«МБС-Тест ВГС РНК количественный» Набор реагентов для выделения и количественного определения РНК вируса гепатита С методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени», ТУ 20.59.52-083-26329720-2025 — инструкция и характеристики

РУ: Г004-00110-00/05434526 от 29.06.2026 · класс риска 3

Производитель: ООО "МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ СОЮЗ" (Россия)

Вид изделия: Вирус гепатита С нуклеиновая кислота ИВД, набор, анализ нуклеиновых кислот

Назначение: Предназначен для выделения и количественного определения РНК вируса гепатита С образцов сыворотки (плазмы) крови, цельной крови и капиллярной крови методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов реакции в режиме реального времени. Функциональное назначение: Набор реагентов предназначен для выделения и количественного определения молекул РНК вируса гепатита C в сыворотке (плазме) крови, цельной крови и капиллярной крови с целью оценки вирусной нагрузки пациентов.

Автоматически отфильтрованный фрагмент инструкции по применению (страницы, где похоже, что есть таблица технических характеристик) — не полный документ. Карточка РУ на портале Росздравнадзора →

Текст инструкции: технические характеристики

Комплект 2
Вариант исполнения 2.1
2
3
6
Вариант исполнения 2.2
7
8
13
Вариант исполнения 2.3
14
15
19
Вариант исполнения 2.4
20
21
Комплект 4
27
Вариант исполнения 4.1
28
29
32
Вариант исполнения 4.2
33
34
38
Вариант исполнения 4.3
39
40
46
Вариант исполнения 4.4
47
48
1 НАЗНАЧЕНИЕ
«МБС-Тест ВГС РНК количественный» набор реагентов для выделения и
количественного определения РНК вируса гепатита C методом ОТ-ПЦР в режиме
реального времени», ТУ 20.59.52-083-26329720-2025 (далее по тексту – набор реагентов),
предназначен для выделения и количественного определения РНК вируса гепатита C (далее
по тексту - ВГC) из образцов сыворотки (плазмы) крови, цельной крови и капиллярной
крови человека (далее по тексту – анализируемые образцы) методом обратной транскрипции
и полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов
реакции в режиме реального времени (далее по тексту – ПЦР-РВ).
Функциональное назначение:
Набор реагентов предназначен для выделения и количественного определения
молекул РНК вируса гепатита C в сыворотке (плазме) крови, цельной крови и капиллярной
крови с целью оценки вирусной нагрузки пациентов.
Описание аналита:
Вирус гепатита С (ВГС) – РНК-содержащий вирус, который имеет тропность к
антигенам клеток печени. При попадании в организм человека он способен проникать в
гепатоциты, репродуцироваться в них, что сопровождается развитием воспалительного
процесса. Вирус отличается формированием большого количества мутаций в ходе своего
репродуктивного цикла, что позволяет ему длительное время обходить иммунитет.
Среди всех видов вирусного гепатита, гепатит С считается наиболее серьезным
заболеванием. Передача вируса происходит через контакт с зараженной кровью – чаще
всего, при использовании общих игл, при переливании крови, при использовании
нестерильных инструментов, инфицированных вирусом гепатита С, при нанесении
татуировок. Второй путь передачи - от матери к ребенку во время беременности и родов.
Количественная характеристика содержания РНК вируса гепатита С в клинических
образцах важна для оценки эффективности противовирусной терапии и имеет
прогностическое значение для определения хронизации этого гепатита.
Специфическое расстройство, состояние или фактор риска
Вирус гепатита С является РНК — содержащим вирусом семейства флавивирусов.
Вирус поражает клетки печени, приводит к развитию острых и хронических гепатитов.
Особенностью вируса гепатита С является бессимптомное течение в большинстве
случаев и высокая частота перехода острой формы заболевания в хроническую
(пожизненную) форму. Примерно у четверти больных хронический гепатит С приводит в
2
течение последующих десятилетий к развитию цирроза печени, что, в свою очередь, может
служить основой для формирования гепатоцеллюлярной карциномы (первичный рак
печени). Довольно часто ввиду преимущественного бессимптомного течения инфекции
заболевание впервые проявляется осложнениями цирроза печени.
Помимо воздействия на печень, вирус гепатита С способен вызывать
иммунологические реакции и системные поражения организма. Это связано с его
возможностью размножения не только в клетках печени, но и в клетках иммунной системы.
В качестве анализируемого образца используется сыворотка, плазма с цитратом
натрия или ЭДТА (К , К ), цельная кровь и капиллярная кровь человека.
2 3
Популяционные и демографические аспекты применения
Набор реагентов может быть использован для исследования всех групп населения без
градации по популяционному или демографическому признаку.
Область применения – клиническая лабораторная диагностика.
Показания к применению: оценка вирусной нагрузки пациентов.
Противопоказания к применению: не применимо.
Сокращенное наименование медицинского изделия для диагностики in vitro
«МБС-Тест ВГС РНК количественный».
Предназначенный пользователь набора реагентов
Только для профессионального использования.
Сотрудники клинико-диагностических лабораторий медицинских учреждений.
2 ПРИНЦИП МЕТОДА
Принцип метода основан на количественном определении содержания копий РНК
вируса гепатита C с использованием процесса амплификации участков генома ВГC с
помощью специфических к этим участкам праймеров и гибридизационных зондов
(флуоресцентно меченные зонды), MMLV-обратной транскриптазы и Taq ДНК-полимеразы
(входящей в состав «ПЦР-буфера») с последующим определением накопления
специфического флуоресцентного сигнала на амплификаторе с системой детекции
флуоресцентного сигнала в режиме реального времени.
Выявление наличия или отсутствия РНК ВГC и его количественное определение в
анализируемых образцах включает в себя две стадии:
1) выделение РНК из анализируемых образцов, включающее лизис образцов,
сорбцию РНК на магнитные частицы, отмывки и элюцию;
3
| Наименование компонента | Количество |  |  |  |
|  | кат № | кат № | кат № | кат № |
|  | Вариант исполнения 2.1 | Вариант исполнения 2.2 | Вариант исполнения 2.3 | Вариант исполнения 2.4 |
| Компоненты для выделения. Упаковка 1 | 1 шт. в составе: | 1 шт. в составе: | 1 шт. в составе: | 1 шт. в составе: |
| «ЛБ» – лизирующий раствор – прозрачная от бесцветного до коричневого цвета жид- кость с взвесью магнитных частиц корич- невого или черного цвета. Допускается расслоение на надосадочную жидкость и осадок магнитных частиц. Допускается выпадение кристаллов и хлопьев белого цвета. После встряхивания образуется од- нородный раствор со взвесью магнитных частиц коричневого или черного цвета. Опасные вещества: гуанидин тиоционат Консервант: не более 0,15% проклин 300 | 1 фл. (33,0 мл) | 1 фл. (33,0 мл) | 1 планшет 96 лунок по 300 мкл | 1 планшет 96 лунок по 300 мкл |
| «РП» – раствор для преципитации – про- зрачная бесцветная жидкость. | 1 фл. (55,0 мл) | 1 фл. (55,0 мл) | 1 фл. (55,0 мл) | 1 фл. (55,0 мл) |
2) амплификация методом ОТ-ПЦР в реальном времени, с использованием
специфических праймеров и гибридизационных зондов.
Для контроля анализа и выделения в составе ПЦР-смеси предусмотрены праймеры и
гибридизационные зонды, специфические для участка искусственной плазмиды
(экзогенный внутренний контроль). Внутренний контроль (ВКО) позволяет контролировать
этапы выделения нуклеиновых кислот и проведения ПЦР, отсутствие в образце ингибиторов
ПЦР. С учетом внутреннего контроля происходит пересчет количества копий/мл вируса в
анализируемом образце.
3 ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ
Набор реагентов поставляется нестерильным. Стерилизация перед применением не
требуется.
3.1 Состав набора реагентов
Набор реагентов выпускают в виде комплекта 2 и комплекта 4 на 100 реакций,
включая калибраторы и контрольные образцы.
Варианты исполнения 2.1, 2.2, 4.1 и 4.2 предназначены для ручной постановки ана-
лиза и с помощью автоматических станций для выделения нуклеиновых кислот (далее по
тексту – автоматические станции). Варианты исполнения 2.3, 2.4, 4.3 и 4.4 предназначены
для постановки анализа с помощью автоматических станций с магнитной головкой.
Состав комплекта 2 представлен в таблице 1, комплекта 4 в таблице 2.
Т а б л и ц а 1 – Состав комплекта 2
4
| Опасные вещества: изопропанол |  |  |  |  |  |  |  |
| «ПР» – буферный раствор для отмывки магнитных частиц – прозрачная бесцветная жидкость. Опасные вещества: изопропанол Консервант: не более 0,15% проклин 300 |  |  |  | 3 фл. (по 85,0 мл) | 3 фл. (по 85,0 мл) | 3 планшета 96 лунок по 750 мкл | 3 планшета 96 лунок по 750 мкл |
| «ЭР» – буферный раствор для элюции – прозрачная бесцветная жидкость. Консервант: не более 0,15% проклин 300 |  |  |  | 1 фл. (9,0 мл) | 1 фл. (9,0 мл) | 1 планшет 96 лунок по 75 мкл | 1 планшет 96 лунок по 75 мкл |
| Пакет 1, в составе: Планшет глубоколуночный 2,2 мл на 96 лунок – 1 шт. Гребенка для глубоколуночного планшета – 1 шт. |  |  |  | - | - | 1 шт. | 1 шт. |
|  | Гребенка для глубоколуночного планшета – 1 |  |  |  |  |  |  |
|  | шт. |  |  |  |  |  |  |
| Пакет 2, в составе: Пленка клейкая для планшетов – 1 шт. Ванночка для реагентов – 2 шт. |  |  |  | - | - | 1 шт. | 1 шт. |
| Пакет 3, в составе: Планшет для ПЦР на 96 лунок – 1 шт. Пленка для ПЦР – 1 шт. |  |  |  | 1 шт. | - | 1 шт. | - |
| Пакет 4, в составе: Микропробирки для ПЦР 8 штук/стрип – 12 шт. |  |  |  | - | 1 шт. | - | 1 шт. |
| Пакет 5, в составе: Крышки для микропробирок для ПЦР 8 штук/стрип – 12 шт. |  |  |  | - | 1 шт. | - | 1 шт. |
| Эксплуатационная документация: |  |  |  |  |  |  |  |
| Инструкция по применению набора реа- гентов |  |  |  | 1 шт. | 1 шт. | 1 шт. | 1 шт. |
| Компоненты для ПЦР-РВ. Упаковка 2 |  |  |  |  |  |  |  |
| Пакет 1, в составе: |  |  |  | 1 шт. | 1 шт. | 1 шт. | 1 шт. |
| «ПЦР-буфер» – буфер для полимеразной цепной реакции - прозрачная бесцветная жидкость. Консервант: не более 0,1% проклин 300 |  |  | 1 пр. (1,0 мл) |  |  |  |  |
| «ПЦР-смесь» –смесь для полимеразной цепной реакции – прозрачная светло- фиолетового цвета жидкость. Консервант: не более 0,1% проклин 300 |  |  | 1 пр. (0,6 мл) |  |  |  |  |
| Пакет 2, в составе: |  |  |  | 1 шт. | 1 шт. | 1 шт. | 1 шт. |
| «Фермент RT» - MMLV- обратная транскриптаза – прозрачная бесцветная вязкая жидкость |  |  | 1 пр. (0,15 мл) |  |  |  |  |
| «ОКО» – отрицательный контрольный образец – прозрачная бесцветная жидкость. |  |  | 1 пр. (1,0 мл) |  |  |  |  |
| «K1 2к» - калибратор 1 для комплекта 2– прозрачная бесцветная жидкость. |  |  |  | 1 пр. (1,0 мл) | 1 пр. (1,0 мл) | 1 пр. (1,0 мл) | 1 пр. (1,0 мл) |
| «K2 2к» – калибратор 2 для комплекта 2 – прозрачная бесцветная жидкость. |  |  |  | 1 пр. (1,0 мл) | 1 пр. (1,0 мл) | 1 пр. (1,0 мл) | 1 пр. (1,0 мл) |
| «ПКО» - положительный контрольный образец – прозрачная бесцветная жидкость. |  |  |  | 1 пр. (1,0 мл) | 1 пр. (1,0 мл) | 1 пр. (1,0 мл) | 1 пр. (1,0 мл) |
5
| Наименование компонента | Количество |  |  |  |
|  | кат № | кат № | кат № | кат № |
|  | Вариант исполнения 4.1 | Вариант исполнения 4.2 | Вариант исполнения 4.3 | Вариант исполнения 4.4 |
| Компоненты для выделения. Упаковка 1 | 1 шт. в составе: | 1 шт. в составе: | 1 шт. в составе: | 1 шт. в составе: |
| «ЛБ» – лизирующий раствор – прозрачная от бесцветного до коричневого цвета жид- кость с взвесью магнитных частиц корич- невого или черного цвета. Допускается расслоение на надосадочную жидкость и осадок магнитных частиц. Допускается выпадение кристаллов и хлопьев белого цвета. После встряхивания образуется од- нородный раствор со взвесью магнитных частиц коричневого или черного цвета. Опасные вещества: гуанидин тиоционат Консервант: не более 0,15% проклин 300 | 1 фл. (33,0 мл) | 1 фл. (33,0 мл) | 1 планшет 96 лунок по 300 мкл | 1 планшет 96 лунок по 300 мкл |
| «РП» – раствор для преципитации – про- зрачная бесцветная жидкость. Опасные вещества: изопропанол | 1 фл. (55,0 мл) | 1 фл. (55,0 мл) | 1 фл. (55,0 мл) | 1 фл. (55,0 мл) |
|  | 3 фл. (по 85,0 мл) | 3 фл. (по 85,0 мл) | 3 планшета 96 лунок по 750 мкл | 3 планшета 96 лунок по 750 мкл |
«ВКО» - внутренний контрольный
2 пр. 2 пр. 2 пр. 2 пр.
образец – прозрачная бесцветная
(по 1,2 мл) (по 1,2 мл) (по 1,2 мл) (по 1,2 мл)
жидкость.
Примечание
1 Паспорт на серию входит в комплект поставки набора реагентов. Число экземпляров паспорта каждой серии
определено в договоре на поставку продукции.
2 Паспорт безопасности предоставляется транспортной компании в количестве – 1 шт. и конечному
потребителю при запросе, количество экземпляров, определено в договоре на поставку продукции.
3 Планшет глубоколуночный 2,2 мл на 96 лунок - прозрачный бесцветный (нейтральный) планшет; материал
полипропилен; 96 лунок; объем лунки 2,2±0,22 мл; 44,3±0,4 мм (высота); 127,8±0,6 мм (длина); 85,5±0,4 мм (ширина);
массой 96,0±9,6 г.
4 Гребенка для глубоколуночного планшета - прозрачная бесцветная (нейтральная) гребенка; материал
полипропилен; 126,8±0,5 мм (длина); 85,2±0,3 мм (ширина); 48,0±0,3 мм (высота); массой 52,6±5,26 г.
5 Пленка клейкая для планшета - бесцветная прозрачная пленка; материал поливинилхлорид; 130,0±13,0 мм
(длина); 90,0±9,0 мм (ширина); массой 2,7±0,5 г.
6 Ванночка для реагентов - бесцветная или белая ванночка; 100±1,0 мм (длина); 50±5,0 мм (ширина); 19±1,9 мм
(высота); массой 2,25±0,5 г.
7 Планшет для ПЦР на 96 лунок - бесцветный прозрачный планшет; количество лунок 96; материал
полипропилен; 127,76±12,7 мм (длина); 85,48±8,5 мм (ширина); 80±8 мм (высота).
8 Пленка для ПЦР - бесцветная прозрачная пленка; материал полиолефин; 140,0±0,5 мм (длина) 78,0±0,3 мм
(ширина); массой 2,4±0,2 г.
9 Микропробирки для ПЦР 8 штук/стрип - бесцветные прозрачные пробирки, соединенные в один ряд (стрип),
количество в стрипе 8 шт.; материал полипропилен; объём лунки 0,20±0,02 мл; 80,0±8,0 мм (длина).
