Реагенты in vitro для лабораторных исследований возбудителей воспалительных заболеваний человека, в наборах и отдельных упаковках, с принадлежностями (см. Приложение на 4 листах) — инструкция и характеристики

РУ: ФСЗ 2010/08504 от 03.12.2010 · класс риска 1

Производитель: "ЭЛИТЕХ МИКРОБИО" (Франция)

Вид изделия: Бета-гемолитический стрептококк группы А антитела к стрептолизину O ИВД, реагент · Множественные виды бактерий Staphylococcus spp. антигены изолята культуры ИВД, реакция агглютинации · Множественные виды Streptococcus spp. определение изолята культуры ИВД, набор

Автоматически отфильтрованный фрагмент инструкции по применению (страницы, где похоже, что есть таблица технических характеристик) — не полный документ. Карточка РУ на портале Росздравнадзора →

Текст инструкции: технические характеристики

«Утверждаю»
№ныи директор
ге01№шнл»
Т.В.Мельникова
г.
Инструкция по применению
«Наборы реагентов для лабораторных исследований
основных патогенных грибов с принадлежностями»
производства: ЭЛИТЕХ МИКРОБИО, 19 Алле Датен Парк Дактивите Дю Плато
83870 Синь, Франция, Тел.:+33(0)4 94 88 55 00, Факс:+33(0)04 94 88 55 05 /
ЕЫТЕСН MICROBIO, 19 АПее D ’Athenes Parc D ’Activites Du Plateau 83870
Signes, France, TeL;+33(0)4 94 88 55 00 - Fax;+33(0)04 94 88 55 05)
Содержание:
1. Назначение.
2. Введение.
3. Принцип метода.
4. Реагенты.
5. Меры предосторожности.
6. Сбор образцов.
7. Хранение реагентов.
8. Необходимые непоставляемые реагенты и материалы.
9. Методика.
10. Учет и интерпретация результатов.
11. Контроль качества.
12. Ограничения метода.
13. Причины погрешностей.
14. Эффективность метода.
15. Утилизация отходов.
CANDIFAST
Идентификации дрожжевых грибов и тест
на резистентность к противогрибковым препаратам
8 тестов, 30 тестов
CANDIFAST ES TWIN
Резистентность дрожжевых грибов к противогрибковым препаратам
30 тестов
1. НАЗНАЧЕНИЕ
Набор CANDIFAST предназначен для идентификации основных патогенных дрожжевых
грибов человека, а также для проведения теста на резистентность к различным
противогрибковым препаратам.
CANDIFAST ES Twin - это набор для проведения теста на резистентность дрожжевых
грибов к различным противогрибковым препаратам.
2. ВВЕДЕНИЕ
За последние 10 лет значительно увеличилось число грибковых инфекций, и особенно
тех, которые вызваны дрожжевыми грибами. Дрожжевые грибы являются условно-
патогенными микроорганизмами. Большая их часть - это сапрофиты, которые при
благоприятных условиях в организме носителя становятся патогенными. Такими
условиями, в основном, являются физиологические факторы (новорожденные, старые
люди, беременные женщины), местные факторы (опрелости, мацерации),
патологические факторы (рак, иммунодефицит, нарушения обмена веществ), факторы,
связанные с терапевтически лечением (антибиотики, противозачаточные таблетки,
иммуносупрессорные средства, ионизирующее облучение, хирургические операции).
Клинические признаки, вызванные этими дрожжевыми грибами, совершенно различные;
состояние кожи (интертригинозный дерматит, вросший ноготь), слизисто-кожные
нарушения (кандидоз ротовой полости, колит, вагиниты), висцеральные условия и
септицемия.
Увеличение количества имеющихся противогрибковых препаратов и появление
грибковых заболеваний, которые не поддаются лечению, доказывает необходимость
тестирования восприимчивость дрожжевых грибов к противогрибковым препаратам.
3. ПРИНЦИП МЕТОДА
Идентификация дрожжевых грибов основывается;
- на чувствительности тестируемого штамма к актидиону, который становится
видимым за счет изменения цвета индикатора - в желтый, светло-оранжевый
цвет, либо цвет фуксии;
- на ферментации семи сахаров, которая становится видимой за счет изменения
цвета индикатора на желтый или светло-оранжевый цвет из-за окисления среды;
- на демонстрации активности уреазы, которая подщелачивает среду, в результате
чего индикатор изменяет свой цвет на цвет фуксии;
- Определение резистентности дрожжевых грибов к противогрибковым препаратам
основывается на росте или отсутствии роста этих дрожжевых грибов в
присутствии противогрибковых препаратов. Рост демонстрируется изменением
цвета среды;
- ферментация глюкозы дрожжевыми грибами, которая ведет к окислению среды,
содержащей фенол красный, изменяет ее цвет на желтый или светло-оранжевый;
гидролиз мочевины уреаза-положительными дрожжевыми грибами, при котором
высвобождающийся аммиак подщелачивает среду, содержащую фенол красный,
изменяя ее цвет на цвет фуксии-розовый.
4. РЕАГЕНТЫ
Компоненты набора Количество
Плашка CANDIFAST 8 30 -
Плашка CANDIFAST ES Twin - - 15
Rl: флакон с Реагентом 1 10 35 35
R2; флакон с Реагентом 2 8 30 30
ТС: флакон для проверки мутности 1 1 1
Описание
CANDIFAST- плашка: плашка с 20 лунками, готовая к использованию.
На каждой плашке можно провести анализ только одной пробы (идентификация + тест
на резистентность).
Ряд идентификации
В лунке 1 находится фенол красный, актидион (ACT) и глюкоза,
в лунках со 2 по 8 находится фенол красный и различные сахары, а именно;
в лунке 2 (GLU) ; глюкоза
в лунке 3 (GAL) : галактоза
в лунке 4 (TRE) : трегалоза
в лунке 5 (MAL) ; мальтоза
в лунке 6 (CEL) : целлобиоза
в лунке 7 (RAF) : рафиноза
в лунке 8 (LAC) : лактоза
лунки 9 и10 пустые
Ряд теста на резистентность
В лунке 1 находится контрольная лунка роста (С+)
в лунках со 2 по 8 находятся различные противогрибковые препараты в следующей
последовательности:
в лунке 2 (АВ) : амфотерицин В (4 мг/мл)
в лунке 3 (NY) : нистатин (200 ед./мл)
в лунке 4 (FCT) ; флюкотазин (35 мг/мл)
в лунке (ECZ) : эконозол (16 мг/мл)
в лунке 6 (KTZ) : кетоконазол (16 мг/мл)
в лунке 7 (MCZ) : миконазол (16 мг/мл)
в лунке 8 (FCZ) ; флюконазол (16 мг/мл)
лунки 9 и10 пустые
Плашка CANDIFAST ES Twin: плашка с 2 х 20 лунками, готовая к использованию.
Два ряда лунок идентичные ряду плашки теста на резистентность CANDIFAST.
На каждой плашке можно провести анализ двух проб (только тесты на резистентность)
R1 - Регент 1; 4-мл флакон с буферной средой агара для разбавления и идентификации
Мясной экстракт 1,3 г/л, казеин пептон 1,8 г/л, дрожжевой экстракт 0,8 г/л,
аминокислоты, витамины, минеральные вещества 5,75 г/л, мочевина 20 г/л, агар 0,52 г/л,
антибиотик 1Д2 г/л. pH: 6,05 ±0,1.
R2 - Реагент 2: 2-мл флакон с средой YNB - азотистые основания дрожжей, содержащей
мочевину и фенол красный для проведения теста на резистентность.
Мясной экстракт 1,3 г/л, казеин пептон 1,8 г/л, дрожжевой экстракт 0,8 г/л,
аминокислоты, витамины, минеральные вещества 8,75 г/л, мочевина 20 г/л, глюкоза 8,5
г/л, фенол красный 0,052 г/л, антибиотик 1,16 г/л. pH: 7,3 ±0,1.
4
тс - Проверка помутнения среды; 4-мл флакон с раствором сульфата бария.
5. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
- Данные реагенты предназначены исключительно для in vitro использования и
работу с ними должен проводить только персонал, имеющий на это разрешение.
- Пробы и реагенты посева могут вызвать инфекцию, поэтому с ними необходимо
обращаться с предосторожностью, соблюдая правила и требования гигиены для
работы с подобными препаратами, предусмотренные в стране пользователя.
- Реагенты, содержащие сырье животного происхождения, нужно обрабатывать с
пр едо сторожкостью.
- Нельзя использовать реагенты после истечения срока их годности.
- Нельзя использовать реагенты, которые испорчены или неправильно хранились
до использования.
6. СБОР ОБРАЗЦОВ
Колонии, используемые для идентификации и теста не резистентность должны быть
молодыми (от 24 до 48 часов) и тщательно изолированными при комнатной температуре
или при 37°С в среде агара, желательно в чашках Петри. Рекомендуется делать изоляцию
на средах, которые характерны для дрожжевых грибов.
7. ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ
Набор и его компоненты во время хранения при 2-8°С в их оригинальном состоянии
сохраняют стабильность до даты истечения срока годности, указанной на упаковке.
Половина набора CANDIFAST ES Twin может храниться при температуре от 2 до 8°С в
течение 7 дней, в своей оригинальной упаковке, запечатанной и с десикантом
(осушителем) внутри.
8. НЕОБХОДИМЫЕ НЕПОСТАВЛЯЕМЫЕ МАТЕРИАЛЫ
- Парафиновое масло.
- Стерильные пипетки.
- Инкубатор при 37°С.
- Контейнер для загрязненных отходов.
9. МЕТОДИКА
Позволяет достичь комнатной температуры реагентов (18-25°С) перед их
использованием
9.1. Подготовка посевного материала (инокулята)
Собрать изолированную колонию с помощью проволочной петли или пастеровской
пипеткой. Посеять инокулят из флакона Реагента 1 с колонией. Тщательно перемешать.
Стандартизацию посевного материала можно выполнить тремя различными способами:
С помощью контроля помутнения
Добиться такой же непрозрачности инокулированного Реагента 1, как и во флаконе
контроля помутнения, пользуясь черными линиями, нанесенными на этикетку флаконов.
Если Реагент 1 светлее (недостаточно посевного материала), то нужно добавлять
инокулят во флакон до тех пор, пока полученная непрозрачность будет такой же, как и
во флаконе контроля помутнения.
Если Реагент 1 более мутный (слишком много посевного материала), то нужно
разбавлять его Реактивом 1 из другого только что открытого флакона, пока нужное
помутнение не будет получено.
С помощью денситометра
Убедиться с помощью денсиметра, что помутнение Реагента 1 с инокулятом
соответствует 1 ЕД по стандарту Мак-Фарданда (McFarland). При необходимости,
поступать, как описано выше, чтобы отрегулировать помутнение.
С помощью подсчета в клетке Малассеза (Malassez")
Посевной материал можно стандартизировать методом подсчета дрожжевых грибков в
клетке Малассеза. Необходимо получить раствор 2 500 - 3 500 дрожжевых грибов на
мм^.
9.2а. Инокуляция плашки CANDIFAST
Ряд идентификации
Пометить тест-плашку для идентификации тестируемых проб. Приподнять липкую
ленту и внести в каждую из первых 8 лунок следующий состав;
- 100 мкл инокулированного стандартизованного Реагента 1 (R1)
- 2 капли парафинового масла
Вновь заклеить тест-плашку липкой лентой
Ряд теста на резистентность
Сначала инокулировать Реагент 2 , внеся 100 мкл (|il) инокулированного
стандартизованного Реагента 1 (см. § 9.1).
Затем приподнять липкую ленту и внести в каждую из первых 8 лунок следующий
состав;
- 100 мкл инокулированного стандартизованного Реагента 2 (R2)
- 2 капли парафинового масла
Вновь заклеить тест-плашку липкой лентой
(2 пустые лунки)
9.2.6. Инокуляция плашки CANDIFAST ES Twin
Первый ряд пробы
Инокулировать Реагент 2 (R2), внеся 100 мкл (ц1) инокулированного стандартизованного
Реагента 1.
Пометить этикетками оба ряда на плашке.
Приподняв липкую ленту, внести в каждую из первых 8 лунок следующий состав;
- 100 мкл инокулированного Реагента 2 (R2)
- 2 капли парафинового масла
Второй ряд пробы
Инокулировать аналогичным образом второй ряд, используя дополнительный флакон с
инокулированным Реагентом 2, как описано выше.
Плотно заклеить тест-плашку липкой лентой.
9.3. Инкубация
Инкубировать тест-плашку при 37°С в течение 24 часов; при необходимости и в
зависимости от штаммов, процесс инкубации можно продлить до 48 и даже до 72 часов.
Как только дрожжевые грибки выросли в контрольной лунке, можно считывать плашку.
10. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Считать каждую тест-плашку целиком только в случае, если в контрольной лунке (С+:
лунка 1 ряда теста на резистентность) имеет место изменение цвета среды следующим
образом:
- цвет изменяется на желтый, светло-оранжевый-желтый или цвет фуксии* (*для
семейства уреаза положительных).
ЮЛ. Ряд идентификации
Лунка 1 ' (ACT- актидион)
Характеристика положительная, если наблюдается изменение цвета среды;
-цвет изменяется на желтый, светло-оранжевый-желтый или цвет фуксии.
Характеристика отрицательная, если не наблюдается изменение цвета среды на желтый,
светло-оранжевый-желтый или цвет фуксии.
Лунки со 2 по 8 (GLU to RAF- от глюкозы дорафииозы)
Характеристика положительная, если наблюдается изменение цвета среды:
- цвет изменяется на желтый, светло-оранжевый-желтый или цвет фуксии.
Характеристика отрицательная, если не наблюдается изменение цвета среды на желтый,
светло-оранжевый-желтый или цвет фуксии.
Идентификацию дрожжевых грибков выполняют с помощью плашки CANDIFAST
параллельно с анализом морфологических признаков колоний.
Для интерпретации результатов можно пользоваться таблицей ниже или диаграммой,
прилагаемой к набору.
Можно также пользоваться маркировками на липкой ленте тест-
плашки; считывать лунки с актидионом в первую очередь; затем определить
местоположение последней лунки с положительным результатом справа от нее.
Название микроорганизма напечатано на липкой ленте на пересечении актидион
положительного (нижний ряд) или актидион отрицательного (верхний ряд) признаков и
местоположения сахара.
Дрожжевые грибы Актадион глю ГАЛ ТРЕГАЛ МАЛЫ ЦЕЛЛОБИАЗА РАФИНОЗА
ЛАКТОЗА
Candida albicans + + + V + - _
Candida albicans
(var stellatoidea) + + - V + -
Candida glabrata V + - + - -
Candida kefyr + + + - V +
Candida krusei V + - - - -
Candida lusitaniae - + + + V + -
Candida parapsilosis - + + - V - -
Candida tropicalis - + + + + - -
Saccharomyces - + + V V V + -
Cryptococcus или Trichosporon
или семейства Rhodotorula V уреаза положительный
- Дифференциальный диагноз
Виды Cryptococcus, Trichosporon и Rhodotnrola можно дифференцировать с помощью
исследования морфологии.
- Виды Rhodotnrola характеризуются своеобразными оранжево-красными колониями
при росте на декстрозном агаре Сабуро.
- Некоторые штаммы видов Cryptococcus также могут давать красноватую пигментацию.
Таким образом, виды Cryptococcus следует изучить на наличие капсулы с помощью
препарата с индийской тушью.
Виды Trichosporon производят псевдогифы при росте в среде РСВ (ПХБ -
полихлорированный бифенил) агара.
Примечание
- Среди Saccharomyces, Saccharomyces cerevisiae есть основные виды человеческих
патогенов.
- Штаммы Saccharomyces boulardii или Saccharomyces cerevisiae можно
изолировать у пациентов, проходящих лечение от дрожжевых грибков.
- С помощью микроскопических исследований можно дифференцировать два вида;
- S. cerevisiae - большие шарообразные дрожжевые грибки.
- s. boulardii - меньшего размера, яйцеподобные или вытянутой формы.
При проведении теста с набором CANDIFAST некоторые штаммы Cryptococcus могут
расти в присутствии актидиона.
10.2. Ряд теста на резистентность
Лунки со 2 по 8 (Ът амфотерицина (АВ) до флюконазола (FCZ)
Изменение цвета среды на желтый, светло-оранжевый-желтый или цвет фуксии
свидетельствует о том, что тестируемые штаммы способны расти в этой лунке, и, таким
образом, проявляется резистентность к имеющемуся противогрибковому препарату.
Если цвет лунки остается светло-оранжевого-красного цвета, то рост тестируемого
штамма подавляется противогрибковым препаратом в этой лунке.
11. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Стандартизацию метода время от времени рекомендуется проверять с помощью
эталонных штаммов, Candida albicans АТСС 90029 и Candida parapsilosis АТСС
22019**.
Штаммы Инкубация Ожидаемые результаты
ACT GLU GAL TRE MAL CEL RAF LAC C+ AB NY FCT ECZ KTZ MCZ
FCZ
C.albicans 24 часа + + + - + - _ -
(АТСС 90029)
С.parapsilosis 48 часов - + + - _ _ _ - + ...........................................
