной в сертификате контроля качества данной
партии.
• При качественном варианте SERION ELISA antigen среднее значение OD
положительного контроля, после вычета значения холостого субстрата, должно быть
в пределах области применения, указанной в сертификате контроля качества
данной партии.
• Отдельные значения OD не должны расходиться более чем на 20%.
• Если эти критерии не выполняются, тест является не действительным и
его необходимо повторить. j
1
8.2 Обработка данных теста SERION ELISA Aspergillus antigen (количественный)
8.2.1 Количественное измерение сыворотки по методу 4PL
Определение концентрации антигена в тесте SERION ELISA Aspergillus antigen
производится по "логистической логарифмической модели с 4 параметрами (4PL)",
математическая функция которой описывается следующей формулой:
D -А
OD = А +
^ ^ В(С - In конц.)
Параметры А, В, С и D точно передают ход кривой и определяют
1. нижнюю асимптоту - параметр А
2. подъем кривой - параметр В
3. точку перегиба кривой - параметр С
4. верхнюю асимптоту - параметр D
Институт BnpnoH\Serion ГмбХ (Вюрцбург) для каждой партии наборов определяет
стандартные кривые в нескольких тестах при соблюдении оптимальных условий. У
пользователя отпадает необходимость в дорогостоящем и занимающем много времени
построении стандартной кривой.
Для расчетов результатов хода теста пользователь в каждой упаковке теста получает
соответственно адаптированную к партии стандартную кривую в виде графика и таблицу
значений. Соответственное программное обеспечение для оценки предоставляется по
запросу.
Для выравнивания колебаний тестов и проверки качества хода теста в поставку включена
тн стандартная сыворотка. Этой контрольной сыворотке при контроле качества
присваивается номинальное значение и область применения, в пределах которой возможна
точная и надежная обработка результатов теста. Стандартная сыворотка не имеет
функции положительной контрольной сыворотки и в отдельных ELISA-тестах может
оцениваться, как предельная или отрицательная.
13 Обработка данных SERION ELISA Aspergillus antigen
13,1 Неавтоматизированная обработка
Ди обработки результатов теста прилагаются стандартная кривая, а также таблица
качений, при помощи которых каждому полученному в результате теста значению OD
иожет быть определена соответствующая концентрация антигена. В таблице оценки
приведено "номинальное значение" стандартной сыворотки, а также область его
применения.
Холостое значение субстрата (прозрачного) необходимо до обработки данных вычитать
из всех результатов измерений.
<[етод 1: Качественный расчет
установления области Cut-off в OD среднее значение измеренного стандартного OD
шножают на числовое значение, указанное в сертификате качества (см. формулы для
социальных систем оценок), например:
0D = 0,502 х MW(STD) при верхнем значении Cut-off
DD=0,352 х MW(STD) при нижнем значении Cut-off
Если, например, среднее значение поглощения стандартной сыворотки равно 0,64,
залучается, что область Cut-off находится в пределах от 0,225 до 0,321.
Метод 2: Бесступенчатое определение концентрации антигена при помощи стандартной
кривой.
[олебания тестов, в зависимости от того или иного дня или лаборатории (т.н. межпробная
иертя) выравниваются за счет умножения актуальной измереной величины пробы
цента на поправочный коэффициент F.
Номинальное значение OD (стандартной сыворотки)
F = ------------------------------------------------------------------------------------------
Значение OD (стандартной сыворотки) в определенный день
Этот метод необходим, чтобы актуальный уровень измерения пользователя подровнять
или нормализировать к специфической каждой партии стандартной кривой.
Сначала путем расчета коэффициента необходимо исправить суточные колебания:
1 Из двух значений поглощения стандарта образовать среднее значение и проверит
находится ли полученное значение в допустимых пределах.
2 Расчет коэффициента "F": Указанное номинальное значение стандарта делится нг
среднее значение поглощения: F = номинальное значение стандарта / среднее значени
поглощения стандарта.
3 Все измеренные величины проб пациентов умножаются на "F".
4 На основании откорректированных измеренных величин при помощи стандартн
кривой считываются значения концентрации антигена в Ед/мл.
Обобщение для Serion ELISA Aspergillus antigen:
Положительный результат теста >2,30 Ед/мл
Пограничный результат теста 1,15 - 2,30 Ед/мл
Отрицательный результат теста <1,15 Ед/мл
8.3.2 Автоматическая обработка теста при помощи программы SERION easy base
4PL/SERION evaluate
В результате ввода 4 параметров и номинального значения стандартной сыворо
концентрации антигена после замеров исследуемого планшета рассчитывас
специальной программой для расчета.
В случае, если значение выходит за рамки области применения, программа SERION е
base 4PL может выдать следующие сообщения об ошибках:
"Стандарты выходят за пределы допусков"; и/или "Стандарты различаются более 1
на 20%."
Сообщение об ошибках программы SERION evaluate подается только на английском
! лыке:
«Standard values out of ranges in following groups: Group 1-24. Standard value differ more
than 20% in following groups: Group 1-24."
mix случаях результат теста является недействительным и его следует повторить.
Параметры и номинальное значение необходимо менять только при изменении партии
(параметры и номинальное значение приведены в таблице значений). Верность ввода этих
зависящих от партии значений можно проверить при помощи соответствующих
стандартной сыворотке значений Ед/мл. Полученное среднее значение должно совпадать
с указанным в сертификате партии значением. Корректировка значения замера
производится автоматически. На дисплее учета результатов появляется следующий текст:
Наименование пробы Значение OD Ед/мл Подсчёт
^Интерпретация результатов
Положительный результат теста в материале пациента указывает на наличие грибка
шдщы. Интерпретацию результатов следует проводить только с учетом всей
готической картины и определением титра антител.
О положительном результате можно говорить, если выявлено по крайней мере 2,3
циниц. Такой результат в пробе сыворотки означает, что в пробе имеются
юзбудители кандиды в концентрации 2,3 нгр./мл протеина. При этом речь может
ш как о живом возбудителе, так и о не живом.
)фицательный результат теста не исключает наличия острой инфекции
шветствующим возбудителем. Особенно при высоком титре антител к кандиде может
)ыть, что антитела так сильно маскируют антиген, что даже после денатурации при
Заготовке пробы антиген не может быть распознан. Отрицательный результат теста
южеттак же быть вызван временем забора пробы во время инфекции, неподходящим
абором пробы, подготовкой пробы или её хранением.
ч
9. ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ЧЕРТЫ
9.1 Чувствительность и специфичность
Во институтском исследование Serion ELISA Aspergillus antigen были проверены 245
сыворотки взрослых и результаты сравнены с имеющимся в продаже тестом. 182 сыворо
были от случайных доноров. Ещё 63 сывороток были от пациентов, у которых во время
интенсивного медицинского лечения были установлены признаки системного кандидоз.
Были вычислены следующие отличительные признаки:
Чувствительность 98 %
Специфичность 95 %
Во вне институтском исследование были проверены сыворотки пациентов, у которых в
культурах было выявлено наличие возбудителя аспергиллеза. Выявление грибка в
культуре крови является «золотым стандартом». Это означает, что все эти сыворотки (п=
считаются потенциально положительными к антигену аспергилла.
Эти 30 сывороток пациентов, у которых возбудитель был определён по культуре, были
протестированны в сравнительных тестах Serion ELISA Aspergillus antigen и двух других
имеющихся в продаже антигенных тестах (тест A: ELISA; тест В: Latex-агглюцинация)
Virion Serion Тест А Тест В
П ол ожительные 19 14 10
Пограничные 2 0 4
Отрицательные 9 16 16
Чувствительность 67,86 % 46,67 % 38,47 %
C£
ERION ELISA classic Aspergillus fumigatus IgG/IgM/IgA
ГЛАВЛЕНИЕ
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
ПРИНЦИП РАБОТЫ SERION ELISA classic
СОДЕРЖИМОЕ И СОСТАВ УПАКОВКИ ТЕСТА
ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ
ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ РЕАГЕНТОВ
ПРОВЕДЕНИЕ ТЕСТА SERION ELISA classic
7.1 Общие указания
7.2 Подготовка и хранение проб
7.3 Подготовка реагентов
7.4 Краткий порядок проведения теста
7.5 Проведение теста
. ОБРАБОТКА ДАННЫХ ТЕСТА
8.1 Количественное измерение сывороток по 4 параметрам логарифмической
модели (4PL)
8.2 Критерии действительности теста
8.3 Обработка данных теста SERION ELISA classic
Aspergillus fumigatus IgG/IgM/IgA (количественный)
8.4 Интерпретация результатов
I. ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ЧЕРТЫ
9.1 Точность
9.2 Чувствительность и специфичность
10. МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ
10.1 Предостережения и меры предосторожности
10.2 Утилизация
II. ЛИТЕРАТУРА
Данная версия № V 9.04/12-1
(предыдущая версия: V 8.04/03-1)
issian 1
SERION ELISA classic Aspergillus fumigatus IgG/IgM/IgA
Иммуноферментный набор для определения антител к
иммуноглобулинам человека (IgG/IgM/IgA)
- только для диагностики in vitro -
Набор IgG (количественный) № для заказа: ESR132G
Набор IgM (количественный) № для заказа: ESR132M
Набор IgA (количественный) № для заказа: ESR132A
Тесты одобрены : Dade Behring ВЕР ® III / ВЕР ® 2000, DSX, в ручном режиме
1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Иммуноферментный тест-набор SERION ELISA classic Aspergillus fumigatu
IgG/IgM/IgA предназначен для качественного и количественного выявления антита
человека к Aspergillus fumigatus вирусам в сыворотке или плазме. Раздельный охва
по иммуноглобулиновым классам способствует более четкой картине .
микологическом контроле пациентов групп риска.
2. ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Aspergillus плесневые грибки относятся к аскомицетам. Эти организмы образую
развлетвленные мицелии. Размножение грибка осуществляется через конидй]
которые как особо стойкие постоянные формы освобождаются из мицелий. 20 вида!
Aspergillus подходит гуманпатогенное значение оппортунистический возбудител
болезни, наиболее важной разновидностью является Aspergillus fumigatus.
Aspergillus fumigatus вызывает целый ряд аллергических и инвазивных заболевали]
у человека. Бронхопульмональные заболевания относятся к наиболе
распространенным проявлениям инвазивных аспергилоз. У пациентов
персистирующей иммуной суппресией после операций по пересадке костного мозг
или трансплантаций может развиться тяжелая форма Aspergillose, наприме
инвазивная Aspergillose лёгких (IAL). IAL проявляется как острая пневмонш
Сопровождаясь высокой температурой возникают радиологически возрастающи
пульмональные инфильтраты.
Патогенез инвазивных Aspergillus-инфекций происходит в несколько ступеней:
Грибковые споры передаются и воспринимаются по воздуху, так называемы
биоаэрозольным способом. Благодаря своему размеру, прим. 3 мкм, они проникак
до лёгочных альвеол. При инвазивных Aspergillose нити грибка проникают пр
помощи освобожденных протеиназов в слизистую бронхов и паренхиму лёгкой
Aspergillen имеют тенденцию проникать в кровяные сосуды и поселяться поел
гематогенной диссеминации в отдаленных тканях.
russian 2
серодиагностике для выявления специфических для Aspergillus антител при
[вазивных аспергиллозах используют непрямые гемагпнотинативные тесты (IHAT).
щако они, из-за их относительно низкой чувствительности, не пригодны как медот
бора.
iSA-методы, при использование специфических для классов иммунглобулинов
цимных конъюгатов, дают возможность дифференциированное рассмотрение
акций антител в ходе контроля пациентов из группы риска. Для дальнейшего
гагноза инвазивных аспергиллоз у пациентов групп риска следует проверить лёгкие
(средством метода биопсии на наличие возможного ущерба.
ПРИНЦИП РАБОТЫ SERION ELISA classic
ж использовании непрямой техники ELISA, микрострипы теста покрыты
ответствующим антигеном. Специфические антитела, находящиеся в пробе
циента, связываются с этими антигенами, образуя твердую фазу.
ы проявления серологической реакции используют помеченные щелочной
эсфатазой выявленные антитела, направленные против человеческих
шуноглобулинов пробы пациента, которые в положительном случае связаны с
тигеном. При добавлении субстрата (паранитрофенилфосфата) в результате
акции фермента и субстрата происходит окрашивание раствора в желтый цвет,
тгенсивность желтой окраски измеряется фотометрическим способом; она
юпорциональна уровню содержания специфических антител.
4. СОДЕРЖИМОЕ И СОСТАВ УПАКОВКИ ТЕСТА
Компоненты теста и состав Колич./
объём
Отрывные микрострипы, каждая с 8 отдельными лунками с
антигенным покрытием (всего 96), 12
1 тестовый держатель
Напыленный материал деактивирован
Стандартная сыворотка (готовая к употреблению) 2 х 2 мл
Человеческая сыворотка в фосфатном буфере с протеином;
отрицательная в отношении антител к HIV, антигенов I IBs -Ag
(поверхностных антигенов вируса гепатита В) и антител к HCV;
консервант: < 0,1 % азид на трия
Краситель: Amaranth О
Отрицательная контрольная сыворотка (готовая к 2 мл
употреблению)
Человеческая сыворотка в фосфатном буфере с протеином;
отрицательная в отношении антител к HIV, антигенов HBs -Ag
(поверхностных антигенов вируса гепатита В) и антител к HCV;
консервант: < 0,1 % азид натрия
Краситель: Lissamin-зеленый V
Конъюгаты к человеческим IgG, IgA, IgM (готовые к 13 мл
употреблению)
Поликлональные козьи антитела направленные против
человеческих IgG, IgA, IgM, конъюгированные со щелочной
фосфатазой, стабилизированные протеиновым
стабилизирующим раствором
Консервант: 0,01 % метилизотиазолон
0,01 % бромнитродиоксан
Концентрат раствора для промывания (достаточно для 1000 33,3 мл
мл)
Раствор хлорида натрия с Tween 20, 30 mM Tris
Консервант: <0,1 % азид натрия
Буфер для разведения 2 х 50 мл
Фосфатный буфер с протеином и Tween 20;
Консервант: < 0,1 % азид натрия
0,01 г/л бромфеноловой голубой соли натрия
Стоп-реагент 15 мл
1,2 N натровый щелок
Субстрат (готовый к употреблению) 13 мл
паранитрофенилфосфат, буфер без растворителя,
Консервант: < 0,1 % азид натрия
Сертификат контроля качества со стандартной кривой и 1
таблицей значений
(количественное выражение антител в мЕд/мл или Ед/мл)
russian 4
5. ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ
- Обычное лабораторное оборудование
I
Для выявления IgM:
Rf абсорбент SERION Rf-Absorbens (№ для заказа Z200/20ml)
Спектрофотометр для микротитровальных стрипов с фильтром, длина волны 405
нм, рекомендуемая длина эталонной волны в пределах от 620 нм до 690 нм
(например, 650 нм)
- Термостат инкубатор 37°С
Блажная камера
■- Дистиллированная вода
6. ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ РЕАГЕНТОВ
Реактив Хранение Срок годности
Микротит- после вскрытия упаковки при 2-8 °С при использовании 4 недели
ровальные осушителя, в закрытом виде
стрипы
(антиген) Следует обратить внимание на то, чтобы неиспользованные лунки
хранились в сухих условиях и герметично в специальном пакете из
композитной алюминиевой пленки.
Контрольные/ после вскрытия упаковки при 2-8°С до окончания
стандартные срока хранения;
сыворотки 24 месяца с дата
выпуска
Конъюгат готовый к употреблению раствор при 2-8°С до окончания
срока хранения;
Следует избегать заражения (стерильные наконечники пипеток!) 28 месяца с даты
выпуска
Разбавляю после вскрытия упаковки при 2-8°С 24 месяца
щий буфер Помутневшие растворы использовать не следует.
до окончания
в неоткрытом виде срока хранения
36 месяцев с
даты выпуска
Буфер для концентрат после вскрьгшя упаковки при 2-8°С до окончания
промывания срока хранения
готовый раствор при 2-8°С 2 недели
готовый раствор при комнатной температуре 1 неделя
Емкость для готового раствора следует регулярно промывать!
Помутневшие растворы использовать не следует.
Субстрат готовый раствор при 2-8°С, хранить в защищенном от света месте до окончания
срока хранения
Избегайте загрязнения микробами! При наличии интенсивной желтой 24 месяца с даты
окраски (экстинкция дистиллированной воды > 0,25) не использовать. выпуска
Стоп-реагент после вскрытия упаковки при комнатной температуре до окончания
срока хранения
russian 5
7. ПРОВЕДЕНИЕ ТЕСТА SERION ELISA classic
7.1 Общие указания
Необходимо использовать исключительно реагенты SERION ELISA cli
поскольку они адаптированы друг к другу внутри системы, и не заменят
реагентами других производителей. Стандартные и контрольные сыворотки, а т
конъюгаты в зависимости от партии адаптированы к конкретному тест-набору
могут использоваться в тест-наборах других партий. Разбавляющий буфер, б)
для промывывания, стоп-реагент и раствор субстрата могут использоваться во
тестах SERION ELISA classic независимо от партий и наборов.
Для каждого класса иммунглобулина имеются три разных концентрации конъюг
НИЗКАЯ, СРЕДНЯЯ И ВЫСОКАЯ.
Классификацию конъюгата можно распознать на этикетках по следук
обозначениям:
Напр. IgG + IgG-конъюгат низкой концентрации
IgG ++ IgG-конъюгат средней концентрации
IgG +++ IgG-конъюгат высокой концентрации
Чтобы сохранить высокое качество наших тест-наборов, необходимо в отдел
случаях применять особые конъюгаты. Это особые партии и они не и
обозначений «+». Специальные конъюгаты нельзя заменять другими конъюгата!
Пожалуйста, всегда обращайте внимание на надписи на этикетках!
Все компоненты теста ELISA classic следует использовать до истечения срока год
(см. указания на этикетке) при соблюдении правильных условий хранени:
применять реагенты после истечения срока годности. По этому поводу см, так»
"ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ РЕАГЕНТОВ"
Неверное разбавление реагентов может привести к потерям чувствительности.
Реагенты теста во время хранения и инкубации необходимо защищать от я
света. После использования плотно закрыть упаковку во избежание высыха!
бактериального загрязнения.
При повреждении пакета из алюминиевой пленки или неплотной упаковке п
для хранения неиспользованных лунок, их рте следует использовать для теста.
Все реагенття теста перед его началом необходимо довести до коми
температуры.
При извлечении порции реактива, во избежание загрязнения их микробами ст
всегда соблюдать правила стерильности. Во избежание ложноположите.
результатов наконечник пипетки при вводе конъюгата ни в коем случае не д<
касаться и смачивать верхний край лунок. При закрытии флаконов необх<
russian 6
следить за тем, чтобы для этого использовалась соответствующая данному флакону
крышка.
Воспроизводимость результатов зависит, кроме прочего, и от тщательного
перемешивания соответствующих реагентов. Перед забором контрольной сыворотки
и конъюгата емкости необходимо хорошо встряхнуть. Растворы проб перед вводом
необходимо хорошо размешать мономиксером (например, Vortex).
Необходимо следить за аккуратным заполнением лунок и соблюдением указанных
времени и температуры инкубации. Значительные различия во времени между
заполнением первой и последней лунок при добавлении проб/контрольных
сывороток, конъюгата и субстрата приводит к различиям "прединкубационного
периода", которые могут значительно повлиять на точность и воспроизводимость
измеренных значений.
Лишь строгое соблюдение рабочей инструкции теста SERION ELISA classic
обеспечивает правильность результатов.
Результаты теста можно учитывать лишь в том случае, если соблюдены все условия в
зависимости от партии, приведенные в сертификате контроля качества, прилагаемом
к набору.
Правильная промывка препятствует неспецифичности теста:
Следует выполнять руководство к применению используемых промывателей. В тесте
SERION ELISA classic используются плоские планшеты. Важно равномерное
наполнение лунок буфером для промывки и его полное удаление после промывки
(возможны неконтролируемые эффекты при разбавлении). Избегать образования
пены! Не повреждать покрытие лунок!
I 7.2 Подготовка и хранение проб
Липидные, гемолизированные, а также иктеричные пробы (сыворотка или плазма)
следует использовать лишь с оговоркой, хотя в ходе наших исследований не было
замечено негативного влияния. Пробы, загрязненные бактериями, использовать не
следует.
Пригодными для исследований материалами являются пробы сыворотки или плазмы
(EDTA, цитрат, гепарин), полученные стандартными лабораторными методами.
Пробы нельзя деактивировать термическим способом.
russian 7
7.2.1 Разбавление проб
Перед началом теста, пробы (Vi) растворить в разбавляющем буфере (Уг):
SERION ELISA classic Aspergillus fumigatus IgG
Vt + V 2 = 1+500 no 10 мкл сыворотки пациента
на каждые 1000 мкл разбавляющего буфера (=1 + 10(
50 мкл из первого разбавления
на каждые 200 мкл разбавляющего буфера (=1+4)
SERION ELISA classic Aspergillus fumigatus IgA
Vi + V2 = 1+100 no 10 мкл пробы пациента
на каждые 1000 мкл разбавляющего буфера
После каждого разбавления и перед отбором, пробы следует хорошо р;
мономиксером (например, Vortex) для получения гомогенного раствора.