10 Крышки для микропробирок для ПЦР 8 штук/стрип - бесцветные прозрачные, соединенные в один ряд
(стрип), количество в стрипе 8 шт.; материал полипропилен; 80,0±8,0 мм (длина); 8,0±0,8 мм (ширина).
11 Метрологическая прослеживаемость значений, приписанных калибраторам, входящим в состав набора
реагентов, определена согласно ГОСТ ISO 17511 с использованием 6го международного стандарта ВОЗ РНК ВГC (6th
WHO International Standard for Hepatitis C Virus RNA for Nucleic Acid Amplification Techniques 18/184).
Т а б л и ц а 2 – Состав комплекта 4
6
| Опасные вещества: изопропанол Консервант: не более 0,15% проклин 300 |  |  |  |  |  |  |  |
| «ЭР» – буферный раствор для элюции – прозрачная бесцветная жидкость. Консервант: не более 0,15% проклин 300 |  |  |  | 1 фл. (9,0 мл) | 1 фл. (9,0 мл) | 1 планшет 96 лунок по 75 мкл | 1 планшет 96 лунок по 75 мкл |
| Пакет 1, в составе: Планшет глубоколуночный 2,2 мл на 96 лу- нок – 1 шт. Гребенка для глубоколуночного планшета – 1 шт. |  |  |  | - | - | 1 шт. | 1 шт. |
|  | Гребенка для глубоколуночного планшета |  |  |  |  |  |  |
|  | – 1 шт. |  |  |  |  |  |  |
| Пакет 2, в составе: Пленка клейкая для планшетов – 1 шт. Ванночка для реагентов – 2 шт. |  |  |  | - | - | 1 шт. | 1 шт. |
| Пакет 3, в составе: Планшет для ПЦР на 96 лунок – 1 шт. Пленка для ПЦР – 1 шт. |  |  |  | 1 шт. | - | 1 шт. | - |
| Пакет 4, в составе: Микропробирки для ПЦР 8 штук/стрип – 12 шт. |  |  |  | - | 1 шт. | - | 1 шт. |
| Пакет 5, в составе: Крышки для микропробирок для ПЦР 8 штук/стрип – 12 шт. |  |  |  | - | 1 шт. | - | 1 шт. |
| Эксплуатационная документация: |  |  |  |  |  |  |  |
| Инструкция по применению набора реа- гентов |  |  |  | 1 шт. | 1 шт. | 1 шт. | 1 шт. |
| Компоненты для ПЦР-РВ. Упаковка 2 |  |  |  |  |  |  |  |
| Пакет 1, в составе: |  |  |  | 1 шт. | 1 шт. | 1 шт. | 1 шт. |
| «ПЦР-буфер» – буфер для полимеразной цепной реакции - прозрачная бесцветная жидкость. Консервант: не более 0,1% проклин 300 |  |  | 1 пр. (1,0 мл) |  |  |  |  |
| «ПЦР-смесь» –смесь для полимеразной цепной реакции – прозрачная светло-фиолетового цвета жидкость. Консервант: не более 0,1% проклин 300 |  |  | 1 пр. (0,6 мл) |  |  |  |  |
| Пакет 2, в составе: |  |  |  | 1 шт. | 1 шт. | 1 шт. | 1 шт. |
| «Фермент RT» - MMLV- обратная транскриптаза – прозрачная бесцветная вязкая жидкость |  |  | 1 пр. (0,15 мл) |  |  |  |  |
| «ОКО» – отрицательный контрольный образец – прозрачная бесцветная жидкость. |  |  | 1 пр. (1,0 мл) |  |  |  |  |
| «K1 4к» - калибратор 1 для комплекта 4– прозрачная бесцветная жидкость. |  |  |  | 1 пр. (0,6 мл) | 1 пр. (0,6 мл) | 1 пр. (0,6 мл) | 1 пр. (0,6 мл) |
| «K2 4к» – калибратор 2 для комплекта 4 – прозрачная бесцветная жидкость. |  |  |  | 1 пр. (0,6 мл) | 1 пр. (0,6 мл) | 1 пр. (0,6 мл) | 1 пр. (0,6 мл) |
| «K3 4к» – калибратор 3 для комплекта 4 – прозрачная бесцветная жидкость. |  |  |  | 1 пр. (0,6 мл) | 1 пр. (0,6 мл) | 1 пр. (0,6 мл) | 1 пр. (0,6 мл) |
| «K4 4к» – калибратор 4 для комплекта 4 – прозрачная бесцветная жидкость. |  |  |  | 1 пр. (0,6 мл) | 1 пр. (0,6 мл) | 1 пр. (0,6 мл) | 1 пр. (0,6 мл) |
| «ПКО» - положительный контрольный образец – прозрачная бесцветная жидкость. |  |  |  | 1 пр. (1,0 мл) | 1 пр. (1,0 мл) | 1 пр. (1,0 мл) | 1 пр. (1,0 мл) |
7
«ВКО» - внутренний контрольный образец 2 пр. 2 пр. 2 пр. 2 пр.
– прозрачная бесцветная жидкость. (по 1,2 мл) (по 1,2 мл) (по 1,2 мл) (по 1,2 мл)
Примечание
1 Паспорт на серию входит в комплект поставки набора реагентов. Число экземпляров паспорта каждой серии
определено в договоре на поставку продукции.
2 Паспорт безопасности предоставляется транспортной компании в количестве – 1 шт. и конечному
потребителю при запросе, количество экземпляров, определено в договоре на поставку продукции.
3 Планшет глубоколуночный 2,2 мл на 96 лунок - прозрачный бесцветный (нейтральный) планшет; материал
полипропилен; 96 лунок; объем лунки 2,2±0,22 мл; 44,3±0,4 мм (высота); 127,8±0,6 мм (длина); 85,5±0,4 мм (ширина);
массой 96,0±9,6 г.
4 Гребенка для глубоколуночного планшета - прозрачная бесцветная (нейтральная) гребенка; материал
полипропилен; 126,8±0,5 мм (длина); 85,2±0,3 мм (ширина); 48,0±0,3 мм (высота); массой 52,6±5,26 г.
5 Пленка клейкая для планшета - бесцветная прозрачная пленка; материал поливинилхлорид; 130,0±13,0 мм
(длина); 90,0±9,0 мм (ширина); массой 2,7±0,5 г.
6 Ванночка для реагентов - бесцветная или белая ванночка; 100±1,0 мм (длина); 50±5,0 мм (ширина); 19±1,9 мм
(высота); массой 2,25±0,5 г.
7 Планшет для ПЦР на 96 лунок - бесцветный прозрачный планшет; количество лунок 96; материал
полипропилен; 127,76±12,7 мм (длина); 85,48±8,5 мм (ширина); 80±8 мм (высота).
8 Пленка для ПЦР - бесцветная прозрачная пленка; материал полиолефин; 140,0±0,5 мм (длина) 78,0±0,3 мм
(ширина); массой 2,4±0,2 г.
9 Микропробирки для ПЦР 8 штук/стрип - бесцветные прозрачные пробирки, соединенные в один ряд (стрип),
количество в стрипе 8 шт.; материал полипропилен; объём лунки 0,20±0,02 мл; 80,0±8,0 мм (длина).
10 Крышки для микропробирок для ПЦР 8 штук/стрип - бесцветные прозрачные, соединенные в один ряд
(стрип), количество в стрипе 8 шт.; материал полипропилен; 80,0±8,0 мм (длина); 8,0±0,8 мм (ширина).
11 Метрологическая прослеживаемость значений, приписанных калибраторам, входящим в состав набора
реагентов, определена согласно ГОСТ ISO 17511 с использованием 6го международного стандарта ВОЗ РНК ВГC (6th
WHO International Standard for Hepatitis C Virus RNA for Nucleic Acid Amplification Techniques 18/184).
3.2 Число анализируемых образцов биологического материала
Набор реагентов предназначен для ручных и автоматических постановок анализа и
рассчитан на выполнение 100 определений (тестов), включая калибраторы и контрольные
образцы.
4 АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА РЕАГЕНТОВ
4.1 Предел обнаружения
Предел обнаружения был определен с помощью 6го международного стандарта ВОЗ
РНК ВГC (6th WHO International Standard for Hepatitis C Virus RNA for Nucleic Acid
Amplification Techniques 18/184). Предел обнаружения для всех типов анализируемых
образцов составляет 20 копий/мл или 7,4 МЕ/мл.
4.2 Аналитическая специфичность
4.2.1 Анализ in silico
Для анализа in silico были взяты генетические последовательности инфекционных
агентов наиболее близких к ВГC, либо тех что могут встретиться у болеющих ВГC.
Таблица 3 Инфекционные агенты, вовлеченные в анализ:
8
| Инфекционный агент | № последовательности в Genbank | Инфекционный агент | № сборки генома в Genbank |
| Вирус гепатита А | NC_001489.1 | Пикорнавирусы | GCF_000860505.1 |
| Вирус гепатита B | NC_003977.2 | Гепаднавирусы | GCF_000861825.2 |
| Вирус гепатита D | NC_059681.1 | Kolmioviridae | GCF_018547865.1 |
| Вирус иммунодефицита человека | NC_001802.1 | Ретровирусы | GCF_000864765.1 |
| цитомегаловирус | NC_006273.2 | Герпесвирусы | GCF_000845245.1 |
| вирус Эпштейна- Барр | NC_007605.1 | Герпесвирусы | GCF_002402265.1 |
| вирус простого герпеса типы 1, 2 | NC_001806.2 NC_001798.2 | Герпесвирусы | GCF_000859985.2 GCF_000858385.2 |
| вирус ветряной оспы | NC_001348.1 | Герпесвирусы | GCF_000858285.1 |
| вирус герпеса человека типы 6, 8 | NC_001664.4 NC_009333.1 | Герпесвирусы | GCF_000845685.2 GCF_000838265.1 |
| парвовирус В19 | NC_000883.2 | Парвовирусы | GCF_000839645.1 |
| вирус клещевого энцефалита | NC_001672.1 | Flaviviridae | GCF_000863125.1 |
| вирус лихорадки западного Нила | NC_001563.2 | Flaviviridae | GCF_000861085.1 |
| аденовирус типы 2, 3, 7 | AC_000007.1 PP068614.1 AC_000018.1 | Аденовирусы | GCF_000859465.1 - GCF_000859485.1 |
| Legionella pneumophila | NZ_CP013742.1 | Бактерия | GCF_001941585.1 |
| Streptococcus pneumoniae | NZ_LN831051.1 | Бактерия | GCF_001457635.1 |
| Staphylococcus aureus | NC_007795.1 | Бактерия | GCF_000013425.1 |
Для анализа использовали доступные он-лайн ресурсы: BLAST
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), а также MUSCLE (https://www.ebi.ac.uk
/Tools/msa/muscle/).
В наборе реагентов реализована методика количественного определения гена-
мишени через специфическую амплификацию. Специфические олигонуклеотидные
последовательности с флуоресцентной меткой и без таковой были разработаны таким
образом, чтобы избежать любой неспецифической амплификации ДНК, выделенной из
анализируемых образцов. Анализ специфичности был проведен in silico с использованием
базы данных BLAST, который не выявил существенной гомологии с другими генными
мишенями.
9
4.2.2 Анализ in vitro
Для анализа in vitro было проанализировано 60 образцов сыворотки (плазмы) крови,
цельной крови и капиллярной крови человека на другие инфекции близкие к ВГC, либо тех
что могут встретиться у болеющих ВГC – вирус гепатита A, вирус гепатита B, вирус
гепатита D, вирус иммунодефицита человека, Legionella pneumophila, Streptococcus
pneumoniae. Проведенный анализ in vitro показал отсутствие ложноположительных
результатов в анализируемых образцах, содержащих проанализированные инфекционные
агенты.
4.3 Потенциально интерферирующие вещества
При выделении нуклеиновых кислот (далее по тексту – НК) из анализируемых
образцов гемоглобин (до 160 мг/мл), триглицериды (до 50 мг/мл), общий билирубин (до 60
мг/мл) не влияют на результат анализа.
Гуанидин тиоцианат (до 50 мМ), мочевина (до 50 мМ), изопропиловый спирт (до 5 %)
– вещества, которые могут попадать в образец при выделении НК (из компонентов для
выделения набора реагентов) не влияют на результат анализа.
4.4 Линейный диапазон
Линейный диапазон количественного определения копийности РНК ВГC составляет
от 50 до 2,7*108 копий/мл (от 18,5 до 1*108 МЕ/мл).
4.5 Воспроизводимость
Внутрисерийная воспроизводимость анализа была протестирована в ходе клинико-
лабораторных испытаний с использованием 10 положительных и 10 отрицательных
образцов сыворотки крови, в 5 повторах на наборах реагентов одной серии. Коэффициент
вариации не превысил 8%.
Межсерийная воспроизводимость анализа была протестирована в ходе клинико-
лабораторных испытаний с использованием 10 положительных и 10 отрицательных
образцов сыворотки крови, на 2 сериях набора реагентов. Коэффициент вариации не
превысил 8%.
4.6 Точность измерения
Точность измерения в ходе дополнительных технических испытаний была оценена на
образцах панели стандартных контрольных образцов «СКО ВГC», аттестованной ОБТК
предприятия. Точность измерения – достаточная.
10
4.7 Правильность измерения
Правильность измерения в ходе дополнительных технических испытаний была
оценена на образцах панели стандартных контрольных образцов «СКО ВГC»,
аттестованной ОБТК предприятия. Правильность измерения – достаточная.
4.8 Эффективность амплификации
Эффективность амплификации по HEX от 90% до 110%.
5 ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА РЕАГЕНТОВ
При определении диагностической чувствительности и диагностической
специфичности в ходе клинических испытаний было использовано 1170 образцов
(сыворотки крови, плазмы (К2ЭДТА, К3ЭДТА, цитрат натрия), цельной и капиллярной
крови).
Диагностическая чувствительность набора реагентов (с доверительной вероятностью
95%) составила 100 % (98,8-100%).
Диагностическая специфичность набора реагентов (с доверительной вероятностью
95%) составила 100 % (99,4-100%).
6 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ И РИСКИ ПРИМЕНЕНИЯ НАБОРА
РЕАГЕНТОВ
Потенциальный риск применения набора реагентов – класс 3 (Приказ МЗ РФ №4н от
06.06.2012 г.).
При работе с набором реагентов соблюдать требования ГОСТ Р 52905-2007 (ИСО
15190:2003) «Лаборатории медицинские. Требования безопасности», СанПиН 3.3686-21
«Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней»,
методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих
методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микро-
организмы I–IV групп патогенности» и СП 2.1.3678-20 «Санитарно-эпидемиологические
требования к эксплуатации помещений, зданий, сооружений, оборудования и транспорта, а
также условиям деятельности хозяйствующих субъектов, осуществляющих продажу това-
ров, выполнение работ или оказание услуг».
К работе с набором реагентов допускают специально обученный персонал, прошед-
ший дополнительное профессиональное обучение правилам безопасной работы с микроор-
ганизмами III-IV групп патогенности и молекулярно-генетическим методам.
11
Компоненты набора реагентов «ЛБ», «ПР», «ЭР» содержат в качестве консерванта не
более 0,15 % проклина 300. Компоненты набора реагентов «ПЦР буфер», «ПЦР-смесь» со-
держат в качестве консерванта не более 0,1 % проклина 300.
Изопропанол, входящий в состав компонентов «РП» и «ПР», обладает раздражающим
действием. Следует избегать разбрызгивания и попадания на кожу и слизистые. Использо-
вать только в хорошо вентилируемом помещении! Избегать разбрызгивания, вдыхания, про-
глатывания и попадания компонента на кожу, слизистые и в глаза! Беречь от источников
воспламенения / нагревания / искр / открытого огня! При пожаре тушить огнетушителями
на основе диоксида углерода, порошковым средством для тушения или водяной струей мел-
кого разбрызгивания. При борьбе с крупными пожарами применять водяную струю мелкого
разбрызгивания или спиртоустойчивую пену. Полноструйная вода НЕ пригодна для туше-
ния!
Гуанидин тиоцианат, входящий с состав компонента «ЛБ», обладает раздражающим
действием. Следует избегать разбрызгивания и попадания их на кожу и слизистые.
