Набор реагентов для выявления РНК эболавируса леса Тай (TAIFV), РНК эболавируса Бундибуджио (BDBV) и РНК эболавируса Рестон (RESTV) методом ПЦР АмплиСенс® FiloВ-скрин-FL — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора ВКЛАДЫШ с настройками Набор реагентов АмплиСенс® FiloB-скрин-FL Форма 1: REF H-3631-1-4 LOT 24.06.26 Настройки для приборов роторного типа Rotor-Gene 6000, Rotor-Gene Q More Settings/ Calibrate/Gain Threshold/ Dynamic Tube/ Slope Correct/ Outlier Removal/ Канал Optimisation…/ Порог Динамич.фон Коррект. уклона Устранение Опт.уровня сигн. выбросов FAM/Green от 5 до 10 FL 0,03 включена включена 10% JOE/Yellow от 5 до 10 FL 0,05 включена включена 10% ROX/Orange от 5 до 10 FL 0,03 включена включена 10% Cy5/Red от 5 до 10 FL 0,03 включена включена 10% Примечание – В случае если кривые флуоресценции по каналу(ам) FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange, Cy5/Red не соответствуют экспоненциальному росту (не имеют S-образный вид), допускается увеличение значения порога отрицательных проб (NTC threshold /Порог Фона – ПФ) до 20 %. Настройки для приборов планшетного типа Примечание – Для каждого шага этапа циклирования, нажав кнопку Step Options, задать скорость нагревания/охлаждения Ramp Rate 2,5 °С/sec. Канал Threshold/Порог FAM/HEX/ Установить пороговую линию на уровне 5 % от максимального уровня ROX/ Cy5 флуоресценции образцов К+ в последнем цикле амплификации Примечание – Кривая флуоресценции К+ должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции, переходящего в линейный подъем. «ДТпрайм» Нижняя Критерий Норма- Фитирование Тип Величина граница/Порог Метод Каналы положительного лизация (сглаживание) анализа Threshold положительного результата ПЦР данных данных результата Fam, Сt (Cp) Порого- Hex, Не исполь- для всех 60 % 10 StD 5 % Отключить вый Ct Rox, зовать каналов Cy5 См. продолжение на обороте Граничные значения порогового цикла Ct для приборов роторного типа Канал для флуорофора Образец FAM/Green JOE/Yellow ROX/Orange Cy5/Red К+ 21 21 21 21 K– отсутствуют отсутствуют отсутствуют отсутствуют ОК отсутствуют отсутствуют отсутствуют 25 ПКО 27 25 25 25 Исследуемые 32 32 32 28 образцы Граничные значения порогового цикла Ct для приборов планшетного типа Канал для флуорофора Образец FAM JOE ROX Cy5 К+ 23 23 23 23 K– отсутствуют отсутствуют отсутствуют отсутствуют ОК отсутствуют отсутствуют отсутствуют 28 ПКО 30 28 28 28 Исследуемые 33 33 33 29 образцы ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора ВКЛАДЫШ с настройками Набор реагентов АмплиСенс® FiloB-скрин-FL Форма 1: REF H-3631-1-4 LOT 25.06.26 Настройки для приборов роторного типа Rotor-Gene 6000, Rotor-Gene Q More Settings/ Calibrate/Gain Threshold/ Dynamic Tube/ Slope Correct/ Outlier Removal/ Канал Optimisation…/ Порог Динамич.фон Коррект. уклона Устранение Опт.уровня сигн. выбросов FAM/Green от 5 до 10 FL 0,03 включена включена 10% JOE/Yellow от 5 до 10 FL 0,05 включена включена 10% ROX/Orange от 5 до 10 FL 0,03 включена включена 10% Cy5/Red от 5 до 10 FL 0,03 включена включена 10% Примечание – В случае если кривые флуоресценции по каналу(ам) FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange, Cy5/Red не соответствуют экспоненциальному росту (не имеют S-образный вид), допускается увеличение значения порога отрицательных проб (NTC threshold /Порог Фона – ПФ) до 20 %. Настройки для приборов планшетного типа Примечание – Для каждого шага этапа циклирования, нажав кнопку Step Options, задать скорость нагревания/охлаждения Ramp Rate 2,5 °С/sec. Канал Threshold/Порог FAM/HEX/ Установить пороговую линию на уровне 5 % от максимального уровня ROX/ Cy5 флуоресценции образцов К+ в последнем цикле амплификации Примечание – Кривая флуоресценции К+ должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции, переходящего в линейный подъем. «ДТпрайм» Нижняя Критерий Норма- Фитирование Тип Величина граница/Порог Метод Каналы положительного лизация (сглаживание) анализа Threshold положительного результата ПЦР данных данных результата Fam, Сt (Cp) Порого- Hex, Не исполь- для всех 60 % 10 StD 5 % Отключить вый Ct Rox, зовать каналов Cy5 См. продолжение на обороте Граничные значения порогового цикла Ct для приборов роторного типа Канал для флуорофора Образец FAM/Green JOE/Yellow ROX/Orange Cy5/Red К+ 21 21 21 21 K– отсутствуют отсутствуют отсутствуют отсутствуют ОК отсутствуют отсутствуют отсутствуют 25 ПКО 27 25 25 25 Исследуемые 32 32 32 28 образцы Граничные значения порогового цикла Ct для приборов планшетного типа Канал для флуорофора Образец FAM JOE ROX Cy5 К+ 23 23 23 23 K– отсутствуют отсутствуют отсутствуют отсутствуют ОК отсутствуют отсутствуют отсутствуют 28 ПКО 30 28 28 28 Исследуемые 33 33 33 29 образцы УТВЕРЖДАЮ» Директор Федерального бюджетного учреждения науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ____________________ В.Г. Акимкин «____»__________________ 20___г. ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ Набор реагентов для выявления РНК участка гена VP40 эболавируса леса Тай (TAIFV), РНК участка гена NP эболавируса Бундибуджио (BDBV) и РНК участка гена L эболавируса Рестон (RESTV) методом ПЦР АмплиСенс FiloВ-скрин-FL АмплиСенс ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Российская Федерация, 111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, д. 3А г. Москва, ул. Новогиреевская, д. 3А, стр. 6 тел. (495) 974 9642, е-mail: amplisens@pcr.ru | ОГЛАВЛЕНИЕ | | | | СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ........ | ......................................................................................... | . 3 | | НАЗНАЧЕНИЕ ......................... | ......................................................................................... | . 3 | | ПОКАЗАНИЯ И ПРОТИВОПО | КАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ... | . 4 | | ПРИНЦИП МЕТОДА ................ | ......................................................................................... | . 4 | | ФОРМЫ КОМПЛЕКТАЦИИ ..... | ......................................................................................... | . 5 | | АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕР | ИСТИКИ ......................................................................... | . 5 | | ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТ | ЕРИСТИКИ .................................................................... | . 8 | | МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТ | И ...................................................................................... | . 9 | | СВЕДЕНИЯ ОБ УТИЛИЗАЦИИ | ...................................................................................... | 11 | | ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИ | АЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ............................................ | 11 | | ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВА | НИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА . | 13 | | ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМО | ГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАКЦИИ РНК ....................... | 15 | | ИНТЕРФЕРИРУЮЩИЕ ВЕЩЕ | СТВА И ОГРАНИЧЕНИЯ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ПР | ОБ | | ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛ | А ..................................................................................... | 17 | | ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕД | ОВАНИЯ ......................................................................... | 19 | | ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕ | ДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ .................................................. | 19 | | ФОРМА 1: «ПЦР-комплект» ва | риант FRT-L-t ................................................................ | 20 | | СОСТАВ .............................. | ........................................................................................ | 20 | | ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦ | ИЯ И АМПЛИФИКАЦИЯ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ | | | «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» | ........................................................................................ | 20 | | А. Подготовка проб для | проведения ОТ-ПЦР ..................................................... | 20 | | Б. Проведение ОТ-ПЦР | с детекцией в режиме «реального времени» ............. | 21 | | В. Анализ и интерпрета | ция результатов ............................................................. | 22 | | СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ | ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ .................... | 26 | | ГАРАНТИЙНЫЕ ОБЯЗАТЕЛЬ | СТВА ИЗГОТОВИТЕЛЯ ................................................. | 27 | | СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ | В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ ....................................... | 28 | Б VER 04.08.26 / стр. 2 из 28 | АмплиСенс FiloВ- скрин-FL | - Набор реагентов для выявления РНК участка гена VP40 эболавируса леса Тай (TAIFV), РНК участка гена NP эболавируса Бундибуджио (BDBV) и РНК участка гена L эболавируса Рестон (RESTV) методом ПЦР АмплиСенс FiloВ- скрин-FL | | ВКО-FL | - экзогенный внутренний контрольный образец | | ДНК | - дезоксирибонуклеиновая кислота | | кДНК | - комплементарная ДНК, получаемая в реакции обратной транскрипции на матрице РНК | | К+ | - положительный контроль ОТ-ПЦР | | К– | - отрицательный контроль ОТ-ПЦР | | ОК | - отрицательный контроль экстракции | | ОКО | - отрицательный контрольный образец | | ОТ-ПЦР | - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией | | ПК | - положительный контроль экстракции | | ПКО | - положительный контрольный образец | | ПЦР | - полимеразная цепная реакция | | РНК | - рибонуклеиновая кислота | | РУ | - регистрационное удостоверение | | ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора | - Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | | BDBV | - эболавирус Бундибуджио | | FRT | - флуоресцентная детекция в режиме «реального времени» | | RESTV | - эболавирус Рестон | | TAIFV | - эболавирус леса Тай | СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения: НАЗНАЧЕНИЕ Набор реагентов АмплиСенс FiloВ-скрин-FL предназначен для качественного определения РНК участка гена VP40 эболавируса леса Тай (TAIFV), РНК участка гена NP эболавируса Бундибуджио (BDBV) и РНК участка гена L эболавируса Рестон (RESTV), принадлежащих к семейству Filoviridae, в биологическом материале, полученном от человека (цельная венозная кровь, плазма) методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации. В случае невозможности исследования крови от пациентов в исследовании могут быть использованы мазки со слизистой оболочки ротоглотки. Материалом для проведения ОТ-ПЦР служат пробы РНК, экстрагированные из исследуемого материала. VER 04.08.26 / стр. 3 из 28 Ограничения по применению медицинского изделия в различных популяционных и демографических группах отсутствуют. Набор реагентов используется в клинической лабораторной диагностике для исследования биологического материала, полученного от лиц с подозрением на лихорадку Эбола, вне зависимости от формы и наличия манифестации заболевания. Набор реагентов может применяться для исследования смывов с поверхностей объектов окружающей среды при проведении профилактических мероприятий с целью предотвращения заболевания человека. Потенциальные пользователи медицинского изделия: к работе с набором реагентов допускаются только медицинские работники, обученные методам молекулярной диагностики и правилам работы в клинико-диагностической лаборатории в установленном порядке. ПОКАЗАНИЯ И ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ Набор реагентов используется в клинической лабораторной диагностике для исследования биологического материала, полученного от лиц с подозрением на лихорадку Эбола, вне зависимости от формы и наличия манифестации заболевания. Противопоказания отсутствуют, за исключением случаев, когда взятие материала не может быть осуществлено по медицинским показаниям. ПРИНЦИП МЕТОДА Принцип тестирования основывается на экстракции РНК из образцов исследуемого материала совместно с экзогенным внутренним контрольным образцом (ВКО-FL) и одновременном проведении реакции обратной транскрипции РНК и амплификации участков кДНК выявляемых вирусов и кДНК ВКО-FL с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. ВКО-FL позволяет контролировать все этапы ПЦР-исследования для каждого образца и оценивать влияние ингибиторов на результаты ПЦР-исследования. С полученными на этапе экстракции пробами РНК проводится обратная транскрипция РНК с помощью фермента TM-Ревертазы и амплификация участков кДНК при помощи VER 04.08.26 / стр. 4 из 28 специфичных к этим участкам праймеров и фермента Taq- полимеразы. В составе реакционной смеси присутствуют флуоресцентно-меченые олигонуклеотиды, которые гибридизуются с комплементарным участком амплифицируемой кДНК-мишени, в результате чего происходит нарастание интенсивности флуоресценции. Это позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала. Детекция флуоресцентного сигнала осуществляется непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени». На этапе ОТ-ПЦР одновременно в одной пробирке проводится 4 реакции – амплификация кДНК TAIFV, кДНК BDBV, кДНК RESTV, а также амплификация последовательности кДНК ВКО-FL. Результаты амплификации регистрируются по четырем различным каналам флуоресцентной детекции, указанным в табл. 1: Таблица 1 Канал для FAM JOE ROX Cy5 флуорофора кДНК-мишень кДНК TAIFV кДНК BDBV кДНК RESTV кДНК ВКО-FL искусственная Область Ген VP40 Ген NP Ген L нуклеотидная амплификации последовательность ФОРМЫ КОМПЛЕКТАЦИИ Форма 1: «ПЦР-комплект» вариант FRT-L-t Форма 1 рассчитана на 96 реакций обратной транскрипции и амплификации, включая контроли, и используется для проведения обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК c гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» и позволяет выявлять РНК в качественном формате. Для проведения полного ПЦР- исследования необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции РНК, рекомендованные Изготовителем. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Определение аналитических характеристик медицинского изделия проведено в лабораторных условиях с применением VER 04.08.26 / стр. 5 из 28 образцов, полученных генно-инженерным способом, содержащих диагностически значимую мишень патогена. Применение указанных образцов обусловлено отсутствием целевого патогена в доступных государственных, национальных, исследовательских и иных коллекциях патогенных микроорганизмов и невозможностью применения музейного тест-штамма. Результаты испытаний подтверждают способность набора реагентов выявлять заявленную диагностическую мишень в условиях примененной модели испытаний. Для данного набора реагентов применимы следующие характеристики: Аналитическая чувствительность (предел обнаружения) Таблица 2 Объем Комплект для Аналитическая Вид исследуемого обратной чувствительность Комплект для исследуемого образца для транскрипции, (предел экстракции РНК материала экстракции, амплификации обнаружения), мкл и детекции копий/мл Цельная венозная кровь, плазма, мазки со слизистой оболочки «ПЦР-комплект» 100 «РИБО-преп» 5000 ротоглотки, вариант FRT-L-t смывы с поверхностей объектов окружающей среды Данный предел обнаружения достигается при соблюдении правил, указанных в разделах «Взятие, транспортирование и хранение исследуемого материала» и «Подготовка исследуемого материала к экстракции РНК». Аналитическая специфичность Набор реагентов обнаруживает участки РНК эболавируса леса Тай (TAIFV), эболавируса Бундибуджио (BDBV) и эболавируса Рестон (RESTV). Аналитическая