SERION ELISA classic Aspergillus fumigatus IgM
Антитела ревматоидного фактора в большинстве являются ауто-антителах
IgM, которые в основном связываются с иммунными комплекса
Специфическое выявление IgM антител из-за этих ревматоидных фактор
иметь ложноположительные результаты. Кроме того, существует возл
вытеснения IgM-антител с более слабыми связями IgG-антителами с более с
связями. Обнаружение IgM в этом случае может оказаться ложноотрицател!
этой причине пробы для определения IgM необходимо предварительно of
абсорбентом ревматоидного фактора.
(SERION-Rheumafaktor-Absorbens, заказ Nr. Z200 (20 ml/100 определений).
Сначала производится разбавление абсорбента ревматоидного факто
разбавляющим буфером (Уг) в соотношении 1+4.
Vi + V2 = 1 + 4 по 200 мкл Rf-абсорбента
на каждые 800 мкл разбавляющего буфера
russian 8
Затем пробы пациента (V ) разбавляются в смеси Rf и разбавляющего буфера (Уз):
4
V 4 + Уз = 1+500 по 10 мкл пробы пациента
на каждые мкл Rf -разбавляющего буфера (= 1 + 100)
1000
50 мкл из первого разбавления
на каждые 200 мкл Rf -разбавляющего буфера (=1 + 4)
7.2.2 Хранение проб
зобы пациентов хранятся не более 7 дней при температуре 2-8°С. Более длительное
анение проб возможно при температуре < -20°С.
едует избегать повторных циклов замораживания и оттаивания.
Разбавленные образцы могут храниться при 2-8°С в течение одной недели.
ussian 9 ш
7.3. Приготовление реагентов
7.3.1 Микротитровальные стрипы
Титровальные стрипы или лунки теста упакованы вместе с осушител
Ненужные лунки следует извлечь из рамки держателя и снова положит
специальный пакет, который закрывается герметически.
7.3.2 Контрольные сыворотки / стандартные сыворотки
Контрольная и стандартная сыворотки готовы к употреблению и не треб)
дальнейшего разбавления. Они могут непосредственно использоваться в тесте
При каждом тесте независимо от количества использованных титровалы
стрипов должны проводиться у контрольных сывороток простой и Cut-off,
стандартных сывороток двойной анализ.
Контрольные сыворотки не обрабатывать абсорбентом ревматоидного факто
7.3.3 Конъюгат к человеческим IgG, IgA, IgM (готовый к употреблению)
Конъюгаты различных партий (номера лотов) нельзя менять, поскольку i
адаптированы к соответствующему антигенному покрьп
микротитровальных стрипов.
Конъюгаты взаимозаменяемы, как описано в пункте 7.1
Строго избегать бактериального заражения готового к употреблению конъю]
(не производить забора непосредственно из бутылочки с конъюгатом).
7.3.4 Буфер для промывки
Концентрат буфера для промывки (Vi) разбавить дистиллированной воде
соотношении 1:30 до конечного объема (Уг).
Пример: _____________________________________________________
Концентрат буфера для Конечный объем (Уг)
промывки (Vl)
33,3 мл 1000 мл
1,0 мл 30 мл
7.3.5 Разбавляющий буфер для проб (готовый к употреблению)
7.3.6 Субстрат (готовый к употреблению)
Во избежание загрязнения бактериями используйте перчатки. Для заЕ
раствора субстрата используйте только стерильные наконечники пипеток!
7.3.7 Стоп-реагент (готовый к употреблению)
russian 10
7.4 Краткий порядок проведения теста
Aspergillus fumigatus
IgG/IgM/IgA quantitativ
Для обнаружения IgM антител провести предварительную Rf-абсорбцию проб.
Разбавление проб
(пробы пациентов)
IgG, IgM: 1+500
IgA: 1+100
41
-
Добавление разбавленных проб и
готовых к употреблению контрольных/стандартных сывороток (100 мкл)
И
ИНКУБАЦИЯ 60 мин./37°С
влажная камера
11
ПРОМЫВКА
11
-
Добавление раствора конъюгата (100 мкл)
А
ИНКУБАЦИЯ 30 мин./37°С
влажная камера
11
-
ПРОМЫВКА
11
Добавление раствора субстрата (100 мкл)
11
-
ИНКУБАЦИЯ 30 мин./37°С
влажная камера
11
Добавление стоп-реагента (100 мкл)
11
-
ИЗМЕРЕНИЕ ПОГЛОЩЕНИЯ при 405 нм
russian 11
7.5 Проведение теста
1. установить необходимое количество лунок в тестовую рамку и закрепить л
протокола.
2. По 100 мкл разбавленных проб или готовых к употреблению контролен вве
пипеткой в соответствующие лунки титровальных стрипов. Одну nyi
необходимо оставить для холостого значения, например:
IgG/IgM/lgA количественный:
Антигенные лунки
Лунка А1 Холостое значение субстрата
Лунка В1 Отрицательный контроль
Лунка С1 Стандартная сыворотка
Лунка D1 Стандартная сыворотка
Лунка Е1 Пациент 1....
3. Инкубация образцов 60 минут (+/- 5 мин.) при 37°С (+/-1°С) во влажной каме
4. По истечении времени инкубации, лунки промойте (в промывателе 1
вручную):
- отсосите инкубационную жидкость или удалите ее из лунок вытряхиванием
- в каждую лунку введите по 300 мкл водного раствора
- отсосите буфер для промывки или удалите его вытряхиванием
- повторите процедуру 3 раза (т.е. всего промойте 4 раза)
- вытряхните планшет на бумажные салфетки
5. Добавление конъюгата
100 мкл готового к употреблению IgG/IgM/lgA конъюгата ввести в
соответствующие лунки (кроме холостого значения субстрата).
6. Инкубация конъюгата 30 минут (+/-1 мин.) * при 37°С (+/-1°С) во влаж
камере.
7. По истечении времени инкубации промойте лунки (см. выше).
8. Добавление субстрата
По 100 мкл готового к употреблению раствора субстрата введите во все лунк
т.ч. и в лунку для холостого значения субстрата).
9. Инкубация субстрата 30 минут (+/1 мин.)’ при 37°С (+/1°С) во влажной каме
10. Остановка реакции
По 100 мкл останавливающего раствора введите во все лунки,
микротитровальный планшет слегка встряхните.
11. Измерение поглощения
В течение 60 мин. при 405 нм к холостому значению субстрата, эталонная дли]
волны в пределах 620-690 нм (например, 650 нм).
Учтите, пожалуйста, что в особых условиях работы может возникнуть необходил
лабораторной адаптации инкубационного периода.
russian 12
8. ОБРАБОТКА ДАННЫХ ТЕСТА
SERION ELISA classic Aspergillus fumigatus IgG / IgM / IgA (количественного)
8.1 Количественное измерение сыворотки по методу 4PL
/ Определение концентрации антител в тесте SERION ELISA classic производится по
"логистической логарифмической модели с 4 параметрами (4PL)", математическая
функция которой описывается следующей формулой:
D - А
OD = А +
р -I- g В(С - In конц.)
Параметры А, В, С и D точно передают ход кривой и определяют
1. нижнюю асимптоту О параметр А
2. подъем кривой параметр В
3. точку перегиба кривой параметр С
4. верхнюю асимптоту параметр D
Институт BnpnonXSerion ГмбХ (Вюрцбург) для каждой партии наборов определяет
стандартные кривые в нескольких тестах при соблюдении оптимальных условий. У
пользователя отпадает необходимость в дорогостоящем и занимающем много
времени построении стандартной кривой.
Для расчетов результатов хода теста пользователь в каждой упаковке теста получает
соответственно адаптированную к партии стандартную кривую в виде графика и
таблицу значений. Соответственное программное обеспечение для оценки
предоставляется в ответ на запрос.
Для выравнивания колебаний тестов и проверки качества хода теста в поставку
включена т.н. стандартная сыворотка. Этой контрольной сыворотке при контроле
качества присваивается поминальное значение и область применения, в пределах которой
возможна точная и надежная обработка результатов теста. Стандартная сыворотка не
имеет функции положительной контрольной сыворотки и в отдельных ELISA-тестах
может оцениваться, как предельная или отрицательная.
russian 13
8.2 Критерии действительности теста
Холостое значение субстрата должно иметь значение OD < 0,25.
Отрицательный контроль при оценке теста должен быть отрицательным.
При количественном варианте SERION ELISA classic среднее значение О
стандартной сыворотки, после вычета значения холостого субстрата, должно бьп
в пределах области применения, указанной в сертификате контроля качесп
данной партии.
При качественном варианте SERION ELISA classic среднее значение О
положительного контроля, после вычета значения холостого субстрата долш
быть в пределах области применения, указанной в сертификате контрш
качества данной партии.
Отдельные значения OD не должны расходиться более чем на 20%.
Если эти критерии не выполняются, тест является недействительным и его
необходимо повторить.
8.3 Обработка данных теста
SERION ELISA classic Aspergillus fumigatus IgG / IgM / IgA (количественного)
8.3.1 Неавтоматизированная обработка
Для обработки результатов теста прилагаются стандартная кривая, а также табли!
значений, при помощи которых каждому полученному в результате теста значеш
OD может быть определена соответствующая активность антител. В таблице оцет
приведено "номинальное значение" стандартной сыворотки, а также область е:
применения.
Холостое значение субстрата (прозрачного) необходимо до обработки даннь
вычитать из всех результатов измерений.
Метод 1: Качественный расчет
Для установления области Cut-off в OD среднее значение измеренного стандартно:
OD умножают на числовое значение, указанное в сертификате качества (см. формул
для специальных систем оценок), например:
OD = 0,502 х MW(STD) при верхнем значении Cut-off
OD = 0,352 х MW(STD) при нижнем значении Cut-off
Если, например, среднее значение поглощения стандартной сыворотки равно 0,6
получается, что область Cut-off находится в пределах от 0,225 до 0,321.
Метод 2: Бесступенчатое определение активности антител при помощи стандартно!
кривой.
Колебания тестов, в зависимости от того или иного дня или лабораторо
(т.н. межпробная дисперсия) выравниваются за счет умножения текущей измерено
величины пробы пациента на поправочный коэффициент F.
russian 14
Номинальное значение OD (стандартной сыворотки)
F -------------------------------------------------------------------------------------
Значение OD (стандартной сыворотки) в определенный день
Сначала путем расчета коэффициента необходимо исправить суточные колебания:
1. Из двух значений поглощения стандарта образовать среднее значение и
проверить, находится ли полученное значение в допустимых пределах.
2. Расчет коэффициента "F": Указанное номинальное значение стандарта делится
на среднее значение поглощения:
F = номинальное значение стандарта / среднее значение поглощения стандарта.
3. Все измеренные величины проб пациентов умножаются на "F".
4. На основании откорректированных измеренных величин при помощи
стандартной кривой считываются значения активности антител в мЕд/мл или
; Ед/мл.
Обобщение для SERION ELISA Aspergillus fumigatus IgG / IgM / IgA
Положительный результат теста: >70 Ед/мл
Пограничный результат теста: 50-70 Ед/мл
Отрицательный результат теста: <50 Ед/мл
В случае пограничного результата, тест следует провести параллельно с новыми
пробами (парных сывороток), взятыми с интервалом в 1-2 недели.
russian 15
8.3.2 Автоматическая обработка теста при помощи программ
SERION easy base 4PL/SERION evaluate
В результате ввода 4 параметров и номинального значения стандартной сыворот
активность антител после замеров исследуемого планшета рассчитывает
специальной программой для расчета.
В случае, если значение выходит за рамки области применения, программа SERIC
easy base 4PL может выдать следующие сообщения об ошибках:
"Стандарты выходят за пределы допусков"; и/или "Стандарты различаются
6oj
чем на 20%."
Сообщение об ошибках программы SERION evaluate производится только
английском языке:
«Standard values out of ranges in following groups: Group 1-24. Standard value d:l
more than 20% in following groups: Group 1-24."
В этих случаях результат теста является недействительным и его следует повторил
Параметры и номинальное значение необходимо менять только при измене
партии (параметры и номинальное значение приведены в таблице значен
Верность ввода этих зависящих от партии значений можно проверить при поме
соответствующих стандартной сыворотке значений мЕд/мл или Ед/мл. Получен
среднее значение должно совпадать с указанным в сертификате партии значеш
Корректировка значения замера производится автоматически. На дисплее у'
результатов появляется следующий текст:
Наименование пробы
Значение OD
мЕд/мл или Ед/мл
Подсчёт
russian 16
8.4 Интерпретация результатов
<и
ся IgM-антитела после первичной инфекции обнаруживаются первыми, затем следуют
IgA-антитсла. IgM-антитела исчезают через прим. 16 недель, так же как и IgA-
антитела.
При реинфекции возрастание титра IgM и IgA иммуной реакции слабое и бывает
редко.
е
IgG-антитела возникают по сравнению с IgM-антителами с запозданием. После
| достижения максимума их концентрация снижается, нередко в течение нескольких
1 лет.
Сероконверсия указывает на наличие острой инфекции. Это может быть как
первичная инфекция, так и реинфекция. Следует брать серию проб с интервалом 1-2
недели.у некоторых пациентов с иммуной суппресией нет реакции IgG-антител.
При интерпретации результатов серологической диагностики следует учитывать всю
клиническую картину. В случае сомнений следует использовать другие методы
диагностики, например выявление антигена для установления наличия острой
инфекции или радиологический метод и биопсию при подозрении на инвазивную
Aspergillose.
Перекрестные реакции с другими грибковыми антителами, напр. антителами
Candida albicans, не наблюдаются.
9. ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ЧЕРТЫ
9.1 Точность
Л, Точность в пределах сыворотки была определена при использовании сывороток с
J различной реактивностью многократно (п = 20) в планшете с антигенным
покрытием. Для определения точности в пределах сыворотки пробы сыворотки с
различной реактивностью испытывались в 10 независимых друг от друга опытах.
ч Стандартное отклонение
Коэффициент вариации (КВ) = —-----—-----------------------х 100
Среднее значение
SERION ELISA classic Aspergillus fumigatus IgG:
Среднее Внутрипробное Среднее Межпробное
значение (Intraassay) значение (Interassay)
поглощения (КВ %) поглощения (КВ %)
(OD) (OD)
Проба
отрицательная 0Д07 5,00 0,106 11,20
слабоположительная 0,524 6,80 0,394 7,60
russian 17
SERION ELISA classic Aspergillus fumigatus IgM:
Среднее Внутрипробное Среднее Межг
значение (Intraassay) значение (Inte
поглощения (КВ %) поглощения (К)
(OD) (OD)
Проба
отрицательная 0,323 10,70 0,323 10,50
слабоположительная 0,495 6,40 0,500 5,80
SERION ELISA classic Aspergillus fumigatus IgA:
Среднее Внутрипробное Среднее Меж]
значение (Intraassay) значение (Int<
поглощения (КВ %) поглощения (К
(OD) (OD)
Проба
отрицательная 0,174 13,80 0,172 11,90
положительная 1,208 4,30 1,199 5,10
9.2 Чувствительность и специфичность
Для сравнения с одним непрямым тестом гемагглюцинации (IHA
исследованы 86 сывороток пациентов повышенного риска.
При тесте IHAT выявляются кроме IgG-антител преимущественно IgM-
Чувствительность комбинированного теста SERION ELISA classic Aspergillus
IgM и SERION ELISA classic Aspergillus fumigatus IgG по сравнению c IHAT c
89,7 %. Пограничные значения в SERION ELISA classic IgG, IgM и IgA пре;
собой отрицательные результаты у > 95 % исследуемых неотобранных с
доноров.
18
russian
10. МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ
10.1 Предостережения и меры предосторожности
Тест SERION ELISA classic предназначен только для использования специалистами,
безупречно владеющим необходимыми навыками.
При обращении с реагентами теста и пробами пациентов необходимо выполнение
общепринятых лабораторных правил:
• Упаковка теста содержит человеческие сыворотки. Хотя все контрольные
сыворотки имеют отрицательные значения содержания вирусов HBs-Ag, гепатита
С, а также ВИЧ, их следует рассматривать, как потенциально инфекционно
опасные материалы.
■ Не набирайте растворы в пипетку при помощи рта.
В помещениях, где ведется работа с реагентами теста и пробами пациентов, не
разрешается принимать пищу, нить или курить.
- При обращении с реагентами теста и пробами пациентов следует избегать
прямого контакта, поэтому следует использвать лабораторный халат,
одноразовые перчатки и защитные очки. Руки по окончании работы следует
тщательно мыть.
Пробы пациентов и все потенциально инфекционные материалы после
проведения теста следует обеззаразить.
Реагенты необходимо хранить в месте, недоступном для детей.
• Стоп-реагент:
едкий (С); R34: вызывает химические ожоги,
необходимо использовать защитные очки, перчатки и лабораторный халат
10.2 утилизация
Пожалуйста, выполняйте предписания, предусмотренные действующим
законодательством!
v i r i o n \ s e r i o n
Производитель SERION ELISA classic
Bordetella pertussis IgG/IgM/lgA
Институт Вирион/Серион ООО
Фридрих-Бергиус-Ринг 19
Д-97076 Вюрцбург
Инструкция по применению - русский язык
Телефон: +49 (0) 9 31. 30 45 0
Факс: +49 {0)9 31. 30 45 100
Эл. почта: dialog@virion-serion.de (Данная версия № V 14. 09/02-1)
Интернет: www.virion-serion.de
Russian
Обновления
Пожалуйста, обратите внимание на изменения по сравнению с
предыдущей версией
Номер версии: V14. 09/02-1
Предыдущая версия: V13. 06Д1-1
Изменение в главе: 9.1
SERION ELISA classic Bordetella pertussis IgG/IgM/IgA
ОГЛАВЛЕНИЕ
1 ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
2
3 ПРИНЦИП РАБОТЫ SERION ELISA classic
C€
4 СОДЕРЖИМОЕ И СОСТАВ УПАКОВКИ ТЕСТА
5 ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ
6 ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ РЕАГЕНТОВ
7 ПРОВЕДЕНИЕ ТЕСТА SERION ELISA classic
7.1 Общие указания
7.2 Подготовка и хранение проб
7.3 Приготовление реагентов
7.4 Краткий порядок проведения теста
7.5 Проведение теста
8 ОБРАБОТКА ДАННЫХ ТЕСТА SERION ELISA classic
8.1 Количественное измерение сыворотки по методу 4PL
8.2 Критерии действительности теста
8.3 Обработка данных теста SERION ELISA classic Bordetella pertussis IgG/IgM/IgA
(koj i ичествег шый)
8.4 Интерпретация результатов
9 ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ЧЕРТЫ
9.1 Точность
9.2 Чувствительность и специфичность
10 МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ
10.1 Предостережения и меры предосторожности
10.2 Утилизация
11 ЛИТЕРАТУРА
Данная версия № V: V 14. 09/02-1 ]
предыдущая версия: V13. 06/11-1
russian
SERION ELISA classic Bordetella pertussis IgG/Ig]VVIgA
Иммуноферментный набор для определения антител к
иммуноглобулинам человека IgG/IgM/IgA
- только для диагностики in vitro -
IgG-набор (количественный) № для заказа: ESR120 G
IgM-набор (количественный) № для заказа: ESR120 М
IgA-набор (количественный) № для заказа: ESR120 А
Тесты одобрены : Immunomat TWJJVsystem / BASEplus, Dade Behring ВЕР ® III /
ВЕР ® 2000, DSX, в ручном режиме
1 ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Иммуноферментный тест-набор SERION ELISA classic Bordetella pertussis
Ig G /Ig M /Ig A предназначен для качественного и количественного выявления
антител человека к Bordetella pertussis в сыворотке или плазме. Системы тестов
служат для диагностики инфекций Bordetella pertussis и поддержки
эпидемиологических исследований. IgG-ELISA можно применять для контроля
успешности прививки.
2 ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Die bakterielle Gattung Bordetella umfasst vier Spezies: Bordetella pertussis, B.
parapertussis, B. bronchiseptica und B. avium. Bei diesen Bakterien handelt es sich um
ubiquitar vorkommende, kleine (0,2 - 0,5 pm) gram-negative und obligat aerobe
Stabchenbakterien, die einzeln oder paarweise vorliegen und sich bei Temperaturen von
35 - 37 °C optmial vermehren. Die ausschlieRlich humanpathogenen B. pertussis und B.
parapertussis sind die Erreger des Keuchhustens (Pertussis) und dessen milder
verlaufender und weniger haufig auftretender Form (atypische Pertussis). Die beiden
anderen Spezies treten vor allem als Erreger respiratorischer Erkrankungen bei
warmbltitigen Tieren in Erscheinung. Allerdings hat auch B. bronchiseptica in seltenen
Fallen (z. B. bei engem Kontakt mit Tieren) eine humanpathogene Bedeutung als
opportunistischer Sekundarerreger bei Mischinfektionen (z. B. Bronchitis, Pneumonie,
Wundinfektion). Obwohl unter den drei humanpathogenen Bordetella-Spezies
phanotypische Unterschiede bestehen, weisen sie doch eine DNA-Homologie von 72 - 94
% auf, so class gegenwartig diskutiert wird, sie in einer gemeinsamen Spezies oder als drei
Subspezies einer einzelnen Spezies zusammenzufassen.
russian 2
3 ПРИНЦИП РАБОТЫ SERION ELISA classic
При использовании непрямой техники ELISA, микрострины теста покрыты]
соответствующим антигеном. Специфические антитела, находящиеся в пробе]
пациента, связываются с этими антигенами, образуя твердую фазу.