При проглатывании компонентов набора реагентов прополоскать полость рта, обра-
титься за медицинской помощью при плохом самочувствии. НЕ вызывать рвоту! При вды-
хании компонентов набора реагентов выйти на свежий воздух, обратиться за медицинской
помощью при плохом самочувствии. При попадании компонентов набора реагентов на кожу
и/или одежду немедленно снять всю загрязненную одежду, промыть кожу проточной водой,
обратиться за медицинской помощью при плохом самочувствии. При попадании компонен-
тов набора реагентов в глаза осторожно промыть глаза проточной водой в течение несколь-
ких минут. Снять контактные линзы (при наличии), если это легко сделать. Продолжить
промывание глаз. Немедленно обратиться за медицинской помощью!
Все реактивы, входящие в состав компонентов набора реагентов в используемых
концентрациях, являются нетоксичными.
Все использованные материалы, инструменты и оборудование, рабочее место дезин-
фицировать в соответствии с требованиями СанПиН 3.3686-21 и МУ 287-113.
Обеззараживание и/или обезвреживание и утилизацию всех анализируемых образцов,
компонентов и отходов набора реагентов, несущих потенциальную биологическую
опасность, производить в соответствии с разделом «Утилизация набора реагентов»
настоящей инструкции по применению. При удалении отходов после амплификации
(пробирок, содержащих продукты ПЦР) недопустимо открывание пробирок и
разбрызгивание содержимого, поскольку это может привести к контаминации продуктами
ПЦР лабораторной зоны, оборудования и реагентов.
12
7 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, ПРЕДУСМОТРЕННЫЕ ДЛЯ
ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КОМБИНАЦИИ С НАБОРОМ РЕАГЕНТОВ
7.1 При ручной постановке анализа необходимо нижеперечисленное
оборудование и материалы:
− амплификатор с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени: планшет-
ного или роторного типа; с 3, 4, 5 или 6 каналами детекции; возможностью флуоресцентной
детекции на каналах FAM/Green и R6G/JOE/HEX/VIC/Yellow; с возможностью градиента
температур внутреннего блока от 30 °С до 99 °С, например: термоциклер для амплификации
нуклеиновых кислот 1000, производства "Био-Рад Лабораториез, Инк.", США (РУ ФСЗ
2008/03399) или амплификатор нуклеиновых кислот CFX Opus 96 Dx с детекцией продуктов
ПЦР в режиме реального времени, производства «Био-Рад Лабораториез, Инк.», США (РУ
РЗН 2022/18397) или амплификатор детектирующий «ДТпрайм» по ТУ 9443-004-96301278-
2010, производства ООО "НПО ДНК-Технология", Россия (РУ ФСР 2011/10229) или ампли-
фикатор детектирующий «ДТлайт» по ТУ 9443-003-96301278-2010, производства ООО
"НПО ДНК-Технология", Россия (РУ ФСР 2011/10228) или прибор для проведения полиме-
разной цепной реакции в режиме реального времени Rotor-Gene Q, производства «КИАГЕН
ГмбХ», Германия (РУ ФСЗ 2010/07595) или амплификатор нуклеиновых кислот Applied
Biosystems QuantStudio 5 с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в
режиме реального времени, производства "Лайф Текнолоджис Холдингс Пте. Лтд", Синга-
пур (РУ РЗН 2019/8446) и аналогичные;
− бокс биологической безопасности 2-го класса;
− бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс);
− морозильная камера, поддерживающая температуру от минус 24 до минус 16 °С
или холодильник с морозильной камерой, поддерживающий температуру от минус 24 до
минус 16 °С.
− микроцентрифуга;
− термостат или термостатирующий шейкер, поддерживающие температуру
(80 ± 1) °С;
− встряхиватель для пробирок, типа вортекс (далее по тексту - вортекс);
− вакуумный отсасыватель (аспиратор) для удаления надосадочной жидкости (при
необходимости);
− одноканальные полуавтоматические дозаторы пипеточные с переменным или фик-
13
сированным объемом, позволяющие отбирать объемы жидкостей от 1 до 1000 мкл, аттесто-
ванные по значению средней дозы и сходимости результатов, погрешность измерения кото-
рых должна быть не более 3 %;
− многоканальные (8-ми или 12-ти канальные) полуавтоматические дозаторы пипе-
точные с переменным объемом, позволяющие отбирать объемы жидкостей от 1 до 1000 мкл,
аттестованные по значению средней дозы и сходимости результатов, погрешность измере-
ния которых должна быть не более 3 %;
− штативы для микропробирок вместимостью 0,2 и 2,0 мл;
− контейнер для сбора и обеззараживания наконечников;
− одноразовые наконечники для полуавтоматических одноканальных дозаторов пипе-
точных с аэрозольным барьером;
− пробирки одноразовые полипропиленовые вместимостью 1,5 – 2,0 мл, сертифици-
рованные на отсутствие РНКаз и ДНКаз;
− магнитный штатив или магнитный стержень;
− халат, шапочки, обувь и одноразовые нестерильные неопудренные медицинские
перчатки.
7.2 При постановке анализа на автоматической станции необходимо:
− автоматические станции для выделения и очистки нуклеиновых кислот из различ-
ных типов биоматериала, основанные на методе магнитной сепарации, использующие глу-
боколуночные планшеты, например автоматическая станция для выделения нуклеиновых
кислот с принадлежностями для ПЦР исследований: процессор магнитных частиц для
очистки нуклеиновых кислот, клеток и белков KingFisher Flex, производства «Термо Фишер
Сайентифик», Финляндия (РУ ФСЗ 2009/05562), или система для автоматического выделе-
ния и очистки нуклеиновых кислот из биологического материала AutoPure 96, производства
ООО «Ханьчжоуская компания инструментов» Китай, (РУ РЗН 2022/16430) или аналогич-
ные;
– автоматические дозирующие модульные роботизированные платформы, которые
осуществляют дозирование жидких образцов и реагентов из лабораторного пластика любого
типа, а также способные перемещать этот пластик между широким спектром интегрирован-
ных устройств, например станция для раскапывания: станция дозирующая автоматическая
Microlab STARlet с принадлежностями производства «Гамильтон Бонадуц AГ», Швейцария
14
(РУ РЗН 2018/6981) или анализатор автоматический модульный Freedom EVO с принадлеж-
ностями, производства «ТЕКАН Швайц АГ», Швейцария (РУ ФСЗ 2008/03047) или ПЦР-
станция для автоматического выделения нуклеиновых кислот (Fully automated nucleic acid
extractor) ADC CH-196 (РУ № РЗН 2024/23110) или аналогичные;
− амплификатор с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени
(далее по тексту - амплификатор): планшетного или роторного типа; с 3, 4, 5 или 6 каналами
детекции; возможностью флуоресцентной детекции на каналах FAM/Green и
R6G/JOE/HEX/VIC/Yellow; с возможностью градиента температур внутреннего блока от 30
°С до 99 °С, например: термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот 1000,
производства "Био-Рад Лабораториез, Инк.", США (РУ ФСЗ 2008/03399) или амплификатор
нуклеиновых кислот CFX Opus 96 Dx с детекцией продуктов ПЦР в режиме реального
времени, производства «Био-Рад Лабораториез, Инк.», США (РУ РЗН 2022/18397) или
амплификатор детектирующий «ДТпрайм» по ТУ 9443-004-96301278-2010, производства
ООО "НПО ДНК-Технология", Россия (РУ ФСР 2011/10229) или амплификатор
детектирующий «ДТлайт» по ТУ 9443-003-96301278-2010, производства ООО "НПО ДНК-
Технология", Россия (РУ ФСР 2011/10228) или прибор для проведения полимеразной
цепной реакции в режиме реального времени Rotor-Gene Q, производства «КИАГЕН ГмбХ»,
Германия (РУ ФСЗ 2010/07595) или амплификатор нуклеиновых кислот Applied Biosystems
QuantStudio 5 с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме
реального времени, производства "Лайф Текнолоджис Холдингс Пте. Лтд", Сингапур (РУ
РЗН 2019/8446) и аналогичные;
− бокс биологической безопасности 2-го класса;
− бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс);
− морозильная камера, поддерживающая температуру от минус 24 до минус 16 °С
или холодильник с морозильной камерой, поддерживающей температуру от минус 24 до
минус 16 °С.
− микроцентрифуга;
− термостат или термостатирующий шейкер, поддерживающие температуру
(80 ± 1) °С;
− вортекс;
15
− одноканальные полуавтоматические дозаторы пипеточные с переменным или фик-
сированным объемом, позволяющие отбирать объемы жидкостей от 1 до 1000 мкл, аттесто-
ванные по значению средней дозы и сходимости результатов, погрешность измерения кото-
рых должна быть не более 3 %;
− многоканальные (8-ми или 12-ти канальные) полуавтоматические дозаторы пипе-
точные с переменным объемом, позволяющие отбирать объемы жидкостей от 1 до 1000 мкл,
аттестованные по значению средней дозы и сходимости результатов, погрешность измере-
ния которых должна быть не более 3 %;
− штативы для микропробирок вместимостью 0,2 и 2,0 мл;
− магнитная подставка для глубоколуночных планшетов (при наличии);
− контейнер для сбора и обеззараживания наконечников;
− одноразовые наконечники для полуавтоматических одноканальных дозаторов пипе-
точных с аэрозольным барьером;
− планшеты глубоколуночные 2,2 мл на 96 лунок и 0,5 мл на 96 лунок (для вариантов
исполнения 2.1, 2.2, 4.1 и 4.2);
− насадка на магнитные стержни;
− ванночки для реагентов;
− халат, шапочки, обувь и одноразовые нестерильные неопудренные медицинские
перчатки.
8 АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ
Идентификацию и прослеживаемость анализируемых образцов проводить в
соответствии с системой менеджмента качества лаборатории.
ВНИМАНИЕ! Выделять НК из образцов сыворотки (плазмы) крови, цельной крови
или капиллярной крови человека необходимо только с помощью «Компонентов для выде-
ления. Упаковка 1», входящих в состав набора реагентов.
Забор цельной и капиллярной крови проводить в соответствии с «ГОСТ Р 59778-2021.
Процедуры взятия проб венозной и капиллярной крови для лабораторных исследований».
После забора пробирку обязательно аккуратно перевернуть несколько раз вверх дном, чтобы
кровь в пробирке тщательно перемешалась с антикоагулянтом.
Для получения сыворотки крови образец цельной крови человека инкубируют при
комнатной температуре в течение 30 мин до полного образования сгустка или при 370С на
15 мин. Центрифугируют при комнатной температуре в течение 20 мин при 1600 g.
Перенести сыворотку крови человека отдельными наконечниками с фильтром в пробирки
16
объемом 1,5 или 2,0 мл. Сыворотка не должна быть гемолизированной. Образец готов к
проведению анализа.
ВНИМАНИЕ! Образцы цельной крови НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ!
Антикоагулянты: К2ЭДТА, К3ЭДТА и цитрат натрия человека не влияют на
результаты анализа.
ВНИМАНИЕ! НЕЛЬЗЯ использовать для забора крови вакуумные системы,
содержащие в качестве антикоагулянта соли гепарина!
В соответствии с «МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих
методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим
микроорганизмы I-IV групп патогенности», перед выделением НК образцы цельной крови
могут храниться и транспортироваться:
- в течение 48 часов при температуре от 2 до 8 °С или
- в течение 8 часов при температуре от 20 до 25 °С.
После хранения образцов нужно их доводить до комнатной температуры и
переворачивать 3-6 кратным переворачиванием пробирки для перемешивания.
Для выделения НК из сыворотки (плазмы) крови, цельной крови или капиллярной
крови необходимо 200 мкл биологического образца.
Выделенные образцы НК из образцов сыворотки (плазмы) крови, цельной крови или
капиллярной крови допускается хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение одного часа,
при температуре от минус 24 до минус 16 °С в течение 2-х недель и при температуре ниже
минус 65 °С в течение года. Для хранения НК необходимо, не захватывая магнитные
частицы, перенести надосадочную жидкость после выделения НК в новую чистую пробирку
имеющую специальную маркировку RNase-free, DNase-free. Объем образцов НК,
выделенных из сыворотки (плазмы) крови, цельной крови или капиллярной крови
необходимый для проведения анализа ПЦР-РВ составляет 35 мкл.
9 ОЖИДАЕМЫЕ И ПРЕДСКАЗУЕМЫЕ ПОБОЧНЫЕ ЭФФЕКТЫ,
СВЯЗАННЫЕ С ПРИМЕНЕНИЕМ НАБОРА РЕАГЕНТОВ
Побочные эффекты, связанные с применением набора реагентов, такие как получение
ложноположительных и ложноотрицательных результатов, могут наблюдаться в
следующих случаях:
Использование компонентов с истекшим сроком годности.
17
Использование «Компоненты для выделения. Упаковка 1» и «Компоненты для ПЦР-
РВ. Упаковка 2» из наборов реагентов разных серий или смешивание их в процессе приго-
товления растворов.
Использование компонентов из наборов реагентов других производителей.
Несоблюдение условий и сроков хранения вскрытых компонентов в случае частичной
постановки.
Использование для приготовления реакционной смеси нестерильных пробирок.
Несоблюдение условий хранения анализируемых образцов, которое может привести
к разрушению аналита или появлению в анализируемом образце веществ, искажающих ре-
зультат анализа.
Неправильное дозирование растворов, которое приводит как к росту, так и к сниже-
нию регистрируемой флуоресценции.
Изменение концентрации раствора за счет испарения жидкости из открытого флакона
с компонентом.
Использование оборудования, не прошедшего регламентированного периодического
технического обслуживания и/или поверки/аттестации и/или эксплуатирующегося не в со-
ответствии с инструкцией по применению на данное оборудование.
Использование для работы с компонентами, анализируемыми и контрольными образ-
цами нестерильных наконечников.
Внесение анализируемых образцов одним наконечником.
Использование для дезинфекции посуды, оборудования, материалов и рабочих по-
верхностей неразрешенных и/или оказывающих влияние на результат ПЦР-РВ дезинфици-
рующих средств. Рекомендуется использовать, например, дезсредства: хлорамин и другие
хлорсодержащие средства.
Рекомендуется использовать неопудренные перчатки и одноразовые нарукавники.
10 ПОДГОТОВКА «КОМПОНЕНТЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ. УПАКОВКА 1»
НАБОРА РЕАГЕНТОВ, КОМПЛЕКТ 2
Варианты исполнения 2.1 и 2.2
Для выделения НК из анализируемых образцов использовать «Компоненты для выде-
ления. Упаковка 1» и часть из «Компоненты для ПЦР-РВ. Упаковка 2», входящие в состав
набора реагентов.
Извлечь из коробки набора реагентов «ЛБ», «РП», «ПР», «ЭР», «К1 2к», «К2 2к»,
«ПКО», «ОКО» и «ВКО» проверить целостность упаковки и срок годности каждого
18
компонента набора реагентов. При обнаружении повреждения или при истечении срока
годности компоненты набора реагентов следует обработать в соответствии с разделом
«Утилизация набора реагентов» настоящей инструкции по применению. Перед
применением все вышеперечисленные компоненты инкубировать при комнатной
температуре (от 15 до 25 °С) в течение 15 мин., затем аккуратно перемешать содержимое
флаконов.
ВНИМАНИЕ! При наличии во флаконах с компонентами «ЛБ» кристаллического
осадка или хлопьев необходимо прогреть их содержимое при 65 °С до полного растворения
осадка.
Хранение: неиспользованные и вcкрытые компоненты «ЛБ», «ПР», «РП», «ЭР»,
хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение срока годности набора реагентов. «К1 2к»,
«К2 2к», «ПКО», «ОКО» и «ВКО» от минус 24 до минус 16 °С в течение срока годности
набора реагентов.
Варианты исполнения 2.3 и 2.4
Извлечь из коробки набора реагентов «ЛБ», «РП», «ПР», «ЭР», «К1 2к», «К2 2к»,
«ПКО», «ОКО» и «ВКО» проверить целостность упаковки и срок годности каждого
компонента набора реагентов. При обнаружении повреждения или при истечении срока
годности компоненты набора реагентов следует обработать в соответствии с разделом
«Утилизация набора реагентов» настоящей инструкции по применению. Перед
применением все вышеперечисленные компоненты инкубировать при комнатной
температуре (от 15 до 25 °С) в течение 15 мин. Затем процентрифугировать на центрифуге
для планшетов все предразлитые планшеты.