специфичность набора реагентов доказана при исследовании ДНК/РНК следующих микроорганизмов, а также геномной ДНК человека: VER 04.08.26 / стр. 6 из 28 рекомбинантный бактериофаг, содержащий фрагмент РНК, соответствующий участку генома BDBV. Консервативность выбранного участка генома показана in silico для генетических линий Butalya (KR063673.1), Isiro (MT680254.1) и 2026 (OZ492176.1); рекомбинантный бактериофаг, содержащий фрагмент РНК, соответствующий участку генома RESTV. Консервативность выбранного участка генома показана in silico для генетических линий I (NC_004161), II (KY798007), III (FJ621583), IV (JX477166), V (FJ621584); рекомбинантный бактериофаг, содержащий фрагмент РНК TAIFV. Консервативность выбранного участка генома показана in silico (NC_014372.1, MH121167.1, KU182910.1). Буньявирусы (сем. Bunyaviridae): CCHFV; Флавивирусы (сем. Flaviviridae): Yellow fever virus, WNV, TBE, HCV, Zika virus; Тогавирусы (сем. Togaviridae): Sindbis virus, Chikungunya virus; Реовирусы (сем. Reoviridae): Rotavirus; Пикорнавирусы (сем. Picornaviridae): Coxsackie virus A, B, HAV; Ретровирусы (сем. Retrovoridae): HIV; Рабдовирусы (сем. Rhabdoviridae): Rabies virus; Герпесвирусы (сем. Herpesviridae): CMV; Парвовирусы (сем. Parvoviridae): Human parvovirus B19; Гепаднавирусы (сем. Hepadnaviridae): HBV; Хантавирусы (сем. Hantaviridae): DOBV, PUUV; Коронавирусы (сем. Coronaviridae): SARS-CoV-2; Yersinia enterocolitica; - Vibrio cholerae; - Plasmodium falciparum; - Plasmodium vivax; - Salmonella typhi; - Coxiella burnetti; - ДНК человека. При тестировании образцов ДНК/РНК вышеперечисленных организмов и ДНК человека неспецифических реакций выявлено не было. VER 04.08.26 / стр. 7 из 28 Информация об интерферирующих соединениях указана в разделе «Интерферирующие вещества и ограничения по использованию проб исследуемого материала». Повторяемость и воспроизводимость исследования Повторяемость и воспроизводимость исследования были определены путем тестирования положительных модельных образцов и отрицательных образцов. В модельные образцы добавляли стандартные образцы предприятия с концентрацией каждого аналита не ниже предела обнаружения. В качестве отрицательных образцов были использованы образцы, не содержащие исследуемые аналиты. Условия повторяемости включали в себя тестирование в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором, с использованием одного и того же оборудования в пределах короткого промежутка времени. Условия воспроизводимости – тестирование в двух независимых лабораториях, разными операторами, в разные дни, на различных приборах разных серий набора реагентов. Результаты представлены в табл. 3. Таблица 3 Вид Повторяемость Воспроизводимость исследуемого Тип образцов Количество Совпадение Количество Совпадение материала образцов результатов, % образцов результатов, % Цельная Положительные 10 100 30 100 венозная Отрицательные 10 100 30 100 кровь Положительные 10 100 30 100 Плазма Отрицательные 10 100 30 100 Мазки со Положительные 10 100 30 100 слизистой оболочки Отрицательные 10 100 30 100 ротоглотки Смывы с Положительные 10 100 30 100 поверхностей объектов Отрицательные 10 100 30 100 окружающей среды ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Для определения диагностических характеристик набора реагентов были протестированы по 25 положительных в отношении каждого аналита и 25 отрицательных образцов. Общий пул составил 100 тестируемых проб для каждого типа биоматериала (цельной венозной крови, плазмы, мазков со VER 04.08.26 / стр. 8 из 28 | Вид исследуемого материала | Возбудитель | | Диагностическая | | | Диагностическая | | | | | | чувствительность1 | | | специфичность2 | | | | | | (с доверительной | | | (с доверительной | | | | | | вероятностью 95 %) | | | вероятностью 95 %) | | | Цельная венозная кровь | TAIFV | 100 (86,28 – 100) % | | | 100 (86,28 – 100) % | | | | | BDBV | 100 (86,28 – 100) % | | | 100 (86,28 – 100) % | | | | | RESTV | 100 (86,28 – 100) % | | | 100 (86,28 – 100) % | | | | Плазма | TAIFV | 100 (86,28 – 100) % | | | 100 (86,28 – 100) % | | | | | BDBV | 100 (86,28 – 100) % | | | 100 (86,28 – 100) % | | | | | RESTV | 100 (86,28 – 100) % | | | 100 (86,28 – 100) % | | | | Мазки со слизистой оболочки ротоглотки | TAIFV | 100 (86,28 – 100) % | | | 100 (86,28 – 100) % | | | | | BDBV | 100 (86,28 – 100) % | | | 100 (86,28 – 100) % | | | | | RESTV | 100 (86,28 – 100) % | | | 100 (86,28 – 100) % | | | | Смывы с поверхностей объектов окружающей среды | TAIFV | 100 (86,28 – 100) % | | | 100 (86,28 – 100) % | | | | | BDBV | 100 (86,28 – 100) % | | | 100 (86,28 – 100) % | | | | | RESTV | 100 (86,28 – 100) % | | | 100 (86,28 – 100) % | | | слизистой оболочки ротоглотки, смывов с поверхностей объектов окружающей среды). Диагностическая эффективность медицинского изделия исследована в лабораторных условиях с применением образцов, полученных генно-инженерным способом, содержащих диагностически значимую мишень патогена. В качестве референтного метода использовался метод прямого секвенирования по методике Сэнгера. Результаты представлены в табл. 4. Таблица 4 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно-биологические (ПЦР) исследования биологического материала на наличие возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», СанПиН 2.1.3684-21 «Санитарно- эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий» и МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации 1 Относительная чувствительность в сравнении с использованным референтным методом. 2 Относительная специфичность в сравнении с использованным референтным методом. VER 04.08.26 / стр. 9 из 28 нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности». Набор реагентов предназначен для одноразового применения для проведения ПЦР-исследования указанного количества проб (см. раздел «Формы комплектации»). Набор реагентов готов к применению согласно данной инструкции. Применять набор реагентов строго по назначению. При работе необходимо всегда выполнять следующие требования: - Температура в помещении лаборатории должна быть от 20 до 28 °С, относительная влажность – от 15 до 75 %. - Не использовать набор реагентов, если нарушена внутренняя упаковка или внешний вид реагента не соответствует описанию. - Не использовать набор реагентов, если не соблюдались условия транспортирования и хранения согласно инструкции. - Не использовать набор реагентов по истечении срока годности. - Использовать одноразовые неопудренные перчатки, лабораторные халаты, защищать глаза во время работы с образцами и реагентами. Тщательно вымыть руки по окончании работы. Все операции проводятся только в перчатках для исключения контакта с организмом человека. - Избегать вдыхания паров, контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой. Вреден при проглатывании. При контакте немедленно промыть пораженное место водой, при необходимости обратиться за медицинской помощью. При использовании по назначению и соблюдении вышеперечисленных мер предосторожности набор реагентов безопасен. При соблюдении условий транспортировки, эксплуатации и хранения риски взрыва и возгорания отсутствуют. Сведения о безопасности набора реагентов доступны по запросу. VER 04.08.26 / стр. 10 из 28 СВЕДЕНИЯ ОБ УТИЛИЗАЦИИ Неиспользованные реагенты, реагенты с истекшим сроком годности, использованные реагенты, упаковку3, биологический материал, а также материалы, инструменты и предметы, загрязненные биологическим материалом, следует удалять в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.3684-21 «Санитарно- эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий». ВНИМАНИЕ! При удалении отходов после амплификации (пробирок, содержащих продукты ПЦР) недопустимо открывание пробирок и разбрызгивание содержимого, поскольку это может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны, оборудования и реагентов. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ Перечисленные ниже дополнительные материалы и оборудование, относящиеся к категории медицинских изделий и зарегистрированные на территории Российской Федерации или Евразийского экономического союза, не имеют ограничений по совместному использованию с данным набором реагентов, кроме позиций, для которых указаны конкретные примеры. Взятие исследуемого материала 1. 0,9 % раствор натрия хлорида (стерильный физиологический раствор) или ТЕ-буфер (Трис-ЭДТА буфер). 2. Вакуумная система забора крови Vacuette. 3. Транспортная среда для транспортирования и хранения биологического материала, содержащая консервант (например, «Транспортная среда для хранения и транспортировки респираторных мазков» (РУ № ФСР 3 Неиспользованные реагенты, реагенты с истекшим сроком годности, использованные реагенты, упаковка относятся к классу опасности медицинских отходов Г. VER 04.08.26 / стр. 11 из 28 2009/05011), «Транспортная среда с муколитиком (ТСМ)» (РУ № ФСР 2009/05514)). 4. Емкость для взятия, хранения и транспортировки биологических образцов объемом 30-60 мл, стерильная. 5. Пробирки с винтовой горловинной крышкой объёмом 15 мл. 6. Зонд медицинский одноразовый стерильный. 7. Зонд-тампон стерильный в индивидуальной упаковке. 8. Одноразовые полипропиленовые плотно закрывающиеся или завинчивающиеся пробирки объемом 1,5; 2 мл. Предварительная подготовка исследуемого материала 9. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся пробирки объемом 1,5 и 2,0 мл. 10. Реагент для предварительной обработки мокроты (например, реагент для предобработки слизистого материала «МУКОЛИЗИН» (РУ № ФСР 2011/12082)). 11. 0,9 % раствор натрия хлорида (стерильный физиологический раствор) или фосфатный буферный раствор (PBS) (натрия хлорид, 137 мМ; калия хлорид, 2,7 мМ; натрия монофосфат, 10 мМ; калия дифосфат, 2 мМ; pH=7,5±0,2). 12. Завинчивающиеся крышки к пробиркам. 13. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до 100, до 200, и до 1000 мкл. 14. Штативы для пробирок объемом 1,5 и 2,0 мл. 15. Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» с максимальной скоростью центрифугирования не менее 12 тыс. g. 16. Автоматические дозаторы переменного объема. 17. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 до минус 16 °С. 18. Отдельный халат, шапочка, обувь и одноразовые перчатки. 19. Одноразовые пластиковые контейнеры для сброса и инактивации материалов. Экстракция РНК из исследуемых образцов 20. Комплект реагентов для экстракции РНК – «РИБО-преп» (РУ № ФСР 2008/03147). 21. Дополнительные материалы и оборудование для экстракции РНК – согласно инструкции к комплекту реагентов для экстракции РНК. VER 04.08.26 / стр. 12 из 28 Обратная транскрипция, амплификация с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации 22. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до 100 мкл. 23. Штативы для пробирок объемом 0,2 мл. 24. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс, УФ-бокс) или бокс микробиологической безопасности II класса защиты. 25. Центрифуга-вортекс. 26. Автоматические дозаторы переменного объема. 27. Программируемый амплификатор с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени», (например, Rotor-Gene Q (QIAGEN GmbH («Киаген ГмбХ»), Германия (РУ № ФСЗ 2010/07595)), Rotor- Gene 6000 (Corbett Research, Австралия), CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Inc. («Био-Рад Лабораториез, Инк.»), США (РУ № ФСЗ 2008/03399)), «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК- Технология», Россия (РУ № ФСР 2011/10229))). 28. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 до минус 16 °С. 29. Отдельный халат, шапочка, обувь и одноразовые перчатки. 30. Емкость для сброса наконечников. ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА Материалом для исследования служат: - цельная венозная кровь, плазма, - мазки со слизистой оболочки ротоглотки, - смывы с поверхностей объектов окружающей среды. Взятие цельной венозной крови у людей проводится утром натощак в пробирку или в специальную вакуумную систему с К ЭДТА / К ЭДТА (конечная концентрация в крови 1,2-2,0 мг/мл) 2 3 в качестве антикоагулянта. После взятия крови пробирку следует несколько раз плавно перевернуть вверх дном, чтобы кровь в пробирке тщательно перемешалась с антикоагулянтом (в противном случае кровь свернется, и экстракция РНК станет невозможной!). После плавного перемешивания пробирку поместить в штатив. Экстракцию РНК проводить из 100 мкл VER 04.08.26 / стр. 13 из 28 цельной венозной крови. Допускается хранение образцов цельной венозной крови до ПЦР-исследования или проведения предварительной подготовки: при температуре от 18 до 25 °С – в течение 2 часов; при температуре от 2 до 8 °С – в течение 12 часов. Недопустимо замораживание образца цельной венозной крови! В случае необходимости провести исследование плазмы крови, следует осуществить дополнительную пробоподготовку (см. раздел «Подготовка исследуемого материала к экстракции РНК»). Подготовку образцов провести не позднее указанного выше времени. Допускается транспортирование материала при температуре от 2 до 8 °С в течение 12 часов. Мазки со слизистой оболочки ротоглотки Мазок берут сухим стерильным зондом вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки. После взятия материала часть зонда с мазком помещают в пробирку с транспортной средой. Конец зонда отламывают, придерживая крышкой пробирки, с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть пробирку. Пробирку герметично закрывают, встряхивают, чтобы увлажнить зонд, и маркируют. Допускается хранение мазков со слизистой оболочки ротоглотки до проведения предварительной подготовки: при температуре от 18 до 25 °С – в течение 6 часов; при температуре от 2 до 8 °С – в течение 3 суток; при температуре от минус 24 до минус 16 °С – в течение 1 месяца; при температуре не выше минус 68 °С – длительно. Допускается однократное замораживание-оттаивание материала. Смывы с объектов окружающей среды Для анализа смывов с объектов окружающей среды предварительно подготавливают одноразовые полипропиленовые пробирки объемом 1,5-2,0 мл, в которые VER 04.08.26 / стр. 14 из 28 вносят по 300 мкл стерильного физиологического раствора. Одноразовые тампоны-зонды смачивают в физиологическом растворе или ТЕ-буфере и затем берут смывы с поверхности площадью 5-10 см2. Рабочую часть зонда с тампоном помещают в пробирку, верхнюю часть зонда отламывают, придерживая крышкой пробирки, с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть пробирку. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают, маркируют. Допускается транспортирование и хранение смывов с объектов окружающей среды до проведения ПЦР- исследования: при температуре от 18 до 25 °С – не более 2 суток; при температуре от 2 до 8 °С – не более 1 недели; при температуре от минус 24 до минус 16 °С – в течение года. Допускается двукратное замораживание-оттаивание материала. ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАКЦИИ РНК Образцы цельной венозной крови, смывов с поверхностей объектов окружающей среды не требуют предварительной подготовки. Для получения плазмы крови требуется предварительная подготовка образцов крови. Перенести 1,5 мл крови с раствором ЭДТА, используя наконечник с фильтром, в стерильную одноразовую пробирку объемом 2,0 мл. Центрифугировать 10 минут при 40 g (например, 800 об/мин для микроцентрифуги MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation). Не захватывая осадок эритроцитов, перенести 500-600 мкл супернатанта отдельным наконечником с фильтром в стерильную одноразовую пробирку объемом 1,5 мл. Для разделения плазмы и лейкоцитов необходимо пробирки с отобранным супернатантом центрифугировать 5 мин при 7 тыс g (например, 10 тыс. об/мин для микроцентрифуги MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation). Нижняя фракция содержит лейкоциты крови, верхняя фракция содержит плазму VER 04.08.26 / стр. 15 из 28 крови. Экстракцию РНК проводить из 100 мкл плазмы. Допускается хранение плазмы крови до проведения ПЦР- исследования: при температуре от минус 24 до минус 16 °С – в течение 1 недели; при температуре не выше минус 68 °С – длительно. Мазки со слизистой оболочки ротоглотки Содержимое закрытой пробирки осаждают на вортексе в течение 5 с для удаления капель с внутренней поверхности крышки. Для экстракции РНК отбирают 100 мкл образца. Если объем образца в пробирке меньше 100 мкл и в пробирке есть зонд, следует добавить физиологический раствор или фосфатный буфер до объема, необходимого для экстракции с учетом возможности повторного анализа образца (100-300 мкл), перемешать и осадить на вортексе в течение 5 с для удаления капель с внутренней поверхности крышки. Если объем образца в пробирке меньше 100 мкл и зонд отсутствует, образец признать непригодным для анализа, биоматериал следует взять повторно. При наличии в образце слизи в пробу добавляют реагент «МУКОЛИЗИН» в соотношении 1:1, инкубируют при комнатной температуре (от 18 до 25 °С), периодически помешивая на вортексе в течение 5 мин (до визуального просветления). В случае наличия нерастворимых включений (осадка) образцы центрифугируют в течение 5 мин при 0,6 тыс. g (например, 3 тыс. об/мин для центрифуги MiniSpin, Eppendorf Manufacturing Corporation, Германия). Для экстракции РНК отбирают 100 мкл надосадочной жидкости. При необходимости повторного проведения анализа остаток образца замораживают. VER 04.08.26 / стр. 16 из 28 ИНТЕРФЕРИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА И ОГРАНИЧЕНИЯ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ПРОБ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА Непригодными для исследования являются: - образцы цельной венозной крови и плазмы, взятые в пробирки с гепарином в качестве антикоагулянта; - образцы цельной венозной крови, содержащие кровяной сгусток или подвергшиеся заморозке. Сведения о других интерферирующих веществах при условии соблюдения правил взятия и предварительной подготовки исследуемого материала, указанных в инструкции, отсутствуют. Для контроля эффективности экстракции РНК реакции амплификации в наборе реагентов предусмотрено использование внутреннего контрольного образца (ВКО-FL), который добавляется в каждый биологический образец на этапе экстракции нуклеиновых кислот. По окончании реакции амплификации наличие сигнала, свидетельствующего о накоплении фрагментов кДНК ВКО-FL, говорит о достаточной эффективности экстракции нуклеиновых кислот и отсутствии ингибиторов ПЦР. Потенциально интерферирующие вещества Для оценки потенциальной интерференции были выбраны эндогенные и экзогенные вещества, которые могут присутствовать в биологическом материале и в смывах с поверхностей объектов окружающей среды, используемых для исследования (см. табл. 5). Были протестированы модельные образцы цельной венозной крови, плазмы, мазков со слизистой оболочки ротоглотки, смывов с поверхностей объектов окружающей среды без добавления и с добавлением потенциально интерферирующих веществ. Концентрация каждого интерферирующего вещества указана в табл.5. В модельные образцы добавляли стандартные образцы предприятия с концентрацией каждого аналита не ниже предела обнаружения. VER 04.08.26 / стр. 17 из 28 | и | Вид | о | п | Вид | о | Потенциальный интерферент4 | П | ротестированна | я | Наличие интерференции | | | сследуемог | | | отенциальног | | | | концентрация | | | | | материала | | | интерферента | | | | в образце 5 | | | | Цельная венозная кровь | | | Эндогенные вещества | | | Холестерин | 78 ммоль/л | | | Не обнаружено | | | | | | | | Билирубин | 210 мкмоль/л | | | Не обнаружено | | | | | | | | Триглицериды | 37 ммоль/л | | | Не обнаружено | | | | | | | | Гемоглобин | 250 г/л | | | Не обнаружено | | | | | Экзогенные вещества6 | | | К ЭДТА 2 | 2 мг/мл | | | Не обнаружено | | | | | | | | К ЭДТА 3 | 2 мг/мл | | | Не обнаружено | | | | | | | | Лития гепарин | 12 МЕ/мл | | | Обнаружено | | Плазма | | | Эндогенные вещества | | | Холестерин | 78 ммоль/л | | | Не обнаружено | | | | | | | | Билирубин | 210 мкмоль/л | | | Не обнаружено | | | | | | | | Триглицериды | 37 ммоль/л | | | Не обнаружено | | | | | Экзогенные вещества6 | | | К ЭДТА 2 | 2 мг/мл | | | Не обнаружено | | | | | | | | К ЭДТА 3 | 2 мг/мл | | | Не обнаружено | | | | | | | | Лития гепарин | 12 МЕ/мл | | | Обнаружено | | Мазки со слизистой оболочки ротоглотки | | | Эндогенные вещества | | | Муцин | 150 мг/мл | | | Не обнаружено | | | | | | | | Кровь цельная | 30 % | | | Не обнаружено | | | | | Экзогенные вещества | | | Хлоргексидин (Водный раствор хлоргексидина биглюконата) | 12,5 мкг/мл | | | Не обнаружено | | | | | | | | Бензилдиметил- миристоиламино- пропиламмоний (Мирамистин) | 0,005 мкг/мл | | | Не обнаружено | | Смывы с поверхностей объектов окружающей среды | | | Экзогенные вещества | | | Натриевая соль дихлоризоциануровой кислоты (Хлормисепт люкс) | 0,1 % | | | Обнаружено | Таблица 5 4 Для лекарственных средств указано действующее вещество и название препарата в скобках. 5 Для лекарственных средств указана концентрация действующего вещества. 6 В соответствии с ГОСТ Р 53079.4-2008 (Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4. Правила ведения преаналитического этапа) калия ЭДТА используют в концентрации от 1,2 до 2,0 мг/мл, лития гепарин – в концентрации от 12 до 30 МЕ/мл. VER 04.08.26 / стр. 18 из 28 ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ ПЦР-исследование состоит из следующих этапов: экстракция РНК из исследуемых образцов, обратная транскрипция РНК и амплификации кДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». анализ и интерпретация результатов. ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ ВНИМАНИЕ! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку RNase-free, DNase-free. Для экстракции РНК используется комплект реагентов для экстракции РНК – «РИБО-преп». Порядок работы с комплектом реагентов смотрите в инструкции к соответствующему комплекту для экстракции. Объемы реагентов и образцов при экстракции с помощью комплекта реагентов «РИБО-преп»: Экстракция РНК из каждого исследуемого образца и контролей проводится в присутствии внутреннего контрольного образца – ВКО-FL. Объем ВКО-FL – 10 мкл в каждую пробирку. Объем исследуемого образца – 100 мкл. В пробирку отрицательного контроля экстракции (ОК) внести 100 мкл ОКО. ВНИМАНИЕ! При получении новой серии набора реагентов необходима постановка положительного контроля экстракции (ПК). Для этого в пробирку положительного контроля экстракции (ПК) внести 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО FiloB. Объем элюции – 50 мкл. ВНИМАНИЕ! Реакцию ОТ-ПЦР рекомендуется проводить сразу после получения проб РНК. Допускается хранение проб РНК при температуре от 2 до 8 °С не более 30 мин, при температуре от минус 24 до минус 16 °С не более недели и при температуре не выше минус 68 °С до года. Допускается однократное замораживание-оттаивание проб РНК. VER 04.08.26 / стр. 19 из 28 | Реагент | Описание | Объем, мл | Количество, шт. | | ПЦР-смесь FiloB-Lyo | Сухая масса белого цвета | – | 96 | | К+ FiloB | Прозрачная бесцветная жидкость | 0,5 | 1 | | К– | Прозрачная бесцветная жидкость | 0,5 | 1 | | ПКО FiloB | Прозрачная бесцветная жидкость | 0,1 | 1 | | ВКО-FL | Прозрачная бесцветная жидкость | 1,0 | 1 | | ОКО | Прозрачная бесцветная жидкость | 1,2 | 8 | ФОРМА 1 ФОРМА 1: «ПЦР-комплект» вариант FRT-L-t СОСТАВ «ПЦР-комплект» вариант FRT-L-t – комплект реагентов для обратной транскрипции РНК и амплификации участков кДНК эболавируса леса Тай (TAIFV), РНК эболавируса Бундибуджио (BDBV) и РНК эболавируса Рестон (RESTV) c гибридизационно- флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» – включает: Эксплуатационная документация на бумажном носителе и на сайте Изготовителя (www.amplisens.ru) – инструкция по применению (1 шт.), паспорт качества (1 шт.), вкладыш (1 шт.), краткое руководство (1 шт.). ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ И АМПЛИФИКАЦИЯ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» ВНИМАНИЕ! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку RNase-free, DNase-free. Для внесения в пробирки реагентов, проб РНК и контрольных образцов используются одноразовые наконечники с фильтрами. А. Подготовка проб для проведения ОТ-ПЦР Общий объем реакционной смеси – 25 мкл, включая объем пробы РНК – 25 мкл. 1. Отобрать необходимое количество пробирок с готовой лиофилизированной реакционной ПЦР-смесью FiloB-Lyo VER 04.08.26 / стр. 20 из 28 ФОРМА 1 для проведения ОТ-ПЦР РНК исследуемых и контрольных образцов (количество контрольных образцов см. в пункте 3). 2. В подготовленные пробирки внести по 25 мкл проб РНК, полученных в результате экстракции из исследуемых образцов. ВНИМАНИЕ! Содержимое пробирок необходимо тщательно перемешать пипетированием, не допуская появления пузырьков воздуха. 3. Поставить контрольные реакции. а) положительный контроль ОТ-ПЦР (К+) – в пробирку с реакционной смесью внести 25 мкл К+ FiloB. б) отрицательный контроль экстракции (ОК) – в пробирку с реакционной смесью внести 25 мкл пробы, экстрагированной из ОКО. ВНИМАНИЕ! При получении новой серии набора реагентов необходима постановка положительного контроля экстракции (ПК). Для этого в пробирку с реакционной смесью внести 25 мкл пробы, экстрагированной из ПКО FiloB. При подозрении на возможную контаминацию также необходима постановка отрицательного контроля ОТ-ПЦР (К–). Для этого в пробирку с реакционной смесью внести 25 мкл К–. ВНИМАНИЕ! Содержимое пробирок необходимо тщательно перемешать пипетированием, не допуская появления пузырьков воздуха. ВНИМАНИЕ! Провести ОТ-ПЦР сразу после соединения реакционной смеси и РНК-пробы и контролей. Время внесения проб в реакционную смесь и запуск реакции на приборе не должно превышать 10-15 минут. Б. Проведение ОТ-ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» 1. Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора. Рекомендуется: а) перед постановкой в амплификатор планшетного типа осадить капли со стенок пробирок на вортексе; б) в случае неполной загрузки приборов планшетного типа дополнительно установить пустые пробирки по краям реакционного модуля амплификатора. VER 04.08.26 / стр. 21 из 28 | Цикл | Температура, °С | Время | | Детекция флуоресцентного | | Количество циклов | | | | | | сигнала по каналам для | | | | | | | | флуорофоров | | | | 1 | 50 | 15 мин | – | | | 1 | | 2 | 95 | 15 мин | – | | | 1 | | 3 | 95 | 10 с | – | | | 8 | | | 60 | 20 с | – | | | | | 4 | 95 | 10 с | – | | | 37 | | | 52 | 25 с | FAM, JOE, ROX, Cy5 | | | | | | 72 | 15 с | – | | | | ФОРМА 1 2. Запустить программу амплификации, запрограммировав детектирующий амплификатор для выполнения программы, указанной в табл. 6. Таблица 6 Программа амплификации и детекции флуоресцентного сигнала для приборов роторного7 и планшетного8 типа В. Анализ и интерпретация результатов ВНИМАНИЕ! Установление диагноза и назначение лечения должны производиться врачом соответствующей специализации. Анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала, свидетельствующего о накоплении продукта амплификации, по четырем каналам (см. табл. 7): Таблица 7 Канал для флуорофора FAM JOE ROX Cy5 Продукт амплификации кДНК TAIFV кДНК BDBV кДНК RESTV кДНК ВКО-FL Анализ полученных результатов проводят с помощью ПО прибора, используемого для проведения ПЦР c детекцией в режиме «реального времени». Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции S-образной (сигмообразной) формы с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы РНК значения порогового цикла (Ct). Принцип интерпретации результатов следующий (см. табл.8): 7 Например, Rotor-Gene Q (QIAGEN), Rotor-Gene 6000 (Corbett Research) 8 Например, CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Inc.), «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК-Технология»). VER 04.08.26 / стр. 22 из 28 ФОРМА 1 Таблица 8 Интерпретация результатов анализа исследуемых образцов Значение порогового цикла по каналу для флуорофора (Сt) Результат FAM JOE ROX Cy5 определено РНК TAIFV, BDBV отсутствует отсутствует отсутствует меньше и RESTV граничного НЕ обнаружена определено определено РНК TAIFV меньше отсутствует отсутствует или обнаружена граничного отсутствует определено определено РНК BDBV отсутствует меньше отсутствует или обнаружена граничного отсутствует определено определено РНК RESTV отсутствует отсутствует меньше или обнаружена граничного отсутствует отсутствует или отсутствует или отсутствует или отсутствует или определено определено определено определено Невалидный* больше больше больше больше граничного граничного граничного граничного * В случае получения невалидного результата необходимо провести повторное ПЦР-исследование соответствующего исследуемого образца, начиная с этапа экстракции РНК. Рекомендуется, по возможности, произвести повторное взятие исследуемого материала. ВНИМАНИЕ! Граничные значения Ct указаны во вкладыше с настройками, прилагаемом к набору реагентов. Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для контролей этапов экстракции и ОТ-ПЦР в соответствии с табл. 9 и вкладышем с настройками, прилагаемым к набору реагентов. VER 04.08.26 / стр. 23 из 28 ФОРМА 1 Таблица 9 Результаты для контролей различных этапов ПЦР- исследования Контроли- Значение порогового цикла по каналу для флуорофора (Сt) руемый Конт- этап ПЦР- роль исследова- FAM JOE ROX Cy5 ния определено определено определено определено Экстракция ПК меньше меньше меньше меньше РНК граничного граничного граничного граничного определено Экстракция ОК отсутствует отсутствует отсутствует меньше РНК граничного К– ОТ-ПЦР отсутствует отсутствует отсутствует отсутствует определено определено определено определено K+ ОТ-ПЦР меньше меньше меньше меньше граничного граничного граничного граничного Возможные ошибки: 1. Для положительного контроля ОТ-ПЦР (К+) значение порогового цикла (Сt) по любому из указанных каналов для флуорофоров (см. табл. 9) отсутствует или превышает граничное значение. Необходимо повторить амплификацию и детекцию для всех образцов. 2. Для положительного контроля экстракции (ПК) значение порогового цикла (Сt) по каналам для флуорофоров FAM и/или JOE, и/или ROX отсутствует или превышает граничное значение. Необходимо повторить ПЦР-исследование, начиная с этапа экстракции РНК, для всех образцов. 3. Для отрицательного контроля экстракции (ОК): а) по какому-либо из каналов для флуорофоров FAM и/или JOE, и/или ROX определено значение порогового цикла (Сt). Вероятна контаминация лаборатории фрагментами амплификации или контаминация реагентов, исследуемых образцов на каком-либо этапе ПЦР- исследования. Необходимо предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации и повторить ПЦР-исследование для всех образцов, в которых обнаружена специфическая РНК, начиная с этапа экстракции РНК; VER 04.08.26 / стр. 24 из 28 ФОРМА 1 б) по каналу для флуорофора Cy5 значение порогового цикла (Ct) отсутствует или определено больше граничного. Это означает, что образец ОК не выполнил функцию контроля контаминации. Требуется повторное ПЦР-исследование всех образцов, в которых обнаружена специфическая РНК, начиная с этапа экстракции РНК. 4. Для отрицательного контроля ОТ-ПЦР (К–) по каналам для флуорофоров FAM и/или JOE, и/или ROX определено значение порогового цикла (Сt). Вероятна контаминация лаборатории фрагментами амплификации или контаминация реагентов, исследуемых образцов на каком- либо этапе ПЦР-исследования. Необходимо предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации и повторить амплификацию и детекцию для всех образцов, в которых обнаружена специфическая РНК. 5. Для исследуемого образца определено значение порогового цикла (Сt), при этом на графике флуоресценции отсутствует участок характерного экспоненциального подъема (график представляет собой приблизительно прямую линию). Необходимо проверить правильность выбранного уровня пороговой линии или параметров расчета базовой линии. Если результат получен при правильном уровне пороговой линии (базовой линии), требуется повторно провести амплификацию и детекцию для этого образца. VER 04.08.26 / стр. 25 из 28 СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ Срок годности. 