Для проявления серологической реакции используют помеченные щелочной
фосфатазой выявленные антитела, направленные против человечески!
иммуноглобулинов пробы пациента, которые в положительном случае связаны!
антигеном. При добавлении субстрата (паранитрофенилфосфата) в результате^
реакции фермента и субстрата происходит окрашивание раствора в желтый цвет.
Интенсивность желтой окраски измеряется фотометрическим способом; она!
пропорциональна уровню содержания специфических антител.
russian 5
4 СОДЕРЖИМОЕ И СОСТАВ УПАКОВКИ ТЕСТА
Компоненты теста и состав Колич./
объём
Отрывные микрострипы, каждая с 8 отдельными лунками с антигенным покрытием
(всего 96) MTPL
12
1 тестовый держате ль
Напыленный материал деактивирован
Стандартная сыворотка (готовая к употреблению) |STD| 2x2 мл
Человеческая сыворотка в фосфатном буфере с протеином; отрицательная в отношении
антител к HIV, антигенов HBs -Ag (поверхностных антигенов вируса гепатита В) и
антител к HCV; консервант: < ОД % азид натрия
Краситель: Amaranth О
Отрицательная контрольная сыворотка (готовая к употреблению) NEG| 2мл
Человеческая сыворотка в фосфатном буфере с протеином; отрицательная в отношении
антител к HIV, антигенов HBs -Ag (поверхностных антигенов вируса гепатита В) и
антител к HCV; консервант: < ОД % азид натрия
Краситель: Lissamin-зелепый V
Конъюгаты к человеческим IgG, IgA, IgM (готовые к употреблению) ]АРС| 13 мл
Поликлональные козьи антитела направленные против человеческих IgG, IgA, IgM,
конъюгированные со щелочной фосфатазой, стабилизированные протеиновым
стабилизирующим раствором
Консервант: 0,01 % метил изотиазолон
0,01 % бромнитродиоксан
Концентрат раствора для промывания (достаточно для 1000 мл) WASH 33,3 мл
Раствор хлорида натрия с Tween 20, 30 mM Tris
Консервант: < ОД % азид натрия
Буфер для разведения DILB 2 х 50 мл
Фосфатный буфер с протеином и Tween 20;
Консервант: < ОД % азид натрия
0,01 г/л бромфеноловой голубой соли натрия
Стоп-реагент |STOP 15 мл
1,2 N натровый щелок
Субстрат (готовый к употреблению) |pNPP| 13 мл
паранитрофенилфосфат, буфер без растворителя,
Консервант: < ОД % азид натрия
Сертификат контроля качества со стандартной кривой и таблицей значений INFO 1
(количественное выражение антител в мЕд/мл или Ед/мл)
russian 6
5 ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Обычное лабораторное оборудование
Для выявления IgM: 1
Rf абсорбент SERION Rf-Absorbens (№ для заказа Z200/ 20ml)
Спектрофотометр для микротитровальных стрипов с фильтром, длина волны
405 нм, рекомендуемая длина эталонной волны в пределах от 620 нм до 690 нм
(например, 650 нм)
Термостат инкубатор 37°С
Влажная камера
Дистиллированная вода
russian 7
6 ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ РЕАГЕНТОВ
Реактив Хранение Срок годности
Микротит- в неоткрытом виде См. срок хранения на планшете.
1 ровальные
| страны
Минимальный срок годности
| (антиген)
после вскрытия упаковки при 2-8 °С при 4 недели
использовании осушителя, в закрытом виде
Срок годности при правильном
Следует обратить внимание на то, чтобы применение и хранение
неиспользованные лунки хранились в сухих условиях
до истечения срока хранения
в специальном пакете из композитной алюминиевой
плетши с герметическим запором.
I Контрольные/ после вскрытия упаковки при 2-8°С до окончания срока хранения;
н
| стандартные 24 месяца с даты выпуска
[ сыворотки
Конъюгат готовый к употреблению раствор при 2-8°С до окончания срока хранения;
28 месяца с даты выпуска
Следует избеган, заражения (стерильные
наконечники пипеток!)
Разбавляю-щий после вскрытия упаковки при 2-8°С 24 месяца
буфер
Помутневшие растворы использовать не следует.
36 месяцев с даты выпуска
в неоткрытом виде
.
l Буфер для концентрат после вскрытия упаковки при 2-8°С до окончания срока хранения
1 промывания
2 недели
готовый раствор при 2-8°С 1 неделя
готовый раствор при комнапюй температуре
Емкость для готового раствора следует регулярно
промывай.! Помутневшие растворы использовать не
следует.
Субстрат готовый раствор при 2-8°С, хранить в защищенном от до окончания срока хранения
света месте
24 месяца с даты выпуска
Избегайте загрязнения микробами! При наличии
интенсивной желтой окраски (экстипкция
дистиллированной воды > 0,25) не использовать.
1 Стоп-реагент после вскрытия упаковки при комнатной до окончания срока хранения
температуре
__________________________
russian 8
При повреждении пакета из алюминиевой пленки или неплотной упаковке пакета,
для хранения неиспользованных лунок, их не следует использовать для теста.
Все реагенты теста перед его началом необходимо довести до комнатной
температуры.
При извлечении порции реактива, во избежание загрязнения их микробами следует
всегда соблюдать правила стерильности. Во избежание ложноположительных
результатов наконечник пипетки при вводе конъюгата ни в коем случае не должен
касаться и смачивать верхний край лунок. При закрытии флаконов необходимо
следить за тем, чтобы для этого использовалась соответствующая данному флакону
крышка.
Воспроизводимость результатов зависит, кроме прочего, и от тщательного
перемешивания соответствующих реагентов. Перед забором контрольной
сыворотки и конъюгата емкости необходимо хорошо встряхнуть. Растворы проб
перед вводом необходимо хорошо размешать мономиксером (например, Vortex).
Необходимо следить за аккуратным заполнением лунок и соблюдением указанных
времени и температуры инкубации. Значительные различия во времени между
заполнением первой и последней лунок при добавлении проб/контрольных
сывороток, конъюгата и субстрата приводит к различиям "прединкубационного
периода", которые могут значительно повлиять на точность и воспроизводимость
измеренных значений.
Лишь строгое соблюдение рабочей инструкции теста SERION ELISA classic
обеспечивает правильность результатов.
Результаты теста можно учитывать лишь в том случае, если соблюдены все условия в
зависимости от партии, приведенные в сертификате контроля качества,
прилагаемом к набору.
Правильная промывка препятствует неспецифичности теста:
Следует выполнять руководство к применению используемых промывателей. В тесте
SERION ELISA classic используются плоские планшеты. Важно равномерное
наполнение лунок буфером для промывки и его полное удаление после промывки
(возможны неконтролируемые эффекты при разбавлении). Избегать образования
пены! Не повреждать покрытие лунок!
russian 10
7.2 Подготовка и хранение проб
Липидные, гемолизированные, а также иктеричные пробы (сыворотка или пт
следует использовать лишь с оговоркой, хотя в ходе наших исследований не (
замечено негативного влияния. Пробы, загрязненные бактериями, использова:
следует.
Пригодными для исследований материалами являются пробы сыворотки, пл;
(EDTA, цитрат, гепарин), полученные стандартными лабораторными методами.
Пробы нельзя деактивировать термическим способом.
7.2.1 Разбавление проб
Перед началом теста, пробы (Vi) растворить в разбавляющем буфере (V ):
2
SERION ELISA classic Bordetella pertussis IgG/IgA
Vi + V = 1+1000 no 10 мкл сыворотки пациента
2
на каждые 1000 мкл разбавляющего буфера
После каждого разбавления и перед отбором, пробы следует хорошо разме
мономиксером (например, Vortex) для получения гомогенного раствора.
SERION ELISA classic Bordetella pertussis IgM
Интерференция ревматоидного фактора
Антитела ревматоидного фактора в большинстве являются ауто-антителами к
IgM, которые в основном связываются с иммунными комплексами
Специфическое выявление IgM антител из-за этих ревматоидных факторов ы
иметь ложноположительные результаты. Кроме того, существует возможг
вытеснения IgM-антител с более слабыми связями IgG-антителами с (
сильными связями. Обнаружение IgM в этом случае может оказ
ложноотрицательным. По этой причине пробы для определения IgM необхо
предварительно обработать абсорбентом ревматоидного фактора. (SEP
Rheumafaktor-Absorbens, Nr. для заказа Z4 (4 мл / 20 определений) / Z200 (20 mj
определений)).
russian 11
Сначала производится разбавление абсорбента ревматоидного фактора (Vi)
разбавляющим буфером (Уг) в соотношении 1+4.
Vi + V2 = 1 + 4 по 200 мкл Rf-абсорбента
на каждые 800 мкл разбавляющего буфера
Затем пробы пациента (У*) разбавляются в смеси Rf и разбавляющего буфера (Уз):
V4+ Уз = 1+100 по 10 мкл сыворотки пациента
на каждые 1000 мкл разбавляющего буфера
После каждого разбавления и перед отбором, пробы следует хорошо размешать
мономиксером (например, Vortex) для получения гомогенного раствора.
7.2.2 Хранение проб
Пробы пациентов хранятся не более 7 дней при температуре 2-8°С. Более
| длительное хранение проб возможно при температуре < -20°С.
[ Следует избегать повторных циклов замораживания и оттаивания.
Разбавленные образцы могут храниться при 2-8°С в течение одной недели.
I
russian 12
7.3 Приготовление реагентов
7.3.1 Микротитровалъные стрипы
Титровальные стрипы или лунки теста упакованы вместе с осушителем. Ненуж
лунки следует извлечь из рамки держателя и снова положить в специальный го
который закрывается герметически.
7.3.2 Контрольные сыворотки / стандартные сыворотки
Контрольная и стандартная сыворотки готовы к употреблению и не тре?
дальнейшего разбавления. Они могут непосредственно использоваться в тесте.
При каждом тесте независимо от количества использованных титровальных стр]
должны проводиться у контрольных сывороток простой и Cut-off, а у стагщар'
сывороток двойной анализ.
Контрольные сыворотки не обрабатывать абсорбентом ревматоидного фактора!
7.3.3 Конъюгат к человеческим IgG, IgA или IgM-AT (готовый к употреблению)
Конъюгаты взаимозаменяемы в пределах данной концентрации и к
иммунноглобулина.
Строго избегать бактериального заражения готового к употреблению конъюгат
производить забора непосредственно из бутылочки с конъюгатом).
7.3.4 Буфер для промывки
Концентрат буфера для промывки (Vi) разбавить дистиллированной во£
соотношении 1:30 до конечного объема (V2).
Пример:
Концентрат буфера для Конечный объем (V2)
промывки (Vi)
33,3 мл 1000 мл
1,0 мл 30 мл
7.3.5 Разбавляющий буфер для проб (готовый к употреблению)
7.3.6 Субстрат (готовый к употреблению)
Во избежание загрязнения бактериями используйте перчатки. Для забора рас
субстрата используйте только стерильные наконечники пипеток!
7.3.7 Стоп-реагент (готовый к употреблению)
russian 13
7.4 Краткий порядок проведения теста
Bordetella pertussis
IgG/IgM/IgA quantitativ
Для обнаружения IgM антител провести предварительную Rf-абсорбцию проб.
Разбавление проб1
(пробы пациентов)
1+100
Добавление разбавленных проб и
готовых к употреблению контрольных/стандартных сывороток (100 мкл)
t
11
ИНКУБАЦИЯ 60 мин./37°С
влажная камера
13-
ПРОМЫВКА (4 х 300 мкл [РЩ [WASH1I) 2
13-
Добавление раствора конъюгата |АРС| (100 мкл)
13
ИНКУБАЦИЯ 30 мин./37°С
влажная камера
13
ПРОМЫВКА (4 х 300 мкл [DIL| |WASHj]) 2
4# 13
Добавление раствора субстрата |pNPP] (100 мкл)
13
ИНКУБАЦИЯ 30 мин./37°С
влажная камера
13
Добавление стоп-реагента |STОР| (100 мкл)
13
ИЗМЕРЕНИЕ ПОГЛОЩЕНИЯ при 405 нм
Специальный буфер для разбавления для следующих наборов:
Borrelia IgG & IgM, EBV EA IgG, Parvovirus B19 IgM, Hantavirus Puumala IgG & IgM.
2При доделке вручную: в конце вытряхнуть планшет на бумажную салфетку.
russian 14
7.5 Проведение теста
1. установить необходимое количество лунок в тестовую рамку и закрепил
протокола.
2. По 100 мкл разбавленных проб или готовых к употреблению контролен
пипеткой в соответствующие лунки титровалъных стрипов. Одну лунку необ:
оставить для холостого значения, например:
IgG/IgM/IgA количественный: Антигешзые лунки
Лунка А1 Холостое значение субстрата
Лунка В1 Отрицательный контроль
Лунка С1 Стандартная сыворотка
Лунка D1 Стандартная сыворотка
Лунка Е1 Пациент 1....
3. Инкубация образцов 60 минут (+/- 5 мин.) при 37°С (+/-1°С) во влажной KaMept
4. По истечении времени инкубации, лунки промойте (в промывателе или вручну:
- отсосите инкубационную жидкость или удалите ее из лунок вытряхиванием
- в каждую лунку введите по 300 мкл водного раствора
- отсосите буфер для промывки или удалите его вытряхиванием
- повторите процедуру 3 раза (т.е. всего промойте 4 раза)
- вытряхните планшет на бумажные салфетки
5. Добавление конъюгата
100 мкл готового к употреблению IgG/IgM/IgA конъюгата ввести в соответствуй:
лунки (кроме холостого значения субстрата).
6. Инкубация конъюгата 30 минут (+/-1 мин.) ’при 37°С (+/-1°С) во влажной кам!
7. По истечении времени инкубации промойте лунки (см. выше).
8. Добавление субстрата
По 100 мкл готового к употреблению раствора субстрата введите во все лунки (
лунку для холостого значения субстрата).
9. Инкубация субстрата 30 минут (+Д мин.)* при 37°С (+Д°С) во влажной камере
10. Остановка реакции
По 100 мкл останавливающего раствора введите во все лунки, микротитровальн:
планшет слегка встряхните.
11. Измерение поглощения
В течение 60 мин. при 405 нм к холостому значению субстрата, эталонная длина
пределах 620-690 нм (например, 650 нм).
Учтите, пожалуйста, что в особых условиях работы может возникнуть необх
лабораторной адаптации инкубационного периода.
russian 15
8 ОБРАБОТКА ДАННЫХ ТЕСТА SERION ELISA classic Bordetelia
pertussis IgG/IgM/IgA
8.1 Количественное измерение сыворотки по методу 4PL
Определение концентрации антител в тесте SERION ELISA classic производится по
"логистической логарифмической модели с 4 параметрами (4PL)",
математическая функция которой описывается следующей формулой:
D - А
OD = А +
1 + Q В (С - In конц.)
Параметры А, В, С и D точно передают ход кривой и определяют
1. нижнюю асимптоту О параметр А
2. подъем кривой ^ параметр В
3. точку перегиба кривой О параметр С
4. верхнюю асимптоту <=> параметр D
Институт BnpnoH\Serion ГмбХ (Вюрцбург) для каждой партии наборов определяет
стандартные кривые в нескольких тестах при соблюдении оптимальных условий. У
пользователя отпадает необходимость в дорогостоящем и занимающем много
времени построении стандартной кривой.
Для расчетов результатов хода теста пользователь в каждой упаковке теста получает
соответственно адаптированную к партии стандартную кривую в виде графика и
таблицу значений. Соответственное программное обеспечение для оценки
предоставляется в ответ на запрос.
Для выравнивания колебаний тестов и проверки качества хода теста в поставку
включена так называемая стандартная сыворотка. Этой контрольной сыворотке
при контроле качества присваивается номинальное значение и область применения, в
пределах которой возможна точная и надежная обработка результатов теста.
Стандартная сыворотка не имеет функции положительной контрольной сыворотки
и в отдельных ELISA-тестах может оцениваться, как предельная или отрицательная.
russian 16
<1с.
8.2 Критерии действительности теста
Холостое значение субстрата должно иметь значение OD < 0,25.
Отрицательный контроль при оценке теста должен быть отрицательным.
При количественном варианте SERION ELISA classic среднее значение О
стандартной сыворотки, после вычета значения холостого субстрата, должно быть
пределах области применения, указанной в сертификате контроля качества данно
партии.
При качественном варианте SERION ELISA classic среднее значение О
положительного контроля, после вычета значения холостого субстрата должно быт
в пределах области применения, указанной в сертификате контроля качеств
данной партии.
Отдельные значения OD не должны расходиться более чем на 20%.
Если эти критерии не выполняются, тест является недействительным и его необходимо
повторить.
8.3 Обработка данных теста SERION ELISA classic Bordetella pertussis IgG/IgM/IgA
Данные активности антител в „FDA-U/т Г („FDA-Ед/мл") ссылаются на ,,U.S. Referenc
Pertussis Antiserum (human) Lot 3" организации „Center for Biologies Evaluation an
Research, Food and Drug Adminiatration (FDA)".
8.3.1 Неавтоматизированная обработка
Для обработки результатов теста прилагаются стандартная кривая, а также таблш
значений, при помощи которых каждом}7 полученному в результате теста значению О
может быть определена соответствующая активность антител. В таблице оцеш
приведено "номинальное значение" стандартной сыворотки, а также область е
применения.
Холостое значение субстрата (прозрачного) необходимо до обработки даннь
вычитать из всех результатов измерений.
Метод 1: Качественный расчет
Для установления области Cut off в OD среднее значение измеренного стандартного С
умножают на числовое значение, указанное в сертификате качества (см. формулы д
специальных систем оценок), например:
OD = 0,502 х MW(STD) при верхнем значении Cut off
OD = 0,352 х MW(STD) при нижнем значении Cut off
Если, например, среднее значение поглощения стандартной сыворотки равно 0,(
получается, что область Cut off находится в пределах от 0,225 до 0,321.
russian 17
Метод 2: Бесступенчатое определение активности антител при помощи
стандартной кривой.
Колебания тестов, в зависимости от того или иного дня или лаборатории
(т.н. межпробная дисперсия) выравниваются за счет умножения текущей измереной
величины пробы пациента на поправочный коэффициент F.
Номинальное значение OD (стандартной сыворотки)
F = -----------------------------------------------------------------------------------
_____ Значение OD (стандартной сыворотки) в определенный день
Этот способ необходим для того, чтобы выравнять или нормализовать актуальную
измеренную величину пользователя к специфической партии стандартной кривой.
Сначала путем расчета коэффициента необходимо исправить суточные колебания:
1. Из двух значений поглощения стандарта образовать среднее значение и
проверить, находится ли полученное значение в допустимых пределах.
2. Расчет коэффициента "F": Указанное номинальное значение стандарта делится
на среднее значение поглощения:
F = номинальное значение стандарта / среднее значение поглощения стандарта.
3. Все измеренные величины проб пациентов умножаются на "F".
4. На основании откорректированных измеренных величин при помощи
стандартной кривой считываются значения активности антител в мЕд/мл или
Ед/мл.
Обобщение для Bordetella pertussis IgG:
Положительный результат теста: >30 FDA-Ед/мл
Пограничный результат теста: 20-30 FD А-Ед/мл
Отрицательный результат теста: <20 FD А-Ед/мл
russian 18
Обобщение для Bordetella pertussis IgM:
Положительный результат теста: >14 Ед/мл
Пограничный результат теста: 9-14 Ед/мл
Отрицательный результат теста: <9 Ед/мл
Обобщение для Bordetella pertussis IgA:
Положительный результат теста: >22 FDA-Ед/мл
Пограничный результат теста: 15-22 FDA-Ед/мл
Отрицательный результат теста: <15 FDA-Ед/мл
В случае пограничного результата, тест следует провести параллельно с новыми
пробами (парных сывороток), взятыми с интервалом в 1-2 недели.
8.3.2 Автоматическая обработка теста при помощи программы
SERION easy base 4PL/SERION evaluate
В результате ввода 4 параметров и номинального значения стандартной сыворотки
активность антител после замеров исследуемого планшета рассчитывается
специальной программой для расчета.
В случае, если значение выходит за рамки области применения, программа SERION
easy base 4PL может выдать следующие сообщения об ошибках:
"Стандарты выходят за пределы допусков"; и/или "Стандарты различаются
более чем на 20%."
Сообщение об ошибках программы SERION evaluate производится только на
английском языке:
«Standard values out of ranges in following groups: Group 1-24. Standard value differ
more than 20% in following groups: Group 1-24."
В этих случаях результат теста является недействительным и его следует повторить. )
Параметры и номинальное значение необходимо менять только при изменении
партии (параметры и номинальное значение приведены в таблице значений),
Верность ввода этих зависящих от партии значений можно проверить при помощи
соответствующих стандартной сыворотке значений мЕд/мл или Ед/мл. Полученное
среднее значение должно совпадать с указанным в сертификате партии значением.