Хранение: неиспользованные компоненты «ЛБ», «ПР», «ЭР», а также вскрытые и
неиспользованные флаконы «РП» хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение срока
годности набора реагентов. Вскрытые и не использованные пробирки «К1 2к», «К2 2к»,
«ПКО», «ОКО» и «ВКО» хранить от минус 24 до минус 16 °С в течение срока годности
набора реагентов. Вскрытые предразлитые планшеты с компонентами, «ЛБ», «ПР», «ЭР» не
хранятся.
ВЫДЕЛЕНИЕ НК ИЗ ОБРАЗЦОВ
ВНИМАНИЕ! При работе с биоматериалами необходимо использовать только
одноразовые стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку
RNase-free, DNase-free. Для проведения всех манипуляций использовать одноразовые наконечники с
фильтрами.
19
10.1 Ручная методика выделения НК:
10.1.1 Предварительная подготовка анализируемых образцов
10.1.1.1 Промаркировать по одной одноразовой пластиковой пробирке объёмом 1,5
мл для каждого анализируемого образца. Также промаркировать по одной пробирке под
«ПКО», «ОКО», «К1 2к», «К2 2к».
10.1.1.2 Разморозить «ПКО», «ОКО», «К1 2к», «К2 2к» и «ВКО», перемешать и
скинуть капли на вортексе.
10.1.1.3 Перемешать анализируемые образцы вручную, переворачивая пробирку 8-10
раз.
10.1.1.4 Отобрать в каждую промаркированную пробирку по 200 мкл
соответствующего анализируемого образца или «ПКО», «ОКО», «К1 2к», «К2 2к». Добавить
в каждую пробирку по 20 мкл «ВКО». Перемешать на вортексе, скинуть капли. Если
предполагается разовое выделение 96 образцов, без последующего использования набора
реагентов, то допускается добавить 2200 мкл «ВКО» в весь объем «ЛБ» (33 мл), тогда
отдельно добавлять в каждую пробирку «ВКО» не требуется.
10.1.2 Процедура экстракции НК
ВНИМАНИЕ! Необходимо периодически встряхивать «ЛБ» для перемешивания
магнитных частиц во время разнесения его по пробиркам.
ВНИМАНИЕ! При выполнении процедуры по пп. 10.1.2.1-10.1.2.7 рекомендуется
открывать крышку только той пробирки, с которой идет работа, и сразу закрывать её после
проведения манипуляции. НЕ открывать сразу несколько пробирок, для исключения
контаминации!
10.1.2.1 В пробирку с предварительно подготовленными 220 мкл образца + «ВКО»
(анализируемого образца или «ПКО», «ОКО», «К1 2к», «К2 2к» (п. 10.1.1.4)) внести 300 мкл
«ЛБ» перемешать пипетированием, затем 500 мкл «РП», перемешать содержимое пробирок
на вортексе в течение 3 сек. Если в ЛБ предварительно добавлялось «ВКО», то в пробирку
с предварительно подготовленными 200 мкл образца (анализируемым образцом или
«ПКО», «ОКО», «К1 2к», «К2 2к» (п. 10.1.1.4)) внести 320 мкл «ЛБ» перемешать
пипетированием, затем внести 500 мкл «РП», перемешать содержимое пробирок на вортексе
в течение 3 сек.
ВНИМАНИЕ! Обязательно использовать отдельный одноразовый наконечник для
каждой манипуляции, чтобы исключить контаминацию компонентов «ЛБ» и «РП».
20
10.1.2.2 Инкубировать пробирки в твердотельном термостате при температуре 75 °С
в течение 15 минут. Перемешивать содержимое на вортексе 3 сек каждые 2 минуты.
10.1.2.3 После инкубации перемешать образцы на вортексе в течение 5 сек и осадить
капли на миницентрифуге на максимальном количестве оборотов.
10.1.2.4 Поместить пробирки в магнитный штатив, выдержать 1-2 минуты, затем
отобрать надосадочную жидкость из пробирок с помощью вакуумного отсасывателя или пи-
петочного дозатора, не задевая магнитных частиц.
ВНИМАНИЕ! Держать пробирки в магнитном штативе при удалении надосадочной
жидкости. Использовать отдельный одноразовый наконечник с аэрозольным барьером (при
использовании пипеточного дозатора) или без такового (при использовании вакуумного
отсасывателя) для каждого анализируемого образца.
ВНИМАНИЕ! При добавлении раствора, пробирки не вынимать из магнитного
штатива! На каждом этапе необходимо убедиться, что магнитные частицы все время
остаются смоченными растворами.
НЕ ДОПУСКАТЬ высыхания магнитных частиц!
10.1.2.5 Внести по 750 мкл «ПР» в каждую пробирку.
10.1.2.6 Закрыть пробирки, перемешать содержимое пробирок переворачиванием
магнитного штатива 8-10 раз. НЕ ВЫНИМАТЬ ПРОБИРКИ ИЗ МАГНИТНОГО ШТА-
ТИВА! Отобрать надосадочную жидкость пипеточным дозатором или вакуумным отсасы-
вателем из пробирок и с крышек пробирок, не задевая магнитных частиц, и держа пробирки
в магнитном штативе.
10.1.2.7 Повторить процедуру отмывки магнитных частиц по пп. 10.1.2.5-10.1.2.6 еще
два раза. После последней отмывки собрать остаток «ПР» из-под крышки пробирки.
Общее количество отмывок – 3.
10.1.2.8 Открыть пробирки и подсушить осадок магнитных частиц в твердотельном
термостате при температуре 65 °С в течение 3-х минут.
10.1.2.9 Не вынимая пробирки из твердотельного термостата добавить на дно проби-
рок по 75 мкл «ЭР». Закрыть крышки пробирок.
10.1.2.10 Проверить, что «ЭР» полностью покрывает магнитные частицы, иначе акку-
ратно перемешать в течение 1-3 секунд на вортексе.
10.1.2.11 Инкубировать пробирки в твердотельном термостате при температуре 65 °С
в течение 10 минут. Перемешивать содержимое на вортексе по 3 сек каждые 2 минуты.
10.1.2.12 После инкубации перемешать образцы на вортексе в течение 5 сек и осадить
капли на миницентрифуге на максимальном количестве оборотов.
21
10.1.2.13 Образцы выделенных НК готовы для постановки ПЦР анализа.
10.1.2.14 Перед внесением в реакционную смесь пробирки с образцами выделенных
НК необходимо поставить на магнитный штатив.
ВНИМАНИЕ! Отбирать образец выделенной НК для постановки ПЦР анализа необ-
ходимо аккуратно, избегая попадания магнитных частиц в наконечник пипеточного доза-
тора.
Образцы выделенных НК могут храниться при температуре от 2 до 8 °С в течение
одного часа, при температуре от минус 24 до минус 16 °С в течение 2-х недель и при темпе-
ратуре ниже минус 65 °С в течение года. Для хранения НК необходимо, не захватывая маг-
нитные частицы, перенести надосадочную жидкость после выделения НК в новую чистую
пробирку имеющую специальную маркировку RNase-free, DNase-free.
10.2 Методика выделения НК с использованием автоматических дозирующих
станций
ВНИМАНИЕ! При использовании автоматической станции для выделения НК
необходимо ознакомиться с инструкцией по эксплуатации данной автоматической станции
и запрограммировать последовательность действий (при необходимости обратиться в
компанию, обслуживающую автоматическую дозирующую станцию), указанную ниже.
10.2.1 Подготовка к проведению процедуры выделения НК
Внести необходимое количество реагентов «ЛБ», «РП», «ПР», «ЭР»,
соответствующее количеству анализируемых образцов, в картриджи для реагентов
автоматической станции:
• Картридж «ЛБ»:
1) Рассчитать необходимый объём по формуле:
300 мкл «ЛБ» x (N+2), где N – количество анализируемых образцов.
Пример расчета: количество анализируемых образцов 50.
300 мкл x (50+2) = 15 600 мкл «ЛБ»
2) Рассчитать необходимый объём по формуле, в случае если «ВКО» добавлено в
«ЛБ»:
320 мкл «ЛБ» x (N+2), где N – количество анализируемых образцов.
Пример расчета: количество анализируемых образцов 50.
320 мкл x (50+2) = 16 640 мкл «ЛБ»
ВНИМАНИЕ! Необходимо перемешать содержимое флакона «ЛБ» перед внесением
в картридж.
22
• Картридж «РП»:
1) Рассчитать необходимый объём по формуле:
500 мкл «РП» x (N+2), где N – количество анализируемых образцов.
Пример расчета: количество анализируемых образцов 50.
500 мкл x (50+2) = 26 000 мкл «РП»
2) Внести рассчитанный объём в картридж.
• Картриджи с «ПР» - 3 картриджа:
1) Рассчитать необходимый объём по формуле:
750 мкл «ПР» x (N+2), где N – количество анализируемых образцов.
Пример расчета: количество анализируемых образцов 50.
750 мкл x (50 +2) = 39 000 мкл «ПР»
2) Внести рассчитанный объём в 3 картриджа
• Картридж «ЭР»:
1) Рассчитать необходимый объём по формуле:
75 мкл «ЭР» x (N+2), где N – количество анализируемых образцов.
Пример расчета: количество анализируемых образцов 50.
75 мкл x (50 +2) = 3 900 мкл «ЭР»
2) Внести рассчитанный объём в картридж.
10.2.2 Предварительная подготовка анализируемых образцов
10.2.2.1 Предварительную подготовку анализируемых образцов проводить в
соответствии с Разделом 8 Анализируемые образцы и п. 10.1 Ручной методики выделения
НК.
10.2.2.2 Внести в лунки планшета или пробирки (в зависимости от модели
автоматической станции) весь объем предварительно подготовленного анализируемого
образца, «ПКО», «ОКО», «К1 2к», «К2 2к».
10.2.3 Процедура экстракции НК
Запрограммировать следующую последовательность действий (при необходимости
обратиться в компанию, обслуживающую автоматическую дозирующую станцию),
указанную ниже:
10.2.3.1 Внести в лунки планшета или пробирки с образцами (п. 10.2.2.2) по 300 мкл
«ЛБ» или 320 мкл «ЛБ» + «ВКО» и 500 мкл «РП», перемешать.
10.2.3.2 Инкубировать образцы при температуре 75 °С в течение 15 мин при
постоянном аккуратном перемешивании.
23
10.2.3.3 Поместить пробирки или планшет в магнитный штатив (далее по тексту –
МШ) на 3 мин.
10.2.3.4 Удалить надосадочную жидкость, не вынимая пробирки или планшет из МШ.
10.2.3.5 Добавить в образцы по 750 мкл «ПР», перемешать содержимое, поместить в
МШ на 3 мин.
10.2.3.6 Отобрать надосадочную жидкость аналогично п. 10.2.3.4.
10.2.3.7 Добавить в образцы по 750 мкл «ПР», перемешать содержимое, поместить в
МШ на 3 мин. Отобрать надосадочную жидкость аналогично п.10.2.3.4.
10.2.3.8 Добавить в образцы по 750 мкл «ПР» и удалить надосадочную жидкость, не
вынимая пробирки или планшет из МШ, содержимое не перемешивать.
10.2.3.9 Подсушить осадок магнитных частиц 65 °С в течение 3-х минут.
10.2.3.10 Добавить в лунки планшета или пробирки по 75 мкл «ЭР» и инкубировать
при 65 °С в течение 10 мин при постоянном аккуратном перемешивании.
10.2.3.11 Поместить пробирки или планшет в МШ на 1 мин.
10.2.3.12 Перенести надосадочную жидкость в новые пробирки или планшет, не
задевая осадок магнитных частиц.
10.2.3.13 Образцы выделенных НК готовы для постановки ПЦР анализа.
Образцы выделенных НК могут храниться при температуре от 2 до 8 °С в течение
одного часа, при температуре от минус 24 до минус 16 °С в течение 2-х недель и при темпе-
ратуре ниже минус 65 °С в течение года.
10.3 Методика выделения НК с использованием автоматических станций с
магнитной головкой
10.3.1 Предварительная подготовка анализируемых образцов
Предварительную подготовку анализируемых образцов проводить в соответствии с
Разделом 8 Анализируемые образцы и п. 10.1 Ручной методики выделения НК.
10.3.2.1 Подготовка к проведению процедуры выделения НК Варианты
исполнения 2.1 и 2.2
10.3.2.1.1 Приготовить и промаркировать пять глубоколуночных планшетов:
«Образец», «ПР 1», «ПР 2», «ПР 3» и «ЭР».
10.3.2.1.2 Внести в каждую лунку соответствующих глубоколуночных планшетов:
• В планшеты «ПР 1», «ПР 2», «ПР 3» - по 750 мкл «ПР»;
• В планшет «ЭР» - по 75 мкл «ЭР»;
24
• В планшет «Образец» - по 300 мкл «ЛБ», затем по 200 мкл соответствующего
образца или «ПКО», «К1 2к», «К2 2к», «ОКО». Добавить в каждую лунку по 20 мкл «ВКО».
Затем по 500 мкл «РП». Если предполагается разовое выделение 96 образцов, без
последующего использования набора реагентов, то допускается добавить 2200 мкл «ВКО»
в весь объем «ЛБ» (33 мл). Тогда в планшет «Образец» в каждую лунку вносится - по 320
мкл «ЛБ», затем по 200 мкл соответствующего образца или «ПКО», «ОКО». Затем по 500
мкл «РП». Допускается поменять порядок на «ЛБ» -> «РП» -> образец.
10.3.2.1.3 Поместить новую насадку на магнитную головку (далее по тексту – МГ) в
планшет для хранения насадки. Поместить все планшеты в автоматическую станцию
согласно протоколу.
10.3.2.2 Подготовка к проведению процедуры выделения НК Варианты
исполнения 2.3 и 2.4
10.3.2.2.1 Достать из упаковки и открутить на центрифуге для планшетов планшеты:
«ЛБ», «ПР 1», «ПР 2», «ПР 3» и «ЭР».
ВНИМАНИЕ! В каждой лунке планшета «ЭР» находится по 75 мкл раствора. Перед
постановкой в станцию выделения необходимо убедиться, что весь раствор находиться на
дне лунок планшета, в противном случае результаты анализа могут быть некорректными.
10.3.2.2.2 Внести в каждую лунку планшета «ЛБ» по 200 мкл соответствующего
образца или «ПКО», «К1 2к», «К2 2к», «ОКО». Добавить в каждую лунку по 20 мкл «ВКО»,
затем добавить по 500 мкл «РП» в каждую лунку планшета. Допускается поменять порядок
на «РП» -> образец
10.3.2.2.3 Поместить новую насадку на магнитную головку (далее по тексту – МГ) в
планшет для хранения насадки. Поместить все планшеты в автоматическую станцию
согласно протоколу. Стандартный протокол – слот 1 планшет с гребенкой, слот 2 планшет
«ЛБ», слот 3 «ПР 1», слот 4 «ПР 2», слот 5 «ПР 3», слот 8 «ЭР».
10.3.3 Процедура экстракции НК
10.3.3.1 Инкубировать планшет «Образец» при температуре 75 °С в течение 15 мин,
при постоянном аккуратном перемешивании (скорость средняя или 5 из 10).
10.3.3.2 Поместить МГ в планшет «Образец» на 1 мин.
10.3.3.3 Переместить МГ с магнитными частицами в планшет «ПР 1», перемешать
содержимое в течении 1 мин.
10.3.3.4 Переместить МГ с магнитными частицами в планшет «ПР 2», перемешать
содержимое в течении 1 мин.
25
10.3.3.5 Переместить МГ с магнитными частицами в планшет «ПР 3», перемешать
содержимое в течении 1 мин.
10.3.3.6 Собрать магнитные частицы и высушить на воздухе в течение 3-х мин.
10.3.3.7 Переместить МГ с магнитными частицами в планшет «ЭР».