(АТСС 22019)
GLU - глюкоза; GAL - галактоза; TRE- трегалоза; MAL -мальтоза; CEL - целлобиоза;
RAF - раффиноза; LAC ~ лактоза.
АВ - амфотерицин В; NY - нистатин; FCT - флюкотазин; ECZ - эконозол; KTZ -
кетоконазол; MCZ - миконазол; FCZ - флюконазол.
12. ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА
- Данный in vitro метод для определения резистентности к противогрибковым
препаратам имеет индикационное значение при взаимодействии
противогрибковых препаратов и дрожжеподобных грибков во время in vivo
лечения (2, 4).
- Процедура CANDIFAST предназначена для идентификации и тестирования
резистентности к противогрибковым препаратам только тех дрожжевых грибков,
которые вызывают кожно-слизистый кандидоз. Таким образом, нельзя эту
процедуру использовать для штаммов грибков, вызывающих системные микозы.
- Процедура CANDIFAST не позволяет разделить штаммы на три категории;
чувствительные (Ч) - промежуточные (П) - устойчивые (У).
- Некоторые термочувствительные штаммы, изолированные при температуре 20°С,
растут иначе, чем изолированные при 37°С. В этом случае дрожжевые грибки
либо не будут расти, либо будут расти плохо. Как следствие этого, выполнить
надежную идентификацию или добиться их резистентности к определенным
противогрибковым препаратам будет очень трудно, если вообще возможно.
- Для определенных штаммов С. lusitaniae задержка роста в лунке с трегалозой
(TRE) делает идентификацию по прилагаемой таблице труднодостижимой.
Идентификацию можно выполнить также с помощью маркировок на липкой
ленте тест-плашки.
8
- Для определенных штаммов С glabrata трудность считывания признаков
галактозы (GAL) делает идентификацию по прилагаемой таблице
труднодостижимой. Идентификацию можно выполнить также с помощью
маркировок на липкой ленте тест-плашки.
- Интерпретация результатов теста на резистентность не принимает в расчет
помутнение среды, которое может появиться после инкубации с -азол (-azole)
противогрибковыми препаратами.
13. ПРИЧИНЫ ПОГРЕШНОСТЕЙ
- Подготовленный посевной материл - инокулят либо сильно концентрированный,
либо недостаточной концентрации.
- Подготовленный инокулят из смешанной культуры или с изолированными
колониями, выращенными более 48 часов.
- Плашку считали до появления изменений цвета индикатора роста.
“ Плашку не считали после инкубации в течение 24 или 48 часов, даже при том что
индикатор роста был положительным.
- В общем, несоблюдение рекомендаций, содержащихся в инструкциях.
14. ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕТОДА
Коллекционные штаммы
Исследования проводили с помощью коллекции из 80 штаммов (31 - Candida albicans, 17
-С. glabrata, 11 - С. tropicalis, 6 - С lusitaniae, 3 - С. parapsilosis, 2 - С kefyr, 2 - С. krusei,
5 - Saccharomyces spp., 2 - Cryptococcus neoformans и 1 -Trichosporon cutaneum).
78 штаммов были правильно идентифицированы с помощью маркировок на липкой
ленте тест-плашки и дали совпадение 97,5% с методом INTERNATIONAL MICROBIO
FUNGICHROM и методом Biom6rieux API 32С. Общее совпадение для теста на
резистентность при сравнении с Biorad FUNGITEST и плашкой В1отёг{еих АТВ Fungus
составляло 87,4%.
Клинические штаммы
Исследования проводили со 100 свежеизолированными штаммами из клинических проб,
взятых у пациентов в лечебных заведениях (72 - Candida albicans, 9 - С. glabrata, 8 - С.
parapsilosis, 5 - С tropicalis, 3 - С. krusei, 1 - С. kefyr, 1 - С inconspicua и 1 -
Saccharomyces spp).
98 штаммов были правильно идентифицированы в сравнении с методом Biomerieux
VITEK.
Общее совпадение для теста на резистентность сравнимо с Biorad FUNGITEST и
плашкой Biomerieux АТВ Fungus и составило 98,5%. Среди 10 расхождений 3 -
существенные ошибки и 7 - несущественные. Эти расхождения касались 4 штаммов (2 -
С glabrata, 1 - С. parapsilosis и 1 - С tropicalis), а 3 - противогрибковых препаратов;
эконазола (2 Р/П и 1 Р/Ч), кетоконазола (1 Р/П и 2 Р/Ч) и миконазола (4 Р/П).
15. УТИЛИЗАЦИЯ ОТХОДОВ
Отходы следует уничтожать в соответствии с санитарно-гигиеническими требованиями
и применяемыми правилами для данных видов продуктов в стране применения.
FUNGIFAST
с
Идентификация дрожжевых грибов и
тестирование чувствительности к противогрибковым препаратам
8 тестов, 30 тестов
1. НАЗНАЧЕНИЕ
Набор FUNGIFAST позволяет идентифицировать основные патогенные дрожжевые
грибы человека, а также протестировать их чувствительность к различным
противогрибковым препаратам, применяемым при лечении поверхностных или
системных микозов.
2. ВВЕДЕНИЕ
За последнее время значительно увеличилось число грибковых инфекций, и особенно
тех, которые вызваны дрожжевыми грибками. Из всех видов Candida только десять
вызывают заболевания человека (кандидоз). Они являются возбудителями
поверхностных инфекций (кандидоз кожи и слизистых), в основном, за счет Candtda
albicans, и глубоких или системных инфекций за счет С. albicans, а также С glabrata, С.
tropicalis и С. parapsilosis. Виды Candida также вызывают внутрибольничные инфекции.
Среди других дрожжевых грибков Cryptococcus neoformans является причиной
серьезных инфекций, особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом.
С промышленным выпуском новых лекарственных препаратов и появлением
трудноизлечимых медикаментозным способом микозов возникает необходимость
оценить активность противогрибковых препаратов против дрожжеподобных грибков.
3. ПРИНЦИП МЕТОДА
3.1. Идентификация
Идентификация дрожжевых грибов основывается на:
выявлении активности различных ферментов с помощью, хромогенных реакций.
Ферментативная активность проявляется тремя типами реакций:
Гидролиз хромогенных субстратов:
оксидазы и пептидазы дрожжевых грибков гидролизуют хромогенные субстраты, что
приводит к высвобождению паранитрофенола или паранитроанилина. Оба компонента
имеют желтый цвет (лунки GAL и PRO).
Ассимиляция естественных субстратов:
- потребление сахара можно обнаружить за счет изменения цвета бромкрезолового
пурпурного (БКП) с фиолетового на желтый или даже на бесцветный (лунки с TRE,
MAL, CEL, RAF, LAC).
- гидролиз мочевины приводит к выделению аммиака, который подщелачивает среду и
заставляет феноловый красный (PR) изменить цвет на фуксийно-розовый (лунка с URE -
мочевина).
Окисление синтетических субстратов:
- активность фенолоксидазы в присутствии кофейной кислоты дает коричневую окраску
(лунка РОХ).
На каждой плашке FUNGIFAST имеется также лунка с положительным контролем
(лунка С+), которая выявляет ассимиляцию глюкозы.
3.2. Тестирование чувствительности
Определение чувствительности к противогрибковым препаратам основывается на росте
или отсутствии роста дрожжевых грибков в присутствии различных противогрибковых
препаратов. Рост дрожжевых грибков демонстрируется изменением цвета среды.
10
ф 1 2 . О Г Р А Н И Ч Е Н И Я М Е Т О Д А
1 2 .1 . И д е н т и ф и к а ц и я
- Т е с т F U N G I F A S T д а е т в о з м о ж н о с т ь и д е н т и ф и ц и р о в а т ь т о л ь к о в и д ы , о п и с а н н ы е в б а з е
д а н н ы х .
- К о д ООО н е п о з в о л я е т р а з л и ч и т ь в и д ы Candida krusei и Candida rugosa. Ч т о б ы
и д е н т и ф и ц и р о в а т ь э т и д в а в и д а г р и б о в с л е д у е т в ы п о л н и т ь д о п о л н и т е л ь н о е
т е с т и р о в а н и е .
1 2 .2 Т е с т и р о в а н и е ч у в с т в и т е л ь н о с т ь
- Д а н н ы й in vitro м е т о д д л я о п р е д е л е н и я ч у в с т в и т е л ь н о с т и к п р о т и в о г р и б к о в ы м
п р е п а р а т а м и м е е т п о к а з а т е л ь н о е з н а ч е н и е д л я о ц е н к и в з а и м о д е й с т в и я
п р о т и в о г р и б к о в ы х п р е п а р а т о в и д р о ж ж е п о д о б н ы х г р и б к о в в о в р е м я in vivo л е ч е н и я .
1 3 . П Р И Ч И Н Ы П О Г Р Е Ш Н О С Т Е Й
- П о д г о т о в к а и н о к у л я т а и з с м е ш а н н о й к у л ь т у р ы .
- Т е м п е р а т у р а к у л ь т и в и р о в а н и я н а э т а п е в ы д е л е н и и ш т а м м о в и л и /и и н к у б а ц и и
п л а ш к и н е с о о т в е т с т в о в а л а 3 7 ° С .
1 3 .1 . И д е н т и ф и к а ц и я
- П л а ш к а н е б ы л а з а к р ы т а л и п к о й п л е н к о й в о в р е м я и н к у б а ц и и .
- П л а ш к у и н к у б и р о в а л и б о л е е 4 8 ч а с о в , з а и с к л ю ч е н и е м С neoformans.
1 3 .2 . Т е с т и р о в а н и е ч у в с т в и т е л ь н о с т и
- П л о т н о с т ь п о с е в н о г о м а т е р и а л а : п о с е в н о й м а т е р и а л л и б о с и л ь н о к о н ц е н т р и р о в а н ,
л и б о е г о к о н ц е н т р а ц и я н е д о с т а т о ч н а .
- В о з р а с т п о с е в н о г о м а т е р и а л а : п о с е в н о й м а т е р и а л и з к о л о н и й , к о т о р ы е
в ы р а щ и в а л и б о л е е 4 8 ч а с о в .
- Н е д о б а в и л и п а р а ф и н о в о е м а с л о в л у н к и с 1 1 п о 2 0 .
- П р о в о д и л и у ч е т р е з у л ь т а т о в н а п л а ш к е д о т о г о к а к п р о ш л и 2 4 ч а с о в и н к у б а ц и и .
- П р о в о д и л и у ч е т р е з у л ь т а т о в н а п л а ш к е д о т о г о , к а к и з м е н и л с я ц в е т и н д и к а т о р а
р о с т а .
- П р о в о д и л и у ч е т р е з у л ь т а т о в н а п л а ш к е ч е р е з 2 4 и л и 4 8 ч а с о в п о с л е т о г о , к а к
с р е д а и з м е н и л а ц в е т в л у н к е к о н т р о л я р о с т а , и в ц е л о м , н е с о б л ю д е н и е
р е к о м е н д а ц и й в и н с т р у к ц и я х .
1 4 . Э Ф Ф Е К Т И В Н О С Т Ь М Е Т О Д А
О ц е н к а р а б о ч и х х а р а к т е р и с т и к б ы л а в ы п о л н е н а н а 1 0 9 р а з л и ч н ы х ш т а м м а х г р и б о в (5 5 -
Candida albicans, 2 1 - С glabrata, 6 - С parapsilosis, 5 - С tropicalis, 5 - С. lusitaniae, 6 -
С. krusei^ 3 - С . kefyr, 2 ~ С. guilliermondii, 5 - Saccharomyces cerevisiae, 1 - Cryptococcus
neoformans), б о л ь ш и н с т в о и з к о т о р ы х б ы л и с в е ж е в ы д е л е н н ы м и и з к л и н и ч е с к о г о
м а т е р и а л а .
И д е н т и ф и к а ц и я : п а р а л л е л ь н о б ы л о п р о в е д е н о с р а в н и т е л ь н о е и з у ч е н и е м е т о д а B io r a d
A U X A C O L O R 2 . В с е 1 0 8 т е с т и р у е м ы х ш т а м м о в д р о ж ж е в ы х г р и б о в б ы л и
и д е н т и ф и ц и р о в а н ы с п о м о щ ь ю F U N G I F A S T и 9 8 ,1 % ( 1 0 6 /1 0 8 ) ш т а м м о в б ы л и
и д е н т и ф и ц и р о в а н ы п р а в и л ь н о .
- 1 0 3 ш т а м м а б ы л и п р а в и л ь н о и д е н т и ф и ц и р о в а н ы о б о и м и м е т о д а м и .
- 3 ш т а м м а б ы л и п р а в и л ь н о и д е н т и ф и ц и р о в а н ы т о л ь к о F U N G I F A S T .
- 2 ш т а м м а б ы л и и д е н т и ф и ц и р о в а н ы о ш и б о ч н о .
16
-1 штамм С insconspicua не был идентифицирован (не был включен в базу данных).
с
Тестирование на чувствительность; было проведено сравнительное изучение с методом
Biomerieux АТВ FUNGUS 3. В таблице ниже представлены значения совпадение
категории в процентах;
N=109 АВ 5-FC ITZ FCZ VRZ
те 0 12 18 И 1
ME 0 0 7 7 8
VME 0 0 4 0 0
% совпадения 100 89 73,4 83,5 91,7
те; незначительная погрешность
ME: большая погрешность
VME; очень большая погрешность
% Agree; процент совпадения
* 4 VME было получено у штаммов S. cerevisiae,
Обший процент совпадений -87,5%.
1 5 . У Т И Л И З А Ц И Я О Т Х О Д О В
Отходы следует уничтожать в соответствии с санитарно-гигиеническими требованиями
и правилами, рекомендованными для данных видов продуктов в стране применения.
17
FUNGIFASTAFG
с
Тест для определения чувствительности дрожжеподобных грибов
к противогрибковым препаратам
12 тестов
1 . Н А З Н А Ч Е Н И Е
Набор FUNGIFAST AFG позволяет определить чувствительность основных патогенных
дрожжеподобных грибов человека к различным противогрибковым препаратам,
применяемым при лечении поверхностных или системных микозов.
2 . В В Е Д Е Н И Е
Частота внутрибольничных или приобретенных в общественных местах грибковых
инфекций возрастает так же, как и появление микозов, не поддающихся лечению. Для
промыщленного выпуска новых лекарственных препаратов необходимо оценить
эффективность подавления противогрибковыми препаратами дрожжеподобных грибов.
Эталонные методы тестирования чувствительности к противогрибковым препаратам
CLSI (Института стандартов клинической лаборатории) и ЕиСА8Т(Европейского
Комитета по тестированию чувствительности к антибиотикам) -трудоемкие процедуры,
непригодные для повседневного применения. В тесте FUNGIFAST AFG используют
метод колориметрической оценки микроразведений питательной среды. Тест быстрый,
простой, результат легко считывается и метод удобный для всех клинических
лабораторий. Более того, FUNGIFAST AFG хорошо согласуется со стандартными
методами.
3 . П Р И Н Ц И П М Е Т О Д А
Определение чувствительности к противогрибковым препаратам основывается на оценке
роста дрожжеподобных грибов или его подавления в присутствии трех-четырех
концентраций различных противогрибковых препаратов.
Рост в жидкой среде проявляется изменением ее цвета. Ферментация глюкозы
дрожжеподобными грибами приводит к восстановлению окислительно­
восстановительного индикатора, в результате чего цвет среды меняется с темчо-
фиолетового на розовый или бесцветный. Результаты можно интерпретировать после 24-
часовй инкубации, сразу после изменения цвета в лунке положительного контроля роста
(С+). Данная лунка не содержит противогрибкового препарата и заполняется засеянной
средой MES FUNGI.
Неизменность цвета исходной среды в лунке отрицательного контроля (С-) облегчает
интерпретацию результатов в других лунках. Эта лунка, также не содержит
противогрибковый препарат, но заполняется чистой незасеянной средой MES FUNGI.
4 . Р Е А Г Е Н Т Ы
К о м п о н е н т ы н а б о р а К о л и ч е с т в о
П л а ш к а FUNGIFAST AFG; плашка с 20 лунками для 12
тестирования одной пробы, отдельно запечатанная в
алюминиевую упаковку
SUSPENSION FUNGI; 4-мл флакон с буферным 14
раствором полужидкой среды, для суспендирования и
стандартизации инокулята, содержащей бакто-агар,
колимицин и ванкомицин
MES FUNGI: 5 -мл флакон с жидкой питательной средой 12
(модифицированная среда RPMI) для проведения теста на
18
чувствительность, содержащей резазурин (индикатор
ф
роста) и глюкозу.
ТС FUNGI: 4-мл флакон с раствором сульфата бария для 1
проверки стандартности инокулята.