12 мес. Набор реагентов с истекшим сроком годности применению не подлежит. Срок годности вскрытых реагентов соответствует сроку годности, указанному на этикетках для невскрытых реагентов, если в инструкции не указано иное. Транспортирование. Транспортирование проводить всеми видами крытых транспортных средств в термоконтейнерах, содержащих хладоэлементы, или в авторефрижераторах. Набор реагентов транспортировать при температуре от 2 до 8 °С без ограничения по времени. Допускается транспортирование при температуре от 2 до 25 °С не более 10 сут. Хранение. Реагенты после вскрытия хранить при той же температуре, что до вскрытия. Форма 1. «ПЦР-комплект» вариант FRT-L-t хранить в холодильной камере при температуре от 2 до 8 °С. ПЦР-смесь FiloB-Lyo после вскрытия вакуумной упаковки хранить в закрытом Zip-lock пакете с влагопоглотителем в защищенном от света и влаги месте. Холодильная камера должна обеспечивать регламентированный температурный режим. VER 04.08.26 / стр. 26 из 28 ГАРАНТИЙНЫЕ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА ИЗГОТОВИТЕЛЯ Изготовитель гарантирует соответствие основных параметров и характеристик набора реагентов требованиям, указанным в технической и эксплуатационной документации, в течение указанного срока годности при соблюдении всех условий транспортирования, хранения и применения. Медицинское изделие техническому обслуживанию и ремонту не подлежит. Рекламации на качество набора реагентов направлять по адресу 111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, дом 3А, e-mail: obtk@pcr.ru. Отзывы и предложения о продукции AmpliSens® вы можете оставить, заполнив анкету потребителя на сайте: www.amplisens.ru. При выявлении побочных действий, не указанных в инструкции по применению набора реагентов, нежелательных реакций при его использовании, фактов и обстоятельств, создающих угрозу жизни и здоровью граждан и медицинских работников при применении набора реагентов, рекомендуется направить сообщение по адресу, указанному выше, и в уполномоченную государственную регулирующую организацию (в РФ – Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения) в соответствии с действующим законодательством. VER 04.08.26 / стр. 27 из 28 СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ Содержимого достаточно для Номер по каталогу проведения <n> тестов Код партии Использовать до Обратитесь к инструкции по Медицинское изделие для применению или к инструкции по диагностики in vitro применению в электронном виде Не допускать воздействия Дата изменения солнечного света Температурный диапазон Дата изготовления Изготовитель Не допускать воздействия влаги Осторожно VER 04.08.26 / стр. 28 из 28 Инструкция по применению набора реагентов расположена на сайте www.amplisens.ru Краткое руководство набора реагентов АмплиСенс FiloB-скрин-FL Форма 1: REF H-3631-1-4 ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Российская Федерация, 111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, д. 3А г. Москва, ул. Новогиреевская, д. 3А, стр. 6 тел. (495) 974 9642, е-mail: amplisens@pcr.ru VER 29.07.26 ВНИМАНИЕ! Краткое руководство предназначено для удобства работы с набором реагентов в лаборатории и может быть использовано только после детального ознакомления с инструкцией по применению данного набора реагентов. Анализ и интерпретацию результатов необходимо проводить в соответствии с инструкцией к набору реагентов. ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ Комплекты для экстракции: «РИБО-преп». Контроли: Для каждой группы экстрагируемых образцов: 1 отрицательный контроль экстракции (ОК). ВНИМАНИЕ! При получении новой серии набора реагентов необходима постановка положительного контроля экстракции (ПК). Для этого в пробирку положительного контроля экстракции (ПК) внести 90 мкл ОКО и 10 мкл ПКО FiloB. Объем исследуемого образца, контролей и элюции При экстракции с помощью «РИБО-преп» добавить: ВКО-FL 10 мкл в каждую пробирку Исследуемые образцы 100 мкл в пробирки для исследуемых образцов ОКО 100 мкл в пробирку для ОК Элюция Все образцы 50 мкл в каждую пробирку ВНИМАНИЕ! Реакцию ОТ-ПЦР рекомендуется проводить сразу после получения проб РНК. Допускается хранение проб РНК при температуре от 2 до 8 °С не более 30 мин, при температуре от минус 24 до минус 16 °С не более недели и при температуре не выше минус 68 °С до года. Допускается однократное замораживание-оттаивание проб РНК. Стр. 1 из 2 | | Внести по 25 мкл | | | | Проб РНК, экстрагированной из исследуемых образцов | | в пробирки для исследуемых образцов | | | Пробы РНК, экстрагированной из ОКО | | в пробирку для ОК | | | К+ FiloВ | | в пробирку для К+ | | | Цикл | | Программа амплификации и детекции флуоресцентного сигнала | | | | | | | | | | для приборов роторного1 и планшетного2 типа | | | | | | | | | Температура, °С | | Время | | Детекция флуоресц. сигнала по каналам | | Кол-во циклов | | | | | | | | для флуорофоров | | | | | 1 | 50 | | 15 мин | – | | | 1 | | | 2 | 95 | | 15 мин | – | | | 1 | | | 3 | 95 | | 10 с | – | | | 8 | | | | 60 | | 20 с | – | | | | | | 4 | 95 | | 10 с | – | | | 37 | | | | 52 | | 25 с | FAM, JOE, ROX, Cy5 | | | | | | | 72 | | 15 с | – | | | | | ПОДГОТОВКА ПРОБ ДЛЯ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ И АМПЛИФИКАЦИИ Общий объем реакционной смеси: 25 мкл, включая объем пробы РНК (25 мкл). Контроли: для каждой группы амплифицируемых образцов 1 положительный (К+) и 1 отрицательный (К–) контроли ОТ-ПЦР, 1 отрицательный (ОК) и 1 положительный (ПК) контроли экстракции. - Отобрать необходимое количество пробирок c готовой лиофилизированной реакционной ПЦР-смесью FiloB-Lyo для проведения ОТ-ПЦР РНК исследуемых и контрольных образцов. ВНИМАНИЕ! При получении новой серии набора реагентов необходима постановка положительного контроля экстракции (ПК). Для этого в пробирку с реакционной смесью внести 25 мкл пробы, экстрагированной из ПКО FiloB. При подозрении на возможную контаминацию также необходима постановка отрицательного контроля ОТ- ПЦР (К–). Для этого в пробирку с реакционной смесью внести 25 мкл К–. ВНИМАНИЕ! Содержимое пробирок необходимо тщательно перемешать пипетированием, не допуская появления пузырьков воздуха. ВНИМАНИЕ! Провести ОТ-ПЦР сразу после соединения реакционной смеси и РНК-пробы. Время внесения проб в реакционную смесь и запуск реакции на приборе не должно превышать 10-15 минут. ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ И АМПЛИФИКАЦИЯ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» - Установить пробирки в ячейки реакционного модуля. Рекомендуется: а) перед постановкой в амплификатор планшетного типа осадить капли со стенок пробирок на вортексе; б) в случае неполной загрузки приборов планшетного типа дополнительно установить пустые пробирки по краям реакционного модуля амплификатора. - Запрограммировать амплификатор с системой детекции в режиме «реального времени». Настройки приборов роторного и планшетного типа см. во вкладыше к набору реагентов. АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ Анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по четырем каналам: Флуорофор FAM JOE ROX Cy5 Мишень для амплификации кДНК TAIFV кДНК BDBV кДНК RESTV кДНК ВКО-FL ВНИМАНИЕ! К каждому набору реагентов прилагается вкладыш с настройками, в котором указаны граничные значения Ct, необходимые для проведения анализа и интерпретации результатов. 1 Например, Rotor-Gene Q (QIAGEN), Rotor-Gene 6000 (Corbett Research). 