10.3.3.8 Инкубировать планшет при температуре 65 °С в течение 10 мин при
постоянном аккуратном перемешивании (скорость средняя или 5 из 10).
10.3.3.9 Удалить МГ с магнитными частицами.
10.3.3.10 Содержимое лунок планшета «ЭР» содержит выделенные образцы НК.
Образцы выделенных НК готовы для постановки ПЦР анализа.
10.3.3.11 Образцы выделенных НК могут храниться при температуре от 2 до 8 °С в
течение одного часа, при температуре от минус 24 до минус 16 °С в течение 2-х недель и
при температуре ниже минус 65 °С в течение года.
11 ПОДГОТОВКА «КОМПОНЕНТЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ. УПАКОВКА 1»
НАБОРА РЕАГЕНТОВ, КОМПЛЕКТ 4
Варианты исполнения 4.1 и 4.2
Для выделения НК из анализируемых образцов использовать «Компоненты для выде-
ления. Упаковка 1» и часть из «Компоненты для ПЦР-РВ. Упаковка 2», входящие в состав
набора реагентов.
Извлечь из коробки набора реагентов «ЛБ», «РП», «ПР», «ЭР», «ПКО», «ОКО» и
«ВКО» проверить целостность упаковки и срок годности каждого компонента набора
реагентов. При обнаружении повреждения или при истечении срока годности компоненты
набора реагентов следует обработать в соответствии с разделом «Утилизация набора
реагентов» настоящей инструкции по применению. Перед применением все
вышеперечисленные компоненты инкубировать при комнатной температуре (от 15 до 25 °С)
в течение 15 мин., затем аккуратно перемешать содержимое флаконов.
ВНИМАНИЕ! При наличии во флаконах с компонентами «ЛБ» кристаллического
осадка или хлопьев необходимо прогреть их содержимое при 65 °С до полного растворения
осадка.
Хранение: неиспользованные и вcкрытые компоненты «ЛБ», «ПР», «РП», «ЭР»,
хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение срока годности набора реагентов. «ПКО»,
«ОКО» и «ВКО» от минус 24 до минус 16 °С в течение срока годности набора реагентов.
Варианты исполнения 4.3 и 4.4
Извлечь из коробки набора реагентов «ЛБ», «РП», «ПР», «ЭР», «ПКО», «ОКО» и
«ВКО» проверить целостность упаковки и срок годности каждого компонента набора
26
реагентов. При обнаружении повреждения или при истечении срока годности компоненты
набора реагентов следует обработать в соответствии с разделом «Утилизация набора
реагентов» настоящей инструкции по применению. Перед применением все
вышеперечисленные компоненты инкубировать при комнатной температуре (от 15 до 25 °С)
в течение 15 мин. Затем процентрифугировать на центрифуге для планшетов все
предразлитые планшеты.
Хранение: неиспользованные компоненты «ЛБ», «ПР», «ЭР», а также вскрытые и
неиспользованные флаконы «РП» хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение срока
годности набора реагентов. Вскрытые и не использованные пробирки «ПКО», «ОКО» и
«ВКО» хранить от минус 24 до минус 16 °С в течение срока годности набора реагентов.
Вскрытые предразлитые планшеты с компонентами, «ЛБ», «ПР», «ЭР» не хранятся.
ВЫДЕЛЕНИЕ НК ИЗ ОБРАЗЦОВ
ВНИМАНИЕ! При работе с биоматериалами необходимо использовать только
одноразовые стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку
RNase-free, DNase-free. Для проведения всех манипуляций использовать одноразовые наконечники с
фильтрами.
11.1 Ручная методика выделения НК:
11.1.1 Предварительная подготовка анализируемых образцов
11.1.1.1 Промаркировать по одной одноразовой пластиковой пробирке объёмом 1,5
мл для каждого анализируемого образца. Также промаркировать по одной пробирке под
«ПКО» и «ОКО».
11.1.1.2 Разморозить «ПКО», «ОКО» и «ВКО», перемешать и скинуть капли на
вортексе.
11.1.1.3 Перемешать анализируемые образцы вручную, переворачивая пробирку 8-10
раз.
11.1.1.4 Отобрать в каждую промаркированную пробирку по 200 мкл
соответствующего анализируемого образца или «ПКО», «ОКО». Добавить в каждую
пробирку по 20 мкл «ВКО». Перемешать на вортексе, скинуть капли. Если предполагается
разовое выделение 96 образцов, без последующего использования набора реагентов, то
допускается добавить 2200 мкл «ВКО» в весь объем «ЛБ» (33 мл), тогда отдельно добавлять
в каждую пробирку «ВКО» не требуется.
27
11.1.2 Процедура экстракции НК
ВНИМАНИЕ! Необходимо периодически встряхивать «ЛБ» для перемешивания
магнитных частиц во время разнесения его по пробиркам.
ВНИМАНИЕ! При выполнении процедуры по пп. 11.1.2.1-11.1.2.7 рекомендуется
открывать крышку только той пробирки, с которой идет работа, и сразу закрывать её после
проведения манипуляции. НЕ открывать сразу несколько пробирок, для исключения
контаминации!
11.1.2.1 В пробирку с предварительно подготовленными 220 мкл образца + «ВКО»
(анализируемым образцом или «ПКО», «ОКО» (п. 11.1.1.4)) внести 300 мкл «ЛБ»
перемешать пипетированием, затем внести 500 мкл «РП», перемешать содержимое
пробирок на вортексе в течение 3 сек. Если в ЛБ предварительно добавлялось «ВКО», то в
пробирку с предварительно подготовленными 200 мкл образца (анализируемым образцом
или «ПКО», «ОКО» (п. 11.1.1.4)) внести 320 мкл «ЛБ» перемешать пипетированием, затем
500 мкл «РП», перемешать содержимое пробирок на вортексе в течение 3 сек.
ВНИМАНИЕ! Обязательно использовать отдельный одноразовый наконечник для
каждой манипуляции, чтобы исключить контаминацию компонентов «ЛБ» и «РП».
11.1.2.2 Инкубировать пробирки в твердотельном термостате при температуре 75 °С
в течение 15 минут. Перемешивать содержимое на вортексе 3 сек каждые 2 минуты.
11.1.2.3 После инкубации перемешать образцы на вортексе в течение 5 сек и осадить
капли на миницентрифуге на максимальном количестве оборотов.
11.1.2.4 Поместить пробирки в магнитный штатив, выдержать 1-2 минуты, затем
отобрать надосадочную жидкость из пробирок с помощью вакуумного отсасывателя или пи-
петочного дозатора, не задевая магнитных частиц.
ВНИМАНИЕ! Держать пробирки в магнитном штативе при удалении надосадочной
жидкости. Использовать отдельный одноразовый наконечник с аэрозольным барьером (при
использовании пипеточного дозатора) или без такового (при использовании вакуумного
отсасывателя) для каждого анализируемого образца.
ВНИМАНИЕ! При добавлении раствора, пробирки не вынимать из магнитного
штатива! На каждом этапе необходимо убедиться, что магнитные частицы все время
остаются смоченными растворами.
НЕ ДОПУСКАТЬ высыхания магнитных частиц!
11.1.2.5 Внести по 750 мкл «ПР» в каждую пробирку.
28
11.1.2.6 Закрыть пробирки, перемешать содержимое пробирок переворачиванием
магнитного штатива 8-10 раз. НЕ ВЫНИМАТЬ ПРОБИРКИ ИЗ МАГНИТНОГО ШТА-
ТИВА! Отобрать надосадочную жидкость пипеточным дозатором или вакуумным отсасы-
вателем из пробирок и с крышек пробирок, не задевая магнитных частиц, и держа пробирки
в магнитном штативе.
11.1.2.7 Повторить процедуру отмывки магнитных частиц по пп. 11.1.2.5-11.1.2.6 еще
два раза. После последней отмывки собрать остаток «ПР» из-под крышки пробирки.
Общее количество отмывок – 3.
11.1.2.8 Открыть пробирки и подсушить осадок магнитных частиц в твердотельном
термостате при температуре 65 °С в течение 3-х минут.
11.1.2.9 Не вынимая пробирки из твердотельного термостата добавить на дно проби-
рок по 75 мкл «ЭР». Закрыть крышки пробирок.
11.1.2.10 Проверить, что «ЭР» полностью покрывает магнитные частицы, иначе акку-
ратно перемешать в течение 1-3 секунд на вортексе.
11.1.2.11 Инкубировать пробирки в твердотельном термостате при температуре 65 °С
в течение 10 минут. Перемешивать содержимое на вортексе по 3 сек каждые 2 минуты.
11.1.2.12 После инкубации перемешать образцы на вортексе в течение 5 сек и осадить
капли на миницентрифуге на максимальном количестве оборотов.
11.1.2.13 Образцы выделенных НК готовы для постановки ПЦР анализа.
11.1.2.14 Перед внесением в реакционную смесь пробирки с образцами выделенных
НК необходимо поставить на магнитный штатив.
ВНИМАНИЕ! Отбирать образец выделенной НК для постановки ПЦР анализа необ-
ходимо аккуратно, избегая попадания магнитных частиц в наконечник пипеточного доза-
тора.
Образцы выделенных НК могут храниться при температуре от 2 до 8 °С в течение
одного часа, при температуре от минус 24 до минус 16 °С в течение 2-х недель и при темпе-
ратуре ниже минус 65 °С в течение года. Для хранения НК необходимо, не захватывая маг-
нитные частицы, перенести надосадочную жидкость после выделения НК в новую чистую
пробирку имеющую специальную маркировку RNase-free, DNase-free.
11.2 Методика выделения НК с использованием автоматических дозирующих
станций
ВНИМАНИЕ! При использовании автоматической станции для выделения НК
необходимо ознакомиться с инструкцией по эксплуатации данной автоматической станции
29
и запрограммировать последовательность действий (при необходимости обратиться в
компанию, обслуживающую автоматическую дозирующую станцию), указанную ниже.
11.2.1 Подготовка к проведению процедуры выделения НК
Внести необходимое количество реагентов «ЛБ», «РП», «ПР», «ЭР»,
соответствующее количеству анализируемых образцов, в картриджи для реагентов
автоматической станции:
• Картридж «ЛБ»:
1) Рассчитать необходимый объём по формуле:
300 мкл «ЛБ» x (N+2), где N – количество анализируемых образцов.
Пример расчета: количество анализируемых образцов 50.
300 мкл x (50+2) = 15 600 мкл «ЛБ»
2) Рассчитать необходимый объём по формуле, в случае если «ВКО» добавлено в
«ЛБ»:
320 мкл «ЛБ» x (N+2), где N – количество анализируемых образцов.
Пример расчета: количество анализируемых образцов 50.
320 мкл x (50+2) = 16 640 мкл «ЛБ»
ВНИМАНИЕ! Необходимо перемешать содержимое флакона «ЛБ» перед внесением
в картридж.
• Картридж «РП»:
3) Рассчитать необходимый объём по формуле:
500 мкл «РП» x (N+2), где N – количество анализируемых образцов.
Пример расчета: количество анализируемых образцов 50.
500 мкл x (50+2) = 26 000 мкл «РП»
4) Внести рассчитанный объём в картридж.
• Картриджи с «ПР» - 3 картриджа:
3) Рассчитать необходимый объём по формуле:
750 мкл «ПР» x (N+2), где N – количество анализируемых образцов.
Пример расчета: количество анализируемых образцов 50.
750 мкл x (50 +2) = 39 000 мкл «ПР»
4) Внести рассчитанный объём в 3 картриджа
• Картридж «ЭР»:
3) Рассчитать необходимый объём по формуле:
75 мкл «ЭР» x (N+2), где N – количество анализируемых образцов.
30
Пример расчета: количество анализируемых образцов 50.
75 мкл x (50 +2) = 3 900 мкл «ЭР»
4) Внести рассчитанный объём в картридж.
11.2.2 Предварительная подготовка анализируемых образцов
11.2.2.1 Предварительную подготовку анализируемых образцов проводить в
соответствии с Разделом 8 Анализируемые образцы и п. 11.1 Ручной методики выделения
НК.
11.2.2.2 Внести в лунки планшета или пробирки (в зависимости от модели
автоматической станции) весь объем предварительно подготовленного образца сыворотки
(плазмы) крови или цельной крови человека, ПКО, ОКО.
11.2.3 Процедура экстракции НК
Запрограммировать следующую последовательность действий (при необходимости
обратиться в компанию, обслуживающую автоматическую дозирующую станцию),
указанную ниже:
11.2.3.1 Внести в лунки планшета или пробирки с образцами (п. 11.2.2.2) по 300 мкл
«ЛБ» или 320 мкл «ЛБ» + «ВКО» и 500 мкл «РП», перемешать.
11.2.3.2 Инкубировать образцы при температуре 75 °С в течение 15 мин при
постоянном аккуратном перемешивании.
11.2.3.3 Поместить пробирки или планшет в магнитный штатив (далее по тексту –
МШ) на 3 мин.
11.2.3.4 Удалить надосадочную жидкость, не вынимая пробирки или планшет из МШ.
11.2.3.5 Добавить в образцы по 750 мкл «ПР», перемешать содержимое, поместить в
МШ на 3 мин.
11.2.3.6 Отобрать надосадочную жидкость аналогично п. 11.2.3.4.
11.2.3.7 Добавить в образцы по 750 мкл «ПР», перемешать содержимое, поместить в
МШ на 3 мин. Отобрать надосадочную жидкость аналогично п. 11.2.3.4.
11.2.3.8 Добавить в образцы по 750 мкл «ПР» и удалить надосадочную жидкость, не
вынимая пробирки или планшет из МШ, содержимое не перемешивать.
11.2.3.9 Подсушить осадок магнитных частиц 65 °С в течение 3-х минут.
11.2.3.10 Добавить в лунки планшета или пробирки по 75 мкл «ЭР» и инкубировать
при 65 °С в течение 10 мин при постоянном аккуратном перемешивании.
11.2.3.11 Поместить пробирки или планшет в МШ на 1 мин.
31
11.2.3.12 Перенести надосадочную жидкость в новые пробирки или планшет, не
задевая осадок магнитных частиц.
11.2.3.13 Образцы выделенных НК готовы для постановки ПЦР анализа.
Образцы выделенных НК могут храниться при температуре от 2 до 8 °С в течение
одного часа, при температуре от минус 24 до минус 16 °С в течение 2-х недель и при темпе-
ратуре ниже минус 65 °С в течение года.
11.3 Методика выделения НК с использованием автоматических станций с маг-
нитной головкой
11.3.1 Предварительная подготовка анализируемых образцов
Предварительную подготовку анализируемых образцов проводить в соответствии с
Разделом 8 Анализируемые образцы и п. 11.1 Ручной методики выделения НК.
11.3.2.1 Подготовка к проведению процедуры выделения НК Варианты
исполнения 4.1 и 4.2
11.3.2.1.1 Приготовить и промаркировать пять глубоколуночных планшетов:
«Образец», «ПР 1», «ПР 2», «ПР 3» и «ЭР».
11.3.2.1.2 Внести в каждую лунку соответствующих глубоколуночных планшетов:
• В планшеты «ПР 1», «ПР 2», «ПР 3» - по 750 мкл «ПР»;
• В планшет «ЭР» - по 75 мкл «ЭР»;
• В планшет «Образец» - по 300 мкл «ЛБ», затем по 200 мкл соответствующего
образца или «ПКО», «ОКО». Добавить в каждую лунку по 20 мкл «ВКО». Затем по 500 мкл
«РП». Если предполагается разовое выделение 96 образцов, без последующего
использования набора реагентов, то допускается добавить 2200 мкл «ВКО» в весь объем
«ЛБ» (33 мл). Тогда в планшет «Образец» в каждую лунку вносится - по 320 мкл «ЛБ», затем
по 200 мкл соответствующего образца или «ПКО», «ОКО». Затем по 500 мкл «РП».
Допускается поменять порядок на «ЛБ» -> «РП» -> образец.
11.3.2.1.3 Поместить новую насадку на магнитную головку (далее по тексту – МГ) в
планшет для хранения насадки. Поместить все планшеты в автоматическую станцию
согласно протоколу.