Содержимое плашки:
Плашка FUNGIFAST AFG содержит различные противогрибковые препараты в
следующих концентрациях:
Лунка 1 (С+): (О ^xg/ml) Лунка И (АВ): (0.5 |^g/ml)
Лунка 2 (5FC) (4 lag/mi) Лунка 12 (АВ): (1 lag/ml)
Лунка 3 (5FC) (8 tig/ml) Лунка 13 (АВ): (2 )ag/ml)
Лунка 4 (5FC) (16 lUg/ml) Лунка 14 (FCZ): (8 ng/ml)
Лунка 5 (5FC) (32 M-g/ml) Лунка 15 (FCZ): (16 lUg/ml)
Лунка 6 (ITZ); (0.125 jug/ml) Лунка 16 (FCZ); (32 M-g/ml)
Лунка 7 (ITZ): (0.25 ^ig/ml) Лунка 17 (FCZ): (64 |ag/ml)
Лунка 8 (ITZ): (0.5 [ig/m\) Лунка 18 (VRZ): (1 |ig/ml)
Лунка 9 (ITZ): (1 |ug/ml) Лунка 19 (VRZ): (2 |J.g/ml)
Лунка 10 (C-): (0 ]ug/ml) Лунка 20 (VRZ): (4 |ig/ml)
В е щ е с т в о С о к р а щ е н и е Т о р г о в о е н а з в а н и е п р е п а р а т а
Амфотерицин В АВ FUNGIZONE (традиционный)
ABELCET, A1VIBIS0NE (липосомный)
Флюцитозин 5FC ANCOTIL
Флюконазол FCZ TRIFLUCAN
Интраконазол ITZ SPORANOX
Вориконазол VOR VFEND
5 . М Е Р Ы П Р Е Д О С Т О Р О Ж Н О С Т И
- Данные реагенты предназначены только для in vitro диагностики, поэтому
работать с ними должен персонал, имеющий на это разрешение.
- Пробы и посевной материал могут являться источником инфекции, поэтому с
ними необходимо обращаться с предосторожностью, соблюдая соблюдая
санитарные нормы и правила для работы с подобными препаратам,
предусмотренные в стране пользователя.
- В некоторых лунках плашки находится сырье животного происхождения, с
которыми нужно обращаться осторожно.
- В некоторых лунках плашки находятся химические вещества, с которыми нужно
обращаться осторожно.
- Нельзя использовать реагенты после истечения срока их годности.
- Нельзя использовать реагенты, которые испорчены или неправильно хранились
до использования.
6 . С Б О Р О Б Р А З Ц О В
Для проведения теста на чувствительность следует брать колонии из молодой чистой
культуры (до 24 часов роста), выделенной на плотной питательной среде на чашках
Петри при температуре 37°С (или при 30°С для Cryptococcus neqformans). Рекомендуется
проводить выделение чистой культуры на средах предназначенных для
дрожжеподобных грибов. Можно использовать хромогенную среду ELITech France.
19
7 . Х Р А Н Е Н И Е Р Е А Г Е Н Т О В
Набор и его содержимое при хранении при 2-8°С в их исходном состоянии стабильны до
истечения срока годности, указанного на упаковке. Реагенты готовы к использованию и
их необходимо использовать сразу же после того, как их открыли.
8 . Н Е О Б Х О Д И М Ы Е Н Е П О С Т А В Л Я Е М Ы Е М А Т Е Р И А Л Ы
- Парафиновое масло
- Стерильные Пастеровские пипетки/микропипетки на 10 ц1 и 100 ц1
- Термостат для поддержания t 37°С и 30°С (только для Cryptococcus)
- Емкость для контаминированных отходов.
9 . М Е Т О Д И К А
Перед использованием реагентов дать им достичь комнатной температуры (18-25°С).
9 .1 . П р и г о т о в л е н и е и н о к у л я т а
Собрать две или три отдельные колонии с помощью проволочной петли или
Пастеровской пипетки с замкнутым резервуаром для накопления. Засеять флакон
SUSPENSION FUNGI собранными колониями. Тщательно перемешать. Стандартизацию
суспензии посевного материала можно выполнить тремя различными способами;
С помощью флакона стандарта мутности ТС FUNGI
Добиться такой же мутности засеянной среды SUSPENSION FUNGI как и во флаконе
стандарта мутности ТС FUNGI сравнивая четкость черных линий, нанесенных на
этикетки флаконов.
Если засеянная среда светлее (недостаточно посевного материала), то нужно добавлять
посевной материал во флакон до тех пор, пока наблюдаемая мутность не будет такой же,
как и во флаконе стандарта мутности.
Если засеянная среда слишком мутная (слишком много посевного материала), то нужно
разбавлять ее SUSPENSION FUNGI из другого, только что открытого флакона, до тех
пор, пока не будет достигнута нужная мутность.
С п о м о щ ь ю д е н с и т о м е т р а
Убедиться с помощью денситометра, что помутнение инокулированной среды
соответствует 2 ЕД по стандарту МакФарланда. При необходимости, поступать, как
описано выше, чтобы отрегулировать мутность среды.
С п о м о щ ь ю п о д с ч е т а в к а м е р е М а л а с с е з а (M a la s s e z " )
Можно стандартизировать посевной материал методом подсчета в камере Малассеза.
Необходимо получить суспензию 10^ -10^ клеток грибов / мл.
9 .2 . И н о к у л я ц и я п л а ш к и
О т р и ц а т е л ь н ы й к о н т р о л ь
Промаркировать плашку FUNGIFAST AFG для идентификации тестируемых проб.
Приподнять липкую ленту на плашке и внести в лунку 10 (С-) следующие компоненты:
- 100 чистой незасеянной среды MES FUNGI,
- 2 капли парафинового масла.
Засев среды ivfes FUNGI
Засеять среду MES FUNGI с помощью 10 ц! предварительно стандартизованной
суспензии клеток посевного материала в среде SUSPENSION FUNG (§9.1). Тщательно
перемешать.
И н о к у л я ц и я п л а ш к и
Добавить в каждую лунку, кроме лунки 10 (С-), которая уже заполнена, следующие
компоненты:
- 100 засеянной среды MES FUNGI,
- 2 капли парафинового масла.
20
Плотно заклеить тест-плашку липкой лентой.
9 .3 . И н к у б а ц и я п л а ш к и
Инкубировать плашку при 37°С в течение 24 часов; при необходимости и в зависимости
от штамма, инкубацию можно продлить до 48 часов.
Примечание: не проводить учет результатов на плашке после 18-20 часов инкубации,
даже если лунка положительного контроля изменила свой цвет. Время инкубация не
менее 24 часов является предпочтительным для считывания результатов,
- для Cryptococcus neoformans плашку инкубировать при 30°С, и при необходимости
продлить время инкубации до 72 или даже 96 часов.
1 0 . И Н Т Е Р П Р Е Т А Ц И Я Р Е З У Л Ь Т А Т О В
Изменение цвета среды, с первоначального темно-фиолетового на розовый или
бесцветный, свидетельствует о том, что тестируемый штамм способен расти в
присутствии тестируемой в этой лунке концентрации противогрибкового препарата.
Отсутствие изменения цвета свидетельствует о подавлении роста тестируемого штамма
указанным препаратом в данной концентрации.
Ю Л , П о д т в е р ж д е н и е д о с т о в е р н о с т и ( л у н к а п о л о ж и т е л ь н о г о к о н т р о л я ( С + )
Убедиться, что лунка контроля роста в среде (С+) меняет цвет на розовый или
бесцветный, в противном случае время инкубации надо увеличить (9.3).
Для С. neoformans результаты можно считывать сразу, как только цвет среды в лунке С+
измениться на светло-фиолетовый.
1 0 .2 . У ч е т о т р и ц а т е л ь н о г о к о н т р о л я ( л у н к а о т р и ц а т е л ь н о г о к о н т р о л я ( С - )
Сравнить изменение цвета в анализируемой лунке с цветом лунки отрицательного
контроля (С-), цвет которой соответствует исходному цвету среды.
1 0 .3 . И н т е р п р е т а ц и я р е з у л ь т а т о в
Для облегчения процесса интерпретации результатов, следует пользоваться прилагаемой
к набору таблицей результатов. Результаты могут быть выражены в виде минимальных
ингибирующих рост концентраций (МИК) или в виде клинической классификации.
Минимальная ингибируюшая рост концентрация ГМИК^
МИК дана как самая низкая концентрация, при которой никакого роста не наблюдается
(первая лунка, которая остается темно-фиолетовой).
Клиническая классификация (Ч/П или Ч-ДЗ / У)
Штамм может быть Чувствительным (Ч), Промежуточным (П) / Чувствительным -
Дозозависимый (Ч-ДЗ) или Устойчивые (У^ в соответствии с критическими значениями
противогрибковых препаратов, приведенных в таблице ниже:
Критические концентрации в fig/ml для Candida spp:
Препарат Ч П чдз у
Амфотерицин В* НО НО - но
Флюцитозин** <4 8-16 - >32
Интраконазол** <0.125 - 0.25-0.5 >1
Флюконазол** <8 - 16-32 >64
Вориконазол *** НО - НО НО
НО: не определено
для амфотерицина минимальная ингибирующая концентрация (МИК) > 2
jj-g/ml указывает на возможную устойчивость.
концентрации, определенные по CLSI (Институт клинических лабораторных
стандартов, США)
21
*** для вориконазола предварительные концентрации; 4<l|ig/ml; ЧДЗ== 2 |ig/ml;
y>2)ig/ml,
1 0 .4 . П р и м е ч а н и е
С. krusei является естественно устойчивым к флюконазолу и неизменно должен
относиться к (У) для этого противогрибкового препарата.
1 1 , К О Н Т Р О Л Ь К А Ч Е С Т В А
Стандартизацию этого метода время от времени рекомендуется проверять с помощью
эталонных штаммов, Candida albicans АТСС 90029 и Candida krusei АТСС 6258**.
Препарат Candida Candida krusei
albicans АТСС 6258
АТСС 90028 48 часов
24 часа
Амфотерицин В <0,5 <0,5
Флюцитозин <4 <4-16
Интраконазол <0,125-0,5 0,25-1
Флюконазол <8 32 - > 64
Вориконазол < 1 <1
1 2 . О Г Р А Н И Ч Е Н И Я М Е Т О Д А
Данный in vitro метод для определения чувствительности к противогрибковым
препаратам имеет индикационное значение при взаимодействии противогрибковых
препаратов и дрожжеподобных грибов во время in vitro. В случае применения
интраконазола, флюконазола и вориконазола может иметь место явление «ползучего»
роста, в особенности, с Candida albicans. Это проявляется неполным изменением цвета
(светло-фиолетовый), идентичным во всех лунках, содержащих один и тот же
противогрибковый препарат.
1 3 . П Р И Ч И Н Ы П О Г Р Е Ш Н О С Т Е Й
- Подготовленный посевной материал из смешанной культуры или из отдельных
колоний, которые выращивали более 24 часов.
- Инкубация плашки происходила при температуре выше 38°С.
- Учет результатов плашки до истечения 24 часов инкубации (например, после 18-
20 часов).
- Учет результатов плашки до появления изменения цвета индикатора роста.
- Учет результатов плашки проводили спустя 24 или 48 часов после того, как среда
изменила цвет в лунке контроля роста.
- В общем, несоблюдение рекомендаций, содержащихся в инструкциях.
1 4 . Э Ф Ф Е К Т И В Н О С Т Ь М Е Т О Д А
Оценка рабочих характеристик была выполнена на различных штаммах {Candida
albicans, С. glabrata, С. parapsilosis, С. tropicalis, С. lusitaniae, С. krusei, С. kefyr, С.
guilliermondii, Saccharomyces cerevisiae, Cryptococcus neoformans), изолированных от
микробиологических проб и полученных из разных отделений больниц и от разных
пациентов сети лечебных учреждений.
Параллельно было проведено сравнительное изучение с эталонными методами; методом
микроразведения ЕиСА8Т(Европейский комитет по определению чувствительности к
22
антибиотикам) (за исключением амфотерицина В) и методом Е-тест компании АВ
АВ 5-FC ITZ FCZ VRZ %СА
НО п = 56 п = 56 п = 56 п = 56 -
EUCAST НО 92.9% 69.6% 73.2% 92.9% 82.2%
п= 100 п = 99 п = 99 п-99 п= 100 -
E-Test 99% 90,9% 79.8% 84.8% 97% 90.3%
НО: Не определено
% СА: % совпадения категории
Что касается времени инкубации, 93,3% (97/104) штаммов давали результат после 24
часов.
15. УТИЛИЗАЦИЯ ОТХОДОВ
Отходы следует уничтожать, соблюдая санитарные нормы и правила, принятые в стране
использования для отходов подобного рода.
23
C A N D I C H R O M П
Изоляция дрожжевых грибов и
прямая идентификация Candida albicans
4 X 180 мл
1 . Н А З Н А Ч Е Н И Е
Набор CANDICHROM II представляет собой среду, готовую к использованию в чашках
с агаровой средой. Набор создан для первичной изоляции дрожжевых грибков и
мицелиальных грибов, а также предположительной идентификации Candida albicans
непосредственно в различных клинических пробах.
2 . В В Е Д Е Н И Е
Частота грибковых инфекций, и особенно тех, которые вызваны дрожжевыми грибками,
значительно увеличилась за последние десять лет. Дрожжевые грибки являются условно-
патогенными микроорганизмами. Большая их часть - это сапрофиты, которые при
благоприятных условиях в организме носителя становятся патогенными. Идентификация
этих видов, будь то какой-то один или различные типы, присутствующие в клинических
пробах, стала необходимой для назначения эффективной терапии (2). Применение чашки
с агаровой средой CANDICHROM II позволяет сократить время за счет отсутствия этапа
идентификации Candida albicans - основных патогенных дрожжевых грибков, и кроме
того, появилась возможность выявить несколько видов одновременно.
3 . П Р И Н Ц И П
Восстановленная среда CANDICHROM II - это избирательная агаровая среда,
предназначенная для изоляции различных грибков. Кроме того, с помошью обогащенной
добавки происходит быстрый рост большинства дрожжевых грибков в течение 24 часов.
Добавка из смеси антибиотиков подавляет рост большинства бактериально
загрязняющих организмов. Наличие хромогенного субстрата в среде позволяет
выполнить прямую идентификацию Candida albicans. Этот принцип лежит в основе
идентификации С albicans специфической гексозаминидазой (3). Штаммы С. albicans
дают блестящие колонии, интенсивного сине-зеленого цвета, в то время как другие
дрожжевые остаются белыми. Смешанные культуры можно идентифицировать с
помощью макроскопических морфологических признаков.
4 . Р Е А Г Е Н Т Ы
К о м п о н е н т ы н а б о р а К о л и ч е с т в о
C A N D I C H R O M I I B a s e 4 флаконы с 1 6 0 мл агаровой 4
основой (пептоны, сульфат аммония, сульфат магния,
фосфат монокалия и агар)
C A N D I C H R O M I I S u p p le m e n t флаконы с 2 0 мл добавки 4
(дрожжевой экстракт, Д-глюкоза, хромогенный субстрат и
ингибитор, смесь антибиотиков.
5 . М Е Р Ы П Р Е Д О С Т О Р О Ж Н О С Т И
- Среда в этой коробке предназначена исключительно для in vitro использования, и
работать с ней должен только персонал, имеющий на это разрешение.
- Пробы и инокулированная чашка с агаровой средой могут вызвать инфекцию,
поэтому с ними необходимо обращаться осторожно, соблюдая правила и
требования гигиены для работы с подобными препаратами, предусмотренные в
стране пользователя.
24
- среда содержит сырье животного происхождения, с ней нужно обращаться
осторожно
- Не использовать реагент после истечения срока их годности. Не использовать
среду, которая испорчена или была неправильно законсервировала после
восстановления.
- При интерпретации результатов необходимо принимать во внимание
макроскопическое и микроскопическое проявление культуры, при необходимости
и результаты дополирггельных тестов по идентификации.
6 . С Б О Р О Б Р А З Ц О В
Пробы следует подбирать в соответствии с природой изученной патологии или с
выполненным анализом. Пробы следует транспортировать и консервировать, строго
соблюдая условия, и соблюдая соответствующие действующие правила в стране-
пользователя.
7. П О Д Г О Т О В К А И Х Р А Н Е Н И Е Р Е А Г Е Н Т О В
Агаровая основа и добавка остаются стабильными при хранении при температуре 2-8°С
в темном месте в оригинальной упаковке до истечения срока годности, указанной на
упаковке.
Подготовка
Отвинтить колпачок бутылочки с CANDICHROMII Base,
- Разжижить CANDICHROM II Base в кипящей воде при 100°С (около 30 минут).
Асептически восстановить добавку CANDICHROM II Supplement с помощью 20
мл стерильной дистиллированной воды и осторожно перемешать, чтобы
растворить содержимое.
- Асептически добавить восстановленную добавку в агаровую основу,
охлажденную до 50°С и тщательно смешать.
- Сразу же разлить в стерильные чашки Петри. Для чашек Петри размером 90 х 15
мм рекомендуется объем 15-18 мл.
Внимание: при необходимости восстановленную среду, однажды приготовленную,
можно повторно растворить. Все чашки следует приготовить одновременно.
Хранение
После приготовления чашки с агаровой средой CANDICHROM II, герметически
запечатанные, остаются стабильными при хранении в темном месте при температуре 2-
8°С в течение 2 месяцев.
Чтобы избежать кристаллизации среды, не располагайте чашки с агаровой средой в
непосредственной близи от холодной или охлаждаемой поверхности.
Чтобы исключить конденсацию, не подвергайте чашки с агаровой средой резким
изменениям температуры.