Корректировка значения замера производится автоматически. На дисплее учета
результатов появляется следующий текст:
Наименование пробы
Значение OD
мЕд/мл или Ед/мл
Подсчёт
russian 19
8.4 Интерпретация результатов
При первичной инфекции возникают антитела классов IgG, IgM и IgA,
непосредственно после прививки в большинстве случаев только антитела IgG и IgM.
У детей старше 6 месяцев наличие IgA-антител следует рассматривать как признак
наличия свежей инфекции. У грудных детей младше 3 месяцев IgA-антитела не
вырабатываются.
Возникновение IgM-антител не недёжно, оно отсутствует у более половины
пациентов. Кроме того могут возникать т.н. „Low responder" (низкие ответы),
которые спустя недели после хода болезни показывают постоянно низкие титры
антител.1 При повторной инфекции В. pertussis очень быстро образуются высокие
У—
При интерпретации анализа антител следует учитывать данные о возрасте
пациента, протяженности болезни, анамнезе прививки и возможные
предварительные заключения.
В следующей таблице приведены обобщенные характерные образцы реакций
серологии В. pertussis.
Активности антител при В. pertussis-серологии:1
IgA IgM IgG
не привит, В. pertussis + + +
не привит, В. pertussis (< 6 месяц.) - + +
свежая прививка, здоров - + +
старая прививка, здоров - - +
свежая прививка, В. pertussis + + ++
старая прививка, В. pertussis + -/+ ++
Указание: вызванные FHA перекрестные реактивности между В. pertussis, В.
parapertussis и Н. influenzae уже были описаны7. При подозрение на перекрестную
реактивность, а так же для контроля за успехом прививки из-за 100% специфичности
для иммуногена РТ рекомендуется проведение дополнительного теста SERION
ELISA classic В. pertussis Toxin IgG.
russian 20
9 ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ЧЕРТЫ
9.1 Точность
Точность в пределах сыворотки была определена при использовании сывороток
различной реактивностью многократно (п = 20) в планшете с антигенны
покрытием. Для определения точности в пределах сыворотки пробы сыворотки
различной реактивностью испытывались в 10 независимых друг от друга опытах.
Стандартное отклонение
Коэффициент вариации (КБ) = ----------------------------------х 100
Среднее значение
SERION ELISA classic Bordetella pertussis IgG:
Среднее Внутрипробное Среднее Межпроб!
значение (Intraassay) значение (Interassa
поглощения (КВ %) поглощения (КВ %)
(OD) (OD)
Проба
Отрицательная 0,215 9,0 0,217 8Д
Положительная 0,529 3,9 0,473 3,3
Положительная 0,720 3,5 0,765 3,9
SERION ELISA classic Bordetella pertussis IgM:
Среднее Внутрипробное Среднее Межпроб!
значение (Intraassay) значение (Interassa
поглощения (КВ %) поглощения (КВ %)
(OD) (OD)
Проба
Пол ож ител ьная 0,551 4,6 0,505 13,7
Слабоположительная 0,512 5,5 0,477 9,5
пограничная 0,466 6,6 0,458 14,4
SERION ELISA classic Bordetella pertussis IgA;
Среднее Внутрипробное Среднее Межпроб!
значение (Intraassay) значение (Interassa
поглощения (КВ %) поглощения (КВ %)
(OD) (OD)
Проба
Положительная 1,367 8,7 1,361 12,7
пограничная 0,605 1/7 0,622 5,4
Положительная 0,914 2,5 0,950 6,7
russian 21
9.2 Чувствительность и специфичность
IgG: 90 сывороток, из них 29 сывороток доноров, 34 сыворотки с подозрением на
инфекцию Б. pertussis, 22 сыворотки течения Института Роберта-Коха в Берлине и 5
положительных сывороток Института Гигиены и Лабораторной Медицины
(клиника в г. Крефельд, доктор Вирсинг фон Кёниг (Dr. С. Н. Wirsing von Konig)),
бьши исследованы во внутриинститутском тесте. Б качестве сравнительного теста
бьша использована одна из имеющихся в продаже ELISA. В обоих ELISAx в качестве
антигенного приготовления использовалась смесь из Pertussis-Toxin (РТ) и
Filamentoses Hamagglutinin (FHA). Всего 13 сывороток в одной из тестовых систем
реагировали погранично. Эти результаты в расчеты не принимались.
IgM: В межинститутском тесте в сравнение с одним из имеющихся в продаже тестов
ELISA были исследованы 86 сывороток. В обоих ELISAx использовались
приготовления целой клетки В. Pertussis. Всего реагировали в одной из тестовых
систем 12 сывороток погранично. Эти результаты в расчеты не принимались.
IgA: 24 сыворотки с подозрением на инфекцию боррелии были протестированны во
внутриинститутском исследовании в сравнении с одним из имеющихся в продаже
тестов ELISA. В обоих тестах в качестве антигенного приготовления используется
смесь из токсина коклюша ( Pertussis-Toxin (РТ) и филаментозного гемагглютинина
(Filamentosem Hamagglutinin (FHA). Всего прореагировали 4 сыворотки погранично
в обоих тестах. Эти результаты при подсчетах во внимание не принимались.
SERION ELISA classic Bordetella pertussis
IgG-выявление IgM-выявление IgA-выявление
Чувствительность 100,0% 80,0% 61,3%
Специфичность 95,2% 100,0% 100,0%
russian 22
10 МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ
10.1 Предостережения и меры предосторожности
Тест SERION ELISA classic предназначен только для использования специал!
безупречно владеющим необходимыми навыками.
При обращении с реагентами теста и пробами пациентов необходимо выло;
общепринятых лабораторных правил:
Упаковка теста содержит человеческие сыворотки. Хотя все контре
сьюоротки имеют отрицательные значения содержания вирусов Н
гепатита С, а также ВИЧ, их следует рассматривать, как потенцт
инфекционно опасные материалы.
Не набирайте растворы в пипетку при помощи рта.
В помещениях, где ведется работа с реагентами теста и пробами пациент
разрешается принимать пищу, пить или курить.
При обращении с реагентами теста и пробами пациентов следует из
прямого контакта, поэтому следует использвать лабораторный
одноразовые перчатки и защитные очки. Руки по окончании работы с;
тщательно мыть.
Пробы пациентов и все потенциально инфекционные материалы
проведения теста следует обеззаразить.
Реагенты необходимо хранить в месте, недоступном для детей.
Стон-реагент:
едкий (С); R34: вызывает химические ожоги,
необходимо использовать защитные очки, перчатки и лабораторный халат
10.2 Утилизация
Пожалуйста, выполняйте предписания, предусмотренные действующим
законодательством!
russian 23
| SE | RION | ELISA classic Bacillu | s anthracis |
| S | ERION | ELISA classic бацилл | ус антрац |
| ОГ | ЛАВЛЕ | НИЕ | |
| 1. О | БЛАС | ТЬ ПРИМЕНЕНИЯ | |
| 2. Д | ИАГН | ОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИ | Е |
| 3. П | РИНЦ | ИП РАБОТЫ SERION ELI | SA classic |
| 4. С | ОДЕР | ЖИМОЕ И СОСТАВ УПАК | ОВКИ ТЕС |
| 5. Д | ОПОЛ | НИТЕЛЬНО НЕОБХОДИ | МЫЕ МАТЕР |
| 6. Х | РАНЕН | ИЕ И СРОК ГОДНОСТИ | РЕАГЕНТОВ |
| 7. П | РОВЕД | ЕНИЕ ТЕСТА SERION EL | ISA classic |
| | 7.1 | Общие указания | |
| | 7.2 | Подготовка и хранение пр | об |
| | 7.3 | Подготовка реагентов | |
| | 7.4 | Краткий порядок проведе | ния теста |
| | 7.5 | Проведение теста | |
| 8. О | БРАБ | ОТКА ДАННЫХ ТЕСТА | |
| | 8.1 | Количественное измерени | е сывороток |
| | | логарифмической модели | (4PL) |
| | 8.2 | Критерии действительнос | ти теста |
| | 8.3 | Обработка данных теста S | ERION ELISA |
| | ан | трацис IgG/IgM (количеств | енный) |
| | 8. | 4 Интерпретация результат | ов |
| 9. О | ТЛИЧ | ИТЕЛЬНЫЕ ЧЕРТЫ | |
| | 9.1 | Точность | |
| | 9.2 | Чувствительность и специ | фичность |
| 10. | МЕРЫ | БЕЗОПАСНОСТИ | |
IgG/IgM
ис IgG/IgM
ТА
РИАЛЫ
по 4 параметрам
A classic бацилла
10.1 Предостережения и меры предосторожности
10.2 Утилизация
11. ЛИТЕРАТУРА
Данная версия № V 1.06/03-1
SERION ELISA classic Bacillus anthracis IgG/IgM
Иммуноферментный набор для определения антител к
иммуноглобулинам человека (IgG/IgM/)
только для диагностики in vitro
Бациллус антрацис IgG -набор (количественный) № доя заказа: ESR140G
Бациллус антрацис IgM-набор (количественный) № для заказа: ESR140M
Тесты одобрены : Dade Behring ВЕР ® III / ВЕР ® 2000, DSX, в ручном режиме
1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Иммунноферментная тест-система SERION ELISA classic Bacillus anthracis IgG/IgM
предназначена для качественного и количественного определения антител человека в
сыворотке или плазме крови к протективному антигену (ПА) бациллы антракс
(Bacillus anthracis). Тест служит для контроля успешности прививки, а также
определения иммунного статуса перед иммунизацией во избежание вреда от
прививки.
2. ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
За выражением сибирская язва или антракс скрывается инфекционное заболевание,
встречающееся в первую очередь у животных. Особенно затронуты копытные, такие
как свиньи, крупный рогатый скот, овцы, козы и лошади в теплых странах. Из-за
тесного контакта с зараженными животными или обращения с зараженными
животными продуктами, такими как кожа животных, мясо или молоко возбудитель
заболевания может переноситься на человека. Инкубационный период зооноза
составляет от нескольких часов до нескольких дней. Хотя в индустриально развитых
странах это заболевание и стало редким, но в эндемичных регионах южной Америки,
Африки и юговосточной Азии из-за заболевания сгад полезных животных регулярно
возникают эпидемии. В последние годы антракс привлек внимание общественности
из-за применения возбудителя в биологическом оружие.
Возбудитель сибирской язвы бацилла антракс является грамположительной аэробной
живой палочкой. При недостатке питания или при повышенных температурах она
образует устойчивые споры, которые могут быть заразными многие годы.
Необходимая для инфицирования человека доза получения спор через легкие в
примерно 8.000-50.000 бактерий довольно высока.
Поглощенные бактерии способны благодаря особой белковой оболочке обходить
важные защитные механизмы человеческой иммунной системы. Кроме того, они
вырабатывают ядовитые вещества, состоящие из т.н. протективного антигена (ПА),
«летального фактора» (ЛФ) и отёчного фактора (ОФ). Эти экзотоксины выделяются в
окружающую бактерии среду и поражают в особенности мелкие кровяные сосуды
таким образом, что они становятся проницаемыми для эритроцитов. Следствием
являются воспалительные реакции и кровотечения. Эго проявляется в виде
геморрагических отёков пораженных тканей.
Симптомы сибирской язвы зависят от соответствующего пути проникновения
возбудителя. Самой распространенной формой у человека является кожная сибирская
язва. Через прямой контакт споры сибирской язвы проникают через мелкие кожные
повреждения. Через короткое время образуется красный узелок с черной
сердцевиной. Из него быстро образуется наполненный гноем пузырек. При
дальнейшем равитии заболевания появляются все новые пузырьки, которые потом
сливаются в сибиреязвенный карбункул (Pustula maligna).
Значительно более редкая форма сибирской язвы у человека это лёгочная форма.
Заражение происходит путем вдыхания спор. Заболевание протекает как тяжелая
форма воспаления лёгких с сильной кровяной мокротой, являющейся высоко
заразной. У пациентов бывает высокая температура, часто озноб, кашель и удушье. Не
подвергающаяся лечению лёгочная сибирская язва заканчивается в болыненстве
случаев смертельно.
Третьей формой заболевания сибирской язвы у человека является кишечная форма.
Эта форма возникает после употребления в пищу сырого мяса или некипяченного
молока зараженных животных. Следствием является тяжелое геморрагическое
воспаление кишечника с кровавой рвотой и кровавыми испражнениями.
Из всех трёх форм сибирской язвы может развиться сибиреязвенный сепсис, который
чаще всего приводит к быстрой смерти.
Диагноз сибирской язвы ставится по клинической картине и по истории болезни. Он
подтверждается как правило выявлением возбудителя, напр. путем исследования
секрета тела или мазка. Лечение антибиотиком следует начинать как можно быстрее.
Наиболее важной формой профилактики является избежание контакта с
заражёнными животными или продуктами. Возможна иммунизация определённых
групп риска, напр. солдат с помощью полученного из фильтрата культуры
прививочного материала, содержащего ПА.
Тест SERION ELISA classic бацилла антракс IgG/lgM даёт возможность
количественного определения антител человека в сыворотке или плазме к
протективному антигену (ПА) бациллы антракс. Тест служит для контроля
успешности прививки, а также для определения иммунного статуса перед
иммунизацией во избежание вреда от прививки.
3. ПРИНЦИП РАБОТЫ SERION ELISA classic
При использовании непрямой техники ELISA, микрострипы :
соответствующим антигеном. Специфические антитела, находят;
пациента, связываются с этими антигенами, образуя твердую фазу.
Для проявления серологической реакции используют помеченные щет
фосфатазой выявленные антитела, направленные против человеческих
иммуноглобулинов пробы пациента, которые в положительном случае сву
антигеном. При добавлении субстрата (паранитрофенилфосфата) в резул
реакции фермента и субстрата происходит окрашивание раствора в желт
Интенсивность желтой окраски измеряется фотометрическим способом; он<
пропорциональна уровню содержания специфических антител. 70
1. СОДЕРЖИМОЕ И СОСТАВ УПАКОВКИ ТЕСТА
Колич./об
Компоненты теста и состав
ъем
Отрывные микрострипы, каждая с 8 отдельными лунками с 12
антигенным покрытием (всего 96), 1 тестовый держатель
Напыленный материал деактивирован
Стандартная сыворотка (готовая к использованию) 2 х 2 мл
Человеческая сыворотка в фосфатном буфере с протеином;
отрицательная в отношении антител к HIV, антигенов HBs -Ag
(поверхностных антигенов вируса гепатита В) и антител к HCV;
Консервант: < ОД % азид натрия
Краситель: Amaranth О
Отрицательная контрольная сыворотка (готовая к 2 мл
использованию)
Человеческая сыворютка в фосфатном буфере с протеином;
отрицательная в отношении антител к H1V, антигенов HBs -Ag
(поверхностных антигенов вируса гепатита В) и антител к HCV;
Консервант: < ОД % азид натрия
Краситель: Lissamin-зеленый V
Конъюгаты к человеческим IgG, IgA, IgM (готовые к 13 мл
употреблению) Поликлональные козьи антитела направленные
против человеческих IgG, IgA, IgM, конъюгированные со
щелочной фосфатазой, стабилизированные протеиновым
стабилизирующим раствором
Консервант: 0,01 % метилизотиазолон 0,01 % бромнитрюдиоксан
Концентрат раствора для промывания (достаточно для 1000 мл) 33,3 мл
Раствор хлорида натрия с Tween 20, 30 mM Tris
Консервант: < ОД % азид натрия
Буфер для разведения 2 х 50 мл
Фосфатный буфер с протеином и Tween 20;
Консервант: < ОД % азид натрия 0,01 г/л бромфеноловой голубой
соли натрия
Стоп-реагент 1,2 N натровый щелок 15 мл
Субстрат (готовый к использованию) 13 мл
паранитрофенилфосфат, буфер без растворителя,
Консервант: < ОД % азид натрия
Сертификат контроля качества со стандартной кривой и 1
таблицей значений (количественное выражение антител в
мЕд/мл или Ед/мл)
ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ
• Обычное лабораторное оборудование
• Спектрофотометр для микротитровальных стрипов с фильтром, длина
волны 405 нм, рекомендуемая длина эталонной волны в пределах от 620 нм
до 690 нм (например, 650 нм)
• Термостат инкубатор 37°С
• Влажная камера
• Дистиллированная вода
6. ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ РЕАГЕНТОВ
Реактив Хранение Срок годност
Микротитровальные После вскрытия упаковки при 2-8°С при 4 недели
стрипы (антиген) использовании осушителя, в закрытом виде
Следует обратить внимание на то, чтобы
неиспользованные лунки хранились в сухих
условиях и герметично в специальном пакете
из композитной алюминиевой пленки
Контрол ьные/стандар После вскрытия упаковки при 2-8°С До окончани
тные сыворотки срока хране
24 месяца с
даты выпуск
Конъюгат Готовый к употреблению раствор при 2-8°С До окончани
Следует избегать заражения (стерильные срока хране
наконечники!) 28 месяца с
даты выпуск
Разбавляющий буфер После вскрытия упаковки при 2-8°С 24 месяца
Помутневшие растворы использовать не
следует До окончани
срока хране
В неоткрытом виде 36 месяцев
даты выпус
Буфер для Концентрат после вскрытия упаковки при 2-8°С До окончани
промывания срока хране
Готовый раствор при 2-8°С 2 недели
Готовый раствор при комнатной температуре 1 недели
Емкость для готового раствора следует
регулярно промывать!
Помутневшие растворы использовать не
следует
Субстрат Готовый раствор при 2-8°С, хранить в До окончани
защищенном от света месте срока хране
24 месяца с
Избегайте загрязнения микробами! При наличии даты выпус
интенсивной желтой окраски (экстинкция
дистиллированной воды >0,25) не использовать.
Стоп-реагент После вскрытия упаковки при комнатной До окончани
температуре. срока хране
7. ПРОВЕДЕНИЕ ТЕСТА SERION ELISA classic
7.1 Общие указания
Необходимо использовать исключительно реагенты SERION ELISA classic, поскольку
они адаптированы друг к другу внутри системы, и не заменять их реагентами других
производителей. Стандартные и контрольные сыворотки, а также конъюгаты в
зависимости от партии адаптированы к конкретному тестнабору и не могут
использоваться в тест-наборах других партий. Разбавляющий буфер, буфер для
промывывания, стоп-реагент и раствор субстрата могут использоваться во всех тестах
SERION ELISA classic независимо от партий и наборов.
Для каждого класса иммунглобулина имеются зри разных концентрации конъюгата:
НИЗКАЯ, СРЕДНЯЯ И ВЫСОКАЯ.
Классификацию конъюгата можно распознать на этикетках по следующим
обозначениям:
Напр. IgG + IgG-конъюгат низкой концентрации
IgG ++ IgG -конъюгат средней концентрации
IgG +++ IgG -конъюгат высокой концентрации
Чтобы сохранить высокое качество наших тест-наборов, необходимо в отдельных
случаях применять особые конъюгаты. Это особые партии и они не имеют
обозначений «+». Специальные конъюгаты нельзя заменять другими конъюгатами.
Пожалуйста, всегда обращайте внимание на надписи на этикетках!
Все компоненты теста ELISA classic следует использовать до истечения срока годности
(сдт. указания на этикетке) при соблюдении правильных условий хранения. Не
применять реагенты после истечения срока годности. По этому поводу см, также п. 6
"ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ РЕАГЕНТОВ"
Неверное разбавление реагентов может привести к потерям чувствительности.
Реагенты теста во время хранения и инкубации необходимо защищать от яркого
света. После использования плотно закрыть упаковку во избежание высыхания и
бактериального загрязнения.
При повреждении пакета из алюминиевой пленки или неплотной упаковке пакета,
для хранения неиспользованных лунок, их не следует использовать для теста.
Все реагенты теста перед его началом необходимо довести до комнатной
температуры.
При извлечении порции реактива, во избежание загрязнения их микробами следует
всегда соблюдать правила стерильности. Во избежание ложноположительных
результатов наконечник пипетки при вводе конъюгата ни в коем случае не должен
касаться и смачивать верхний край лунок. При закрытии флаконов необходимо
следить за тем, чтобы для этого использовалась соответствующая данному флакону
крышка.
Воспроизводимость результатов зависит, кроме прочего, и от тщательного
перемешивания соответствующих реагентов. Перед забором контрольной сыворотки
и конъюгата емкости необходимо хорошо встряхнуть. Растворы проб перед вводом
необходимо хорошо размешать мономиксером (например, Vortex).
Необходимо следить за аккуратным заполнением лунок и соблюдением указанных
времени и температуры инкубации. Значительные различия во времени между
заполнением первой и последней лунок при добавлении проб/контрольных
сывороток, конъюгата и субстрата приводит к различиям "прединкубационного
периода", которые могут значительно повлиять на точность и воспроизводимость
измеренных значений.
Лишь строгое соблюдение рабочей инструкции теста SERION ELISA classic
обеспечивает правильность результатов.
Результаты теста можно учитывать лишь в том случае, если соблюдены все условия в
зависимости от партии, приведенные в сертификате контроля качества, прилагаемом
к набору.
Правильная промывка препятствует неспецифичности теста: Следует выполнять
руководство к применению используемых промывателей. В тесте SERION ELISA classic
используются плоские планшеты. Важно равномерное наполнение лунок буфером
для промывки и его полное удаление после промывки (возможны неконтролируемые
эффекты при разбавлении). Избегать образования пены! Не повреждать покрытие
лунок!