11.3.2.2 Подготовка к проведению процедуры выделения НК Варианты
исполнения 4.3 и 4.4
11.3.2.2.1 Достать из упаковки и открутить на центрифуге для планшетов планшеты:
«ЛБ», «ПР 1», «ПР 2», «ПР 3» и «ЭР».
32
ВНИМАНИЕ! В каждой лунке планшета «ЭР» находится по 75 мкл раствора. Перед
постановкой в станцию выделения необходимо убедиться, что весь раствор находиться на
дне лунок планшета, в противном случае результаты анализа могут быть некорректными.
11.3.2.2.2 Внести в каждую лунку планшета «ЛБ» по 200 мкл соответствующего
образца или «ПКО», «ОКО». Добавить в каждую лунку по 20 мкл «ВКО», затем добавить
по 500 мкл «РП» в каждую лунку планшета. Допускается поменять порядок на «РП» ->
образец
11.3.2.2.3 Поместить новую насадку на магнитную головку (далее по тексту – МГ) в
планшет для хранения насадки. Поместить все планшеты в автоматическую станцию
согласно протоколу. Стандартный протокол – слот 1 планшет с гребенкой, слот 2 планшет
«ЛБ», слот 3 «ПР 1», слот 4 «ПР 2», слот 5 «ПР 3», слот 8 «ЭР».
11.3.3 Процедура экстракции НК
11.3.3.1 Инкубировать планшет «Образец» при температуре 75 °С в течение 15 мин,
при постоянном аккуратном перемешивании (скорость средняя или 5 из 10).
11.3.3.2 Поместить МГ в планшет «Образец» на 1 мин.
11.3.3.3 Переместить МГ с магнитными частицами в планшет «ПР 1», перемешать
содержимое в течении 1 мин.
11.3.3.4 Переместить МГ с магнитными частицами в планшет «ПР 2», перемешать
содержимое в течении 1 мин.
11.3.3.5 Переместить МГ с магнитными частицами в планшет «ПР 3», перемешать
содержимое в течении 1 мин.
11.3.3.6 Собрать магнитные частицы и высушить на воздухе в течение 3-х мин.
11.3.3.7 Переместить МГ с магнитными частицами в планшет «ЭР».
11.3.3.8 Инкубировать планшет при температуре 65 °С в течение 10 мин при
постоянном аккуратном перемешивании (скорость средняя или 5 из 10).
11.3.3.9 Удалить МГ с магнитными частицами.
11.3.3.10 Содержимое лунок планшета «ЭР» содержит выделенные образцы НК.
Образцы выделенных НК готовы для постановки ПЦР анализа.
11.3.3.11 Образцы выделенных НК могут храниться при температуре от 2 до 8 °С в
течение одного часа, при температуре от минус 24 до минус 16 °С в течение 2-х недель и
при температуре ниже минус 65 °С в течение года.
33
12 ПОДГОТОВКА ОБОРУДОВАНИЯ ДЛЯ ПЦР-РВ
Для проведения анализа ПЦР-РВ с помощью «Компоненты для ПЦР-РВ. Упаковка 2»
с использованием амплификатора, необходимо его подготовить заранее в соответствии с
руководством по эксплуатации.
13 ПОДГОТОВКА «КОМПОНЕНТЫ ДЛЯ ПЦР-РВ. УПАКОВКА 2» НАБОРА
РЕАГЕНТОВ
Подготовка «ПЦР-смесь», «ПЦР-буфер» и «Фермент RT» (комплекта 2 и
комплекта 4)
«ПЦР-буфер», «ПЦР-смесь» и «Фермент RT» готовы к использованию.
Перед применением все растворы необходимо разморозить при комнатной
температуре, аккуратно перемешать и осадить капли с крышки пробирки кратким
центрифугированием в течение 1-3 сек.
Хранение: неиспользованные и вcкрытые компоненты «ПЦР-буфер», «ПЦР-смесь» и
«Фермент RT» хранить при температуре от минус 24 до минус 16 °С в течение срока
годности набора реагентов.
Подготовка «К1 4к», «К2 4к», «К3 4к» и «К4 4к» (комплекта 4)
«К1 4к», «К2 4к», «К3 4к» и «К4 4к» готовы к использованию.
Перед применением все растворы необходимо разморозить при комнатной
температуре, аккуратно перемешать и осадить капли с крышки пробирки кратким
центрифугированием в течение 1-3 сек.
Хранение: неиспользованные и вcкрытые компоненты «К1 4к», «К2 4к», «К3 4к» и
«К4 4к» хранить при температуре от минус 24 до минус 16 °С в течение срока годности
набора реагентов.
14 ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-РВ
14.1 КОМПЛЕКТ 2
ВНИМАНИЕ! При работе с НК необходимо использовать только одноразовые стерильные пла-
стиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку RNase-free, DNase-free. Для
внесения в пробирки/лунки планшета реагентов, проб НК, калибраторов и контрольных образцов
использовать одноразовые наконечники с фильтрами
ВНИМАНИЕ! Компоненты реакционной смеси следует смешивать непосредственно перед прове-
дением ПЦР-исследования
Подготовка Расчет количества микропробирок (N) или лунок планшета производится по
микропробирок/ формуле:
N= n + 4, где n – количество выделенных анализируемых образцов,
планшета ПЦР
34
4 – калибраторы, положительный и отрицательный контрольные образцы (4
шт.) – «К1 2к», «К2 2к», «ПКО» и «ОКО».
При необходимости калибраторы, отрицательный и положительный кон-
трольные образцы можно поставить в двух повторах:
Тогда N = n + 8, где n – количество выделенных анализируемых образцов,
8 – калибраторы, отрицательный и положительный контрольные образцы в
двух повторах каждый – 2 х «К1 2к», 2 х «К2 2к», 2 х «ПКО» и 2 х «ОКО».
В случае использования микропробирок отобрать необходимое для проведе-
ния анализа число пробирок или стрипованных пробирок, промаркировать и
расположить в штативе.
ВНИМАНИЕ! В зависимости от используемого оборудования для проведения ПЦР-РВ надписи на
пробирках следует располагать таким образом, чтобы они не мешали детектированию флуорес-
центного сигнала. См. руководство по использованию амплификатора для проведения ПЦР-РВ.
Приготовление В пробирке объемом 1,5 - 2 мл смешать реагенты для приготовления реак-
реакционной ционной смеси из расчета на необходимое количество микропробирок/лунок
смеси планшета N, согласно приведенной ниже таблице.
Название реагента Объем реагента на Объем реагента для анализа
одну реакцию (мик- N микропробирок/лунок
ропробирку/лунку) (с учётом 10% запаса объ-
ема)
«ПЦР-смесь» 5 мкл 5×N×1,1 мкл
«ПЦР-буфер» 9 мкл 9×N×1,1 мкл
«Фермент RT» 1 мкл 1×N×1,1 мкл
Перемешать приготовленную реакционную смесь на вортексе и осадить
капли с крышки пробирки кратким центрифугированием (1-3 с).
Внесение реакци- В каждую микропробирку/лунку планшета внести по 15 мкл реакционной
онной смеси* смеси.
Внесение образ- Внесение образцов в пробирки/лунки планшета с реакционной смесью
цов в про- необходимо осуществлять в следующей последовательности (для исключения
контаминации):
бирки/лунки
1. 35 мкл «ОКО»
планшета с реак-
2. по 35 мкл выделенных образцов НК
ционной смесью*
3. 35 мкл «К2 2к»
4. 35 мкл «К1 2к»
5. 35 мкл «ПКО»
Планшет заклеить пленкой для ПЦР.
В случае использования микропробирок закрыть крышки. Перед постановкой
в амплификатор рекомендуется осадить капли со стенок пробирок кратким
центрифугированием (1-3 с).
При постановке калибраторов, отрицательного и положительного
контрольных образцов в двух повторах п.п. 1, 3-7 выполнить в двух повторах
без внесения изменения последовательности внесения образцов в лунки
плашки или микропробирки.
Регистрация Выполнить в соответствии с «Процедурой измерения и оценки результата»
результатов
анализа
*Внесение реакционной смеси и образцов в лунки планшета можно производить на автоматической
дозирующей станции. Для этого необходимо запрограммировать внесение реакционной смеси и
35
образцов (при необходимости обратиться в компанию, обслуживающую автоматическую
дозирующую станцию).
14.2 КОМПЛЕКТ 4
ВНИМАНИЕ! При работе с НК необходимо использовать только одноразовые стерильные пла-
стиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку RNase-free, DNase-free. Для
внесения в пробирки/лунки планшета реагентов, проб НК, калибраторов и контрольных образцов
использовать одноразовые наконечники с фильтрами
ВНИМАНИЕ! Компоненты реакционной смеси следует смешивать непосредственно перед прове-
дением ПЦР-исследования
Подготовка Расчет количества микропробирок (N) или лунок планшета производится по
микропробирок/ формуле:
N= n + 6, где n – количество выделенных анализируемых образцов,
планшета ПЦР
4 – калибраторы, положительный и отрицательный контрольные образцы (4
шт.) – «К1 4к», «К2 4к», «К3 4к», «К4 4к», «ПКО» и «ОКО».
При необходимости калибраторы, отрицательный и положительный кон-
трольные образцы можно поставить в двух повторах:
Тогда N = n + 12, где n – количество выделенных анализируемых образцов,
8 – калибраторы, отрицательный и положительный контрольные образцы в
двух повторах каждый – 2 х «К1 4к», 2 х «К2 4к», 2 х «К3 4к», 2 х «К4 4к», 2
х «ПКО» и 2 х «ОКО».
В случае использования микропробирок отобрать необходимое для проведе-
ния анализа число пробирок или стрипованных пробирок, промаркировать и
расположить в штативе.
ВНИМАНИЕ! В зависимости от используемого оборудования для проведения ПЦР-РВ надписи на
пробирках следует располагать таким образом, чтобы они не мешали детектированию флуорес-
центного сигнала. См. руководство по использованию амплификатора для проведения ПЦР-РВ.
Приготовление В пробирке объемом 1,5 - 2 мл смешать реагенты для приготовления реак-
реакционной ционной смеси из расчета на необходимое количество микропробирок/лунок
смеси планшета N, согласно приведенной ниже таблице.
Название реагента Объем реагента на Объем реагента для анализа
одну реакцию (мик- N микропробирок/лунок
ропробирку/лунку) (с учётом 10% запаса объ-
ема)
«ПЦР-смесь» 5 мкл 5×N×1,1 мкл
«ПЦР-буфер» 9 мкл 9×N×1,1 мкл
«Фермент RT» 1 мкл 1×N×1,1 мкл
Перемешать приготовленную реакционную смесь на вортексе и осадить
капли с крышки пробирки кратким центрифугированием (1-3 с).
Внесение реакци- В каждую микропробирку/лунку планшета внести по 15 мкл реакционной
онной смеси* смеси.
Внесение образ- Внесение образцов в пробирки/лунки планшета с реакционной смесью
цов в про- необходимо осуществлять в следующей последовательности (для исключения
контаминации):
бирки/лунки
1. 35 мкл «ОКО»
планшета с реак-
2. по 35 мкл выделенных образцов НК
ционной смесью*
3. 35 мкл «К4 4к»
4. 35 мкл «К3 4к»
5. 35 мкл «К2 4к»
6. 35 мкл «К1 4к»
7. 35 мкл «ПКО»
36
| Количество циклов | Температура (℃) | Время | Измерение флуоресценции в каналах |
| 1 | 50 | 25 мин | - |
| 1 | 95 | 15 мин | - |
| 5 | 95 | 10 с | - |
|  | 60 | 20 с | - |
| 45 | 95 | 10 с | - |
|  | 60 | 20 с | FAM/Green, R6G/JOE//HEX/VIC/Yellow |
Планшет заклеить пленкой для ПЦР.
В случае использования микропробирок закрыть крышки. Перед постановкой
в амплификатор рекомендуется осадить капли со стенок пробирок кратким
центрифугированием (1-3 с).
При постановке калибраторов, отрицательного и положительного
контрольных образцов в двух повторах п.п. 1, 3-7 выполнить в двух повторах
без внесения изменения последовательности внесения образцов в лунки
плашки или микропробирки.
Регистрация Выполнить в соответствии с «Процедурой измерения и оценки результата»
результатов
анализа
*Внесение реакционной смеси и образцов в лунки планшета можно производить на автоматической
дозирующей станции. Для этого необходимо запрограммировать внесение реакционной смеси и
образцов (при необходимости обратиться в компанию, обслуживающую автоматическую
дозирующую станцию).
14.3 Процедура измерения и оценка результата
Ввести в прибор для ПЦР-РВ программу проведения амплификации и детекции
флуоресцентных сигналов:
Для детектирования сигнала при амплификации РНК ВГC в наборе реагентов исполь-
зуются гибридизационные зонды, меченные флюорофором HEX. Для детектирования сиг-
нала при амплификации ВКО (экзогенный внутренний контроль) в системе используется
гибридизационный зонд, меченный флюорофором FAM. Для детекции следует выбирать
два канала детекции FAM/Green и R6G/JOE/ HEX/VIC/Yellow.
Запрограммировать положение пробирок с калибраторами, отрицательным контроль-
ным образцом, положительным контрольным образцом, анализируемыми образцами со-
гласно инструкциям по эксплуатации к соответствующему амплификатору для ПЦР-РВ.
Поместить пробирки или планшет в амплификатор.
Запустить программу и провести ПЦР-РВ с флуоресцентной регистрацией в режиме
реального времени.
37
15 РАСЧЕТЫ
15.1 Комплект 2
Полученные данные – кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются
с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР-РВ в
соответствии с инструкцией к прибору.
15.1.1 Условия правильности работы набора реагентов
В калибраторах прибор должен фиксировать:
– нарастание сигнала флуоресценции в канале HEX и определять значение
порогового цикла Ct в канале HEX;
– нарастание сигнала флуоресценции в канале FAM и определять значение
порогового цикла Ct в канале FAM.
В положительном контрольном образце прибор должен фиксировать:
– нарастание сигнала флуоресценции в канале HEX и определять значение
порогового цикла Ct в канале HEX;
– нарастание сигнала флуоресценции в канале FAM и определять значение
порогового цикла Ct в канале FAM.
В отрицательном контрольном образце прибор должен:
– НЕ фиксировать нарастание сигнала флуоресценции в канале HEX и НЕ определять
Ct в канале HEX;
– фиксировать нарастание сигнала флуоресценции в канале FAM и определять Ct в
канале FAM.
В каждом анализируемом образце прибор должен фиксировать:
– нарастание сигнала флуоресценции в канале FAM и определять Ct в канале FAM.
Ct в канале FAM у образцов должно находится в пределах диапазона ВКО, значения
диапазона представлены в паспорте для всех типов амплификаторов.
15.1.2 Учет результатов анализа
На основании значений порогового цикла Ct (пересечение кривой флуоресценции с
установленной на соответствующем уровне пороговой линией) и исходя из заданных
значений калибраторов («К1 2к», «К2 2к»)1 происходит расчет значений копий/мл вируса
гепатита С в образце.
1 Значения концентрации калибраторов и значения Ct указаны в Паспорте.
38
Вычислить среднее значение Ct в канале FAM (x̅ (Ct FAM)) всех анализируемых
образцов, ПКО и ОКО. Исключить все образцы, у которых значения Ct в канале FAM
отличаются от x̅ (Ct FAM) более чем на 3. После исключения пересчитать x̅ (Ct FAM) для
оставшихся образцов.
15.1.3 Условия регистрации результатов:
Для «ОКО»:
– значение Ct в каналах HEX должно быть более порогового значения или не
определяться, в зависимости от типа амплификатора это значение может меняться, в
приложении к паспорту набора реагентов указаны значения для всех типов
амплификаторов;
– если значение Ct в каналах HEX меньше или равно пороговому значению, то это
свидетельствует о наличии контаминации в системе. В этом случае результаты по данной
индивидуальной постановке ПЦР-РВ считаются недостоверными. Требуется предпринять
меры по выявлению и ликвидации источника контаминации и повторить анализ, начиная со
стадии выделения НК.