8 . Н Е О Б Х О Д И М Ы Е Н Е П О С Т А Л Я Е М Ы Е М А Т Е Р И А Л Ы
- стерильные чашки Петри
- кипящая вода
- стерильные сборники или ватные тампоны для сбора проб
- петли для изоляции
- инкубатор t=35-37°C
- контейнер для загрязненных отходов
25
9 . М Е Т О Д И К А
т
Перед использованием подождать, пока температура чашки с агаровой средой не станет
комнатной (18-25°С). Работать в стерильной атмосфере.
9.1. Инокуляция чашки с агаровой средой
- Пометить чашку с агаровой средой CA N D ICH R O M II.
- Инокулировать чашку с пробой непосредственно, пользуясь традиционной техникой
изоляции.
9.2. Инкубация
Инкубировать в течение 18-24 часов при 35-37°С.
9.2. Инкубация чашки с агаровой средой
- Поместить чашку в инкубатор при температуре 37°С на 24 - 48 часов
Примечание: большинство дрожжевых грибков произрастают в течение 24 часов,
однако, предпочтительнее считывать результат после 48 часов или даже 72 часов
инкубации.
10. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
10.1 Предположительная идентификация Candida albicans
Через 24 часа инкубации колонии С. albicans имеют темный синие-зеленый цвет, с
возрастающей со временем интенсивностью окраски. Колонии в основном блестящие,
гладкие, выпуклые и с четкими очертаниями и небольших размеров.
10.2. Дифференциация других дрожжевых грибков и мнцелиальных грибов
Другие штаммы, дающие рост сине-зеленых колоний
Некоторые другие штаммы дрожжевых грибков дают рост окрашенных колоний, однако,
их макроскопические морфологические признаки позволяют отличить их от С albicans.
- Candida tropicalis: определенные штаммы дают рост зеленовато-кремовым колониям в
течение 24 часов, а после 48 часов - колонии бледно-зеленого цвета. Колонии -
блестящие или матовые, гладкие, выпуклые и большего размера, чем С albicans.
- Trichosporon asahii: определенные штаммы дают рост колониям бирюзово-зеленого
цвета, похожим внешне на колонии С. albicans, но с пушистой структурой.
- Aspergillus fumigatus: колонии, окрашенные в сине-зеленый цвет, по виду такие же, как
и колонии С. albicans, но с пушистой структурой.
Штаммы, дающие рост колониям цвета розового коралла
- Rhodotorula: Штаммы сохраняют свой естественный цвет розового коралла.
Штаммы^ дающие рост колониям кремового цвета
- Белый цвет: С. glabrata или С rugosa в общем.
- Белого кремового цвета: С tropicalis (через 24 часа для определенных штаммов),
C.krusei, С. parapsilosis, С. kefyr, С. inconspicua, S. cerevisae.
- Желтого кремового цвета: С. lusitaniae, становятся желтыми в течение 72 часов.
Примечание: для всех других штаммов, отличных от С.albicans, идентификация должна
последовать за обычными лабораторными процедурами.
10.3. Макроскопические морфологические признаки
Культура на чашках с агаровой средой CAN D ICH RO M II имеет следующие
макроскопические морфологические признаки, которые позволяют сделать
дифференциальную идентификацию определенных дрожжевых грибков:
- Candida tropicalis: колонии блестящие или матовые, гладкие, выпуклые и большего
размера, чем С albicans.
- Candida glabrata или С lusitaniae: блестящие колонии, гладкие, слегка вьшуклые, с
четкими очертаниями в виде неровных зубчиков и в основном большие.
- Candida krusei: колонии матовые, плоские, с четкими очертаниями в виде неровных
зубчиков, не пушистые и очень большие.
26
- Candida parapsilosis: колонии яркие до блестящих, выпусклые, с явными очертаниями,
ф
в основном гладкие, но иногда сморщенные.
- Candida inconspicua, С. kefyr и Saccharomyces cerevisiae: колонии блестящие, гладкие и
выпусклые..
- Geotrichum candidum: колонии матовые, плоские, пущистые с четкими очертаниями в
виде неровных зубчиков.
- Geotrichum capitatum. колонии матовые, разбухшие и желеобразного вида.
П . К О Н Т Р О Л Ь К А Ч Е С Т В А
Продуктивность штаммов рекомендуется проверять с помощью эталонных штаммов
{Candida albicans АТСС 90029, Candida glabrata АТСС 90030 и Candida knisei АТСС
6258). Подавление бактериального роста следует проверять с помощью эталонного
ттшмг. Escherichia coli АТСС 25922. Результаты считывать после 24-часовой инкубации
при температуре 37°С :
О ж и д а е м ы е р е з у л ь т а т ы д л я ш т а м м о в
- С albicans АТСС 90029. Колонии среднего размера, темно сине-зеленого и
кремового цвета.
- С. glabrata АТСС 90030. Большие колонии белого и кремового цвета.
“ С. krusei АТСС 6258. Очень большие белые морщинистые и пушистые колонии.
- Е. coh АТСС 25922 . Подавление роста.
1 2 . О Г Р А Н И Ч Е Н И Я М Е Т О Д А
Чашка с агаровой средой CAN DICH RO M II дает рост дрожжеподобным грибам и
определенным мицелиальным грибам.
Если требуется, то идентификацию изолированных микроорганизмов следует
подтвердить с помощью биохимических и иммунологических тестов.
Определенные штаммы С. albicans могут вызвать рост только сине-зеленых колоний
после 48-часовой инкубации.
Определенные штаммы, не считая C.albicans, могут вызвать рост только зеленых
колоний; однако, их можно выделить по их макроскопическим признакам.
Ни одного штамма Candida dublinensis не было протестировано с помощью
CAN D ICH RO M II.
Некоторые бактерии, резистентные в смеси антибиотиков, могут дать рост на чашке
с агаровой средой CAN D ICH RO M II.
Чашку с агаровой средой CAN DICH RO M II оценивали при температуре инкубации
37Х.
1 3 . И С Т О Ч Н И К И О Ш И Б О К
- Несоблюдение рекомендаций по приготовлению и хранению чашек с агаровой
средой.
- Плохая процедура посева пробы приводит в плохой изоляции штамма.
- Возможность ложных положительных реакций при загрязненных пробах мочи.
- Инкубация только 24 часа.
- В общем, несоблюдение инструкций, данных в руководстве.
1 4 . Х А Р А К Т Е Р И С Т И К И
1 4 .1 . И д е н т и ф и ц и р о в а н н ы е к л и н и ч е с к и е ш т а м м ы
П р о д у к т и в н о с т ь
27
П р о д у к т и в н о с т ь ч а ш к и с а г а р о в о й с р е д о й , г о т о в о й к у п о т р е б л е н и ю , C A N D I C H R O M II
с р а в н и в а л и с д в у м я д р у г и м и х р о м о г е н н ы м и ч а ш к а м и с а г а р о в о й с р е д о й C H R O M A G A R
C a n d id a ( B e c to n - D ic k in s o n ) и C A N D I D A I D ( B io M e r ie u x ) .
И з о л и р о в а н н ы е ш т а м м ы :
Было протестировано индивидуально 104 штамма (из которых 36 были - С. albicans, 1 7 -
С tropicalis, 10 - С. glabrata, 10 - С parapsilosis, 9 - С krusei, 4 - С lusitaniae, 3 - С
pseudotropicalis, 3 - С . inconspicua, 1 - С rugosa, 6 - S. cerevisiae, 1 - С neoformam, 1 - Т
asahii, 2 - А. fumigatus и 1 - Rhodotorula sp.). Все эти штаммы культивировали в течение
24 часов на 3 тестируемых средах, кроме 3 штаммов Cryptococcus neoformans, которым
требовалась инкубация в течение 48 часов и штамма Rhodotorula sp, которому
требовалась инкубация 72 часа.
Р а з м е р к о л о н и й Candida albicans б ы л и д е н т и ч н ы м н а 3 т е с т и р у е м ы х с р е д а х . О д н а к о ,
д р у г и е в и д ы д а в а л и к о л о н и и б о л ь ш е г о р а з м е р а н а C A N D I C H R O M I I и C H R O M A G A R
C a n d id a , ч е м н а C A N D I D A ID .
К о м б и н а ц и и ш т а м м о в ;
Б ы л о п р о т е с т и р о в а н о 3 9 к о м б и н а ц и й ш т а м м о в , с о о т в е т с т в е н н о 8 1 ш т а м м . В с е э т и
ш т а м м ы к у л ь т и в и р о в а л и в т е ч е н и е 2 4 ч а с о в н а C A N D I C H R O M I I , к р о м е о д н о г о ш т а м м а
С . glabrata, к о т о р ы й п р о я в л я е т с я ч е р е з 4 8 ч а с о в и н к у б а ц и и . Э т о т о с о б е н н ы й ш т а м м С
glabrata, н е б ы л в ы я в л е н н а ч а ш к е C H R O M A G A R C a n d id a , а б ы л в ы я в л е н т о л ь к о н а
C A N D r o A I D ч е р е з 7 2 ч а с а .
Предположительная идентификация Candida albicans
3 6 и з о л и р о в а н н ы х ш т а м м о в Candida albicans д а в а л и с и н е - з е л е н ы е к о л о н и и ч е р е з 2 4 ч а с а
и н к у б а ц и и . И з 2 8 к о м б и н а ц и й с Candida albicans, п е р е г р у п п и р о в а н н ы е 6 0 ш т а м м о в , в с е
ш т а м м ы С albicans б ы л и в ы я в л е н ы .
14.2. Изоляция клинических проб
Изоляцию дрожжевых грибков и мицелиальных грибов на чашке с агаровой средой,
готовой к употреблению, C A N D I C H R O M I I сравнивали с результатами, полученными на
чашке с Сабуро - гентамицин -хлорамфениколовом агаровой средой (Sabouraud G^).
Было изолировано 125 штаммов (из которых 67 были - С. albicans, 15 - C.tropicalis, 17 -
С glabrata, 9 - С kejyr, 5 -С krusei, 4 - С inconspicua, 2 - С. parapsilosis, 2 - С
guilliermondii, 1 - С. lusitaniae, 1 - G. candidum, 1 - G. capitatum и 1 - Saccharomyces sp.) из
91 разнообразных проб, из которых 58 проб, содержали один единственный вид, 29 проб
содержали 2 вида и 3 пробы содержали 3 вида.
24 ч 48 ч 72 ч
CANDICHROM II 91,2% 96% 98,4%
SABOURAUD GC 92% 96,8% 98,4%
П р е д п о л о ж и т е л ь н а я и д е н т и ф и к а ц и я Candida albicans
Результаты прямой идентификации 67 штаммов Candida albicans с помошью
CANDICHROM II, и без проведения дополнительных тестов, сравнивали с результатми,
полученными на Сабуро - гентамицин -хлорамфениколовом агаре (Sabouraud GC) в
сочетании с иммунологическими и/или биохимическими тестами. Результаты изоляции
24 ч 48 ч 72 ч
CANDICHROM II 83,5% 97% 98,5%
SABOURAUD GC 92,5% 97% 97%
1 5 . У Т И Л И З А Ц И Я О Т Х О Д О В
Отходы следует уничтожать в соответствии с санитарно-гигиеническими нормами и
требованиями, принятыми в стране использования для продуктов подобного рода.
28
E L I c h r o m F U N G I
Идентификация основных патогенных дрожжевых грибов
5 тестов
1 . Н А З Н А Ч Е Н И Е
Набор ELIchrom FUNGI дает возможность идентификации основных патогенных для
человека дрожжевых грибов, используя хромогенные субстраты. Он позволяет
дифференцировать Candida albicans от Candida dubliniensis.
2 В В Е Д Е Н И Е
Количество грибковых инфекций и особенно инфекций, вызванных дрожжевыми
грибами, значительно возросло за последние десять лет. Дрожжевые грибы являются
оппортунистическими агентами. Большинство из них сапрофиты, но они могут стать
патогенными при благоприятных условиях в организме хозяина.
Эти условия включают физиологические факторы (новорожденные дети, пожилые люди,
беременные женщины), местные факторы (опрелости, мацерация), патологические
факторы (рак, иммунодефицит, нарушения метаболизма...), факторы, связанные с
лечением (антибиотики, средства оральной контрацепции, иммуносупрессивные агенты,
ионизирующая радиация, хирургическое вмешательство.,.).
Клинические признаки, обусловленные этими дрожжевыми грибами, крайне
разнообразны: кожные заболевания (интертриго, вросший ноготь...), кожно-слизистые
заболевания (кандидоз ротовой полости, эзофагит, колит, вагинит...), висцеральные и
септицемические заболевания.
Дрожжевые грибы представляют собой одноклеточные талломные грибы, которые
размножаются почкованием. Основными патогенными родами являются: Candfia,
Cryptococcus, Rhodotorula, Saccharomyces, Trichosporon. Род Geotrichum составлен из
плесневых грибов, мицелий которых продуцирует истинные гифы, которые делятся на
прямоугольные артроконидии, варьирующие по размеру и по округленности дистальной
части.
3 П Р И Н Ц И П М Е Т О Д А
Идентификация дрожжевых грибов основана на наличии или отсутствии большого числа
ферментов, визуализируемом по изменению цвета. Ферментативную активность
обнаруживают по трем типам реакции.
• Г и д р о л и з 7 х р о м о г е н н ы х с у б с т р а т о в :
За счет оксидазной и пептидазной активности дрожжевые грибы гидролизуют
хромогенные субстраты, что приводит к высвобождению пара-нитроанилина, пара­
нитрофенола или орто-нитрофенола, которые отличаются желтым окрашиванием (р-
NAG, PRO, ONPG, SGL, GLY) или синим окрашиванием (a-GLU, PHOS).
‘А с с и м и л я ц и я 1 0 п р и р о д н ы х с у б с т р а т о в :
-Утилизацию сахаров выявляют по изменению цвета бромкрезолового пурпурного
(ВСР) из фиолетового в желтый или даже по отсутствию цвета (MDG, TRE, GAL-
SAC, MAL, CEL, RAF, LAC)
-Устойчивость к актидиону выявляется по тому же принципу (ACT)
- При гидролизе мочевины высвобождается аммоний, который подщелачивает среду,
превращая феноловый красный (PR) в пурпурно-розовый цвет (URE).
- При восстановлении эскулина в эскулетин посредством эскулиназы (ESC) в
присутствии лимоннокислого железа продуцируется коричнево-черный комплекс.
• О к и с л е н и е 1 с и н т е т и ч е с к о г о с у б с т р а т а : Активность фенолоксидазы в присутствии
кофейной кислоты приводит к коричневой окраске (РОХ).
29
Каждая пластинка ELIchrom FUNGI также включает лунку с положительным контролем
с
(лунка Т+), которая показывает ассимиляцию глюкозы; и отрицательный контроль (С-)
для прочтения лунок SGL и GLY.
4. РЕАГЕНТЫ
Компоненты набора Количество
Плашка ELIchrom FUNGI готовая к применению 20- 5
луночная плащка
SUSPENSION FUNGI; 4-мл флакон 4 мл с раствором 6
агара.
ТС FUNGI; 4 мл флакон с раствором сульфата бария для 1
контроля мутности.
Описание:
ТС FUNGI; 4 мл пузырек с раствором сульфата бария для контроля мутности.
SUSPENSION FUNGI: 4 мл пузырек с раствором агара, содержащим агар Bacto (0,5 г/л),
колимицин (2,5 мг/л) и ванкомицин (0,05 г/л).
ELIchrom FUNGI: готовая к применению 20-луночная плашка, которая содержит;
С+: положительный контроль, содержащий глюкозу и ВСР.
P-NAG; содержит хромогенный субстрат для a-D-глюкозаминидазы
PRO; содержит хромо генный субстрат для L-пролинамидазы
л ет; содержит актидион, глюкозу и ВСР
MDG; содержит метил-альфа-В-глюкопиранозид
ESC: содержит эскулин
a-GLU: содержит хромогенный субстрат для a-D-глюкопиранозидазы
PHOS: содержит хромогенный субстрат для фосфатазы
TRE; содержит трегалозу и ВСР
ONPG; содержит хромогенный субстрат для p-D-галактозидазы
С-; отрицательный контроль для прочтения SGL и GLY
SGL: содержит хромогенный субстрат для пептидазы
GLY: содержит хромо генный субстрат для глицинамидазы
URE; содержит мочевину и PR
POX; содержит субстрат для фенолоксидазы
SAC/GAL; содержит галактозу, сахарозу и ВСР
MAL; содержит мальтозу и ВСР
CEL; содержит целлобиозу и ВСР
RAF; содержит раффинозу и ВСР
LAC: содержит лактозу и ВСР
5. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
- Реагенты предназначены исключительно для применения in vitro и должны
использоваться допущенным персоналом.
- Образцы и инокулированные реагенты потенциально инфекционны; они требуют
осторожного обращения с соблюдением гигиенических правил и существующих
инструкций для данного типа продукта в стране использования.
- Некоторые лунки плашки ELIchrom FUNCI содержат сырые материалы животного
происхождения, которые должны использоваться с осторожностью.
- Не использовать реагенты после истечения срока годности.
- Не использовать реагенты, которые были повреждены или которые хранились не
должным образом перед применением.
30
6 . С Б О Р О Б Р А З Ц О В
Колонии, используемые для идентификации дрожжевых грибов, должны быть не старше
24-48-часов и изолированными на агар изованной среде в чашке Петри. Рекомендуется
проводить выделение на средах, специфичных для дрожжевых грибов.