7.2 Подготовка и хранение проб
Липидные, гемолизированные, а также иктеричные пробы (сыворотка или плазма)
следует использовать лишь с оговоркой, хотя в ходе наших исследований не было
замечено негативного влияния. Пробы, загрязненные бактериями, использовать не
следует. Пригодными для исследований материалами являются пробы сыворотки или
плазмы (EDTA, цитрат, гепарин), полученные стандартными лабораторными
методами.
Пробы нельзя деактивировать термическим способом.
7.2.1 Разбавление проб
Перед началом теста, пробы (Vi) растворить в разбавляющем буфере (Уг):
IgG
Vi + V2 = 1+100:
на каждые 5 мкл сыворотки пациента 500 мкл разбавляющего буфера
После каждого разбавления и перед отбором, пробы следует хорошо разметать
мономиксером (например, Vortex) дня получения гомогенного раствора.
Интерференция ревматоидного фактора Антитела ревматоидного фактора в
большинстве являются ауто-антителами класса IgM, которые в основном связываются
с иммунными комплексами IgG. Специфическое выявление IgM антител из-за этих
ревматоидных факторов может иметь ложноположительные результаты. Кроме того,
существует возможность, вытеснения IgM-антител с более слабыми связями IgG-
антителами с более сильными связями. Обнаружение IgM в этом случае может
оказаться ложноотрицательным. По этой причине пробы для определения IgM
необходимо предварительно обработать абсорбентом ревматоидного фактора.
(SERION-Rheumafaktor-Absorbens, Nr. для заказа Z4 (4 мл / 20 определений) / Z200
(20 мл/100 определений)).
Сначала производится разбавление абсорбента ревматоидного фактора
(У1)разбавляющим буфером (V2) в соотношении 1+-4.
IgM
VI + V2 = 1 + 4:
• по 200 мкл Rf-абсорбента на каждые 800 мкл разбавляющего буфера
Затем пробы пациента (V4) разбавляются в смеси Rf и разбавляющего буфера (V3)
V4 + V3 = 1+100:
• по 10 мкл сыворотки пациента на каждые 1000 мкл Rf разбавляющего буфера
7.2.2 Хранение проб
Пробы пациентов хранятся не более 7 дней при температуре 2-8°С. Более длительное
хранение проб возможно при температуре < -20°С.
Следует избегать повторных циклов замораживания и оттаивания.
Разбавленные образцы могут храниться при 2-8°С в течение одной недели.
7.3. Приготовление реагентов
7.3.1 Микротитровальные стрипы
Титровалъные стрипы или лунки теста упакованы вместе с осушителем.
Ненужные лунки следует извлечь из рамки держателя и снова положить в
специальный пакет, который закрывается герметически.
7.3.2 Контрольные сыворотки / стандартные сыворотки
Контрольная и стандартная сыворотки готовы к употреблению и не требуют
дальнейшего разбавления. Они могут непосредственно использоваться в тесте. ]
При каждом тесте независимо от количества использованных титровальных |
стрипов должны проводиться у контрольных сывороток простой и Cut-off, а у
стандартных сывороток двойной анализ. 1
Контрольные сыворотки нс обрабатывать абсорбентом ревматоидного фактора!
7.3.3 Конъюгат к человеческим IgG, IgA или IgM-AP (готовый к употреблению)
Конъюгаты различных партий (номера лотов) нельзя менять, поскольку они
адаптированы к соответствующему антигенному покрытию микротитровальных
стрипов. Конъюгаты взаимозаменяемы, как описано в пункте 7.1 Строго избегать
бактериального заражения готового к употреблению конъюгата (не производить
забора непосредственно из бутылочки с конъюгатом).
7.3.4 Буфер для промывки
Концентрат буфера для промывки (Vi) разбавить дистиллированной водой в
соотношении 1:30 до конечного объема (V2).
Пример:
7.3.5 Разбавляющий буфер для проб (готовый к употреблению)
7.3.6 Субстрат (готовый к употреблению) Во избежание загрязнения бактериями
используйте перчатки. Для забора раствора субстрата используйте только
стерильные наконечники пипеток!
7.3.7 Стоп-реагент (готовый к употреблению)
7.4 Краткий порядок проведения теста
бацилла антракс IgG/IgM количественный
Дня определения IgM антител провести предварительную Rf абсорбцию проб
Разбавление проб (пробы пациентов)
IgG/IgM: 1+100
д
Добавление разбавленных проб и готовых к употреблению
контрольных/стандартных сывороток (100 мкл)
Д
ИНКУБАЦИЯ 60 мин./37°С влажная камера
д
ПРОМЫВКА
д
*1
Добавление раствора конъюгата (100 мкл)
i
Д
ИНКУБАЦИЯ 30 мин./37°С влажная камера
Д
ПРОМЫВКА
д
Добавление раствора субстрата (100 мкл)
Д
ИНКУБАЦИЯ 30 мин./37°С влажная камера
д
Добавление стоп-реагента (100 мкл)
Д
ИЗМЕРЕНИЕ ПОГЛОЩЕНИЯ при 405 нм
7.5 Проведение теста
1. Установить необходимое количество лунок в тестовую рамку и закрепить лист
протокола.
2. По 100 мкл разбавленных проб или готовых к употреблению контролей
ввести пипеткой в соответствующие лунки титровальных стрипов. Одну лунку
необходимо оставить для холостого значения, например:
3. Инкубация образцов 60 минут (+/- 5 мин.) при 37°С (+/-1°С) во влажной
камере.
4. По истечении времени инкубации, лунки промойте (в промывателе или вручную):
• аспирируйте инкубационную жидкость или удалите ее из лунок
вытряхива нием
• в каждую лунку введите по 300 мкл водного раствора
• аспирируйте буфер для промывки или удалите его вытряхиванием
• повторите процедуру 3 раза (т.е. всего промойте 4 раза)
• вытряхните планшет на бумажные салфетки
5. Добавление конъюгата 100 мкл готового к употреблению IgG/IgM/IgM/IgA
конъюгата ввести в соответствующие лунки (кроме холостого значения субстрата).
*
6. Инкубация конъюгата 30 минут (+/Л мин.) при 37°С (+/-1°С) во влажной камере.
7. По истечении времени инкубации промойте лунки (см. выше).
8. Добавление субстрата По 100 мкл готового к употреблению раствора субстрата
введите во все лунки (вт.ч. и в лунку для холостого значения субстрата).
*
9. Инкубация субстрата 30 минут (+Д мин.) при 37°С (+Д°С) во влажной камере.
10. Остановка реакции По 100 мкл останавливающего раствора введите во все лунки,
микротитровальный планшет слегка встряхните.
11. Измерение поглощения В течение 60 мин. при 405 нм к холостому значению
субстрата, эталонная длина волны в пределах 620-690 нм (например, 650 нм).
*
Учтите, пожалуйста, что в особых условиях работы может возникнуть необходимость
лабораторной адаптации инкубационного периода.
8. ОБРАБОТКА ДАННЫХ ТЕСТА SERION ELISA classic бацилла антракс IgQ/IgM
(количественный)
8.1 Количественное измерение сыворотки по методу 4PL
Определение концентрации антител в тесте SERION ELISA classic производится по
"логистической логарифмической модели с 4 параметрами (4PL)", математическая
функция которой описывается следующей формулой:
D -А
0D = А + -----------------------------
2 + е В(С-1пконц.)
Параметры А, В, С и D точно передают ход кривой и определяют
1. нижнюю асимптоту - параметр А
2. подъем кривой - параметр В
3. точку перегиба кривой - параметр С
4. верхнюю асимптоту - параметр D
Институт Вирион\5епоп ГмбХ (Вюрцбург) для каждой партии наборов определяет
стандартные кривые в нескольких тестах при соблюдении оптимальных условий. У
пользователя отпадает необходимость в дорогостоящем и занимающем много времени
построении стандартной кривой.
Для расчетов результатов хода теста пользователь в каждой упаковке теста получает
соответственно адаптированную к партии стандартную кривую в виде графика и
таблицу значений. Соответственное программное обеспечение для оценки
предоставляется в ответ на запрос.
Для выравнивания колебаний тестов и проверки качества хода теста в поставку
включена т.н. стандартная сыворотка. Этой контрольной сыворотке при контроле
качества присваивается номинальное значение и область применения, в пределах
которой возможна точная и надежная обработка результатов теста. Стандартная
сыворотка не имеет функции положительной контрольной сыворотки и в отдельных
ELISA-тестах может оцениваться, как предельная или отрицательная.
5 -
8.2 Критерии действительности теста
• Холостое значение субстрата должно иметь значение OD < 0,25.
• Отрицательный контроль при оценке теста должен быть отрицательным.
• При количественном варианте SERION ELISA classic среднее значение OD
стандартной сыворотки, после вычета значения холостого субстрата, должно
быть в пределах области применения, указанной в сертификате контроля
качества данной партии.
• При качественном варианте SERION ELISA classic среднее значение OD
положительного контроля, после вычета значения холостого субстрата должно
быть в пределах области применения, указанной в сертификате контроля
качества данной партии.
• Отдельные значения OD не должны расходиться более чем на 20%.
Если эти критерии не выполняются, тест является недействительным и его
необходимо повторить.
8.3 Обработка теста SERION ELISA classic бацилла антракс IgGДgM
(количественный)
8.3.1 Неавтоматизированная обработка
Для обработки результатов теста прилагаются стандартная кривая, а также таблица
значений, при помощи которых каждому полученному в результате теста значению
OD может быть определена соответствующая активность антител. В таблице оценки
приведено "номинальное значение" стандартной сыворотки, а также область его
применения.
Холостое значение субстрата (прозрачного) необходимо до обработки данных
вычитать из всех результатов измерений.
Метод 1: Качественный расчет
Для установления области Cut-off в OD среднее значение измеренного стандартного
OD умножают на числовое значение, указанное в сертификате качества (см. формулы
для специальных систем оценок), например: OD = 0,502 х MW(STD) при верхнем
значении Cut-off OD = 0,352 х MW(STD) при нижнем значении Cut-off Если, например,
среднее значение поглощения стандартной сыворотки равно 0,64, получается, что
область Cut-off находится в пределах от 0,225 до 0,321.
Метод 2: Бесступенчатое определение активности антител при помощи
стандартной кривой.
Колебания тестов, в зависимости от того или иного дня или лаборатории (т.н.
межпробная дисперсия) выравниваются за счет умножения текущей измерепой
величины пробы пациента на поправочный коэффициент F.
Номинальное значение OD (стандартной сыворотки)
F =---------------------------------------------------------------------------------------------------
Значение OD (стандартной сыворотки) в определенный день
Сначала путем расчета коэффициента необходимо исправить суточные колебания:
1 Из двух значений поглощения стандарта образовать среднее значение и
проверить, находится ли полученное значение в допустимых пределах.
Расчет коэффициента "F": Указанное номинальное значение стандарта делится
на среднее значение поглощения: F = номинальное значение стандарта / среднее
значение поглощения стандарта.
3 Все измеренные величины проб пациентов умножаются на "F".
4 На основании откорректированных измеренных величин при помощи
стандартной кривой считываются значения активности антител в мЕд/мл или Ед/мл.
Обобщение для SERION ELISA dflss/сбацилла антракс IgG/IgM:
Положительный результат >15 Ед/мл
Пограничный результат 10-15 Ед/мл
Отрицательный результат <10 Ед/мл
В случае пограничного результата, тест следует провести параллельно с новыми
пробами (парных сывороток), взятыми с интервалом в 1-2 недели.
8.3.2 Автоматическая обработка теста при помощи программы SERION easy base
4PL/SERION evaluate
В результате ввода 4 параметров и номинального значения стандартной сыворотки
активность антител после замеров исследуемого планшета рассчитывается
специальной программой для расче та.
В случае, если значение выходит за рамки области применения, программа SERION
easy base 4PL может выдать следующие сообщения об ошибках:
"Стандарты выходят за пределы допусков"; и/или "Стандарты различаются более
чем на 20°/)."
Сообщение об ошибках программы SERION evaluate производится только на
английском языке:
«Standard values out of ranges in following groups: Group 1-24. Standard value differ
more than 20% in following groups: Group 1-24."
В этих случаях результат теста является недействительным и его следует повторить.
Параметры и номинальное значение необходимо менять только при изменении
партии (параметры и номинальное значение приведены в таблице значений).
Верность ввода этих зависящих от партии значений можно проверить при помсдвд
соответствующих стандартной сыворотке значений мЕд/мл или Ед/мл. Полученное
среднее значение должно совпадать с указанным в сертификате партии значением.
Корректировка значения замера производится автоматически. На дисплее учета
результатов появляется следующий текст:
Наименование:
пробы
Значение OD
мЕд/мл или Ед/мл
Подсчёт
8.4 Интерпретация результатов
В пункте 8.3.1 представлены предельные значения для определения концентрации
ашител-IgG/IgM бациллы антракс.
Проверка иммунного статуса проводится обычно через четыре-восемь недель после
проведения основной иммунизации. Отрицательный результат в тесте SERION ELISA
classic бацилла антракс IgG/IgM показывает, что в сыворотке нет антител к
прогективному антигену бациллы антракс. Б случае, если перед этим была проведена
иммунизация прививочным материалом на основе ПА, это означает, что иммунитет
не был приобретен. В случае, если результат пограничный, тест следует повторить
через 1-2 недели на параллельно забранной пробе (парной сыворотке).
Положительный результат подтверждает приобретенный иммунитет, хотя нельзя на
основе замеренной концентрации антител делать прогноз о продолжительности
иммунной защиты.
9. ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ЧЕРТЫ
9.1 Точность
Точность в пределах сыворютки была определена при использовании сывороток с
различной реактивностью многократно (п = 20) в планшете с антигенным покрытием.
Для определения точности в пределах сыворотки пробы сыворотки с различной
реактивностью испытывались в 10-ти независимых друг от друга опытах в 5
различных дней.
Standardabweichung
Коэффициент вариации (КВ) = -------------------------------- х 100
Mittelwert
Стандартное отклонение
Среднее значение
SERION ELISA classic бацилла антракс IgG:
Среднее Внутрипробное Среднее Межпробное
значение (КВ, %) значение (КВ, %)
поглощения поглощения
(OD) (OD)
Проба
Слабоположительная 0,591 1/8 0,584 3,9
Положительная 1,001 1,7 1,015 2,6
Сильноположительная 1,938 2,0 1,865 2,6
9.2 Чувствительность и специфичность
Для расчёта результатов данных теста SERION ELISA classic бацилла антракс IgG были
исследованны 573 сывороток доноров и беременных , а также 48 сывороток
иммунизированных доноров. Тест оценивался относительно иммунизации.
При расчетах пограничные результаты во внимание не принимались.
Отличительные черты Чувствительность Специфичность
Бациллус антрацис IgG 100 % 99%
10. МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ
10.1 Предостережения и меры предосторожности
Тест SERION ELISA classic предназначен только для использования специалистам^
безупречно владеющим необходимыми навыками.
При обращении с реагентами теста и пробами пациентов необходимо
выполнение общепринятых лабораторных правил:
• Упаковка теста содержит человеческие сыворотки. Хотя все контрольны
сыворотки имеют отрицательные значения содержания вирусов HBs-/
гепатита С, а также ВИЧ, их следует рассматривать, как потенциальд!
инфекционно опасные материалы.
• Не набирайте растворы в пипетку при помощи рта.
• В помещениях, где ведется работа с реагентами теста и пробами пациентов, I
разрешается принимать пищу, пить или курить.
• При обращении с реагентами теста и пробами пациентов следует избеган
прямого контакта, поэтому следует использвать лабораторный хшн
одноразовые перчатки и защитные очки. Руки по окончании работы следуй!
тщательно мыть.
• Пробы пациентов и все потенциально инфекционные материалы после
проведения теста следует обеззаразить.
• Реагенты необходимо хранить в месте, недоступном для детей.
• Стоп-реагент: едкий (С); R34: вызывает химические ожоги, необходимо
использовать защитные очки, перчатки и лабораторный халат
10.2 Утилизация
Пожалуйста, выполняйте предписания, предусмотренные действующим
законодательством!
Обновления
Пожалуйста, обратите внимание на изменения по сравнению с
предыдущей версией
Номер версии: V15. 08/04-1
• Предыдущая версия: V14. 08/03-1
Изменение в главе: 4, 6, 7.2.1, 7.3.5, 7.4
SERION ELISA classic Borrelia burgdorferi IgG/IgM
ОГЛАВЛЕНИЕ
1 ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
2 ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Ч 3 ПРИНЦИП РАБОТЫ SERION ELISA classic
| 4 СОДЕРЖИМОЕ И СОСТАВ УПАКОВКИ ТЕСТА
5 ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ
6 ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ РЕАГЕНТОВ
7 ПРОВЕДЕНИЕ ТЕСТА SERION ELISA classic
7.1 Общие указания
7.2 Подготовка и хранение проб
7.3 Приготовление реагентов
7.4 Краткий порядок проведения теста
7.5 Проведение теста
8 ОБРАБОТКА ДАННЫХ ТЕСТА SERION ELISA classic
ш 8.1 Количественное измерение сыворотки по методу 4PL
8.2 Критерии действительности теста
8.3 Обработка данных теста SERION ELISA classic Borrelia burgdorferi IgG/IgM
8.4 Интерпретация результатов
9 ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ЧЕРТЫ
9.1 Точность
9.2 Чувствительность и специфичность
10 МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ
10.1 Предостережения и меры предосторожности
10.2 утилизация
11 ЛИТЕРАТУРА
Данная версия № V: V15. 08/04-1
предыдущая версия: V14.08/03-1
SERION ELISA classic Borrelia burgdorferi IgG/IgM
Иммуноферментный набор для определения антител к
иммуноглобулинам человека IgG/IgM
- только для диагностики in vitro -
Набор IgG (количественный) № для заказа: ESR121G
Набор IgM (количественный) № для заказа: ESR121M
Тесты одобрены : Immunomat TWINsystem / BASEplus, Dade Behring ВЕР ® III /
ВЕР ® 2000, DSX, в ручном режиме
1 ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Иммуноферментный тест-набор SERION ELISA classic Borrelia burgdorferi Ig
SERION ELISA classic Borrelia burgdorferi IgM предназначен для качественно:
количественного выявления антител человека к вирусам Borrelia burgdorferi s<
lato в сыворотке, плазме или ликворе.
2 ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Borrelia burgdorferi является возбудителем т.н. Лайм-боррелиоза, заболеванг
очень разнообразной клинической симптоматикой, названной по наименова]
города Старый Лайм (Old Lyme, Connecticut, USA). Возбудитель был открыт Ви
Бургдорфером в 1982 г. и таксономически принадлежит к семейству спирохе
Передача на человека происходит от зараженных клещей (Ixodes ricinus, Eur
Ixodes scapularis, USA).
Наиболее важными гуманпатологическими геновидами Borrelia burgdorferi sc
lato являются В. burgdorferi sensu stricto, B. garinii и В. afzelii. Все три генов
встречаются в Европе во всех умеренных климатических зонах, в то время кг
США встречается только вид В. burgdorferi sensu stricto. Резервуаром возбудт
для боррелий являются мелькие лесные животные, в основном мыши.
В зависимости от географического региона и популяции клещей степ
зараженности инфицированных боррелиями взрослых клещей, нимф и личи
бывает от 0-50%. В эндемических регионах Германии она составляет 10-30%.
russian 2
Лайм-боррелиоз это мультисистемное заболевание, имеющее три стадии с
разнообразными проявлениями болезни. Участие органов может быть как
одиночным, так и выступать в различных комбинациях. Стадия I наступает спустя
несколько недель после укуса клеща и переносе при этом Borrelia burgdorferi на
человеческого хозяина. Клинические симптомы обычно не специфические
(температура, вялость, головные боли, боли в мускулах и суставах). Важным
диагностическим критерием в этой ранней фазе Лайм-боррелиоза является
возникновение у 30-60% инфицированных на месте укуса клеща так называемой
«блуждающей сыпи» (Erythema migrans (ЕМ)).
Во временной промежуток от нескольких недель до нескольких месяцев после
начала инфекции возможна генерализация заболевания и переход её в стадию II. В
ш этой стадии наряду с общими жалобами возникают невралогические симптомы
(напр. лицевой парез или менинго-радикулит), иногда появляются
1 кардиологические симптомы (Лайм-кардит) и глазные проявления.
Многие годы после укуса клеща могут проявляться признаки болезни в III стадии:
поздние дерматологические проявления инфекции Borrelia burgdorferi
(Acrodermatitis chronica atrophicans), жалобы на хронический рецидивирующий
артрит (Lyme-Arthritis), а так же неврологические симптомы (хронический
энцефаломиелит).
Из-за сложной картины заболевания и частой не специфической симптоматики
серологическая диагностика является средством к подбору целенаправленного
дифференцированного диагноза. Для серологического исследования рекомендуется
ступенчатая диагностика. Сначала следует применить чувствительный поисковый
тест (например ELISA). Положительные и пограничные результаты ELISA следует
затем подтвердить иммуноблотом. ELISA является особенно подходящим методом
благодаря её дифференциированному специфическому по иммуноглобулиновым
классам анализу иммуной реакции. Из-за обширной варьированное™ иммуной
реакции пациентов диагноз следует ставить, учитывая всю клиническую картину.