2 Например, CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Inc.), «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК-Технология»). Стр. 2 из 2 | Наименование показателя | Норма | Результаты контроля | | Отрицательный результат для образца ОК (отрицательный контроль экстракции) | Определено значение Ct меньше граничного по каналу для флуорофора Cy5. Значение Ct отсутствует по каналам для флуорофоров FAM, JOE и ROX | соответствует | | Положительный результат для образца ПК (положительный контроль экстракции) | Определено значение Ct меньше граничного по каналам для флуорофоров FAM, JOE, ROX и Cy5 | соответствует | | Положительный результат для образца К+ (положительный контроль ОТ-ПЦР) | Определено значение Ct меньше граничного по каналам для флуорофоров FAM, JOE, ROX и Cy5 | соответствует | | Отрицательный результат для образца К– (отрицательный контроль ОТ-ПЦР) | Значение Ct отсутствует по каналам для флуорофоров FAM, JOE, ROX и Cy5 | соответствует | ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора 111123, Москва, ул. Новогиреевская 3А, тел. (495) 974-96-42, факс (495) 305-54-23, e-mail: obtk@pcr.ru ПАСПОРТ КАЧЕСТВА Набор реагентов для выявления РНК участка гена VP40 эболавируса леса Тай (TAIFV), РНК участка гена NP эболавируса Бундибуджио (BDBV) и РНК участка гена L эболавируса Рестон (RESTV) методом ПЦР АмплиСенс® FiloВ-скрин-FL 2026-06-24 Форма 1 24.06.26 2027-06-24 ТУ 20.59.52-363-01897593-2026. Комплектность, упаковка и маркировка набора указанной серии соответствуют требованиям ТУ. 1. Технические характеристики: 2. Состав, внешний вид: В составе формы Наименование реагента Характеристика и нормы Результаты контроля комплектации ПЦР-смесь FiloВ-Lyo Сухая масса белого цвета соответствует 1 К+ FiloВ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 К– Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 ПКО FiloВ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 ВКО-FL Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 ОКО Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 3. Условия транспортирования и хранения: Транспортирование. Транспортирование проводить всеми видами крытых транспортных средств в термоконтейнерах, содержащих хладоэлементы, или в авторефрижераторах. Набор реагентов транспортировать при температуре от 2 до 8 °С без ограничения по времени. Допускается транспортирование при температуре от 2 до 25 °С не более 10 сут. Хранение. Реагенты после вскрытия хранить при той же температуре, что до вскрытия. Форма 1. «ПЦР-комплект» вариант FRT-L-t хранить в холодильной камере при температуре от 2 до 8 °С. ПЦР-смесь FiloB- Lyo после вскрытия вакуумной упаковки хранить в закрытом Zip-lock пакете с влагопоглотителем в защищенном от света и влаги месте. Холодильная камера должна обеспечивать регламентированный температурный режим. Дата выдачи 24.06.26 Руководитель ГКК (Кодуа О.И.) (подпись) (Ф.И.О.) Форма 1: REF Н-3631-1-4 | Наименование показателя | Норма | Результаты контроля | | Отрицательный результат для образца ОК (отрицательный контроль экстракции) | Определено значение Ct меньше граничного по каналу для флуорофора Cy5. Значение Ct отсутствует по каналам для флуорофоров FAM, JOE и ROX | соответствует | | Положительный результат для образца ПК (положительный контроль экстракции) | Определено значение Ct меньше граничного по каналам для флуорофоров FAM, JOE, ROX и Cy5 | соответствует | | Положительный результат для образца К+ (положительный контроль ОТ-ПЦР) | Определено значение Ct меньше граничного по каналам для флуорофоров FAM, JOE, ROX и Cy5 | соответствует | | Отрицательный результат для образца К– (отрицательный контроль ОТ-ПЦР) | Значение Ct отсутствует по каналам для флуорофоров FAM, JOE, ROX и Cy5 | соответствует | ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора 111123, Москва, ул. Новогиреевская 3А, тел. (495) 974-96-42, факс (495) 305-54-23, e-mail: obtk@pcr.ru ПАСПОРТ КАЧЕСТВА Набор реагентов для выявления РНК участка гена VP40 эболавируса леса Тай (TAIFV), РНК участка гена NP эболавируса Бундибуджио (BDBV) и РНК участка гена L эболавируса Рестон (RESTV) методом ПЦР АмплиСенс® FiloВ-скрин-FL 2026-06-25 Форма 1 25.06.26 2027-06-25 ТУ 20.59.52-363-01897593-2026. Комплектность, упаковка и маркировка набора указанной серии соответствуют требованиям ТУ. 1. Технические характеристики: 2. Состав, внешний вид: В составе формы Наименование реагента Характеристика и нормы Результаты контроля комплектации ПЦР-смесь FiloВ-Lyo Сухая масса белого цвета соответствует 1 К+ FiloВ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 К– Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 ПКО FiloВ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 ВКО-FL Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 ОКО Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 3. Условия транспортирования и хранения: Транспортирование. Транспортирование проводить всеми видами крытых транспортных средств в термоконтейнерах, содержащих хладоэлементы, или в авторефрижераторах. Набор реагентов транспортировать при температуре от 2 до 8 °С без ограничения по времени. Допускается транспортирование при температуре от 2 до 25 °С не более 10 сут. Хранение. Реагенты после вскрытия хранить при той же температуре, что до вскрытия. Форма 1. «ПЦР-комплект» вариант FRT-L-t хранить в холодильной камере при температуре от 2 до 8 °С. ПЦР-смесь FiloB- Lyo после вскрытия вакуумной упаковки хранить в закрытом Zip-lock пакете с влагопоглотителем в защищенном от света и влаги месте. Холодильная камера должна обеспечивать регламентированный температурный режим. Дата выдачи 25.06.26 Руководитель ГКК (Кодуа О.И.) (подпись) (Ф.И.О.) Форма 1: REF Н-3631-1-4 «УТВЕРЖДАЮ» Директор Федерального бюджетного учреждения науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ________________ В.Г. Акимкин «____»_______________20__ г. ФОТОГРАФИЧЕСКИЕ ИЗОБРАЖЕНИЯ МЕДИЦИНСКОГО ИЗДЕЛИЯ Набор реагентов для выявления РНК участка гена VP40 эболавируса леса Тай (TAIFV), РНК участка гена NP эболавируса Бундибуджио (BDBV) и РНК участка гена L эболавируса Рестон (RESTV) методом ПЦР АмплиСенс FiloВ-скрин-FL Фотография набора реагентов АмплиСенс FiloВ-скрин-FL Форма 1 До вскрытия внешней упаковки (коробка) 2 Фотография набора реагентов АмплиСенс FiloВ-скрин-FL Форма 1 После вскрытия внешней упаковки (коробка) 3 Фотография набора реагентов АмплиСенс FiloВ-скрин-FL Форма 1 До вскрытия внешней упаковки (пакет с замком Zip-Lock) 4 Фотография набора реагентов АмплиСенс FiloВ-скрин-FL Форма 1 После вскрытия внешней упаковки (пакет с замком Zip-Lock) 5 Фотография набора реагентов АмплиСенс FiloВ-скрин-FL Форма 1 До вскрытия внешней упаковки (пакет с замком Zip-Lock) 6 Фотография набора реагентов АмплиСенс FiloВ-скрин-FL Форма 1 После вскрытия внешней упаковки (пакет с замком Zip-Lock) 7 Фотография реагентов, входящих в набор реагентов АмплиСенс FiloВ-скрин-FL Форма 1 (ПЦР-смесь FiloB-Lyo) 8 Фотография реагентов, входящих в набор реагентов АмплиСенс FiloВ-скрин-FL Форма 1 (ПКО FiloB, ВКО-FL) 9 Фотография реагентов, входящих в набор реагентов АмплиСенс FiloВ-скрин-FL Форма 1 (ПКО FiloB, ВКО-FL) 10 Фотография реагентов, входящих в набор реагентов АмплиСенс FiloВ-скрин-FL Форма 1 (ПКО FiloB, ВКО-FL) 11 Фотография реагентов, входящих в набор реагентов АмплиСенс FiloВ-скрин-FL Форма 1 (ПКО FiloB, ВКО-FL) 12 Фотография реагентов, входящих в набор реагентов АмплиСенс FiloВ-скрин-FL Форма 1 (К+ FiloB, К–) 13 Фотография реагентов, входящих в набор реагентов АмплиСенс FiloВ-скрин-FL Форма 1 (К+ FiloB, К–) 14 Фотография реагентов, входящих в набор реагентов АмплиСенс FiloВ-скрин-FL Форма 1 (К+ FiloB, К–) 15 Фотография реагентов, входящих в набор реагентов АмплиСенс FiloВ-скрин-FL Форма 1 (ОКО) 16 Фотография реагентов, входящих в набор реагентов АмплиСенс FiloВ-скрин-FL Форма 1 (ОКО) 17 Фотография реагентов, входящих в набор реагентов АмплиСенс FiloВ-скрин-FL Форма 1 (ОКО) 18 Фотография реагентов, входящих в набор реагентов АмплиСенс FiloВ-скрин-FL Форма 1 (ОКО) 19