7 . Х Р А Н Е Н И Е Р Е А Г Е Н Т О В
Набор и его компоненты стабильны до истечения срока годности, указанного на коробке,
при хранении при 2-8 °С в своем исходном состоянии.
Реагенты готовы к применению.
Пузырьки SUSPENSION FUNGI и плашки должны бьггь использованы сразу после
вскрытия.
8 . Н Е О Б Х О Д И М Ы Е Н Е Н О С Т А В Л Я Е М Ы Е Р Е А Г Е Н Т Ы
- Инкубатор на ЗОХ
- Пастеровские пипетки
- Контейнер для грязных отходов.
9 . М Е Т О Д И К А
Перед использованием выставить чашки с агаром для достижения комнатной
температуры (18-25°С).
9 .1 . О ц е н к а и з о л и р у е м ы х к о л о н и й
Перед инокуляцией плашки провести макроскопическую и микроскопическую оценку
колоний.
9 .2 . П о л у ч е н и е и н о к у л ю м а
Снять проволочной петлей или запаянной пастеровской пипеткой две или три
идентичных изолированных колонии.
Инокулировать пузырек SUSPENSION FUNGI колониями. Хорошо перемешать.
Стандартизация инокулюма может быть осуществлена различными способами;
В о т н о ш е н и и Т С F U N G I
Доведение мутности инокулированной среды до контроля мутности ТС FUNGI с
помощью черных полос, напечатанных на этикетках пузырька,
Если среда светлее (недостаточно инокулюма), пузырек должен быть инокулирован
повторно до тех пор, пока наблюдаемая мутность не станет такой же, как контроль
мутности.
Если среда мутнее (инокулюм слишком обогащен), развести ее свежим SUSPENSION
FUNGI из вновь открытого пузырька до получения верной мутности.
С п о м о щ ь ю д е н с и т о м е т р а
Подтвердить с помощью денситометра, что мутность инокулированной среды равна 2
М а е F a r l a n d . При необходимости продолжить, как описано выше до доведения
мутности.
9 .3 . И н о к у л и р о в а н и е п л а ш к и
Удалить липкую ленту, покрывающую плашку.
Внести в 20 лунок 100 мкл инокулированной SUSPENSION FUNGI.
Вновь покрыть плашку липкой лентой.
9 .4 . И н к у б а ц и я
Инкубировать при максимуме 30 °С в течение 24-48 часов.
Считать результаты, когда лунка с положительным контролем станет из фиолетовой
желтой или бесцветной.
31
1 0 . С Ч И Т Ы В А Н И Е И И Н Т Е Р П Р Е Т А Ц И Я Р Е З У Л Ь Т А Т О В
Ю Л . С ч и т ы в а н и е п л а ш к и
Считать лунку С+; если она все еще фиолетовая, увеличить время инкубации.
Если лунка С+ стала желтой или бесцветной, считать плашку, обратившись к цветовой
диаграмме, включенной в набор.
1 0 .2 . И д е н т и ф и к а ц и я
Интерпретацию плашки ELIchrom FUNGI осуществляют либо с помощью таблицы
кодов, либо с помощью идентификационной таблицы. Если полученный через 24 часа
код не приводится, продолжить инкубировать последующие 24 часа. Если через 48 часов
код все еще не приводится, обратиться к идентификационной таблице. Для данного
дрожжевого гриба все основные характеристики, указанные в этой таблице, должны
быть однозначно верны.
Для определения кода характеристики группируются в виде триплетов, квадруплета или
набора из пяти признаков;
- P-NAG, PRO, ACT
- MDG, ESC, a-GLU
- PHOS, TRE, ONPG
- SGL, GLY, URE, POX
-GAL-SAC, MAL, CEL, RAF, LAC
Каждой характеристике приписывается величина ноль, если элемент отрицательный.
Если элемент положительный, величина зависит от его позиции в триплете, квадруплете
или наборе из пяти признаков:
- 1 для позиции 1
- 2 для позиции 2
- 4 для позиции 3
- 8 для позиции 4
- 16 для позиции 5.
В одной группе сложить величины для получения 7-значного номера. После чего
посмотреть этот номер в таблице кодов.
Таблица
Например; Код 7-5-2-00-03, этот код соответствует указателю для Candida albicans.
1 1 . К О Н Т Р О Л Ь К А Ч Е С Т В А
Рекомендуется, чтобы стандартизация способа проверялась время от времени, используя
референсные штаммы, С albicans АТСС 90028 (1) и Candida krusei АТСС 6258 (2).
Считывание через 24 часа:
1 2 . П Р И Ч И Н Ы П О Г Р Е Ш Н О С Т Е Й
- Проведение теста в нестерильных условиях.
- Получение и но кулю ма из смешанной культуры.
- Инокулюм с мутностью ниже 2 Мае Farland можег приводить к ложноотрицательж му
результату, особенно для ESC и RAF.
- Испарение содержимого лунки в процессе инкубации как следствие не должным
образом закрытой с помощью клейкой ленты пластинки.
- Инкубирование пластинки при 37 °С вместо 30°С.
- Плашка считана до появления изменения цвета индикатора роста.
- Плашка не считана после инкубации в течение 24 или 48 часов, даже при
положительном индикаторе роста.
- Общее несоблюдение рекомендаций, приведенных в инструкциях.
32
1 3 . О Г Р А Н И Ч Е Н И Я М Е Т О Д А
- Способ ELIchrom FUNGI позволяет идентифицировать лишь виды, представленные в
прилагаемом списке.
- Для некоторых штаммов идентификация способом ELIchrom FUNCI должна
осуществляться параллельно с анализом морфологических характеристик.
1 4 . Э Ф Ф Е К Т И В Н О С Т Ь М Е Т О Д А
Оценку рабочих характеристик осуществляли, используя 10 референсных штаммов и 190
штаммов из микологических образцов (43 Candida albicans, Candida dubliniensis, 28
Candida glabrata, 5 Candida guillermondii, 7 Candida krusei, 7 Candida lusitaniae, 3
Candida kejyr, 21 Candida parapsilosis, 4 Candida rugosa,13 Candida tropicalisj Candida
catenulate, 1 Candida colliculosa, 4 Candida famata, I Candida inconspicua, 1 Candida
lipolytica, } Candida membrani/aciens, 1 Candida nivariensis, I Candida palmioleophila, 2
Candida parariigosa, 2 Candida pelliculosa, 2 Candida zeylanoides, 2 Cryptococcus albidus, 1
Cryptococcus laurentii, 5 Cryptococcus neoformans, 3 Rhodotorula mucilaginosa/rubra, 5
Saccharomyces cerevisiae, 3 Trichosporon asahii, 2 Trichosporon cutaneum/mucoides, 1
Geotrichum candidnm, 1 Geotrichum capitatum, I Pichia farinose, 1 Rhodotorula glutinis).
Сравнительное исследование осуществляли параллельно со способом Auxacolor 2
(продукция фирмы Biorad), Процент одинаковых результатов составил 86%. Среди
несоответствий лишь в двух случаях подтвердилась ошибка способа ELIchrom FUNGI. В
результате чувствительность теста составила 98,59% и специфичность составила 99%.
93,5% штаммов идентифицировали через 24 часа инкубации.
1 5 . У Т И Л И З А Ц И Я О Т Х О Д О В
Отходы должны быть уничтожены в соответствии с правилами гигиены и
существующей в настоящее время инструкцией по данному виду продукта в стране
применения.
33
Е Ы Т е х B ic o lo r a lb i- d u b li
Тест латекс-агглютинации на стекле для идентификации
Candida из группы С. albicans / С. dubliniensis
60 тестов
1 . Н А З Н А Ч Е Н И Е
ЕЫТех Bicolor albi-dubli представляет собой тест с использованием реакции
агглютинации на стекле для ускоренной идентификации штаммов Candida (группы С
albicans I С. dubliniensis ) непосредственно из изолированных колоний.
Каждый набор позволяет осуществить 60 тестов.
Каждый набор позволяет осуществить 360 тестов.
2 В В Е Д Е Н И Е
Дрожжевые грибы рода Candida могут отвечать за кандидоз кожи, кандидоз слизистых
оболочек и кандидемию или инвазивный кандидоз.
Грибы рода Candida как правило представляют собой дрожжевые грибы-комменсалы
слизистых оболочек желудочно-кищечного тракта и урогенитальной системы. Они
становятся патогенами лишь при благоприятных условиях, возникающих в организме-
хозяине. К числу факторов, которые благоприятствуют развитию кандидозной
инфекции, относятся внутренние физиологические факторы или патологии (пожилой
возраст, беременность, диабет, иммунодефициты и онкологические заболевания). В
отношении внешних факторов, они являются по преимуществу ятрогенными по природе.
Распространение кандидоза значительно возросло за последние двадцать лет как
следствие возникновения патологий, таких как СПИД, распространения лечения
антибиотиками и применения оральных контрацептивов, разработки терапевтических
иммуносупрессивных агентов, парентерального питания и увеличения числа инвазивных
способов исследований и хирургических мероприятий. Например, кандидемия отвечает
за примерно 10% нозокомиальных инфекций; процент, который может достигать 20%
согласно некоторым исследованиям. Более того, прогноз данного кандидоза
неблагоприятный со смертностью пациентов, колеблющейся между 38 и 50%.
Наиболее часто выделяемым видом является С.albicans. Он составляет 60-80%
клинических изолятов.
Идентификация С.albicans может быть осуществлена одновременно с выделением на
хромогенных средах или используя фенотипические характеристики, такие как
способность продуцировать герминативные трубки. Также могут быть использованы
биохимические тесты, такие как ауксанограмма (исследование ассимиляции
моносахаридов в качестве источника углерода и энергии) и зимограмма (исследование
использования моносахаридов в условиях анаэробиоза). Их недостаток заключается во
времени проведения теста от 24 до 48 часов. С.albicans является самым патогенным
видом рода Candida. Его быстрая идентификация поэтому важна для выбора схемы
лечения.
ЕЫТех Bicolor albi-dubli представляет собой ускоренный тест, который позволяет
идентифицировать грибы Candida группы С.albicans и С. dubliniensis. В тесте
используются латексные частицы, сенсибилизированные моноклональным антителом,
специфичным для антигена, который является общим для этих двух видов.
Дифференциация между этими двумя видами возможна с помощью применения теста
ЕЫТех Bicolor dubliniensis.
3 . П Р И Н Ц И П М Е Т О Д А
Тест ЕЫТех Bicolor albi-dubli выполняют с помощью 2 реагентов;
34
- реагента TEST LATEX (коричневого цвета), состоящего из красных частиц латекса в
суспензии с зеленым контр-красителем. Эти частицы сенсибилизируют моноклональным
антителом, специфичным для антигена С albicans I С. dtibliniensis, который присутствует
в основном в клеточной стенке дрожжевых грибов.
- реагента R-DIS, содержащего ферменты, которые обладают способностью
диссоциировать клетки и обнажать внутристеночный антиген, который распознается
моноклональным антителом.
При первом добавлении реагента TEST LATEX к колониям C.albicans или С.
dubliniensis, предварительно помещенным в суспензию с реагентом R-DIS, встряхивание
суспензии приводит к коагглютинации между бластоспорами, несущими антиген,
распознаваемый моноклональным антителом, и сенсибилизированными частицами
латекса.
Положительная реакция характеризуется появлением красных агглютинатов на более
или менее интенсивном зеленом фоне. С колониями дрожжей, отличных от C.albicans и
С. dubliniensis, агглютинации не наблюдается и суспензия остается гомогенной и
равномерно коричневого цвета.
Проведение теста как простое, так и быстрое с получением результатов в течение 5
минут.
4 РЕАГЕНТЫ
К о м п о н е н т ы н а б о р а К о л и ч е с т в о
TEST LATEX; пузырек с сенсибилизированным латексом 1
объемом 1 мл
R-DIS: пузырек с лиофилизированным диссоциирующим 3
реагентом, восстанавливаемым с помощью 0,45 мл
дистиллированной воды
TEST CARD: одноразовое стекло для проведения реакции 12
STICK; одноразовая палочка для перемешивания 60
DROPPER; пипетка 1
5 . М Е Р Ы П Р Е Д О С Т О Р О Ж Н О С Т И
- Реагенты предназначены только для применения в диагностике in vitro и должны
использоваться обученным персоналом.
- Реагент TEST LATEX содержит сырые материалы животного происхождения и должен
использоваться с осторожностью.
- Образцы пациентов потенциально инфекционны; их необходимо брать с
осторожностью с соблюдением гигиенических правил и существующих инструкций для
данного типа продукта в стране использования.
- Реагенты содержат азид натрия (<0,1%).
- Не использовать реагенты после истечения срока годности.
- Не использовать реагенты из партий с различными номерами.
- Выставить реагенты для достижения комнатной температуры.
- Перед применением осторожно встряхнуть реагент TEST LATEX.
-При нанесении реагента TEST LATEX пипетка должна находиться в абсолютно
вертикальном положении. Проверить отсутствие пузырьков воздуха в каплях, чтобы
обеспечить постоянные объемы доставки.
35
6 . С Б О Р О Б Р А З Ц О В
Тест может быть осуществлен;
- либо непосредственно на 24-48-часовой первичной культуре (выращенной на агаре
Сабуро, кровяном агаре...);
- либо после повторного посева на агар Сабуро (24-48 часовая культура),
7 . Х Р А Н Е Н И Е Р Е А Г Е Н Т О В
Все реагенты, хранившиеся при 2-8°С в своей исходной упаковке, стабильны до даты
истечения срока годности, указанной на коробке. Не замораживать их. После
восстановления реагент R-DIS может храниться в течение 45 дней при хранении при 2-8
° С .
Не выставлять реагенты на сильный свет.
8 . Н Е О Б Х О Д И М Ы Е Н Е Н О С Т А В Л Я Е М Ы Е Р Е А Г Е Н Т Ы
- Автоматическая(ие) пипетка(и) с объемом пипетирования, адаптированным к объему,
который будут измерять.
- Дистиллированная вода
' Пастеровская пипетка или проволочная петля
- Контейнер для сбора грязных отходов
9 . М Е Т О Д И К А
Перед применением выставить реагенты для достижения комнатной температуры.
1. Восстановление реагента R-DIS
a. Удалить внешнюю капсулу, после чего немного приподнять заглушку, не снимая ее
полностью, чтобы воздух мог проникать в пузырек.
Затем удалить заглушку в то же время следя, чтобы не пролить часть лиофилизата.
b. Добавить в пузырек точный объем (указанный в параграфе 4) дистиллированной воды.
c. Закрыть пузырек и встряхнуть содержимое, попеременно переворачивая пузырек
вверх дном, для растворения лиофилизата.
2. Выполнение теста на стекле
a. Для каждой тестируемой культуры добавить 20 мкл реагента R-DIS к отдельному
кругу на одноразовом стекле.
b. Используя пастеровскую пипетку или проволочную петлю снять количество
культуры, которое соответствует 3-4 колониям.
c. Диссоциировать образец культуры в капле реагента R-DIS и рассредоточить его по
всей поверхности круга.
d. После того как реагент TEST LATEX хорошо перемешается, добавить в круг с
помощью прилагаемой пипетки 1 каплю реагента.
e. Используя одноразовую палочку для перемешивания, перемешать и рассредоточить по
всей поверхности круга до получения гомогенной суспензии.
f. Вручную медленно круговыми движениями покачать стекло в течение 5 минут и
наблюдать возможное появление красных агглютинатов на зеленом фоне,
1 0 . И Н Т Е Р П Р Е Т А Ц И Я Р Е З У Л Ь Т А Т О В
П р о ч т е н и е
П о л о ж и т е л ь н а я р е а к ц и я : Образование красных агглютинатов на более или менее
интенсивном зеленом фоне.
Н е г а т и в н а я р е а к ц и я ; Отсутствие агглютинации. Суспензия остается гомогенной и
равномерно коричневого цвета.
36
РЕЗУЛЬТАТ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ
полож ительны й Тестируемый штамм относится к виду Candida albicans или
виду Candida dubliniensis. Дифференциация этих двух видов
возможна с помощью теста E L I T e x B ic o lo r dubliniensis.
о т р и ц а т е л ь н ы й Тестируемый штамм не относится к Candida albicans.
Тестируемый штамм не относится к Candida dubliniensis.
1 1 п р и ч и н ы о ш и б о к и о г р а н и ч е н и я т е с т а
- Некоторые штаммы дрожжевых грибов, такие как С parapsilosis, культуру которых
затруднительно диссоциировать, вызывают образование белых или красных агрегатов,
но без зеленого фона (красный или коричневый фон). Реакция, таким образом,
отрицательна.
- Во всех случаях необходимо, чтобы клинические, эпидемиологические и
биологические данные полностью брались в рассмотрение перед постановкой
окончательного диагноза.
1 3 э ф ф е к т и в н о с т ь м е т о д а
ЕЫТех Bicolor albi-dubli состоит из частиц латекса, сенсибилизированньк
моноклональными антителами клона «ЫВ-ЗН8», разработанного «Micro Seccion
Departemental 1» фармацевтического факультета Университета Валенсии совместно с
«Laboratorio Integrado de Bioingeneria (LIB) Universitad Politecnica de Valencia», Spain.