SERION ELISA classic Borrelia burgdorferi IgG/IgM использует европейский род
геновида Borrelia garinii наряду с видом Borrelia afzelii РКо, чем достигается высокая
чувствительность. Важные для диагностики ранней фазы заболевания боррелиоза
протеины OspC und VlsE, а так же для поздней фазы важный протеин Р100
содержатся в используемых нами геновидах. . Для увеличения чувствительности к
антигенному покрытию добавили рекомбинированный протеин VlsE.
) Специфичность теста оптимируется благодаря добавлению к разбавляющему
буфферу лизата Treponema phagedenis. Лизат дает возможность выборочной
абсорбции потенциально перекрестно-реактивных антител трепонемы в сыворотке.
russian 3
3 ПРИНЦИП РАБОТЫ SERION ELISA classic
При использовании непрямой техники ELISA, микрострипы теста покрыт
соответствующим антигеном. Специфические антитела, находящиеся в проб
пациента, связываются с этими антигенами, образуя твердую фазу.
Для проявления серологической реакции используют помеченные щелочной
фосфатазой выявленные антитела, направленные против человеческих
иммуноглобулинов пробы пациента, которые в положительном случае связаны с
антигеном. При добавлении субстрата (паранитрофенилфосфата) в результате
реакции фермента и субстрата происходит окрашивание раствора в желтый цвет.
Интенсивность желтой окраски измеряется фотометрическим способом; она
пропорциональна уровню содержания специфических антител.
russian 4
I 4 СОДЕРЖИМОЕ И СОСТАВ УПАКОВКИ ТЕСТА
1 (компоненты теста и состав Колич./
объём
1 Отрывные микрострипы, каждая с 8 отдельными лунками с антигенным
покрытием (всего 96)| МТР|,
12
; 1 тестовый держатель
Напыленный материал деактивирован
Стандартная сыворотка (готовая к употреблению) |STD| 2x2 мл
I Человеческая сыворотка в фосфатном буфере с протеином; отрицательная в
отношении антител к HIV, антигенов I IBs -Ag (поверхностных антигенов вируса
гепатита В) и антител к HCV; консервант: < ОД % азид натрия
1 Краситель: Amaranth О
1 Отрицательная контрольная сыворотка (готовая к употреблению) |NEG 2 мл
1 Человеческая сыворотка в фосфатном буфере с протеином; отрицательная в
| отношении антител к HIV, антигенов HBs -Ag (поверхностных антигенов вируса
гепатита В) и антител к HCV; консервант: < ОД % азид натрия
Краситель: Lissamin-зеленый V
Конъюгаты к человеческим IgG, IgA, IgM (готовые к употреблению) |АРС| 13 мл
Поликлональные козьи антитела направленные против человеческих IgG, IgA, IgM,
1 конъюгированные со щелочной фосфатазой, стабилизированные протеиновым
стабилизирующим раствором
1 Консервант: 0,01 % метилизотиазолои
I 0,01 % бромпитродиоксан
Концентрат раствора для промывания (достаточно для 1000 мл) WASH 33,3 мл
Раствор хлорида натрия с Tween 20, 30 mM Tris
I Консервант: < ОД % азид натрия
Буфер для разведения S2 (№ для заказа: B231-S2) DILBS2 2 х 50 мл
Фосфатный буфер с протеином и Tween 20;
Консервант: < ОД % азид натрия
0,01 г/л бромфеноловой голубой соли натрия
Стоп-реагент STOP 15 мл
1,2 N натровый щелок
Субстрат (готовый к употреблению) |pNPP| 13 мл
паранитрофенилфосфат, буфер без растворителя,
Консервант: < ОД % азид натрия
Сертификат контроля качества со стандартной кривой и таблицей значений 1
INFO
(количественное выражение антител в мЕд/мл или Ед/мл)
russian 5
5 ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Обычное лабораторное оборудование
Для выявления IgM:
Rf абсорбент SERION Rf-Absorbens (№ для заказа Z200/20m 1)
Спектрофотометр для микрогитровальных стрипов с фильтром, длина волны
405 нм, рекомендуемая длина эталонной волны в пределах от 620 нм до 690 нм
(например, 650 нм)
Термостат инкубатор 37°С
Влажная камера
Дистиллированная вода
6 ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ РЕАГЕНТОВ
]
Реактив Хранение
=
-----------------------------------------■
Микротит- в неоткрытом виде См. срок хранения на
ровальные планшете.
стрипы
(антиген)
после вскрытия упаковки при 2-8 °С при Минимальный срок годносп
использовании осушителя, в закрытом виде
4 недели
Следует обратить внимание на то, чтобы
Срок годности при
неиспользованные лунки хранились в сухих условиях и
правильном применение и
герметично в специальном пакете из композитной
хранение
алюминиевой пленки.
до истечения срока хранен!
Контрольные / после вскрытия упаковки при 2-8°С до окончания срока храиенш;
стандартные 24 месяца с даты выпуска 1
сыворотки
Конъюгат готовый к употреблению раствор при 2-8°С до окончания срока хранении
28 месяца с даты выпуска
Следует избегать заражения (стерильные
наконечники пипеток!)
russian 6
i Разбавляю после вскрытия упаковки при 2-8°С 24 месяца
щий буфер
Помутневшие растворы использовать не следует.
SERION ELISA
до окончания срока хранения
classic Borrelia
burgdorferi в неоткрытом виде 36 месяцев с дата выпуска
IgG/IgM
(№ для заказа:
B231-S2)
Буфер для концентрат после вскрьггия упаковки при 2-8°С до окончания срока хранения
промывания
2 недели
готовый раствор при 2-8°С 1 неделя
! готовый раствор при комнатной температуре
Емкость для готового раствора следует регулярно
промывать! Помутневшие растворы использовать не
следует.
Субстрат готовый раствор при 2-8°С, хранить в до окончания срока хранения
защищенном от света месте
24 месяца с даты выпуска
Избегайте загрязнения микробами! При наличии
интенсивной желтой окраски (экстинкция
дистиллированной воды > 0,25) не использовать.
Стоп-реагент после вскрытия упаковки при комнатной до окончания срока хранения
температуре
7 ПРОВЕДЕНИЕ ТЕСТА SERION ELISA classic
7.1 Общие указания
Необходимо использовать исключительно реагенты SERION ELISA classic,
поскольку они адаптированы друг к другу внутри системы, и не заменять их
реагентами других производителей. Стандартные и контрольные сыворотки, а
также конъюгаты в зависимости от партии адаптированы к конкретному тест-
набору и не могут использоваться в тест-наборах других партий. Разбавляющий
буфер, буфер для промывывания, стоп-реагент и раствор субстрата могут
использоваться во всех тестах SERION ELISA classic независимо от партий и наборов.
Для каждого класса иммунглобулина имеются три разных концентрации
конъюгата:
НИЗКАЯ, СРЕДНЯЯ И ВЫСОКАЯ.
russian 7
Классификацию конъюгата можно распознать на этикетках но следующим
обозначениям:
Напр. IgG + IgG-конътогат низкой концентрации
IgG ++ IgG-конъюгат средней концентрации
IgG +++ IgG-конъюгат высокой концентрации
Пожалуйста, всегда обращайте внимание на надписи на этикетках!
Все компоненты теста ELISA classic следует использовать до истечения срока j
годности (см. указания на этикетке) при соблюдении правильных условий|
хранения. Не применять реагенты после истечения срока годности. По этому I
поводу см, также п. 6 "ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ РЕАГЕНТОВ"
Неверное разбавление реагентов может привести к потерям чувствительности.
Реагенты теста во время хранения и инкубации необходимо защищать от яркого!
света. После использования плотно закрыть упаковку во избежание высыхания и
бактериального загрязнения.
Герметично закрытый пакет дня лунок микротитровальной панели разрезать только
по намеченному месту.
При повреждении пакета из алюминиевой пленки или неплотной упаковке пакета, |
дня хранения неиспользованных лунок, их не следует использовать для теста.
Все реагенты теста перед его началом необходимо довести до комнатной]
температуры.
При извлечении порции реактива, во избежание загрязнения их микробами следует
всегда соблюдать правила стерильности. Во избежание ложноположительных
результатов наконечник пипетки при вводе конъюгата ни в коем случае не должен
касаться и смачивать верхний край лунок. При закрытии флаконов необходимо
следить за тем, чтобы для этого использовалась соответствующая данному флакону
крышка.
Воспроизводимость результатов зависит, кроме прочего, и от тщательного
перемешивания соответствующих реагентов. Перед забором контрольной
russian 8
сыворотки и конъюгата емкости необходимо хорошо встряхнуть. Растворы проб
перед вводом необходимо хорошо размешать мономиксером (например, Vortex).
Необходимо следить за аккуратным заполнением лунок и соблюдением указанных
времени и температуры инкубации. Значительные различия во времени между
заполнением первой и последней лунок при добавлении проб/контрольных
сывороток, конъюгата и субстрата приводит к различиям "прединкубационного
периода", которые могут значительно повлиять на точность и воспроизводимость
измеренных значений.
Лишь строгое соблюдение рабочей инструкции теста SERTON ELISA classic
обеспечивает правильность результатов.
Результаты теста можно учитывать лишь в том случае, если соблюдены все условия в
зависимости от партии, приведенные в сертификате контроля качества,
прилагаемом к набору.
Правильная промывка препятствует неспецисЬичности теста:
Следует выполнять руководство к применению используемых промывателей. В тесте
SERION ELISA classic используются плоские планшеты. Валено равномерное
наполнение лунок буфером для промывки и его полное удаление после промывки
(возможны неконтролируемые эффекты при разбавлении). Избегать образования
пены! Не повреждать покрытие лунок!
7.2 Подготовка и хранение проб
Липидные, гемолизированные, а также иктеричные пробы (сыворотка или плазма)
следует использовать лишь с оговоркой, хотя в ходе наших исследований не было
замечено негативного влияния. Пробы, загрязненные бактериями, использовать не
следует.
Пригодными для исследований материалами являются пробы сыворотки или
длазмы (EDTA, цитрат, гепарин), полученные стандартными лабораторными
методами.
Пробы нельзя деактивировать термическим способом.
russian 9
7.2.1 Разбавление проб
Перед началом теста, пробы (Vi) растворить в разбавляющем буфере (V ):
2
Набор SERION ELISA classic Borrelia burgdorferi IgG/IgM содержит специальн]
разбавляющий буффер Borrelia burgdorferi IgG/IgM (№ для заказа: B231-S2
лизатом Treponema phagedenis для абсорбции потенциально перекрестноактивн
антител спирохет в сыворотках. Бутылочку с разбавляющим буффером В от
burgdorferi IgG/IgM непосредственно перед началом теста встряхнуть!
Перед началом теста, пробы (Vi) растворить в разбавляющем буфере (V ):
2
SERION ELISA classic Borrelia burgdorferi IgG
Vi + V = 1+100 no 10 мкл пробы пациента
2
на каждые 1000 мкл разбавляющего буфера
После каждого разбавления и перед отбором, пробы следует хорошо размет
мономиксером (например, Vortex) для получения гомогенного раствора.
SERION ELISA classic Borrelia burgdorferi IgM
Интерференция ревматоидного фактора
Антитела ревматоидного фактора в большинстве являются ауто-антителами кла
IgM, которые в основном связываются с иммунными комплексами I
Специфическое выявление IgM антител из-за этих ревматоидных факторов мо)
иметь ложноположительные результаты. Кроме того, существует возможно*
вытеснения IgM-антител с более слабыми связями IgG-антителами с бо.
сильными связями. Обнаружение IgM в этом случае может оказат
ложноотрицательным. По этой причине пробы для определения IgM необходг
предварительно обработать абсорбентом ревматоидного фактора. (SERIC
Rheumafaktor-Absorbens, Nr. для заказа Z4 (4 мл / 20 определений) / Z200 (20 мл/
определений)).
Сначала производится разбавление абсорбента ревматоидного фактора (
разбавляющим буфером (V ) в соотношении 1+4.
2
russian 10
V. Ч
Vi + V 2 = 1 + 4 по 200 мкл Rf-абсорбента
на каждые 800 мкл разбавляющего буфера
Затем пробы пациента (V ) разбавляются в смеси Rf и разбавляющего буфера (Уз):
4
V 4 + Уз = 1+100 по 10 мкл пробы пациента
на каждые мкл Rf -разбавляющего буфера
1000
После каждого разбавления и перед отбором, пробы следует хорошо размешать
мономиксером (например, Vortex) для получения гомогенного раствора.
7.2.2 Хранение проб
Пробы пациентов хранятся не более 7 дней при температуре 2-8°С. Более
длительное хранение проб возможно при температуре < -20°С.
Следует избегать повторных циклов замораживания и оттаивания.
Разбавленные образцы могут храниться при 2-8°С в течение одной недели.
russian 11
7.3 Приготовление реагентов
7.3.1 Микротитровальные стрипы
Титровальные стрипы или лунки теста упакованы вместе с осушителем. Ненужны!
лунки следует извлечь из рамки держателя и снова положить в специальный пакет
который закрывается герметически.
7.3.2 Контрольные сыворотки / стандартные сыворотки
Контрольная и стандартная сыворотки готовы к употреблению и не требую
дальнейшего разбавления. Они могут непосредственно использоваться в тесте.
При каждом тесте независимо от количества использованных титровальных стрипо
должны проводиться у контрольных сывороток простой и Cut-off, а у стандартны
сывороток двойной анализ.
Контрольные сыворотки не обрабатывать абсорбентом ревматоидного фактора!
7.3.3 Конъюгат к человеческим IgG, IgA или IgM-AT (готовый к употреблению)
Конъюгаты взаимозаменяемы в пределах данной концентрации и класс
иммунноглобулина.
Строго избегать бактериального заражения готового к употреблению конъюгата (i
производить забора непосредственно из бутылочки с конъюгатом).
7.3.4 Буфер для промывки
Концентрат буфера для промывки (Vi) разбавить дистиллированной водой
соотношении 1:30 до конечного объема (Уг).
Пример:
Копцсшрат буфера для Конечный объем (Уг)
промывки (Vl)
33,3 мл 1000 мл
1,0 мл 30 мл
7.3.5 Разбавляющий буфер для проб (готовый к употреблению)
Набор SERION ELISA classic Borrelia burgdorferi IgG/IgM содерж!
специальный разбавляющий буффер Borrelia burgdorferi IgG/IgM (N° д
заказа: B231-S2).
7.3.6 Субстрат (готовый к употреблению)
Во избежание загрязнения бактериями используйте перчатки. Для забора раство
субстрата используйте только стерильные наконечники пипеток!
7.3.7 Стоп-реагент (готовый к употреблению)
russian 12
7.4 Краткий порядок проведения теста
Borrelia burgdorferi
IgG/IgM количественный
Дня обнаружения IgM антител провести предварительную Rf-абсорбцию проб.
Разбавление проб1
(пробы пациентов)
1+100
Добавление разбавленных проб и
готовых к употреблению контрольных/стандартных сывороток (100 мкл)
ИНКУБАЦИЯ 60 мин./37°С
влажная камера
41
ПРОМЫВКА (4 х 300 мкл |DIL| jWASHj])2
41
Добавление раствора коныогата |АРС| (100 мкл)
41
ИНКУБАЦИЯ 30 мин./37°С
влажная камера
41
ПРОМЫВКА (4 х 300 мкл |DIL| [WASH])2
f
41
Добавление раствора субстрата |pNPP| (100 мкл)
41
ИНКУБАЦИЯ 30 мин./37°С
влажная камера
41
Добавление стоп-реагента |STOP| (100 мкл)
41
ИЗМЕРЕНИЕ ПОГЛОЩЕНИЯ при 405 нм
Специальный буфер для разбавления для следующих наборов:
Borrelia TgG & IgM, EBV EA IgG, Parvovirus B19 IgM, Hantavirus Puumala TgG & IgM.
2При доделке вручную: в конце вытряхнуть планшет на бумажную салфетку.
russian 13
7.5 Проведение теста
1. Установить необходимое количество лунок в тестовую рамку и закрепить лип
протокола. I
2. По 100 мкл разбавленных проб или готовых к употреблению контролен
ввести пипеткой в соответствующие лунки титровальных стрипов. Одну лунку
необходимо оставить для холостого значения, например:
IgG/IgM количественный:
Антигенные лунки
Лунка А1 Холостое значение субстрата
Лунка В1 Отрицательный контроль
Лунка С1 Стандартная сыворотка
Лунка D1 Стандартная сыворотка
Лунка Е1 Пациент 1....
3. Инкубация образцов 60 минут (+/- 5 мин.) при 37°С (+/-1°С) во влажной
камере.
4. По истечении времени инкубации, лунки промойте (в промывателе или
вручную):
- отсосите инкубационную жидкость или удалите ее из лунок вытряхиванием
- в каждую лунку введите по 300 мкл водного раствора
- отсосите буфер для промывки или удалите его вытряхиванием
- повторите процедуру 3 раза (т.е. всего промойте 4 раза)
- вытряхните планшет на бумажные салфетки
5. Добавление конъюгата
100 мкл готового к употреблению IgG/IgM/IgA конъюгата ввести в
соответствующие лунки (кроме холостого значения субстрата).
6. Инкубация конъюгата 30 минут (+/-1 мин.) * при 37°С (+/-1°С) во влажнел
камере.
7. По истечении времени инкубации промойте лунки (см. выше).
russian 14
8. Добавление субстрата
По 100 мкл готового к употреблению раствора субстрата введите во все лунки (в
т.ч. и в лунку для холостого значения субстрата).
9. Инкубация субстрата 30 минут (+/1 мин.)* при 37°С (+/1°С) во влажной камере.
10. Остановка реакции
По 100 мкл останавливающего раствора введите во все лунки,
микротитровальный планшет слегка встряхните.
И. Измерение поглощения
В течение 60 мин. при 405 нм к холостому значению субстрата, эталонная длина
волны в пределах 620-690 нм (например, 650 нм).
8 ОБРАБОТКА ДАННЫХ ТЕСТА SERION ELISA classic Borrelia
burgdorferi IgG/IgM
8.1 Количественное измерение сыворотки по методу 4PL
Определение концентрации антител в тесте SERION ELISA classic производится по
"логистической логарифмической модели с 4 параметрами (4PL)",
математическая функция которой описывается следующей формулой:
D - А
OD = А +
1 g В(С - In конц.)
Параметры А, В, С и D точно передают ход кривой и определяют
1. нижнюю асимптоту ^ параметр А
2. подъем кривой О параметр В
3. точку перегиба кривой ^ параметр С
4. верхнюю асимптоту параметр D
Учтите, пожалуйста, что в особых условиях работы может возникнуть необходимость
лабораторной адаптации инкубационного периода.
russian 15
Институт ВирионХЭегюп ГмбХ (Вюрцбург) ддя каждой партии наборов определяет
стандартные кривые в нескольких тестах при соблюдении оптимальных условий. У
пользователя отпадает необходимость в дорогостоящем и занимающем много
времени построении стандартной кривой.
Для расчетов результатов хода теста пользователь в каждой упаковке теста получает
соответственно адаптированную к партии стандартную кривую в виде графика и
таблицу значений. Соответственное программное обеспечение для оценки
предостав.ляется в ответ на запрос.
Для выравнивания колебаний тестов и проверки качества хода теста в поставку
включена так называемая стандартная сыворотка. Этой контрольной сыворотке
при контроле качества присваивается номинальное значение и область применения, в
пределах которой возможна точная и надежная обработка результатов теста.
Стандартная сыворотка не имеет функции положительной контрольной сыворотки
и в отдельных ELTSA-тестах может оцениваться, как предельная или отрицательная.
8.2 Критерии действительности теста
Холостое значение субстрата должно иметь значение OD < 0,25.
Отрицательный контроль при оценке теста должен быть отрицательным.
При количественном варианте SERION ELISA classic среднее значение OD
стандартной сыворотки, после вычета значения холостого субстрата, должно
быть в пределах области применения, указанной в сертификате контроля
качества данной партии. ||
При качественном варианте SERION ELISA classic среднее значение OD
положительного контроля, после вычета значения холостого субстрата должно
быть в пределах области применения, указанной в сертификате контроля
качества данной партии.
Отдельные значения OD не должны расходиться более чем на 20%.
Если эти критерии не выполняются, тест является недействительным и его
необходимо повторить.
russian 16
8.3 Обработка данных теста SERION ELISA classic Borrelia burgdorferi IgG/IgM
8.3.1 Неавтоматизированная обработка
Для обработки результатов теста прилагаются стандартная кривая, а также таблица
значений, при помощи которых каждому полученному в результате теста значению
0D может быть определена соответствующая активность антител. В таблице оценки
приведено "номинальное значение" стандартной сыворотки, а также область его
применения.
Холостое значение субстрата (прозрачного) необходимо до обработки данных
вычитать из всех результатов измерений.
Метод 1: Качественный расчет
Для установления области Cut off в OD среднее значение измеренного стандартного
0D умножают на числовое значение, указанное в сертификате качества (см.