Для калибраторов «К1 2к», «К2 2к» и «ПКО»:
– полученные значения Ct, должны укладываться в диапазон значений, приведенный
в приложении к паспорту набора реагентов;
– эффективность амплификации по HEX должна находиться в пределах от 90 до
110%;
– в случае если значение Ct не укладываются в диапазон значений, приведенный в
приложении к паспорту набора реагентов или если эффективность амплификации не
находятся в указанных пределах, результаты по данной индивидуальной постановке ПЦР-
РВ считаются недостоверными. Требуется перестановка ПЦР для всех проб;
15.1.4 Интерпретация результатов анализа
Концентрация РНК ВГС:
Расчет можно провести с использованием таблицы формата Excel (см. Паспорт на
набор реагентов) или с использованием программного обеспечения, анализирующего файл
с амплификатора.
В таблицу необходимо внести значения концентрации калибраторов «К1 2к» и «К2
2к» из паспорта к набору реагентов, а также их значения Ct в каналах FAM и HEX из
постановки. Для образцов необходимо ввести значения Ct в каналах FAM и HEX.
Если таблица отсутствует, то можно рассчитать значения вручную, в два шага:
39
1) Коэффициент β
𝑙𝑔𝐶(𝐾1)−𝑙𝑔𝐶(𝐾2)
𝛽 = ,
(Ct(K1)HEX − Ct(ПКО)FAM)− ∆𝐶𝑡(𝐾2)
где ΔCt(n) = Ct(n)HEX – Ct(n)FAM
2) Концентрация РНК ВГС в образце
𝐶(обр) = 𝐶(𝐾2)∗10𝛽∗(∆𝐶𝑡(обр)−∆𝐶𝑡(𝐾2))
• Если Ct образца по HEX больше, чем пороговое значение или не определяется
и его Ct по FAM не отличается от x̅ (Ct FAM) более чем на 3, то считать, что в данном образце
отсутствует РНК ВГС. Если Ct по FAM отличается от x̅ (Ct FAM) более чем на 3, то результат
анализа образца считать не достоверным. Вероятна низкая концентрация РНК ВГC в
анализируемом образце, либо некорректное проведение выделения. Требуется
перевыделение и повторный анализ, при повторении проблемы - повторное взятие
клинического материала и повторный анализ.
• Если вычисленное значение концентрации РНК ВГС в образце превосходит
2,7*108 копий/мл (1*108 МЕ/мл), то необходимо считать концентрацию неопределенной
больше, чем 2,7*108 копий/мл (1*108 МЕ/мл).
• Если вычисленное значение концентрации РНК ВГС в образце меньше, чем
20 копий/мл (7,4 МЕ/мл) и Ct образца по HEX меньше, чем пороговое значение, то
необходимо считать концентрацию неопределенной меньше, чем 20 копий/мл (7,4 МЕ/мл).
15.2 Комплект 4
Полученные данные – кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются
с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР-РВ в
соответствии с инструкцией к прибору.
15.2.1 Условия правильности работы набора реагентов
В калибраторах прибор должен фиксировать:
– нарастание сигнала флуоресценции в канале HEX и определять значение
порогового цикла Ct в канале HEX;
– нарастание сигнала флуоресценции в канале FAM и определять значение
порогового цикла Ct в канале FAM.
В положительном контрольном образце прибор должен фиксировать:
40
– нарастание сигнала флуоресценции в канале HEX и определять значение
порогового цикла Ct в канале HEX;
– нарастание сигнала флуоресценции в канале FAM и определять значение
порогового цикла Ct в канале FAM.
В отрицательном контрольном образце прибор должен:
– НЕ фиксировать нарастание сигнала флуоресценции в канале HEX и НЕ определять
Ct в канале HEX;
– фиксировать нарастание сигнала флуоресценции в канале FAM и определять Ct в
канале FAM.
В каждом анализируемом образце прибор должен фиксировать:
– нарастание сигнала флуоресценции в канале FAM и определять Ct в канале FAM.
15.2.2 Учет результатов анализа
На основании значений порогового цикла Ct (пересечение кривой флуоресценции с
установленной на соответствующем уровне пороговой линией) и исходя из заданных
значений калибраторов («К1», «К2», «К3», «К4»)2 происходит расчет значений копий/мл
вируса гепатита С в образце.
Вычислить среднее значение Ct в канале FAM (x̅ (Ct FAM)) всех анализируемых
образцов, ПКО и ОКО. Исключить все образцы, у которых значения Ct в канале FAM
отличаются от x̅ (Ct FAM) более чем на 3. После исключения пересчитать x̅ (Ct FAM) для
оставшихся образцов.
15.2.3 Условия регистрации результатов:
Для «ОКО»:
– значение Ct в каналах HEX должно быть более порогового значения или не
определяться, в зависимости от типа амплификатора это значение может меняться, в
приложении к паспорту набора реагентов указаны значения для всех типов
амплификаторов;
– если значение Ct в каналах HEX меньше или равно пороговому значению, то это
свидетельствует о наличии контаминации в системе. В этом случае результаты по данной
индивидуальной постановке ПЦР-РВ считаются недостоверными. Требуется предпринять
меры по выявлению и ликвидации источника контаминации и повторить анализ, начиная со
стадии выделения НК.
2 Значения концентрации калибраторов и значения Ct указаны в Паспорте.
41
Для калибраторов «К1 4к», «К2 4к», «К3 4к», «К4 4к» и «ПКО»:
– полученные значения Ct, должны укладываться в диапазон значений, приведенный
в приложении к паспорту набора реагентов;
– эффективность амплификации по HEX должна находиться в пределах от 90 до
110%, а коэффициент корреляции R2 – не меньше 0,97;
– в случае если значение Ct не укладываются в диапазон значений, приведенный в
приложении к паспорту набора реагентов или если эффективность амплификации и/или
коэффициент корреляции не находятся в указанных пределах, результаты по данной
индивидуальной постановке ПЦР-РВ считаются недостоверными. Требуется перестановка
ПЦР для всех проб;
15.2.3.4 Интерпретация результатов анализа
Концентрация РНК ВГС:
Расчет можно провести с использованием таблицы формата Excel (см. Паспорт на
набор реагентов) или с использованием программного обеспечения, анализирующего файл
с амплификатора.
В таблицу необходимо внести значения Ct в канале FAM образцов и калибраторов, а
также значения концентрации по HEX из постановки.
Если таблица отсутствует, то можно рассчитать значения вручную:
𝐶(обр) = 𝑘∗𝐶(обр,прибор)∗2𝐶𝑡(обр)𝐹𝐴𝑀−𝐶𝑡(ПКО)𝐹𝐴𝑀,
C(обр, прибор) = значение концентрации образца по HEX, посчитанное в постановке
k = коэффициент разведения, считается как
𝐶(ПКО,паспорт)
𝑘 =
𝐶(ПКО,прибор)
• Если Ct образца по HEX больше, чем пороговое значение или не определяется
и его Ct по FAM не отличается от x̅ (Ct FAM) более чем на 3, то считать, что в данном образце
отсутствует РНК ВГС. Если Ct по FAM отличается от x̅ (Ct FAM) более чем на 3, то результат
анализа образца считать не достоверным. Вероятна низкая концентрация РНК ВГC в
анализируемом образце, либо некорректное проведение выделения. Требуется
перевыделение и повторный анализ, при повторении проблемы - повторное взятие
клинического материала и повторный анализ.
• Если вычисленное значение концентрации РНК ВГС в образце превосходит
2,7*108 копий/мл (1*108 МЕ/мл), то необходимо считать концентрацию неопределенной
больше, чем 2,7*108 копий/мл (1*108 МЕ/мл).
42
• Если вычисленное значение концентрации РНК ВГС в образце меньше, чем
20 копий/мл (7,4 МЕ/мл) и Ct образца по HEX меньше, чем пороговое значение, то
необходимо считать концентрацию неопределенной меньше, чем 20 копий/мл (7,4 МЕ/мл).
ВНИМАНИЕ! Результаты тестирования данным набором реагентов нельзя
использовать для постановки диагноза.
15.3 Ограничения теста
На результаты теста может оказать влияние прием препаратов на основе крови (в
течение последних трех месяцев), моноклональных антител, иммуносупрессивных
препаратов, кортикостероидов, цитостатиков, гепарин, применяемый при антикоагулянтной
терапии, а также недавно проведенные (за два месяца до анализа) процедуры переливания
крови.
16 УТИЛИЗАЦИЯ НАБОРА РЕАГЕНТОВ
В процессе использования набора реагентов и утилизации наборов реагентов с истек-
шим сроком годности токсичные отходы не образуются.
Отходы, образующиеся в процессе использования набора реагентов, относить к
классу Б, наборы реагентов с истекшим сроком годности – к классу Г.
Обращение (сбор, временное хранение, обеззараживание и/или обезвреживание и
транспортирование) отходов, образующихся в процессе использования и утилизации набора
реагентов с истекшим сроком годности, проводить согласно СанПиН 2.1.3684-21 «Сани-
тарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских
поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосфер-
ному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, обществен-
ных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профи-
лактических) мероприятий».
Для обеззараживания и/или обезвреживания отходов в соответствии с МУ 287-113
«Методические указания по дезинфекции, предстерилизационной очистке и стерилизации
изделий медицинского назначения» использовать зарегистрированные в РФ дезсредства и
оборудование в соответствии с инструкциями по их применению.
Отходы утилизировать через организации, имеющие лицензию на этот вид
деятельности.
43
17 УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ
НАБОРА РЕАГЕНТОВ
Срок годности набора реагентов – 12 месяцев с даты изготовления, указанной на
этикетке.
Срок годности вскрытых компонентов набора реагентов – 12 месяцев с даты
изготовления, указанной на этикетке.
Внимание! Компоненты для выделения в предразлитых планшетах вариантов
исполнения 2.3, 2.4, 4.3 и 4.4 в случае повреждения или вскрытия пленки не хранятся.
Набор реагентов с истекшим сроком годности применению не подлежит.
«Компоненты для выделения. Упаковка 1» набора реагентов необходимо хранить и
транспортировать в оригинальной упаковке в соответствии с СанПиН 3.3686–21
«Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней»
раздел XLVIII «Условия транспортирования и хранения иммунобиологических препаратов»
при температуре от 2 до 25 °С в течение срока годности. Замораживание не допускается!
«Компоненты для ПЦР-РВ. Упаковка 2» набора реагентов необходимо хранить и
транспортировать в оригинальной упаковке в соответствии с СанПиН 3.3686–21
«Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней»
раздел XLVIII «Условия транспортирования и хранения иммунобиологических препаратов»
при температуре от минус 24 до минус 16°С в течение срока годности.
Допускается однократное транспортирование «Компоненты для ПЦР-РВ. Упаковка
2» набора реагентов при температуре от 2 до 8 °С не более 7 суток.
Набор реагентов эксплуатировать при следующих условиях:
– температура окружающей среды (17 – 27) °С;
– относительная влажность воздуха (не более 70) %;
– атмосферное давление (84,0 – 106,7) кПа / (630 – 800) мм. рт. ст.
18 ГАРАНТИИ ПРОИЗВОДИТЕЛЯ
Производитель гарантирует соответствие выпускаемых наборов реагентов
требованиям нормативной и технической документации.
Безопасность и качество набора реагентов гарантируются в течение всего срока
годности.
Производитель отвечает за недостатки набора реагентов, за исключением дефектов,
возникших вследствие нарушения правил применения, условий транспортирования и
хранения, либо действия третьих лиц, либо непреодолимой силы.
44
| Символ | Наименование символа | Символ | Наименование символа |
| ГОСТ Р ИСО 15223-1 |  |  |  |
|  | Использовать до |  | Обратитесь к инструкции по при- менению или к инструкции по при- менению в электронном виде |
|  | Дата изготовления |  | Осторожно |
|  | Код партии |  | Медицинское изделие для диагно- стики in vitro |
|  | Не допускать воздействия сол- нечного света | 100 | Содержимого достаточно для про- ведения n (100) тестов |
|  | Не допускать воздействия влаги |  | Температурный диапазон |
|  | Хрупкое, обращаться осторожно |  | Верх (ГОСТ 14192) |
|  | Номер по каталогу |  | Не использовать при повреждении упаковки |
|  |  |  | Запрет на повторное применение |
Производитель обязуется за свой счет заменить набор реагентов, технические и
функциональные характеристики (потребительские свойства) которого не соответствуют
нормативной и технической документации, если указанные недостатки явились следствием
скрытого дефекта материалов или некачественного изготовления набора реагентов
производителем.
По вопросам, касающимся качества набора реагентов, обращаться на предприятие-
изготовитель ООО «Медико-биологический Союз» по адресу:
630090, Новосибирская область, г. Новосибирск, ул. Инженерная, д.16;
головной офис, тел./факс: 8-(383)-363-77-18;
отдел продаж, тел./факс: 8-(383)-363-77-09;
многоканальный телефон: 8-(383)-363-77-01;
ОБТК, тел./факс: 8-(383)-363-77-23, e-mail: obtk@mbu.ru
19 СИМВОЛЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ МАРКИРОВКИ НАБОРА РЕАГЕНТОВ
45
Краткая схема анализа
Краткая схема анализа набором реагентов «МБС-Тест ВГС РНК количественный» комплект 2
1 ПОДГОТОВКА К ВЫДЕЛЕНИЮ ОБРАЗЦОВ
Перед применением инкубировать при комнатной температуре (от 15 до 25 °С) в течение 15 мин «ЛБ», «РП», «ПР»,
и «ЭР», затем аккуратно перемешать содержимое флаконов. При наличии во флаконах с компонентами кристалли-
ческого осадка или хлопьев необходимо прогреть их содержимое при 65 °С до полного растворения осадка.
Разморозить «К1 2к», «К2 2к», «ПКО», «ОКО» и «ВКО», перемешать и скинуть капли на вортексе.
2 ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ПОМОЩЬЮ РУЧНОЙ МЕТОДИКИ
ВНИМАНИЕ! При выделении НК с помощью автоматических станций необходимо следовать алгоритму
инструкции, описанному в соответствующих разделах.
3 ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ К ЭТАПУ ВЫДЕЛЕНИЯ НК
3.1 Промаркировать по одной одноразовой пластиковой пробирке объёмом 1,5 мл для каждого анализируемого об-
разца. Также промаркировать по одной пробирке под «К1 2к», «К2 2к», «ПКО» и «ОКО».
3.2 Перемешать анализируемые образцы вручную, переворачивая пробирку 8-10 раз.
3.3 Отобрать в каждую промаркированную пробирку по 200 мкл соответствующего анализируемого образца или
«ПКО», «ОКО», «К1 2к» и «К2 2к». Добавить в каждую пробирку по 20 мкл «ВКО». Перемешать на вортексе,
скинуть капли.
4 ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ПОДГОТОВЛЕННЫХ
ОБРАЗЦОВ
4.1. В пробирку с предварительно подготовленным образцом (п. 3) внести 300 мкл «ЛБ» перемешать пипетированием,
затем 500 мкл «РП», перемешать содержимое пробирок на вортексе в течение 3 сек.
4.2 Инкубировать пробирки в твердотельном термостате при температуре 75 °С в течение 15 минут. Перемешивать
содержимое на вортексе 3 сек каждые 3 минуты.
4.3 После инкубации перемешать образцы на вортексе в течение 5 сек и осадить капли на миницентрифуге на макси-
мальном количестве оборотов.
4.4 Поместить пробирки в магнитный штатив, выдержать 1-2 минуты, затем отобрать надосадочную жидкость из
пробирок с помощью вакуумного отсасывателя или пипеточного дозатора, не задевая магнитных частиц.
ВНИМАНИЕ! При добавлении раствора, пробирки не вынимать из магнитного штатива! На каждом этапе необхо-
димо убедиться, что магнитные частицы все время остаются смоченными растворами.
НЕ ДОПУСКАТЬ высыхания магнитных частиц!
4.5 Внести по 750 мкл «ПР» в каждую пробирку.
4.6 Закрыть пробирки, перемешать содержимое пробирок переворачиванием магнитного штатива 8-10 раз. НЕ ВЫ-
НИМАТЬ ПРОБИРКИ ИЗ МАГНИТНОГО ШТАТИВА! Отобрать надосадочную жидкость пипеточным дозатором
или вакуумным отсасывателем из пробирок и с крышек пробирок, не задевая магнитных частиц, и держа пробирки в
магнитном штативе.