Это моноклональное антитело обеспечивает чувствительность и специфичность реакции.
A. Чувствительность в сравнении с тестом Blastese (тест на герминативные трубки)
Протокол;
192 идентифицированных штамма или изолята С. albicans или С dubliniensis.{cvLCTQudi
ID.32C, продукция фирмы BioMerieux) тестировали с помощью тестов ELITex Bicolor
albi-dubli и Blastese (тест на герминативные трубки) (24-часовая культура при 37 °С на
Сабуро + инкубация бластоспор в течение 3 ч при 37 °С на сыворотке человека +
прочтение тестов под инвертированным микроскопом).
Результаты:
Заключение:
ELITex Bicoloralbi-dubli обладает лучшей чувствительностью, чем тест Blastese (тест на
герминативные трубки)
B. Чувствительность/специфичность по сравнению с идентификационной системой
ID.32C
Протокол:
2404 изолята дрожжевых грибов, из которых 1747 были Candida группы С. albicans/C.
dubliniensis и 657 другими дрожжевыми грибами, отличными от С. albicans и С.
dubliniensis (идентифицированными системой ID.32C, продукция фирмы BioMerieux)
тестировали с помощью ELITex Bicolor albi-dubli после культивирования на агаре
Сабуро при 37 °С в течение 24 или 48 часов.
Снимали 3 или 4 колонии и тестировали с помощью ELITex Bicoloralbi-dubli.
Результаты:
4 дрожжевых гриба идентифицировали с помощью ID.32C как являющиеся:
-Candida parapsilosis
-Candida kefyr
-Candida glabrata
-Candida guillermondii
Заключение:
Результаты показывают:
37
-очень хорошую корреляцию (99,7%) между ЕЫТех Bicoloralbi-dubli и
идентификационной системой ГО.32С;
- для продукта ЕЫТех Bicolor albi-dubli чувствительность и специфичность выше чем
99%.
1 5 . У Т И Л И З А Ц И Я О Т Х О Д О В
Отходы должны быть уничтожены в соответствии с правилами гигиены и
существующей в настоящее время инструкцией по данному виду продукта в стране
применения. В случае пролития латексного реагента или контаминации рабочей зоны
колониями очистить, используя дезинфицирующий раствор и промокательную бумагу.
38
Е Ы Т е х B ic o lo r dubliniensis
Тест агглютинации на стекле для ускоренной идентификации Candida dubliniensis
100 тестов
1 . Н А З Н А Ч Е Н И Е
ЕЫТех Bicolor dubliniensis представляет собой тест с использованием реакции
агглютинации на стекле для ускоренной идентификации Candida dubliniensis
непосредственно из изолированных колоний.
Каждый набор позволяет осуществить 100 тестов.
2 В В Е Д Е Н И Е
Дрожжевые грибы рода Candida могут отвечать за кандидоз кожи, кандидоз слизистых
оболочек и кандидемию или инвазивный кандидоз.
Грибы рода Candida как правило представляют собой дрожжевые грибы-комменсалы
слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта и урогенитальной системы. Они
становятся патогенами лишь при благоприятных условиях, возникающих в организме-
хозяине. К числу факторов, которые благоприятствуют развитию кандидозной
инфекции, относятся внутренние физиологические факторы или патологии (пожилой
возраст, беременность, диабет, иммунодефициты и онкологические заболевания). В
отношении внешних факторов, они являются по преимуществу ятрогенными по природе.
Распространение кандидоза значительно возросло за последние двадцать лет ^ак
следствие возникновения патологий, таких как СПИД, распространения лечения
антибиотиками и применения оральных контрацептивов, разработки терапевтических
иммуносупрессивных агентов, парентерального питания и увеличения числа инвазивных
способов исследований и хирургических мероприятий. Например, кандидемия отвечает
за примерно 10% нозокомиальных инфекций; процент, который может достигать 20%
согласно некоторым исследованиям. Более того, прогноз данного кандидоза
неблагоприятный со смертностью пациентов, колеблющейся между 38 и 50%.
Наиболее часто выделяемым видом является С.albicans. Она составляет 60-80%
клинических изолятов. Тем не менее, все больше сообщается о других видах в качестве
грибковых организмов, таких как С dubliniensis (вид, очень близкий к С.albicans), С.
glabraia, С. tropicalis, С. krusei, С. lusitaniae, С. parapsilosis и С lipolytica. В 1995 был
идентифицирован новый вид рода Candida: С dubliniensis. Этот вид, близкий к
С.albicans, имеет с С.albicans много общих фенотипических характеристик, таких как
способность продуцировать герминативные трубки и хламидоспоры.
Эти два вида можно без труда различить с помощью молекулярно-биологических
техник, однако это требует затрат времени и специального оборудования,
ЕЫТех Bicolor dubliniensis представляет собой ускоренный тест, который позволяет
идентифицировать С dubliniensis, используя латексные частицы, сенсибилизированные
специфическим моноклональным антителом против С. dubliniensis. Этот тест дает
возможность различать C.albicans и С dubliniensis.
3 П Р И Н Ц И П М Е Т О Д А
Тест ЕЫТех Bicolor dubliniensis основан на коагглютинации бластоспор С dubliniensis с
синими латексными частицами в суспензии в красном красителе. Латексные частицы
сенсибилизируют моноклональным антителом, которое специфически детектирует
поверхностный антиген С. dubliniensis.
Диссоциация колоний С dubliniensis в реагенте TEST LATEX приводит к агглютинации
между бластоспорами и частицами латекса. Эта положительная реакция приводит к
синей агглютинации (которая может постепенно распространяться по направлению к
периферии) на красном фоне. Агглютинацию видно невооруженным глазом.
39
с к о л о н и я м и д р о ж ж е в ы х г р и б о в , н е о т н о с я щ и х с я к С dubliniensis, и в ч а с т н о с т и с
с
к о л о н и я м и C.albicans, а г г л ю т и н а ц и и н е п р о и с х о д и т . С у с п е н з и я о с т а е т с я г о м о г е н н о й и
о к р а ш е н н о й в к р а с н ы й ц в е т .
П р о в е д е н и е т е с т а п р о с т о е и б ы с т р о е с п о л у ч е н и е м р е з у л ь т а т о в в т е ч е н и е 5 м и н у т .
4 . Р Е А Г Е Н Т Ы
К о м п о н е н т ы н а б о р а К о л и ч е с т в о
T E S T L A T E X : п у з ы р е к с е н с и б и л и з и р о в а н н о г о л а т е к с а 1
о б ъ е м о м 2 м л
T E S T C A R D ; о д н о р а з о в о е с т е к л о д л я п р о в е д е н и я р е а к ц и и 1 3
S T I C K ; о д н о р а з о в а я п а л о ч к а д л я п е р е м е ш и в а н и я 1 2 0
5 . М Е Р Ы П Р Е Д О С Т О Р О Ж Н О С Т И
- Реагенты предназначены только для применения в диагностике in vitro и должны
использоваться обученным персоналом.
- Реагент TEST LATEX содержит сырые материалы животного происхождения и должен
использоваться с осторожностью.
- Реагент TEST LATEX содержит азид натрия (<0,1 %).
- Образцы пациентов потенциально инфекционны; их необходимо брать с
осторожностью с соблюдением гигиенических правил и существующих инструкций для
данного типа продукта в стране использования.
- Не использовать реагент TEST LATEX после истечения срока годности.
“ Перед применением выставить реагент TEST LATEX для достижения комнатной
температуры.
- Перед применением осторожно встряхнуть реагент TEST LATEX.
6 . С Б О Р О Б Р А З Ц О В
Тест может быть осуществлен:
- либо непосредственно на 24, 48-72 часовой первичной культуре (выращенной на агаре
Сабуро, средах Candiselect, CHRGMagar Candida, Candida ГО, кровяном агаре...);
' либо после повторного посева на агар Сабуро (24, 48-72 часовая культура).
7 . С Т А Б И Л Ь Н О С Т Ь , Х Р А Н Е Н И Е И П Р И Г О Т О В Л Е Н И Е Р Е А Г Е Н Т О В
Реагент готов к применению.
Реагент, хранившийся при 2-8°С в своей исходной упаковке, стабилен до даты истечения
срока годности, указанной на коробке. Не замораживать.
Не выставлять реагент TEST LATEX на сильный свет.
8 . Н Е О Б Х О Д И М Ы Е Н Е П О С Т А В Л Я Е М Ы Е Р Е А Г Е Н Т Ы
- Автоматическая(ие) пипетка(и) с объемом пипетирования, адаптированным к
измеряемому объему.
- Пастеровская пипетка или проволочная петля
- Контейнер для сбора грязных отходов
9 М Е Т О Д И К А
Перед применением выставить реагент для достижения комнатной температуры.
а. Для каждой тестируемой культуры добавить 20 мкл гомогенизированного реагента
TEST LATEX в отдельный круг на стекле.
40
b. Используя пастеровскую пипетку или проволочную петлю или палочку, снять 2-3
с
колонии из 24, 48-72 часовой культуры.
c. Перенести колонии в каплю реагента TEST LATEX и распределить их для покрытия
всей поверхности круга до получения гомогенной суспензии.
d. Вручную слегка покачать стекло в течение 3-5 минут. Может появиться синяя
агглютинация на розовом или красном или пурпурном фоне.
1 1 И Н Т Е Р П Р Е Т А Ц И Я Р Е З У Л Ь Т А Т О В
П р о ч т е н и е
Положительная реакция; Образование синей агглютинации на розовом или красном или
пурпурном фоне, видимой невооруженным глазом, которая может распространяться по
направлению к периферии, образуя синюю кромку вокруг центрального розового или
пурпурного фона.
Негативная реакция: Отсутствие агглютинации. Суспензия остается гомогенной и
пурпурной.___________
Р Е З У Л Ь Т А Т И Н Т Е Р П Р Е Т А Ц И Я
ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ Тестируемый штамм относится к виду Candida dubliniensis.
ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ Тестируемый штамм не относится к Candida dubliniensis
если штамм ранее идентифицировали как относящийся к
группе Candida albicans / Candida dubliniensis (хромогенная
среда, ELITex Bicolor albi-dubli...), отрицательный результат
дает возможность подтвердить, что штамм представляет
собой Candida albicans.
1 2 . П Р И Ч И Н Ы О Ш И Б О К И О Г Р А Н И Ч Е Н И Я Т Е С Т А
- Для детекции возможной ассоциации Candida albicans /Candida dubliniensis
рекомендуется проводить из одной культуры несколько тестов.
- Некоторые штаммы дрожжевых грибов, отличные от С dubliniensis (например, С
parapsilosis), культуру которых затруднительно диссоциировать, вызывают образование
белых агрегатов, которые не могут быть спутаны с синей агглютинацией. Реакция, таким
образом, отрицательна.
- Во всех случаях необходимо, чтобы клинические, эпидемиологические и
биологические данные полностью брались в рассмотрение перед постановкой
окончательного диагноза.
1 3 . Э Ф Е К Т И В Н О С Т Ь М Е Т О Д А
ЕЫТех Bicolor dubliniensis состоит из частиц латекса, сенсибилизированных
моноклональными антителами, которые обеспечивают специфичность и
чувствительность реакции. В исследовании, осуществленном на 200 дрожжевых
изолятах, сравнили характеристики теста ELITex Bicolor dubliniensis с молекулярно­
биологической методикой и с системой ID 32С (продукция фирмы BIOMERJEUX).
Результаты указывают, что чувствительность составила 98% и специфичность 100%.
Высокая чувствительность теста позволяет осуществлять реакцию с 1-10 штаммами без
феномена «зоны».
1 4 . У Т И Л И З А Ц И Я О Т Х О Д О В
Отходы должны бьггь уничтожены в соответствии с правилами гигиены и
существующей в настоящее время инструкцией по данному виду продукта в стране
применения. Если реагент TEST LATEX проливают или рабочая зона контаминируется
колониями, промыть, используя дезинфицирующий раствор и промокательную бумагу.
41
E L I T e x krusei
Тест латекс-агглютинации на стекле для идентификации Candida krusei
3 0 т е с т о в
1 Н А З Н А Ч Е Н И Е
ELITex krusei представляет собой тест с использованием реакции агглютинации на
стекле для ускоренной идентификации Candida krusei непосредственно из колоний.
Каждый набор позволяет осуществить 30 тестов.
2 В В Е Д Е Н И Е
Дрожжевые грибы рода Candida могут отвечать за кандидоз кожи, кандидоз слизистых
оболочек и кандидемию или инвазивный кандидоз.
Грибы рода Candida, как правило, представляют собой дрожжевые грибы-комменсалы
слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта и урогенитальной системы. Они
становятся патогенами лишь при благоприятных условиях, возникающих в организме-
хозяине, К числу факторов, которые благоприятствуют развитию кандидозной
инфекции, относятся внутренние физиологические факторы или патологии (пожилой
возраст, беременность, диабет, иммунодефициты и онкологические заболевания). В
отношении внешних факторов, они являются по преимуществу ятрогенными по природе.
Распространение кандидоза значительно возросло за последние двадцать лет как
следствие возникновения патологий, таких как СПИД, распространения лечения
антибиотиками и применения оральных контрацептивов, разработки терапевтических
иммуносупрессивных агентов, парентерального питания и увеличения числа инвазивных
способов исследований и хирургических мероприятий. Например, кандидемия отвечает
за примерно 10% нозокомиальных инфекций; процент, который может достигать 20%
согласно некоторым исследованиям. Более того, прогноз данного кандидоза
неблагоприятный со смертностью пациентов, колеблющейся между 38 и 50%.
Наиболее часто выделяемым видом является C.albicans. Она составляет 60-80%
клинических изолятов. Тем не менее, все больше сообщается о других видах в качестве
грибковых организмов, таких как С dubliniensis (вид, очень близкий к C.albicans), С.
glabrata, С. tropicalis, С. krusei, С. lusitaniae, С. parapsilosis и С lipolytica.
С. krusei, как правило, представляет собой дрожжевой гриб-комменсал слизистых
оболочек и наружных покровов, но он также находится и в природе. Этот дрожжевой
гриб редко выделяют из клинических образцов, таких как гемокультуры (2%). Однако
процент смертности, вызванной С krusei, высок (40%) вследствие первичной
резистентности к некоторым азолам, представляющей собой сложную проблему
(флуконазол, итраконазол...). Выделение и быстрая идентификация С krusei, таким
образом, важны для выбора схемы лечения. Традиционно для идентификации С. krusei
используют биохимические тесты. Недостаток ауксанограммы (исследование
ассимиляции моносахаридов в качестве источника углерода и энергии) и зимограммы
(исследование использования моносахаридов в условиях анаэробиоза) заключается в
длительном ожидании от 24 до 48 часов перед считыванием тестов.
ELITex krusei представляет собой тест быстрой идентификации С krusei, в котором
используются латексные частицы, сенсибилизированные специфическим
моноклональным антителом против С krusei.
3 П Р И Н Ц И П М Е Т О Д А
Тест ELITex krusei основан на коагглютинации поверхностного антигена С krusei с
красными латексными частицами, которые сенсибилизированы моноклональным
антителом.
42
Д и с с о ц и а ц и я к о л о н и й С krusei в р е а г е н т е Е Ы Т е х krusei п р и в о д и т к а г г л ю т и н а ц и и м е ж д у
б л а с т о с п о р а м и и ч а с т и ц а м и л а т е к с а . Э т а п о л о ж и т е л ь н а я р е а к ц и я п р и в о д и т к к р а с н о й
а г г л ю т и н а ц и и , к о т о р у ю в и д н о н е в о о р у ж е н н ы м г л а з о м .
С к о л о н и я м и д р о ж ж е в ы х г р и б о в , н е о т н о с я щ и х с я к С . krusei, а г г л ю т и н а ц и и н е
п р о и с х о д и т , и с у с п е н з и я о с т а е т с я г о м о г е н н о й и о к р а ш е н н о й в к р а с н ы й ц в е т .
П р о в е д е н и е т е с т а п р о с т о е и б ы с т р о е с п о л у ч е н и е м р е з у л ь т а т о в в т е ч е н и е 5 м и н у т .
4 Р Е А Г Е Н Т Ы
К о м п о н е н т ы н а б о р а К о л и ч е с т в о
T E S T L A T E X ; п у з ы р е к о б ъ е м о м 1 ,2 м л с 1
с е н с и б и л и з и р о в а н н ы м л а т е к с о м , с н а б ж е н н ы й
д о з и р у ю щ и м у с т р о й с т в о м _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
T E S T C A R D ; о д н о р а з о в о е с т е к л о д л я п р о в е д е н и я р е а к ц и и
5 П Р Е Д О С Т О Р О Ж Н О С Т И
- Реагент предназначен только для применения в диагностике in vitro и должен
использоваться допущенным персоналом.
- Реагент содержит сырые материалы животного происхождения и должен
использоваться с осторожностью.
- Образцы пациентов потенциально инфекционны; их необходимо брать с
осторожностью с соблюдением гигиенических правил и существующих инструкций для
данного типа продукта в стране использования.
- Реагент содержит азид натрия (<0,1 %).
- Не использовать реагент после истечения срока годности.
- Перед применением выставить реагент для достижения комнатной температуры.
- Перед применением осторожно встряхнуть реагент.