формулы дня специальных систем оценок), например:
0D = 0,502 х MW(STD) при верхнем значении Cut off
OD = 0,352 х MW(STD) при нижнем значении Cut off
Если, например, среднее значение поглощения стандартной сыворотки равно 0,64,
получается, что область Cut off находится в пределах от 0,225 до 0,321.
Метод 2: Бесступенчатое определение активности антител при помощи
стандартной кривой.
Колебания тестов, в зависимости от того или иного дня или лаборатории
(т.н. межпробная дисперсия) выравниваются за счет умножения текущей измереной
величины пробы пациента на поправочный коэффициент F.
Номинальное значение OD (стандартной сыворотки)
F = -------------------------------------------------------------------------------------------
Значение OD (стандартной сыворотки) в определенный день
Этот способ необходим для того, чтобы выравнять или нормализовать актуальную
измеренную величину пользователя к специфической партии стандартной кривой.
russian 17
Сначала путем расчета коэффициента необходимо исправить суточные колебания:
1. Из двух значений поглощения стандарта образовать среднее значение и
проверить, находится ли полученное значение в допустимых пределах.
2. Расчет коэффициента "F": Указанное номинальное значение стандарта делится
на среднее значение поглощения:
Б = номинальное значение стандарта / среднее значение поглощения стандарта.
3. Все измеренные величины проб пациентов умножаются на "F".
4. На основании откорректированных измеренных величин при помощи
стандартной кривой считываются значения активности антител в мЕд/мл или
Ед/мл.
Обобщение для SERION ELISA Borrelia burgdorferi IgG:
Положительный результат теста: >5 Ед/мл
Пограничный результат теста: 3-5 Ед/мл
Отрицательный результат теста: <3 Ед/мл
Обобщение для SERION ELISA Borrelia burgdorferi IgM:
Положительный результат теста: >5 Ед/мл
Пограничный результат теста: 3-5 Ед/мл
Отрицательный результат теста: <3 Ед/мл
В случае пограничного результата, тест следует провести параллельно с новыми
пробами (парных сывороток), взятыми с интервалом в 1-2 недели.
russian 18
8,3.2 Автоматическая обработка теста при помощи программы
SERION easy base 4PL/SERION evaluate
В результате ввода 4 параметров и номинального значения стандартной сыворотки
активность антител после замеров исследуемого планшета рассчитывается
специальной программой для расчета.
В случае, если значение выходит за рамки области применения, программа SERION
ту base 4PL может выдать следующие сообщения об ошибках:
"Стандарты выходят за пределы допусков"; и/или "Стандарты различаются
более чем на 20%."
Сообщение об ошибках программы SERION evaluate производится только на
английском языке:
«Standard values out of ranges in following groups: Group 1-24. Standard value differ
more than 20% in following groups: Group 1-24."
В этих случаях результат теста является недействительным и его следует повторить.
Параметры и номинальное значение необходимо менять только при изменении
партии (параметры и номинальное значение приведены в таблице значений).
Верность ввода этих зависящих от партии значений можно проверить при помощи
соответствующих стандартной сыворотке значений мЕд/мл или Ед/мл. Полученное
среднее значение должно совпадать с указанным в сертификате партии значением.
Корректировка значения замера производится автоматически. На дисплее учета
результатов появляется следующий текст:
Наименование пробы
Значение OD
мЕд/мл или Ед/мл
Подсчёт
russian 19
8.4 Интерпретация результатов
В следующей таблице представлены возможные констелляции антител и их
диагностическая интерпретация.
Основная схема интерпретации
IgM IgG Интерпретация
Нет признаков инфекции; при подозрение на острую
инфекцию, наир, после укуса клеща или при Erythema
-/gw -
migrans (ЕМ): повторный контроль через 3-4 недели
+ -/+ Указание на раннюю стадию Borreliose: провести
иммуноблот для подтверждения
Указание на острую Borreliose: провести иммуноблот для
+ +
подтверждения
+ a) Указание на острую Borreliose, часто в стадии III: провести
иммуноблот для подтверждения
b) серорубец после спонтанного выздоровления или терапии
IgM-антитела после острой инфекции Borrelia burgdorferi можно выявлять
примерно с третей недели после укуса клеща. IgM-антитела достигают своего
максимума в стадии Т Лайм-боррелиоза через несколько недель после начала |
инфекции. Их можно выявить и во II стадии. Однако, в фазе I реагирует лишь :
примерно половина инфицированных пациентов реакцией антител.
Антитела IgG появляются обычно после антител IgM. Они достигают своего
максимума значительно позже, спустя месяцы или годы.
Положительная серология боррелей показывает, что пациент иммунологически
разбирается с возбудителем, но это не является показателем наличия Лайм- :
боррелиоза. Интерпретацию результатов ELISA следует проводить, учитывая всю
клиническую картину. Положительные и пограничные результаты ELISA следует
перепроверить в иммуноблоте (ступенчатая диагностика). Серологическим
указанием на наличие острой инфекции является установление значительного
возрастания титра или сероконверсия; указанием на раннюю стадию острой
инфекции после укуса клеща является реакция IgM-антител.
russian 20
_____
9 ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ЧЕРТЫ
9.1 Точность
Точность в пределах сыворотки была определена при использовании сывороток с
различной реактивностью многократно (п = 20) в планшете с антигенным
покрытием. Для определения точности в пределах сыворотки пробы сыворотки с
различной реактивностью испытывались в 10 независимых друг от друга опытах.
Стандартное отклонение
Коэффициент вариации (КВ) = ----------------------------------х 100
Среднее значение
SERION ELISA classic Borrelia burgdorferi IgG:
Среднее Внутри Среднее Внутри
значение значение
пробное пробное
поглощения поглощения
(VK %) (VK %)
(OD) (OD)
Проба
Отрицательная 0,24 2,6 0,26 6,4
Пол ожите лы тая 0,56 6,4 0,76 10,3
Резкоположит. 2,80 2,6 2,5 8,1
SERION ELISA classic Borrelia burgdorferi IgM:
Среднее Внутри Среднее Внутри
значение значение
пробное пробное
поглощения поглощения
(VK %) (VK %)
(OD) (OD)
Проба
Отрицателы тая 0,19 5,0 0,19 7,7
Положительная 0,81 6,6 0,90 9,5
Резкоположит. 3,75 4,5 3,84 5,8
russian 21
SERION ELISA classic Borrelia burgdorferi IgG
244 сыворотки (14 сывороток проверенного качества, 45 сывороток здоровых
доноров, 26 сывороток беременных женщин и 159 сывороток пациентов с
подозрением на инфекцию боррелиоза) были протестированны тестами SERION
ELISA classic Borrelia burgdorferi IgG в сравнение с двумя другими имеющимися в
продаже тестами ELISA и двумя вестернблотами. Оценка
положительная/отрицательная давалась по превышающему совпадению
сравнительных тестов и/или подтверждению блота:
- положительная, если в двух сравнительных тестах ELISA положительная и в блоте
пограничная
- положительная, если в двух сравнительных тестах ELISA отрицательная и в блоте
положительная
- отрицательная, если в двух сравнительных тестах ELISA отрицательная и в блоте
отрицательная
При оценке в расчет не принимались сыворотки, которые были в тесте SERION
ELISA classic пограничными и те, которые в различных тестах показывали
отличающиеся результаты.
SERION ELISA classic
Borrelia burgdorferi IgG
Чувствительность 97,6
Специфичность 97,1
russian 23
£
10 МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ
10.1 Предостережения и меры предосторожности
Тест SERION ELISA classic предназначен только для использования специалисте
безупречно владеющим необходимыми навыками.
При обращении с реагентами теста и пробами пациентов необходимо выполне
общепринятых лабораторных правил:
Упаковка теста содержит человеческие сыворотки. Хотя все контроль
сыворотки имеют отрицательные значения содержания вирусов HBs
гепатита С, а также ВИЧ, их следует рассматривать, как потенциаг
инфекционно опасные материалы.
Не набирайте растворы в пипетку при помощи рта.
В помещениях, где ведется работа с реагентами теста и пробами пациенте]
разрешается принимать пищу, пить или курить.
При обращении с реагентами теста и пробами пациентов следует избе
прямого контакта, поэтому следует использватъ лабораторный х;
одноразовые перчатки и защитные очки. Руки по окончании работы еле
тщательно мыть.
Пробы пациентов и все потенциально инфекционные материалы п
проведения теста следует обеззаразить.
Реагенты необходимо хранить в месте, недоступном для детей.
Стоп-реагент:
едкий (С); R34: вызывает химические ожоги,
необходимо использовать защитные очки, перчатки и лабораторный халат
10.2 утилизация
Пожалуйста, выполняйте предписания, предусмотренные действующим
законодательством!
russian 24
SERION ELISA classic Bordetella pertussis Toxin IgG/IgM
Иммуноферментный набор для определения антител к
иммуноглобулинам человека (IqG/IgM)
только для диагностики in vitro
IgG-набор (количественный) № для заказа: ESR1201 G
IgM-набор (количественный) № для заказа: ESR1201 М
Тесты одобрены : Dade Behring ВЕР ® III/ ВЕР ® 2000, DSX, в ручном режиме
1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Иммуноферментный тест-набор SERION ELISA classic Bordetella pertussis Toxin
IgGAgM предназначен для качественного и количественного выявления антител
человека к Bordetella pertussis Toxin в сыворотке или плазме. Система теста служит для
контроля успешности прививки и может использоваться в комбинации с SERION ELISA
classic Bordetella pertussis IgG, IgA и IgM для выяснения следующих диагностических
вопросов:
• Выявление свежих инфекций В. Pertussis
• Выявление острых или недавно перенесенных инфекций В. Pertussis
• Дифференциация диагноза В. Pertussis от В. Parapertussis
• Дифференциация диагноза длительное время держащихся картин заболевания с
нехарактерной симптоматикой кашля (В. bronchiseptica-, Adenovirus-, RSV
bronchiolitis-, Chlamydia-und Mycoplasma-Infektionen)
• Поддержка эпидемиологических исследований
2. ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Bordetella pertussis относится к Genus Bordetella и представляет собой маленькую
кокковую граммнегативную палочку. Bordetella pertussis является возбудителем коклюша,
широко распространенного инфекционного заболевания, передающегося от человека к
человеку посредством капельной инфекции. Этим инфекционным заболеванием
страдают в первую очередь маленькие дети от 0-4 лет, у грудных детей оно дает
высокую смертность (60% всех смертный случаев от коклюша бывают на первом году
жизни)! Слабые формы развития болезни вызываются В. parapertussis.
Прикрепление В. Pertussis и В. parapertussis на реснички клеток слизистых оболочек
респираторного тракта человека происходит с помощью спаек. Важный спаечный
протеин и так же важный иммуноген это т.н. Filamentose Hamagglutinin (FHA).
Колонизация респираторного тракта и укрепление инфекции облегчается благодаря
комбинированному действию различных факторов вирулентности.
SERION ELISA classic Bordetella pertussis Toxin IgG/IgA
ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
2. ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
3. ПРИНЦИП РАБОТЫ SERION ELISA classic
4. СОДЕРЖИМОЕ И СОСТАВ УПАКОВКИ ТЕСТА
5. ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ
6. ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ РЕАГЕНТОВ
7. ПРОВЕДЕНИЕ ТЕСТА SERION ELISA classic
7.1 Общие указания
7.2 Подготовка и хранение проб
7.3 Подготовка реагентов
7.4 Краткий порядок проведения теста
7.5 Проведение теста
8. ОБРАБОТКА ДАННЫХ ТЕСТА
8.1 Количественное измерение сывороток по 4 параметрам логарифмической
модели (4PL)
8.2 Критерии действительности теста
8.3 Обработка данных теста SERION ELISA classic Bordetella pertussis Toxin
IgG/IgM (количественный)
8.4 Интерпретация результатов
9. ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ЧЕРТЫ
9.1 Точность
9.2 Чувствительность и специфичность
10. МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ
10.1 Предостережения и меры предосторожности
10.2 Утилизация
11. ЛИТЕРАТУРА
Данная версия № V 5.04/12-1
(предыдущая версия: v 4.04/03-1)
3. ПРИНЦИП РАБОТЫ SERION ELISA classic
При использовании непрямой техники ELISA, микрострипы теста покрыты
соответствующим антигеном. Специфические антитела, находящиеся в пробе пациента,
связываются с этими антигенами, образуя твердую фазу.
Для проявления серологической реакции используют помеченные щелочной
фосфатазой выявленные антитела, направленные против человеческих
иммуноглобулинов пробы пациента, которые в положительном случае связаны с
антигеном. При добавлении субстрата (паранитрофенилфосфата) в результате реакции
фермента и субстрата происходит окрашивание раствора в желтый цвет. Интенсивность
желтой окраски измеряется фотометрическим способом; она пропорциональна уровню
содержания специфических антител.
Важным фактором вирулентности является синтезированный и выделяемый
исключительно В. pertussis Pertussis-Toxin (РТ). Множество биологических эффектов,
таких как лейкоцитоз, лимфоцитоз, митогенитет и сенсибилизация гистамина
вызываются действием токсина.2
С 1991 года Постоянная Комиссия при Институте Роберта-Коха (STIKO) рекомендует
опять делать комбинированную прививку против дифтерии, столбняка и коклюша для
всех детей до 6 лет. В 1995 г. были допущены неклеточные прививочные материалы,
которые утвердились, благодаря своей лучшей по сравнению с прививочным
материалом целой клетки переносимостью. Современные неклеточные прививочные
материалы содержат один, два, три или пять компонентов В. pertussis. Все
производители применяют прививочный компонент РТ, в би-три-и мультивалентных
прививочных материалах содержатся дополнительно и FHA. После прививки в 90%
случаев достигается сероконверсия (4-х кратное возрастание титра) для каждого
отдельного антигена Pertussis.
Непосредственно после прививки могут быть выявлены антитела IgM и igG, при этом
антитела IgG персистируют многие годы. Антитела IgA, служащие важным признаком
острой инфекции, образуются лишь в 20%-40% случаев после прививки. У детей младше
6 месяцев антитела IgA вообще не образуются.
В противоположность к дифтерии и столбняку для антител к антигенам Pertussis нет ни
определенного определения пограничных значений для возрастающего иммунитета ни
метода-образца, по которому могут быть откалиброваны другие методы выявления.8
В серологической диагостике для выявления специфических антител к В. Pertussis
ELISA-техника является методом выбора.4,5 В то время, как реакция IgG к иммуногену
РТ является высокоспецифической и позволяет дифференциальнодиагностическое
утверждение (см. ниже), у FHA возникают перекрестные реакции к
В. parapertussis и Hamophilus influenzae. В SERION ELISA classic Bordetella pertussis Toxin
IgG только антиген РТ сцеплен на твердую фазу. Посредством определенной сыворотки
Food and Drug Administration (Lot 3; 200 U/ml; FDA, USA)7 было установлено
подходящее содержание РТ. Активность антител дана в единицах измерения FDA.
Заболевания, похожие на коклюш могут вызываться и другими бактериями, такими как
Hamophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia
trachomatis или вирусами RSV и аденовирусы.1 Bordetella parapertussis и Bordetella
bronchiseptica дают похожую, но более мягкую картину заболевания.
5. ДОПОЛНИТЕЛЬНО НЕОБХОДИМЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Обычное лабораторное оборудование
Для выявления IgM: SERION Rf-абсорбент ( № для заказа Z200/20ml)
Спектрофотометр для микротитровальных стрипов с фильтром, длина волны
405 нм, рекомендуемая длина эталонной волны в пределах от 620 нм до 690
нм (например, 650 нм)
Термостат инкубатор 37°С
Влажная камера
Дистиллированная вода
6. ХРАНЕНИЕ И СРОК ГОДНОСТИ РЕАГЕНТОВ
Микротит- после вскрытия упаковки при 2-8 °С при использовании 4 недели
ровальные осушителя, в закрытом виде Следует обратить внимание на то,
стрипы чтобы неиспользованные лунки хранились в сухих условиях и
(антиген) герметично в специальном пакете из композитной алюминиевой
пленки.
Контрольные/ после вскрытия упаковки при 2-8°С до окончания
стандартные срока хранения;
сыворотки 24 месяца с
даты выпуска
Конъюгат готовый к употреблению раствор при 2-8°С Следует избегать до окончания
заражения (Стерильные наконечники пипеток/) срока хранения;
28 месяцев с
даты выпуска
Разбавляю после вскрытия упаковки при 2-8°С Помутневшие растворы 24 месяца до
щий буфер использовать не следует, в неоткрытом виде окончания
срока хранения
36 месяцев с
п даты выпуска
Буфер для концентрат после вскрытия упаковки при 2-8°С готовый раствор до окончания
промывания при 2-8°С готовый раствор при комнатной температуре Емкость срока хранения
для готового раствора следует регулярно промывать/ 2 недели 1
«>
Помутневшие растворы использовать не следует. неделя
Субстрат готовый раствор при 2-8°С, хранить в защищенном от света до окончания
месте Избегайте загрязнения микробами/ При наличии срока хранения
интенсивной желтой окраски (экстинкция дистиллированной 24 месяца с
воды > 0,25) не использовать. даты выпуска
Стоп-реагент после вскрытия упаковки при комнатной температуре до окончания
срока хранения
9
СОДЕРЖИМОЕ И СОСТАВ УПАКОВКИ ТЕСТА
3.
Компоненты теста и состав Колич./
объём
Отрывные микрострипы, каждая с 8 отдельными лунками с 12
антигенным покрытием (всего 96), 1 тестовый держатель
Напыленный материал деактивирован
Стандартная сыворотка (готовая к употреблению) 2x2 мл
Человеческая сыворотка в фосфатном буфере с протеином;
отрицательная в отношении антител к HIV, антигенов HBs -Ag
(поверхностных антигенов вируса гепатита В) и антител к HCV;
консервант: < 0,1 % азид натрия Краситель: Amaranth О
Отрицательная контрольная сыворотка (готовая к 2 мл
употреблению) Человеческая сыворотка в фосфатном буфере
с протеином; отрицательная в отношении антител к HIV,
антигенов HBs -Ag (поверхностных антигенов вируса гепатита
В) и антител к HCV; консервант: < 0,1 % азид натрия Краситель:
Lissamin-зеленый V
Конъюгаты к человеческим IgG, IgA, IgM (готовые к 13 мл
употреблению) Поликлональные козьи антитела направленные
против человеческих IgG, IgA, IgM, конъюгированные со
щелочной фосфатазой, стабилизированные протеиновым
стабилизирующим раствором Консервант: 0,01 %
метилизотиазолон 0,01 % бромнитродиоксан
Концентрат раствора для промывания (достаточно для 1000 мл) 33,3 мл
Раствор хлорида натрия с Tween 20,30 mM Tris Консервант: <
0,1 % азид натрия
Буфер для разведения Фосфатный буфер с протеином и Tween 2 х 50 мл
20; Консервант: < ОД % азид натрия 0,01 г/л бромфеноловой
голубой соли натрия
Стоп-реагент 1,2 N натровый щелок 15 мл
Субстрат (готовый к употреблению) паранитрофенилфосфат, 13 мл
буфер без растворителя, Консервант: < 0,1 % азид натрия
Сертификат контроля качества со стандартной кривой и 1
таблицей значений (количественное выражение антител в
мЕд/мл или Ед/мл)
следить за тем, чтобы для этого использовалась соответствующая данному флакону
крышка.
Воспроизводимость результатов зависит, кроме прочего, и от тщательного
перемешивания соответствующих реагентов. Перед забором контрольной сыворотки и
конъюгата емкости необходимо хорошо встряхнуть. Растворы проб перед вводом
необходимо хорошо размешать мономиксером (например, Vortex).
Необходимо следить за аккуратным заполнением лунок и соблюдением указанных
времени и температуры инкубации. Значительные различия во времени между
заполнением первой и последней лунок при добавлении проб/контрольных сывороток,
конъюгата и субстрата приводит к различиям "прединкубационного периода", которые
могут значительно повлиять на точность и воспроизводимость измеренных значений.
Лишь строгое соблюдение рабочей инструкции теста SERION ELISA classic
обеспечивает правильность результатов.
Результаты теста можно учитывать лишь в том случае, если соблюдены все условия в
зависимости от партии, приведенные в сертификате контроля качества, прилагаемом к
набору.
Правильная промывка препятствует неспецифичности теста:
Следует выполнять руководство к применению используемых промывателей. В тесте
SERION ELISA classic используются плоские планшеты. Важно равномерное наполнение
лунок буфером для промывки и его полное удаление после промывки (возможны
неконтролируемые эффекты при разбавлении). Избегать образования пены! Не
повреждать покрытие лунок!
7.2 Подготовка и хранение проб
Липидные, гемолизированные, а также иктеричные пробы (сыворотка или плазма)
следует использовать лишь с оговоркой, хотя в ходе наших исследований не было
замечено негативного влияния. Пробы, загрязненные бактериями, использовать не
следует.
Пригодными для исследований материалами являются пробы сыворотки, плазмы (EDTA,
цитрат, гепарин), полученные стандартными лабораторными методами.
Пробы нельзя деактивировать термическим способом.