“ При нанесении реагента пузырек с дозирующим устройством должен находиться в
полностью вертикальном положении. Проверить отсутствие пузырьков воздуха в каплях
для обеспечения постоянных объемов доставки. Перед применением протереть кончик
дозирующего устройства для получения точно отмеренных капель.
6 С Б О Р О Б Р А З Ц О В
Тест может быть осуществлен;
- либо непосредственно на 24, 48-72 часовой первичной культуре (выращенной на агаре
Сабуро, средах Candichrom albicans, chromagar Candida, Albicans ID...);
- либо после повторного посева на агар Сабуро (24-48 часовая культура).
Замечание: Не рекомендуется выполнять тест на колониях, изолированных с кровяного
или шоколадного агара. Необходимо отметить, что агглютинация может быть слабой
или медленно появляющейся.
7 Х Р А Н Е Н И Е Р Е А Г Е Н Т О В
Реагент готов к применению.
Реагент, хранившийся при 2-8°С в своей исходной упаковке, стабилен до даты истечения
срока годности, указанной на коробке.
Не замораживать.
Не выставлять реагент на сильный свет.
8 Н Е О Б Х О Д И М Ы Е Н Е П О С Т А В Л Я Е М Ы Е Р Е А Г Е Н Т Ы
- Пастеровская пипетка или проволочная петля
43
- Контейнер для сбора грязных отходов
9 МЕТОДИКА
Перед применением выставить реагент для достижения комнатной температуры.
a. Для каждой тестируемой культуры добавить 1 каплю гомогенизированного реагента
TEST LATEX в отдельный круг на стекле.
b. Используя пастеровскую пипетку или проволочную петлю, снять 2-3 колонии.
c. Перенести колонии в каплю реагента TEST LATEX и распределить их для покрытия
всей поверхности круга до получения гомогенной суспензии.
d. Вручную слегка покачать стекло в течение 5 минут. Может появиться красная
агглютинация.
11 ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Прочтение
Положительная реакция; Образование красной агглютинации, видимой невооруженным
глазом.
Негативная реакция; Отсутствие агглютинации. Суспензия остается гомогенной и
красной.
РЕЗУЛЬТАТ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ
ПОЛОЖИТЕЛЬНЫМ Тестируемый штамм относится к виду
Candida krusei.
ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ Тестируемый штамм не является Candida
krusei
12. ПРИЧИНЫ ОШИБОК И ОГРАНИЧЕНИЯ ТЕСТА
- Некоторые штаммы дрожжевых грибов, отличные от С krusei (например, С.
parapsilosis), культуру которых затруднительно диссоциировать, вызывают образование
белых агрегатов, которые не могут быть спутаны с красной агглютинацией. Реакция,
таким образом, отрицательная.
- Во всех случаях необходимо, чтобы клинические, эпидемиологические и
биологические данные полностью брались в рассмотрение перед постановкой
окончательного диагноза.
13 ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕТОДА
ELITex krusei состоит из частиц латекса, сенсибилизированных моноклональными
антителами клона 6ВЗ (разработан фирмой SRB-Avrille-FRANCE). Это моноклональньге
антитела, которые обеспечивают специфичность и чувствительность реакции.
В исследовании, осуществленном на 884 дрожжевых изолятах, сравнили характеристики
теста ELITex krusei с системой Ю 32С (продукция фирмы BIOMERIEUX). Результаты
указывают, что чувствительность составила 98,8% и специфичность 100%.
14 УТИЛИЗАЦИЯ ОТХОДОВ
Отходы должны быть уничтожены в соответствии с правилами гигиены и
существующей в настоящее время инструкцией по данному виду продукта в стране
применения.
Если реагент TEST LATEX проливают или рабочая зона контаминируется колониями,
промыть, используя дезинфицирующий раствор и промокательную бумагу.
44
E L I c h r o m glabrata
Быстрый тест для идентификации Candida glabrata
40 тестов
1 Н А З Н А Ч Е Н И Е
ELIchrom glabrata представляет собой быстрый унитарный тест для ускоренной
идентификации колоний Candida glabrata. Каждый набор позволяет осуществить 40
тестов.
2 . В В Е Д Е Н И Е
Дрожжевые грибы рода Candida могут отвечать за кандидоз кожи, кандидоз слизистых
оболочек и кандидемию или инвазивный кандидоз.
Грибы рода Candida, как правило, представляют собой дрожжевые грибы-комменсглы
слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта и урогенитальной системы. Они
становятся патогенами лишь при благоприятных условиях, возникаюших в организме-
хозяине. К числу факторов, которые благоприятствуют развитию кандидозной
инфекции, относятся внутренние физиологические факторы или патологии (пожилой
возраст, беременность, диабет, иммунодефициты и онкологические заболевания). В
отношении внешних факторов, они являются по преимуществу ятрогенными по природе.
Распространение кандидоза значительно возросло за последние двадцать лет как
следствие возникновения патологий, таких как СПИД, распространения лечения
антибиотиками и применения оральных контрацептивов, разработки терапевтических
иммуносупрессивных агентов, парентерального питания и увеличения числа инвазивных
способов исследований и хирургических мероприятий. Например, кандидемия отвечает
за примерно 10% нозокомиальных инфекций; процент, который может достигать 20%
согласно некоторым исследованиям. Более того, прогноз данного кандидоза
неблагоприятный со смертностью пациентов, колеблющейся между 38 и 50%.
Наиболее часто выделяемым видом является C.albicans. Он составляет 60-80%
клинических изолятов. Тем не менее, все больше сообщается о других видах в качестве
грибковых организмов, таких как С. dubliniemis (вид, очень близкий к С.albicans), С.
glabrata, С tropicalis, С. krusei, С. lusitaniae, С, parapsilosis и С lipolytica.
Исследования показывают, что С. glabrata связана с 5-25% всех случаев инфицирования
дрожжевыми грибами, выделенными в медицинской микологии. Этот вид представляет
собой второй самый часто встречаемый дрожжевой гриб у людей. Его патогенная
природа более не обсуждается, С glabrata ответственна за 10-25% всех кандидемий.
Кроме того, С. glabrata в основном менее чувствительна к азоловым производным,
причем некоторые изоляты от пациентов, леченых флуконазолом или кетоконазолом,
проявляют резистентность практически ко всем азоловым производным.
Выделение и быстрая идентификация С. glabrata, таким образом, важны для выбора
схемы лечения. Традиционно для идентификации С glabrata используют биохимические
тесты. Недостаток ауксанограммы (исследование ассимиляции моносахаридов в
качестве источника углерода и энергии) и зимограммы (исследование использования
моносахаридов в условиях анаэробиоза) заключается в длительном проведении тестов,
от 24 до 48 часов.
С. glabrata может быть идентифицирована быстрее с помощью систем, основанных на
детекции ранее образованных ферментов с использованием хромогенных субстратов,
или альтернативно, основанных на ассимиляции трегалозы. E L I c h r o m glabrata
представляет собой тест быстрой идентификации С glabrata, основанный на детекпии
трегалозы.
45
3 . П Р И Н Ц И П М Е Т О Д А
Среди дрожжей, представляющих медицинский интерес, С. glabrata способна в
некоторых условиях быстро гидролизовать трегалозу в глюкозу. Определение продукции
глюкозы может, поэтому, быть использовано для точной идентификации этого вида. Тем
не менее, помимо трегалозного теста также необходимо провести два контроля;
- контроль мальтозы обязателен, поскольку некоторые изоляты С tropicalis также могут
деградировать трегалозу, но в отличие от С. glabrata они кроме того ассимилируют
мальтозу.
- контроль выполняемый в отсутствие моносахарида (контроль реагентов основной
среды). Это обязательно из-за наличия глюкозы в средах для выделения. Поэтому при
невнимательности во время снятия колоний существует риск того, что образец
контаминируется агаром, что может привести к ложноположительной реакции.
ELIchrom glabrata позволяет осуществлять идентификацию С glabrata в три стадии:
1. Приготовление суспензии дрожжевых грибов в дистиллированной воде.
2. Инкубация суспензии дрожжевых грибов с трегалозой или мальтозой (контроль
дрожжей) или с основной средой (контроль среды для выделения).
3. Детекция наличия глюкозы с помощью ревелятора, который содержит глюкоз-
оксидазу, пероксидазу и хромогенный субстрат.
Компоненты теста
Культуральная среда
Колонии С glabrata
Трегалоза
Г люкоза
Окисленный хромоген (оранжево-коричневый)
4 . Р Е А Г Е Н Т Ы
К о м п о н е н т ы н а б о р а К о л и ч е с т в о
T E S T C A R D : Плащка для проведения теста, содержащие 10
12 лунок, 4 из которых предназначены для идентификации
- Т-лунки содержат основную среду и трегалозу
-М-лунки содержат основную среду и мальтозу
-В-лунки содержат основную среду
R E A G ; пузырек с лиофилизированным реагентом 3
(восстанавливаемым с помощью 1,3 мл стерильной
дистиллированной воды)
5 М Е Р Ы П Р Е Д О С Т О Р О Ж Н О С Т И
- Реагенты предназначены только для диагностического применения in vitro и должны
использоваться допущенным персоналом.
- Обеспечить, чтобы дегидратированные среды не изменялись каким-либо образом
(наличие синей окраски во всех лунках).
- Образцы пациентов потенциально инфекционны; их необходимо брать с
осторожностью с соблюдением гигиенических правил и существующих инструкций для
данного типа продукта в стране использования.
- Не использовать реагенты после истечения срока годности.
- Не использовать реагенты из партий с разными номерами.
- Перед применением выставить реагенты для достижения комнатной температуры.
TEST CARD: Т; токсична
Содержит хлорамфеникол.
- R45: Может вызывать рак.
46
- S45; В случае инцидента или если вы себя плохо чувствуете, немедленно обратитесь за
медицинской помощью (по возможности покажите этикетку).
- S53 ; Избегать экспозиции - перед применением получите особые инструкции.
REAG; Т: токсичен.
Содержит глюкоз-оксидазу и 3,3-диметоксибензидина дигидрохлорид.
- R22; Опасен при проглатывании.
“ R42; При ингаляции может вызывать сенсибилизацию.
- R45; Может вызывать рак,
- S22; Не вдыхать пыль.
- S45; В случае инцидента или если вы себя плохо чувствуете, немедленно обратитесь за
медицинской помощью (по возможности покажите этикетку).
- S53; Избегать экспозиции - перед применением получите особые инструкции.
6 С Б О Р О Б Р А З Ц О В
Тест ШЛоЫот glabrata может быть осуществлен на дрожжевых грибах, изолированных
с 24-96 часовой культуры, выращенной при +37°С или +22°С (на средах Сабуро или
хромогенных средах Candida).
7 Х Р А Н Е Н И Е Р Е А Г Е Н Т О В
Хранить TEST CARD, а также реагент REAG (лиофилизованный или восстановленный)
при 2-8""С и вдали от света.
После восстановления реагент REAG стабилен в течение 2 месяцев при 2-8°С.
Срок годности восстановленного реагента REAG может быть продлен до 6 месяцев
путем замораживания (-20°С) аликвот по 75 мкл (в микропробирках с плотно закрытыми
заглушками) сразу после восстановления. Размороженный реагент REAG не может быть
повторно заморожен.
8 . Н Е О Б Х О Д И М Ы Е Н Е Н О С Т А В Л Я Е М Ы Е М А Т Е Р И А Л Ы
- Автоматическая(ие) пипетка(и) с пипетируемым объмом, адаптированным к объему,
который необходимо измерить.
- Пробирки для гемолиза
- стерильная дистиллированная вода
- Контейнеры для сбора грязных отходов
- Пастеровская пипетка или проволочная петля
9 М Е Т О Д И К А
Перед применением выставить реагент для достижения комнатной температуры.
1 Восстановление реагента REAG;
- Осторожно открыть реагент REAG (пузырек под отрицательным давлением).
- В пузырек добавить 1,3 мл стерильной дистиллированной воды и осторожно
перемешать.
2 Выполнение теста:
- Вынуть требуемое количество пластинок TEST CARD в соответствии с числом
тестируемых образцов дрожжевых грибов (В случае единственного дрожжевого гриба
вырезать пластинку так, чтобы присутствовали лунки Т, М и В).
- Пометить пробирку для гемолиза и добавить в нее 100 мкл стерильной
дистиллированной воды.
- Для предотвращения контаминации при сборе идентифицируемых в тесте колоний
дрожжевых грибов быть предельно внимательными. Гомогенизировать колонии в 100
мкл дистиллированной воды так, чтобы плотность суспензии была равна точке 5 в
47
диапазоне Me Farland (3-4 колонии при выращивании культуры на среде Сабуро и 3-8
колоний в зависимости от размера колоний при выращивании культуры на хромогенной
среде).
- Микропипеткой добавить 25 мкл полученной дрожжевой суспензии в каждое синее
пятно в лунках Т, М и В.
- Оставить тест инкубироваться в течение 10 минут при комнатной температуре
(увеличение времени инкубации свыше 10 минут не будет влиять каким-либо образом на
окончательный результат).
- Микропипеткой добавить 25 мкл реагента REAG в каждую из лунок Т, М и В.
- Инкубировать тест в течение 5-10 минут при комнатной температуре.
- Считать результаты теста.
ВАЖНО: если считывание результатов теста откладывается, реакцию можно остановить,
добавив в каждую лунку 25 мкл H2SO4 (ЗМ). При положительной реакции окрашивание
становится коричневым/серым и затем розовым, а в случае отрицательной реакции цвет
немного синеватый.
10 ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Прочтение
Положительная реакция; Появление более или менее темно-оранжевого цвета
РЕЗУЛЬТАТЫ ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Лунка Т Лунка М Лунка В
(Трегалоза) (Мальтоза) (Основная
среда)
Положительно Отрицательно Отрицательно С. glabrata
Отрицательно Отрицательно Отрицательно Дрожжевой гриб, отличный от С
glabrata. Продолжить идентификацию.
Положительно Положительно Отрицательно Дрожжевой гриб, отличный от С
glabrata. Продолжить идентификацию.
Отрицательно Положительно Отрицательно Дрожжевой гриб, отличный от С
glabrata. Продолжить идентификацию.
Положительно Положительно Положительно Невозможно интерпретировать.
Повторить тесты, осторожно снимая
дрожжевой гриб, не смещая агар.
12. ПРИЧИНЫ ПОГРЕШНОСТЕЙ И ОГРАНИЧЕНИЯ ТЕСТА
Не снимать агар вместе с колониями, поскольку это может привести к
неинтерпретируемым результатам.
Во всех случаях необходимо, чтобы клинические, эпидемиологические и биологичес1чие
данные полностью брались в рассмотрение перед постановкой окончательного диагноза.
13 ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕТОДА
Результаты оценки ELIchrom glabrata показывают в зависимости от используемой среды
для выделения чувствительность от 93,8 до 97,9% (97,9% для Candida ID, CandiSelect и
среды Сабуро и 93,8% для среды CHROMagar Candida) и специфичность от 97,6 до 98,8%
(98,8% для сред Сабуро и CHROMagar Candida, 98% для среды Candida ID и 97,6% для
среды CandiSelect),
48
1 5 У Т И Л И З А Ц И Я О Т Х О Д О В
Отходы должны быть уничтожены в соответствии с правилами гигиены и
существующей в настоящее время инструкцией по данному виду продукта в стране
применения.
Если реагент проливают или рабочая зона контаминируется дрожжевыми грибами,
очистить, используя дезинфицирующий раствор и промокательную бумагу.
49
ELLH.A Candida
Серодиагностика кандидоза посредством непрямой гемагглютинации
120 тестов
1. НАЗНАЧЕНИЕ
ELI.H. А Candida дает возможность количественного определения сывороточных антител
против Candida albicans с помощью непрямой гемагглютинации.
Каждый набор позволяет осуществить 120 тестов или 20 реакций из 6 разведений.
2. ВВЕДЕНИЕ
Кандидоз представляет собой оппортунистическую инфекцию, вызванную
дрожжеподобными грибами рода Candida. Candida albicans является самым часто
выделяемым грибом, а также самым патогенным.
Иммунологическая диагностика путем определения антител крайне важна при
предполагаемых инвазивных, висцеральных или септицемических инфекциях,
вызванных Candida, когда гриб не может быть выделен непосредственно из
клинического образца.
3 ПРИНЦИП МЕТОДА
ЕЫ.Н.А Candida основан на принципе непрямой гемагглютинации.
Сенсибилизированные красные кровяные клетки состоят из красных кровяных клеток
овцы, покрьп-ых антигеном Candida albicans.
Наличие сывороточных антител против Candida albicans приводит к агглютинации
сенсибилизированных красных кровяных клеток, приводящей к мутному
красному/коричневому преципитату, покрывающему лунку. В отсутствие
специфических антител красные кровяные клетки образуют кольцеобразный осадок на
дне лунки.
Несенсибилизированные красные кровяные клетки обеспечивают специфичность
реакции, создавая возможность для устранения какого-либо влияния природных
антиовечьих агглютининов (гетероантител Форссмана, антител против инфекционного
мононуклеоза...).
Реакцию проводят в микропланщете с U-образными лунками.
Выполнение простое и быстрое с получением результатов за 2 часа.
4. РЕАГЕНТЫ
К о м п о н е н т ы н а б о р а К о л и ч е с т в о
R1: пузырек объемом 2,4 мл с сенсибилизированными 1
красными кровяными клетками
R2: пузырек объемом 1 мл с несенсибилизированными 1
красными кровяными клетками
B U F ; пузырек объемом 55 мл с фосфатным буфером, pH 1
7,2
R3: пузырек объемом 2 мл с адсорбентом 1
CONTROL+: пузырек объемом 0,2 мл с положительным 1
контролем определенного титра
CONTROL пузырек объемом 0,2 мл с отрицательным 1
контролем
MICROPLATE; микропланшет с U-образным дном лунок 1
50
DROPPER специальная пипетка
5 М Е Р Ы П Р Е Д О С Т О Р О Ж Н О С Т И
- Реагенты предназначены только для применения in vitro и должны использоваться
допущенным персоналом.
- Все реагенты за исключением реагента BUF содержат сырые материалы животного
происхождения и должны использоваться с осторожностью.
- Образцы пациентов потенциально инфекционны. Их необходимо брать с
осторожностью с соблюдением гигиенических правил и существующих инструкций для
данного типа продукта в стране использования.
- Реагенты CONTROL содержат азид натрия (<0,1 %)•
- Не использовать реагенты после истечения срока годности.
- Не использовать реагенты из партий с различными номерами.
- Перед применением выставить сыворотку и реагенты для достижения комнатной
температуры.
- Перед применением осторожно встряхнуть реагенты R1 и R2.
- При нанесении реагентов R1 и R2 пипетка должна находиться в полностью
вертикальном положении. Проверить отсутствие пузырьков воздуха в каплях для
обеспечения постоянных объемов доставки.
6 С Б О Р О Б Р А З Ц О В
Использовать свежую сыворотку или сыворотку, хранившуюся при -20°С, с отсутствием
каких-либо признаков гемолиза, помутнения или контаминации.
Избегать повторного замораживания и оттаивания.
Не декомплементировать сыворотку.
7 Х Р А Н Е Н И Е Р Е А Г Е Н Т О В
Реагенты готовы к применению.
Все реагенты, хранившиеся при 2-8°С в своей исходной упаковке, стабильны до даты
истечения срока годности, указанного на коробке. Не замораживать.
8 Н Е О Б Х О Д И М Ы Е Н Е П О С Т А В Л Я Е М Ы Е Р Е А Г Е Н Т Ы
- Автоматическая(ие) пипетка(и) с пипетируемым объемом, адаптированным к
измеряемому объему;
- Контейнеры для сбора грязных отходов;
- Центрифуга;
- Пробирки для гемолиза.
9 . М Е Т О Д И К А
Перед применением оставить реагенты для достижения комнатной температуры.
9 .1 . П р и г о т о в л е н и е о б р а з ц а
Выполнить разведение тестируемой сыворотки 1 АО:
- 50 мкл сыворотки;
- 1,95 мл реагента BUF.
9 .2 , О с у щ е с т в л е н и е т е с т а в м и к р о п л а н ш е т е
- Используя многоканальную микропипетку, добавить 50 мкл реагента BUF в 8 лунок
микропланшета.
- Используя микропипетку, в 1 лунку добавить 50 мкл разведенной сыворотки.
51
Смешать сыворотку с реагентом BUF и выполнить серийное разведение,
предпочтительно используя микроразбавитель, перенося 50 мкл из 1 лунки во 2, затем 50
мкл из 2 в 3 и так далее до 6 лунки. После чего удаляют 50 мкл из 6 лунки.
Таким образом, получают разведения от 1 ;80 до 1:2560.
- В 7 лунку добавить 50 мкл разведенной сыворотки.
Смешать сыворотку с реагентом BUF и затем удалить 50 мкл.
Это разведение (1:80) представляет собой контроль сыворотки, предназначенный для
определения природных антиовечьих агглютининов, которые могут присутствовать в
некоторых образцах сыворотки.
- Осторожно встряхнуть реагенты R1 и R2.
- В первые 6 лунок добавить 1 каплю реагента R1.
- В 7 лунку (контроль сыворотки) добавить 1 каплю реагента R2.
-В 8 лунку (контроль реагента) добавить 1 каплю реагента R1, эта лунка предназначена
для контроля за верностью реагента BUF и R1.
Замечание: Для каждой серии тестов выполнять только один контроль реагента.
- Очень осторожно встряхнуть содержимое лунок;
-либо вручную, покачивая микропланшет из стороны в сторону, чтобы плоское дно было
расположено на столе;
-либо используя шейкер с вибрирующей платформой для планшетов для
микротитрования (например, при 1300 об/мин в течение 10 секунд). Не использовать
орбитальный шейкер.
- После чего оставить плашку вдали от любых источников вибрации.
- Через 2 часа плашку можно считывать.
9 .3 . А д с о р б ц и я п р и р о д н ы х а н т и о в е ч ь и х а г г л ю т и н и н о в в с л у ч а е а г г л ю т и н а ц и и
к о н т р о л я с ы в о р о т к и
- Осторожно встряхнуть реагент R3.
- В пробирке добавить и перемешать:
-0,1 мл сыворотки;
-0,3 мл реагента R3.
- Инкубировать при комнатной температуре в течение 60 минут.
- центрифугировать при 2000 об/мин в течение 15 минут.
- Собрать супернатант; сыворотка находится теперь в разведении 1 ;4.
- Выполнить разведение супернатанта в реагенте BUF 1:10 для получения
адсорбированного исходного разведения (1:40).
-Выполнить стадии, описанные в «Осуществлении теста в микропланшете», но заменить
исходное разведение на адсорбированное исходное разведение.
1 1 . И Н Т Е Р П Р Е Т А Ц И Я Р Е З У Л Ь Т А Т О В
П р о ч т е н и е
Негативная реакция: Отсутствие гемагглютинации. Наличие более или менее большого
кольца на дне лунки.
Положительная реакция: Наличие гемагглютинации, Наличие мутного
красного/коричневого преципитата, покрывающего лунку, иногда присутствие четкого
валика по периферии.
Пример: Сыворотка, положительная в разведении 1:1280.
Титр <1:160: Не достоверная реакция прогрессирующей инфекции. Повторить тест
через 2-3 недели, а также провести тест электросинереза или иммуноэлектрофореза.
Титр ==1:160: Сомнительная реакция. Вероятность
прогрессирующего кандидоза. Результаты должны интерпретироваться, принимая во
52
внимание полную клиническую картину. Повторить тест через 2-3 недели, а также
провести тест электросинереза или иммуноэлектрофореза.
Титр > 1:320: Достоверная реакция в пользу
прогрессирующего кандидоза.
12. ВНУТРЕННИЙ КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Реагенты CONTROL+ и CONTROL- должны быть обработаны аналогично
тестируемым сывороткам. Титр реагента CONTROL+ должен быть таким же, как титр,
напечатанный на этикетке ± одно разведение. Не должно быть никакой гемагглютинации
реагента CONTROL-. При наличии гемагглютинации тест неверен.
13 ПРИЧИНЫ ПОГРЕШНОСТЕЙ И ОГРАНИЧЕНИЯ ТЕСТА
- Неудовлетворительное хранение сыворотки.
- Неудовлетворительное хранение реагентов после вскрытия.
-Применять лишь пипетки, поставляемые в наборе.
- Не менять пипетки между реагентами R1 и R2.
- В случае положительной реакции в первых 6 лунках выполнить дополнительное
серийное разведение для определения предела титра гемагглютинации.
-Контроль сыворотки должен давать отрицательную реакцию (кольцо). В случае
гемагглютинации этого контроля необходимо повторить тест после устранения из
сыворотки природных антиовечьих агглютининов с помощью адсорбции.
- Контроль реагента должен давать отрицательную реакцию (кольцо). В случае
гемагглютинации этого контроля ELI.H. А Candida не может бьп'ь использован.
-Некоторые сыворотки, концентрация антител в которых очень высока, могут давать
феномен зоны (с исчезновением помутнения) в исходных разведениях, который
пропадает в последующих разведениях.
- Качество реагентов позволяет осуществлять реакцию вечером и считывать тест на
следующее утро при условии, что микроплашка не сдвигается каким-либо образом и
защищена от любых источников вибрации.
- Во всех случаях необходимо, чтобы клинические, эпидемиологические и
биологические данные полностью брались в рассмотрение перед постановкой
окончательного диагноза.
14. ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕТОДА
ELI.H.A Candida состоит из красных кровяных клеток, сенсибилизированных антигеном
Candida albicans, который обеспечивает специфичность и чувствительность реакции.
Оценка показала, что тест обладает чувствительностью 85,4% и специфичностью 97,9%.
15 УТИЛИЗАЦИЯ ОТХОДОВ
Отходы должны быть уничтожены в соответствии с правилами гигиены и
существующей в настоящее время инструкцией по данному виду продукта в стране
применения.
В случае пролития реагента BUF очистить рабочую поверхность промокательной
бумагой и промыть водой. При пролитии на рабочую зону сыворотки или другого
реагента очистить, используя дезинфицирующий раствор и промокательную бумагу.
53
E L I .H .A Aspergillus
Серодиагностика аспергиллеза посредством непрямой гемагглютинации
102 теста
1 Н А З Н А Ч Е Н И Е
ELI.H.A Aspergillus дает возможность количественного определения сывороточных
антител против Aspergillus fumigatus с помощью непрямой гемагглютинации.
Каждый набор позволяет осуществить 102 теста или 17 реакций из 6 разведений.
2 . В В Е Д Е Н И Е
Aspergillus fumigatus является самым часто встречающимся видом в патологии человека.
А. fumigatus обладает особенной способностью к паразитической адаптации в человеке.
Тем не менее, для его развития необходимы некоторые благоприятные условия;
- местные условия (ранее образованные полости, удаленные легочные абсцессы,
поврежденные слизистые оболочки...);
- общие условия (иммуносупрессия после обширного хирургического вмешательства или
медицинских процедур; трансплантации органа, иммуносупрессивной терапии,
стероидных средств, антибиотиков...).
3 П Р И Н Ц И П М Е Т О Д А
ELI.H.A Aspergillus основан на принципе непрямой гемагглютинации.
Сенсибилизированные красные кровяные клетки состоят из красных кровяных клеток
овцы, покрытых антигеном Aspergillus fumigatus.
Наличие специфических сывороточных антител приводит к агглютинации
сенсибилизированных красных кровяных клеток, приводящей к мутному
красному/коричневому преципитату, покрывающему лунку. В отсутствие
специфических антител красные кровяные клетки образуют кольцеобразный осадок на
дне лунки.
Несенсибилизированные красные кровяные клетки обеспечивают специфичность
реакции, давая возможность устранения какого-либо влияния природных антиовечьих
агглютининов (гетероантител Форссмана, антител против инфекционного
мононуклеоза...).
Реакцию проводят в микропланшете с U-образными лунками.
Выполнение простое и быстрое с получением результатов за 2 часа.
4 Р Е А Г Е Н Т Ы
К о м п о н е н т ы н а б о р а К о л и ч е с т в о
R 1 ; пузырек объемом 2,2 мл с сенсибилизированными 1
красными кровяными клетками
R 2 : пузырек объемом 1 мл с несенсибилизированными 1
красными кровяными клетками
B U F : пузырек объемом 55 мл с фосфатным буфером, pH 1
7,2
R 3 : пузырек объемом 2 мл с адсорбентом 1
C O N T R O L + ; пузырек объемом 0,2 мл с положительным 1
контролем определенного титра
C O N T R O L пузырек объемом 0,2 мл с отрицательным 1
контролем
M I C R O P L A T E ; микропланшет с U-образным дном лунок 2
54
DROPPER специальная пипетка
5 . М Е Р Ы П Р Е Д О С Т О Р О Ж Н О С Т И
- Реагенты предназначены только для применения in vitro и должны использоваться
допущенным персоналом.
- Все реагенты за исключением реагента BUF содержат сырые материалы животного
происхождения и должны использоваться с осторожностью.
- Образцы пациентов потенциально инфекционны. Их необходимо брать с
осторожностью с соблюдением гигиенических правил и существующих инструкций для
данного типа продукта в стране использования.
- Реагенты CONTROL содержат азид натрия (<0Д%).
- Не использовать реагенты после истечения срока годности.
- Не использовать реагенты из партий с различными номерами.
- Выставить сыворотку и реагенты для достижения комнатной температуры.
- Перед применением осторожно встряхнуть реагенты R1 и R2,
- При нанесении реагентов R1 и R2 пипетка должна находиться в полностью
вертикальном положении. Проверить отсутствие пузырьков воздуха в каплях для
обеспечения постоянных объемов доставки.
6 . С Б О Р О Б Р А З Ц О В
Использовать свежую сыворотку или сыворотку, хранившуюся при -20°С, с отсутствием
каких-либо признаков гемолиза, помутнения или контаминации.
Избегать повторного замораживания и оттаивания.
Не декомплементировать сыворотку.
7 Х Р А Н Е Н И Е Р Е А Г Е Н Т О В
Реагенты готовы к применению.
Все реагенты, хранивщиеся при 2-8°С, стабильны до даты истечения срока годности,
указанного на коробке. Не замораживать их.
8 Н Е О Б Х О Д И М Ы Е Н Е П О С Т А В Л Я Е М Ы Е Р Е А Г Е Н Т Ы
- Автоматическая(ие) пипетка(и) с пипетируемым объемом, адаптированным к
измеряемому объему,
- Контейнеры для сбора грязных отходов.
- Центрифуга.
- Пробирки для гемолиза.
9 М Е Т О Д И К А
Перед применением выставить реагенты для достижения комнатной температуры.
9 .1 . П р и г о т о в л е н и е о б р а з ц а
Выполнить разведение тестируемой сыворотки 1:40:
- 50 мкл сыворотки;
- 1,95 мл реагента BUF.
9 .2 . О с у щ е с т в л е н и е т е с т а в м и к р о п л а н ш е т е
- Используя многоканальную микропипетку, в 8 лунок микропланшета добавить 50 мкл
реагента BUF.
- Используя микропипетку, в 1 лунку добавить 50 мкл разведенной сыворотки.
Смешать сыворотку с реагентом BUF и выполнить серийное разведение,
предпочтительно используя микроразбавитель, перенося 50 мкл из 1 лунки во 2, затем 50
мкл из 2 в 3 и так далее до 6 лунки. После чего удаляют 50 мкл из 6 лунки.
55
Таким образом, получают разведения от 1:80 до 1 ;2560.
- В 7 лунку добавить 50 мкл разведенной сыворотки.
Смешать сыворотку с реагентом BUF и затем удалить 50 мкл.
Это разведение (1:80) представляет собой контроль сыворотки, предназначенный для
определения природных антиовечьих агглютининов, которые могут присутствовать в
некоторых образцах сыворотки.
- Осторожно встряхнуть реагенты R1 и R2.
- В первые 6 лунок добавить 1 каплю реагента R1,
- В 7 лунку (контроль сыворотки) добавить 1 каплю реагента R2.
- В 8 лунку (контроль реагента) добавить 1 каплю реагента R1, эта лунка предназначена
для контроля верности реагента BUF и R1.
Замечание: Для каждой серии тестов выполнять только один контроль реагента.
- Очень осторожно встряхнуть содержимое лунок;
-либо вручную, покачивая микропланшет из стороны в сторону, чтобы плоское дно было
расположено на столе;
-либо используя шейкер с вибрирующей платформой для планшетов для
микротитрования (например, при 1300 об/мин в течение 10 секунд). Не использовать
орбитальный шейкер.
- После чего оставить плашку вдали от любых источников вибрации.
- Через 2 часа плашку можно считывать.
9 .3 , Адсорбция п р и р о д н ы х а н т и о в е ч ь и х а г г л ю т и н и н о в в с л у ч а е а г г л ю т и н а ц и и
к о н т р о л я с ы в о р о т к и
- Осторожно встряхнуть реагент R3.
- В пробирке добавить и перемешать:
-0,1 мл сыворотки;
-0,3 мл реагента R3.
- Инкубировать при комнатной температуре в течение 60 минут.
- центрифугировать при 2000 об/мин в течение 15 минут.
- Собрать супернатант; сыворотка находится теперь в разведении 1 ;4.
- выполнить разведение супернатанта в реагенте BUF 1:10 для получения
адсорбированного исходного разведения (1:40).
-Выполнить стадии, описанные в «Осуществлении теста в микропланшете», но заменить
исходное разведение на адсорбированное исходное разведение.
1Ь ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
10. прочтение
Негативная реакция: Отсутствие гемагглютинации. Наличие более или менее большого
кольца на дне лунки.
Положительная реакция: Наличие гемагглютинации. Наличие мутнсго
красного/коричневого преципитата, покрывающего лунку, иногда присутствие четкого
валика по периферии.
Пример: Сыворотка, положительная в разведении 1:1280.
Титр <1:320: достоверная реакция. Возможное отсутствие глубокой аспергиллезной
инфекции. Повторить тест через 2-3 недели, а также провести тест электросинереза или
иммуноэлектрофореза.
Титр -1:320: Сомнительная реакция. Повторить тест через 2-3 недели, а также провести
тест электросинереза или иммуноэлектрофореза.
Титр > 1:640: Достоверная реакция в пользу глубокой
аспергиллезной инфекции.
56