7. ПРОВЕДЕНИЕ ТЕСТА SERION ELISA classic
7.1 Общие указания
Необходимо использовать исключительно реагенты SERION ELISA classic, поскольку
они адаптированы друг к другу внутри системы, и не заменять их реагентами других
производителей. Стандартные и контрольные сыворотки, а также конъюгаты в
зависимости от партии адаптированы к конкретному тест-набору и не могут
использоваться в тест-наборах других партий. Разбавляющий буфер, буфер для
промывывания, стоп-реагент и раствор субстрата могут использоваться во всех тестах
SERION ELISA classic независимо от партий и наборов.
Для каждого класса иммунглобулина имеются три разных концентрации конъюгата:
НИЗКАЯ, СРЕДНЯЯ И ВЫСОКАЯ.
Классификацию конъюгата можно распознать на этикетках по следующим обозначениям:
Напр. IgG + IgG-конъюгат низкой концентрации
IgG ++ IgG-конъюгат средней концентрации
IgG +++ IgG-конъюгат высокой концентрации
Чтобы сохранить высокое качество наших тест-наборов, необходимо в отдельных
случаях применять особые конъюгаты. Это особые партии и они не имеют обозначений
«+». Специальные конъюгаты нельзя заменять другими конъюгатами.
Пожалуйста, всегда обращайте внимание на надписи на этикетках!
Все компоненты теста ELISA classic следует использовать до истечения срока годности
(см. указания на этикетке) при соблюдении правильных условий хранения. Не применять
реагенты после истечения срока годности. По этому поводу см, также п.6 "ХРАНЕНИЕ И
СРОК ГОДНОСТИ РЕАГЕНТОВ"
Неверное разбавление реагентов может привести к потерям чувствительности.
Реагенты теста во время хранения и инкубации необходимо защищать от яркого света.
После использования плотно закрыть упаковку во избежание высыхания и
бактериального загрязнения.
При повреждении пакета из алюминиевой пленки или неплотной упаковке пакета, для
хранения неиспользованных лунок, их не следует использовать для теста.
Все реагенты теста перед его началом необходимо довести до комнатной
температуры.
При извлечении порции реактива, во избежание загрязнения их микробами следует
всегда соблюдать правила стерильности. Во избежание ложноположительных
результатов наконечник пипетки при вводе конъюгата ни в коем случае не должен
касаться и смачивать верхний край лунок. При закрытии флаконов необходимо
russian 7
7.3. Приготовление реагентов
7.3.1 Микротитровальные стрипы Титровальные стрипы или лунки теста упакованы
вместе с осушителем. Ненужные лунки следует извлечь из рамки держателя и
снова положить в специальный пакет, который закрывается герметически.
7.3.2 Контрольные сыворотки /стандартные сыворотки Контрольная и стандартная
сыворотки готовы к употреблению и не требуют дальнейшего разбавления. Они
могут непосредственно использоваться в тесте.
При каждом тесте независимо от количества использованных титровальных
стрипов должны проводиться у контрольных сывороток простой и Cut-off, ay
стандартных сывороток двойной анализ.
Контрольные сыворотки не обрабатывать абсорбентом ревматоидного фактора!
7.3.3 Конъюгат к человеческим IgG, IgA или IgM-AP (готовый к употреблению)
Конъюгаты различных партий (номера лотов) нельзя менять, поскольку они
адаптированы к соответствующему антигенному покрытию микротитровальных
стрипов. Конъюгаты взаимозаменяемы, как описано в пункте 7.1 Строго избегать
бактериального заражения готового к употреблению конъюгата (не производить
забора непосредственно из бутылочки с конъюгатом).
7.3.4 Буфер для промывки Концентрат буфера для промывки (Vi) разбавить
дистиллированной водой в соотношении 1:30 до конечного объема (V ).
2
Пример:
Концентрат буфера для промывки (VI) Конечный объем (V2)
33,3 мл 1000 мл
1,0 мл 30 мл
7.3.5 Разбавляющий буфер для проб (готовый к употреблению)
7.3.6 Субстрат (готовый к употреблению) Во избежание загрязнения бактериями
используйте перчатки. Для забора раствора субстрата используйте только
стерильные наконечники пипеток!
7.3.7 Стоп-реагент (готовый к употреблению)
7.2.1 Разбавление проб
Перед началом теста, пробы (Vi) растворить в разбавляющем буфере (V 2 ):
Vi+ у2= 1+Ю00 по 10 мкл сыворотки пациента на каждые 1000 мкл разбавляющего
буфера
После каждого разбавления и перед отбором, пробы следует хорошо размешать
мономиксером (например, Vortex) для получения гомогенного раствора.
Интерференция ревматоидного фактора Антитела ревматоидного фактора в
большинстве являются ауто-антителами класса IgM, которые в основном связываются
иммунными комплексами IgG. Специфическое выявление IgM антител из-за этих
ревматоидных факторов может иметь ложноположительные результаты. Кроме того,
существует возможность, вытеснения IgM-антител с более слабыми связями
IgG-антителами с более сильными связями. Обнаружение IgM в этом случае может
оказаться ложноотрицательным. По этой причине пробы для определения IqM
необходимо предварительно обработать абсорбентом ревматоидного фактора.
(SERION-Rheumafaktor-Absorbens, заказ Nr. Z200 (20 ml/100 определений).
Сначала производится разбавление абсорбента ревматоидного фактора (V1)
разбавляющим буфером (V2) в соотношении 1+4.
IqM
V1 + V2 = 1 + 4:
• по 200 мкл Rf-абсорбента на каждые 800 мкл разбавляющего буфера
Затем пробы пациента (V4) разбавляются в смеси Rf и разбавляющего буфера (V3)
V4 + V3 = 1+100:
• по 10 мкл сыворотки пациента на каждые 1000 мкл Rf разбавляющего буфера
7.2.2 Хранение проб
Пробы пациентов хранятся не более 7 дней при температуре 2-8°С. Более длительное
хранение проб возможно при температуре < -20°С.
Следует избегать повторных циклов замораживания и оттаивания.
Разбавленные образцы могут храниться при 2-8°С в течение одной недели.
7.5 Проведение теста
1. Установить необходимое количество лунок в тестовую рамку и закрепить лист
протокола.
2. По 100 мкл разбавленных проб или готовых к употреблению контролей ввести
пипеткой в соответствующие лунки титровальных стрипов. Одну лунку необходимо
оставить для холостого значения, например:
IgG/IgM количественный:
Антигенные лунки
Лунка А1 Холостое значение субстрата
Лунка В1 Отрицательный контроль
Лунка С1 Стандартная сыворотка
Лунка D1 Стандартная сыворотка
Лунка Е1 Пациент 1...
3. Инкубация образцов 60 минут (+/-5 мин.) при 37°С (+/-1°С) во влажной камере.
4. По истечении времени инкубации, лунки промойте (в промывателе или вручную):
• аспирируйте инкубационную жидкость или удалите ее из лунок вытряхиванием
• в каждую лунку введите по 300 мкл водного раствора
• аспирируйте буфер для промывки или удалите его вытряхиванием
• повторите процедуру 3 раза (т.е. всего промойте 4 раза)
• вытряхните планшет на бумажные салфетки
5. Добавление конъюгата 100 мкл готового к употреблению IgG/IgM конъюгата ввести в
соответствующие лунки (кроме холостого значения субстрата).
6. Инкубация конъюгата 30 минут (+/-1 мин.) *при 37°С (+/-1°С) во влажной камере.
7. По истечении времени инкубации промойте лунки (см. выше).
8. Добавление субстрата По 100 мкл готового к употреблению раствора субстрата
введите во все лунки (в т.ч. и в лунку для холостого значения субстрата).
9. Инкубация субстрата 30 минут (+Д мин.)* при 37°С (+Д°С) во влажной камере.
10. Остановка реакции По 100 мкл останавливающего раствора введите во все лунки,
микротитровальный планшет слегка встряхните.
11. Измерение поглощения В течение 60 мин. при 405 нм к холостому значению
субстрата, эталонная длина волны в пределах 620-690 нм (например, 650 нм).
*
Учтите, пожалуйста, что в особых условиях работы может возникнуть необходимость лабораторной
адаптации инкубационного периода.
7.4 Краткий порядок проведения теста
Bordetella pertussis Toxin IgGДgM quantitativ
Для определения IgM антител провести предварительную Rf абсорбцию проб
Разбавление проб (пробы пациентов) IgG/IgM:l+100
Добавление разбавленных проб и готовых к употреблению контрольных/стандартных
сывороток (100 мкл)
ИНКУБАЦИЯ 60 мин./37°С влажная камера
ПРОМЫВКА
Добавление раствора конъюгата (100 мкл)
ИНКУБАЦИЯ 30 мин./37°С влажная камера
ПРОМЫВКА
Добавление раствора субстрата (100 мкл)
ИНКУБАЦИЯ 30 мин./37°С влажная камера
Добавление стоп-реагента (100 мкл)
ИЗМЕРЕНИЕ ПОГЛОЩЕНИЯ при 405 нм
8.2 Критерии действительности теста
• Холостое значение субстрата должно иметь значение OD < 0,25.
• Отрицательный контроль при оценке теста должен быть отрицательным.
• При количественном варианте SERION ELISA classic среднее значение OD
стандартной сыворотки, после вычета значения холостого субстрата, должно
быть в пределах области применения, указанной в сертификате контроля
качества данной партии.
• При качественном варианте SERION ELISA classic среднее значение OD
положительного контроля, после вычета значения холостого субстрата должно
быть в пределах области применения, указанной в сертификате контроля
качества данной партии. Отдельные значения OD не должны расходиться
более чем на 20%.
Если эти критерии не выполняются, тест является недействительным и его необходимо
повторить.
8.3 Обработка данных теста SERION ELISA classic Bordetella pertussis Toxin IgGДgM
Данные активности IgG-антител в „FDA-Ед/тГ ссылаются на В. pertussis Antiserum Lot
3 (IgG anti-pertussis toxin) организации Food and Drug Adminiatration (FDA), USA. Это
приготовление сыворотки задекларировано с активностью 200 Ед/мл.
8.3.1 Неавтоматизированная обработка
Для обработки результатов теста прилагаются стандартная кривая, а также таблица
значений, при помощи которых каждому полученному в результате теста значению OD
может быть определена соответствующая активность антител. В таблице оценки
приведено "номинальное значение" стандартной сыворотки, а также область его
применения.
Холостое значение субстрата (прозрачного) необходимо до обработки данных вычитать
из всех результатов измерений.
Метод 1: Качественный расчет
Для установления области Cut-off в OD среднее значение измеренного стандартного OD
умножают на числовое значение, указанное в сертификате качества (см. формулы для
специальных систем оценок), например:
1
OD = 0,502 х MW(STD) при верхнем значении Cut-off
OD = 0,352 х MW(STD) при нижнем значении Cut-off
Если, например, среднее значение поглощения стандартной сыворотки равно 0,64,
получается, что область Cut-off находится в пределах от 0,225 до 0,321.
8. ОБРАБОТКА ДАННЫХ ТЕСТА SERION ELISA classic Bordetella pertussis Toxin
IgG/IgM (quantitativ)
8.1 Количественное измерение сыворотки по методу 4PL
Определение концентрации антител в тесте SERION ELISA classic производится по
"логистической логарифмической модели с 4 параметрами (4PL)", математическая
функция которой описывается следующей формулой:
D - А
OD = А + ------------------------------
1 4- е В(С-1пконц.)
Параметры А, В, С и D точно передают ход кривой и определяют
1. нижнюю асимптоту - параметр А
2. подъем кривой - параметр В
3. точку перегиба кривой - параметр С
4. верхнюю асимптоту - параметр D
Институт BnpnoH\Serion ГмбХ (Вюрцбург) для каждой партии наборов определяет
стандартные кривые в нескольких тестах при соблюдении оптимальных условий. У
пользователя отпадает необходимость в дорогостоящем и занимающем много времени
построении стандартной кривой.
Для расчетов результатов хода теста пользователь в каждой упаковке теста получает
соответственно адаптированную к партии стандартную кривую в виде графика и таблицу
значений. Соответственное программное обеспечение для оценки предоставляется в
ответ на запрос.
Для выравнивания колебаний тестов и проверки качества хода теста в поставку
включена т.н. стандартная сыворотка. Этой контрольной сыворотке при контроле
качества присваивается номинальное значение и область применения, в пределах
которой возможна точная и надежная обработка результатов теста. Стандартная
сыворотка не имеет функции положительной контрольной сыворотки и в отдельных
ELISA-тестах может оцениваться, как предельная или отрицательная.
8.3.2 Автоматическая обработка теста при помощи программы SERION easy base
4PL/SERION evaluate
В результате ввода 4 параметров и номинального значения стандартной сыворотки
активность антител после замеров исследуемого планшета рассчитывается
специальной программой для расчета.
В случае, если значение выходит за рамки области применения, программа SERION easy
base4PL может выдать следующие сообщения об ошибках:
"Стандарты выходят за пределы допусков"; и/или "Стандарты различаются более чем
на 20%."
Сообщение об ошибках программы SERION evaluate производится только на английском
языке:
«Standard values out of ranges in following groups: Group 1-24. Standard value differ more
than 20% in following groups: Group 1-24."
В этих случаях результат теста является недействительным и его следует повторить.
Параметры и номинальное значение необходимо менять только при изменении партии
(параметры и номинальное значение приведены в таблице значений). Верность ввода
этих зависящих от партии значений можно проверить при помощи соответствующих
стандартной сыворотке значений мЕд/мл или Ед/мл. Полученное среднее значение
должно совпадать с указанным в сертификате партии значением. Корректировка
значения замера производится автоматически. На дисплее учета результатов
появляется следующий текст:
Наименование пробы
Значение OD
мЕд/мл или Ед/мл
Подсчёт
8.4 Интерпретация результатов
Через месяц после основной иммунизации у 92% детей могут быть выявлены
антитела-IgG (сероконверсия = 4-х кратному возрастанию титра). После освежающей
прививки (4 доза) у 95% привитых наблюдается повторная реакция. Возникшие
антитела-IgG персистируют многие годы и дают иммунитет, который сохраняется в
среднем 10 лет. До 6-летнего возраста обычно проходит заражение, которое ведет к
дальнейшему подъему уровня иммунитета.
Острое заболевание инфекции В. pertussis по определению организации WHO считается
доказанным, если пациент кашляет приступами не менее 3 недель и в тесте ELISA для
IgG или IgA появляется 100% возрастание титра (1-я сыворотка: 1-2 неделя в стадии
convulsivum; 2-я сыворотка: 3-5 недель спустя).
Метод 2: Бесступенчатое определение активности антител при помощи стандартной
кривой.
Колебания тестов, в зависимости от того или иного дня или лаборатории (т.н.
межпробная дисперсия) выравниваются за счет умножения текущей измереной
величины пробы пациента на поправочный коэффициент F.
Номинальное значение OD (стандартной сыворотки)
F = — " " ^ _ _ _ _ _ _ _
Значение OD (стандартной сыворотки) в определенный день
Сначала путем расчета коэффициента необходимо исправить суточные колебания:
1 Из двух значений поглощения стандарта образовать среднее значение и
проверить, находится ли полученное значение в допустимых пределах.
2 Расчет коэффициента "F": Указанное номинальное значение стандарта делится
на среднее значение поглощения: F= номинальное значение стандарта / среднее
значение поглощения стандарта.
3 Все измеренные величины проб пациентов умножаются на "F".
4 На основании откорректированных измеренных величин при помощи стандартной
кривой считываются значения активности антител в мЕд/мл или Ед/мл.
Обобщение для Bordetella pertussis Toxin IgG:
Положительный результат теста >30 Ед/мл
Пограничный результат теста 20-30 Ед/мл
Отрицательный результат теста <20 Ед/мл
В случае пограничного результата, тест следует провести параллельно с новыми
пробами (парных сывороток), взятыми с интервалом в 1-2 недели.
9. ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ЧЕРТЫ
9.1 Точность
Точность в пределах сыворотки была определена при использовании сывороток с
различной реактивностью многократно (п = 20) в планшете с антигенным покрытием. Для
определения точности в пределах сыворотки пробы сыворотки с различной
реактивностью испытывались в 10 независимых друг от друга опытах.
Стандартное отклонение
Коэффициент вариации (КВ)=--------------------------------------------------------хЮО
Среднее значение
SERION ELISA classic Bordetella pertussis Toxin IgG:
Среднее Внутрипробное Среднее Межпробное
значение (КВ, %) значение (КВ, %)
поглощения поглощения
(OD) (OD)
Проба Отрицательная 0,229 9,9 - -
Слабоположительная 0,846 8,5 - -
Сильноположительная _ _
1,334 7,6
Сильноположительная
1,555 8,5 - -
Проба Отрицательная 0,156 16,3
- -
Слабоположительная _ _ 0,641 14,7
Сильноположительная .
_ 0,954 13,1
Сильноположительная
- - 1,572 10,7
9.2 Чувствительность и специфичность
92 сыворотки, из них 10 сывороток доноров,4 сыворотки маленьких детей, 26 сывороток с
подозрением на инфекцию В. pertussis, 25 сывороток течения образцовой лаборатории в
Берлине, 14 положительных сывороток и 13 отрицательных, были исследованы во
внутриинститутском тесте. В качестве сравнительного теста была использована одна из
имеющихся в продаже Pertussis Toxin ELISA. Всего 11 сывороток в одной из тестовых
систем реагировали погранично. Эти результаты в расчеты не принимались.
IgG-выявление
Чувствительность 97%
Специфичность 100 %
Согласно недавнего исследования в Нидерландах определение титра в одной
единственной пробе может дать точное указание на острую или на недавно
перенесенную инфекцию В. Pertussis. В этом исследовании на основе 7756 сывороток
было показано, что после острой инфекции в течение 4 недель возникли титры lgG-PT
MOFDA-Ед/мл или > 80 FDA-Ед/мл у 92,7% или 81% пациентов. Эти титры достигаются
лишь у 3,6% или 0,8% здорового населения. Далее, смогли показать, что уровень IgG-FI
снижается опять в течение года до значения < 80 FDA-Ед/мл. Поэтому lgG-PT-титр > 8 (
FDA-Ед/мл в одной единственной пробе сыворотки может быть рассмотрен, как остра;
или недавно перенесенная инфекция В. Pertussis.9
Возможные интерпретации
в. В.
pertussis pertussis
IgG IgA /IgM
+ + + -острая или недавно перенесенная инфекция
(для контроля за ходом сделать анализ второй
сыворотки через 3-5 недель) -привитые
антитела (после прививки образуются так же
IgM, IgA очень редко)
+ + - -привитые антитела -давняя инфекция
+ + / -перекрестная реакция (В. parapertussis, Н.
influenzae) -острая или недавно перенесенная
инфекция * -привитые антитела**
+ -свежая инфекция (для контроля за ходом
сделать анализ второй сыворотки через 3-5
недель) -привитые антитела (после прививки
образуются так же IgM, IgA очень редко)
-нет В. pertussis-антител (при подозрение
провести контроль хода развития;
дифференциальная диагностика)
При интерпретации анализа антител обычно следует учитывать данные о возрас
пациента, протяженности болезни, анамнезе прививки и возможные предварительнь
заключения. Комбинированное применение SERION ELISA classic Bordetella pertus!
Toxin IgG и SERION ELISA classic Bordetella pertussis IgG, IgA и IgM дает следующ
ифференциально-диагностический образец реакций:
* Между тем, как реакция IgG-антител (100%-ное возрастание титра в парн!
сыворотках) к РТ у иммунизированных пациентов острой инфекцией В. pertus
составляет примерно 75%, примерно 94% пациентов вырабатывают реакцию IgGaHTHT
к комбинации РТ и FHA.6 Поэтому отрицательный результат теста SERION ELISA clas
Bordetella pertussis Toxin IgG не исключает инфекцию В. Pertussis.
** Антитела к FHA персистируют после прививки дольше, чем антитела к РТ.
russian 17
10. МЕРЫ БЕЗОПАСНОСТИ
10.1 Предостережения и меры предосторожности
Тест SERION ELISA classic предназначен только для использования специалис
безупречно владеющим необходимыми навыками.
• Упаковка теста содержит человеческие сыворотки. Хотя все контрольные
сыворотки имеют отрицательные значения содержания вирусов HBs-Ag, гепа'
С, а также ВИЧ, их следует рассматривать, как потенциально инфекционно
опасные материалы.
• Не набирайте растворы в пипетку при помощи рта.
• В помещениях, где ведется работа с реагентами теста и пробами пациентов, i
разрешается принимать пищу, пить или курить.
• При обращении с реагентами теста и пробами пациентов следует избегать
прямого контакта, поэтому следует использвать лабораторный халат,
одноразовые перчатки и защитные очки. Руки по окончании работы следует
тщательно мыть.
• Пробы пациентов и все потенциально проведения теста следует обеззаразит
• Реагенты необходимо хранить в месте, недоступном для детей.
• Стоп-реагент: едкий (С); R34: вызывает химические ожоги, необходимо
использовать защитные очки, перчатки и лабораторный халат
При обращении с реагентами теста и пробами пациентов необходимо выполнение
общепринятых лабораторных правил:
10.2 Утилизация
Пожалуйста, выполняйте предписания, предусмотренные действу
законодательством!
Пронумеровано, прошнуровано,
^СКРЕПЛЕНО ПЕЧАТЬЮ
Подпись
SP 2 ^ г.