4.7 Повторить процедуру отмывки магнитных частиц по пп. 4.5-4.6 еще два раза. Общее количество отмывок – 3.
4.8 Открыть пробирки и подсушить осадок магнитных частиц в твердотельном термостате при температуре 65 °С в
течение 3 минут.
4.9 Не вынимая пробирки из твердотельного термостата добавить на дно пробирок по 75 мкл «ЭР». Закрыть крышки
пробирок.
4.10 Проверить, что «ЭР» полностью покрывает магнитные частицы, иначе аккуратно перемешать в течение 1-3 се-
кунд на вортексе.
4.11 Инкубировать пробирки в твердотельном термостате при температуре 65 °С в течение 10 минут. Перемешивать
содержимое на вортексе по 3 сек каждые 2 минуты.
4.12 После инкубации перемешать образцы на вортексе в течение 5 сек и осадить капли на миницентрифуге на мак-
симальном количестве оборотов.
4.13 Образцы выделенных НК готовы для постановки ПЦР анализа.
4.14 Перед внесением в реакционную смесь пробирки с образцами выделенных НК необходимо поставить на маг-
нитный штатив.
5 ПОДГОТОВКА К ПЦР АНАЛИЗУ
5.1 Подготовить амплификатор заранее в соответствии с руководством по эксплуатации.
5.2 Разморозить «ПЦР-буфер», «ПЦР-смесь» и «Фермент RT» при комнатной температуре, перемешать и осадить
капли с крышки
6 ПОДГОТОВКА МИКРОПРОБИРОК/ПЛАНШЕТА
Калибраторы и отрицательный контроль в одном Калибраторы и отрицательный контроль в двух по-
повторе: вторах:
Рассчитать количество микропробирок/лунок (N) по Рассчитать количество микропробирок/лунок (N) по
формуле: N= n + 4 формуле: N= n + 8
где n – количество анализируемых образцов, где n – количество анализируемых образцов,
46
| Название реагента | Объем реагента на одну ре- акцию (микропробирку/лунку) | Объем реагента для анализа N микропроби- рок/лунок (с учётом 10% запаса объема) |
| «ПЦР-смесь» | 5 мкл | 5×N×1,1 мкл |
| «ПЦР-буфер» | 9 мкл | 9×N×1,1 мкл |
| «Фермент RT» | 1 мкл | 1×N×1,1 мкл |
| Количество циклов | Температура (℃) | Время | Измерение флуоресценции в каналах |
| 1 | 50 | 25 мин | - |
| 1 | 95 | 15 мин | - |
| 5 | 95 | 10 с | - |
|  | 60 | 20 с | - |
| 45 | 95 | 10 с | - |
|  | 60 | 20 с | FAM/Green, R6G/JOE/HEX/VIC/Yellow |
4 – «К1 2к», «К2 2к», «ПКО» и «ОКО» 8 – 2х «К1 2к», 2х «К2 2к», 2х «ПКО» и 2х «ОКО»
Внимание! Надписи на пробирках следует располагать таким образом, чтобы они не мешали детектированию флу-
оресцентного сигнала
7 ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАКЦИОННОЙ СМЕСИ
Внимание! Компоненты реакционной смеси следует смешивать непосредственно перед проведением ПЦР
7.1 В пробирке объемом 1,5-2 мл смешать реагенты из расчета на необходимое количество N проб:
7.2 Перемешать приготовленную реакционную смесь на вортексе и осадить капли с крышки пробирки кратким цен-
трифугированием (1-3 с).
8 ВНЕСЕНИЕ РЕАКЦИОННОЙ СМЕСИ, КАЛИБРАТОРОВ, ОТРИЦАТЕЛЬНОГО КОНТРОЛЯ И
АНАЛИЗИРУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ
Калибраторы и отрицательный контроль Калибраторы и отрицательный контроль
в одном повторе: в двух повторах:
1) В каждую микропробирку/лунку внести по 15 мкл ре- 1) В каждую микропробирку/лунку внести по 15 мкл ре-
акционной смеси акционной смеси
2) Внесение образцов в пробирки/лунки с реакционной 2) Внесение образцов в пробирки/лунки с реакционной
смесью необходимо осуществлять в следующей смесью необходимо осуществлять в следующей
последовательности (для исключения контаминации): последовательности (для исключения контаминации):
1. 35 мкл «ОКО» 1. 35 мкл «ОКО»
2. по 35 мкл выделенных образцов НК 2. 35 мкл «ОКО»
3. 35 мкл «К2 2к» 3. по 35 мкл выделенных образцов НК
4. 35 мкл «К1 2к» 4. 35 мкл «К2 2к»
5. 35 мкл «ПКО» 5. 35 мкл «К2 2к»
3) Планшет заклеить пленкой для ПЦР. 6. 35 мкл «К1 2к»
В случае использования микропробирок закрыть 7. 35 мкл «К1 2к»
крышки. Перед постановкой в амплификатор рекоменду- 8. 35 мкл «ПКО»
ется осадить капли со стенок пробирок кратким центри- 9. 35 мкл «ПКО»
фугированием (1-3 с) 3) Планшет заклеить пленкой для ПЦР.
В случае использования микропробирок закрыть
крышки. Перед постановкой в амплификатор рекоменду-
ется осадить капли со стенок пробирок кратким центри-
фугированием (1-3 с)
9 ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»
9.1 Ввести программу в амплификатор («CFX96», «ДТпрайм», «ДТлайт», «Rotor Gene», «Applied Biosystems
QuantStudio 5»):
9.2 Для детекции следует выбирать два канала:
Канал детекции FAM/Green R6G/JOE/HEX/VIC/Yellow
Мишень ВК ВГС
9.3 Запрограммировать положение пробирок с контрольными и анализируемыми образцами согласно рекоменда-
циям, к соответствующему амплификатору
9.4 Поместить пробирки в амплификатор, запустить программу и провести ПЦР-РВ
10 ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Вычислить среднее значение Ct в канале FAM (x̅(Ct FAM)) всех анализируемых образцов, ПКО и ОКО. Исключить
все образцы, у которых значения Ct в канале FAM отличаются от x̅(Ct FAM) более чем на 3. После исключения
пересчитать x̅(Ct FAM) для оставшихся образцов.
Для «ОКО» значение Ct в каналах HEX должно быть более порогового значения или не определяться, в зависимости
от типа амплификатора это значение может меняться, в приложении к паспорту набора реагентов указаны значения
для всех типов амплификаторов.
47
Для «ПКО», «К1 2к» и «К2 2к» полученные значения Ct, должны укладываться в диапазон значений, приведенный
в приложении к паспорту набора реагентов.
Расчет происходит с помощью таблицы Excel или с использованием программного обеспечения, анализирующего
файл с амплификатора. В таблицу необходимо внести значения концентрации калибраторов «К1 2к» и «К2 2к» из
паспорта к набору реагентов, а также их значения Ct в каналах FAM и HEX. Для образцов необходимо ввести значе-
ния Ct в каналах FAM и HEX.
Таблица интерпретации результатов анализа образцов
Значение «Ct» по каналу Значение «Ct» по каналу HEX/ Yellow
Результат
FAM/Green (ВКО) (РНК ВГС)
׀Ct - x̅(Ct FAM)׀≤ 3 ˃ порогового значения/не определяется отсутствует РНК ВГС
׀Ct - x̅(Ct FAM)׀≤ 3 ≤ порогового значения обнаружена РНК ВГС
Недостоверный, требуется
׀Ct - x̅(Ct FAM)׀˃ 3 любое/не определяется
перестановка с этапа выделения
Если вычисленное значение концентрации РНК ВГС в образце превосходит 2,7*108 копий/мл (1*108 МЕ/мл), то
необходимо считать концентрацию неопределенной больше, чем 2,7*108 копий/мл (1*108 МЕ/мл).
Если вычисленное значение концентрации РНК ВГС в образце меньше, чем 20 копий/мл (7,4 МЕ/мл) и Ct образца по
HEX меньше, чем пороговое значение, то необходимо считать концентрацию неопределенной меньше, чем
20 копий/мл (7,4 МЕ/мл).
Внимание! Данный набор реагентов нельзя использовать для постановки диагноза.
48
Краткая схема анализа набором реагентов «МБС-Тест ВГС РНК количественный» комплект 4
1 ПОДГОТОВКА К ВЫДЕЛЕНИЮ ОБРАЗЦОВ
Перед применением инкубировать при комнатной температуре (от 15 до 25 °С) в течение 15 мин «ЛБ», «РП», «ПР»,
и «ЭР», затем аккуратно перемешать содержимое флаконов. При наличии во флаконах с компонентами кристалли-
ческого осадка или хлопьев необходимо прогреть их содержимое при 65 °С до полного растворения осадка.
Разморозить «ПКО», «ОКО» и «ВКО», перемешать и скинуть капли на вортексе.
2 ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ПОМОЩЬЮ РУЧНОЙ МЕТОДИКИ
ВНИМАНИЕ! При выделении НК с помощью автоматических станций необходимо следовать алгоритму
инструкции, описанному в соответствующих разделах.
3 ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ К ЭТАПУ ВЫДЕЛЕНИЯ НК
3.4 Промаркировать по одной одноразовой пластиковой пробирке объёмом 1,5 мл для каждого анализируемого об-
разца. Также промаркировать по одной пробирке под «ПКО» и «ОКО».
3.5 Перемешать анализируемые образцы вручную, переворачивая пробирку 8-10 раз.
3.6 Отобрать в каждую промаркированную пробирку по 200 мкл соответствующего анализируемого образца или
«ПКО», «ОКО». Добавить в каждую пробирку (включая образцы) по 20 мкл «ВКО». Перемешать на вортексе,
скинуть капли.
4 ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ПОДГОТОВЛЕННЫХ
ОБРАЗЦОВ
4.1. В пробирку с предварительно подготовленным образцом (п. 3) внести 300 мкл «ЛБ» перемешать пипетированием,
затем 500 мкл «РП», перемешать содержимое пробирок на вортексе в течение 3 сек.
4.2 Инкубировать пробирки в твердотельном термостате при температуре 75 °С в течение 15 минут. Перемешивать
содержимое на вортексе 3 сек каждые 2 минуты.
4.3 После инкубации перемешать образцы на вортексе в течение 5 сек и осадить капли на миницентрифуге на мак-
симальном количестве оборотов.
4.4 Поместить пробирки в магнитный штатив, выдержать 1-2 минуты, затем отобрать надосадочную жидкость из
пробирок с помощью вакуумного отсасывателя или пипеточного дозатора, не задевая магнитных частиц.
ВНИМАНИЕ! При добавлении раствора, пробирки не вынимать из магнитного штатива! На каждом этапе необхо-
димо убедиться, что магнитные частицы все время остаются смоченными растворами.
НЕ ДОПУСКАТЬ высыхания магнитных частиц!
4.5 Внести по 750 мкл «ПР» в каждую пробирку.
4.6 Закрыть пробирки, перемешать содержимое пробирок переворачиванием магнитного штатива 8-10 раз. НЕ ВЫ-
НИМАТЬ ПРОБИРКИ ИЗ МАГНИТНОГО ШТАТИВА! Отобрать надосадочную жидкость пипеточным дозатором
или вакуумным отсасывателем из пробирок и с крышек пробирок, не задевая магнитных частиц, и держа пробирки в
магнитном штативе.
4.7 Повторить процедуру отмывки магнитных частиц по пп. 4.5-4.6 еще два раза. Общее количество отмывок – 3.
4.8 Открыть пробирки и подсушить осадок магнитных частиц в твердотельном термостате при температуре 65 °С
в течение 3 минут.
4.9 Не вынимая пробирки из твердотельного термостата добавить на дно пробирок по 75 мкл «ЭР». Закрыть крышки
пробирок.
4.10 Проверить, что «ЭР» полностью покрывает магнитные частицы, иначе аккуратно перемешать в течение 1-3 се-
кунд на вортексе.
4.11 Инкубировать пробирки в твердотельном термостате при температуре 75 °С в течение 10 минут. Перемешивать
содержимое на вортексе по 3 сек каждые 2 минуты.
4.12 После инкубации перемешать образцы на вортексе в течение 5 сек и осадить капли на миницентрифуге на мак-
симальном количестве оборотов.
4.13 Образцы выделенных НК готовы для постановки ПЦР анализа.
4.14 Перед внесением в реакционную смесь пробирки с образцами выделенных НК необходимо поставить на маг-
нитный штатив.
5 ПОДГОТОВКА К ПЦР АНАЛИЗУ
5.1 Подготовить амплификатор заранее в соответствии с руководством по эксплуатации.
5.2 Разморозить «К1 4к», «К2 4к», «К3 4к», «К4 4к», «ПЦР-буфер», «ПЦР-смесь» и «Фермент RT» при комнатной
температуре, перемешать и осадить капли с крышки
6 ПОДГОТОВКА МИКРОПРОБИРОК/ПЛАНШЕТА
Калибраторы и контроли в одном повторе: Калибраторы и контроли в двух повторах:
Рассчитать количество микропробирок/лунок (N) по Рассчитать количество микропробирок/лунок (N) по
формуле: N= n + 6 формуле: N= n + 12
где n – количество анализируемых образцов, где n – количество анализируемых образцов,
6 – «К1 4к», «К2 4к», «К3 4к», «К4 4к», «ПКО» и «ОКО» 12 – 2х «К1 4к», 2х «К2 4к», 2х «К1 4к», 2х «К2 4к»,
2х «ПКО» и 2х «ОКО»
49
| Название реагента | Объем реагента на одну ре- акцию (микропробирку/лунку) | Объем реагента для анализа N микропроби- рок/лунок (с учётом 10% запаса объема) |
| «ПЦР-смесь» | 5 мкл | 5×N×1,1 мкл |
| «ПЦР-буфер» | 9 мкл | 9×N×1,1 мкл |
| «Фермент RT» | 1 мкл | 1×N×1,1 мкл |
| Количество циклов | Температура (℃) | Время | Измерение флуоресценции в каналах |
| 1 | 50 | 25 мин | - |
| 1 | 95 | 15 мин | - |
| 5 | 95 | 10 с | - |
|  | 60 | 20 с | - |
| 45 | 95 | 10 с | - |
|  | 60 | 20 с | FAM/Green, R6G/JOE/HEX/VIC/Yellow |
Внимание! Надписи на пробирках следует располагать таким образом, чтобы они не мешали детектированию флу-
оресцентного сигнала
7 ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАКЦИОННОЙ СМЕСИ
Внимание! Компоненты реакционной смеси следует смешивать непосредственно перед проведением ПЦР
7.1 В пробирке объемом 1,5-2 мл смешать реагенты из расчета на необходимое количество N проб:
7.2 Перемешать приготовленную реакционную смесь на вортексе и осадить капли с крышки пробирки кратким цен-
трифугированием (1-3 с).
8 ВНЕСЕНИЕ РЕАКЦИОННОЙ СМЕСИ, КАЛИБРАТОРОВ, ОТРИЦАТЕЛЬНОГО КОНТРОЛЯ И
АНАЛИЗИРУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ
Калибраторы и контроли в одном повторе: Калибраторы и контроли в двух повторах:
1) В каждую микропробирку/лунку внести по 15 мкл ре- 1) В каждую микропробирку/лунку внести по 15 мкл ре-
акционной смеси акционной смеси
2) Внесение образцов в пробирки/лунки с 2) Внесение образцов в пробирки/лунки с реакционной
реакционной смесью необходимо осуществлять в смесью необходимо осуществлять в следующей
следующей последовательности (для исключения последовательности (для исключения контаминации):
контаминации): 1. 35 мкл «ОКО»
1. 35 мкл «ОКО» 2. 35 мкл «ОКО»
2. по 35 мкл выделенных образцов НК 3. по 35 мкл выделенных образцов НК
3. 35 мкл «К4 4к» 4. 35 мкл «К4 4к»
4. 35 мкл «К3 4к» 5. 35 мкл «К4 4к»
5. 35 мкл «К2 4к» 6. 35 мкл «К3 4к»
6. 35 мкл «К1 4к» 7. 35 мкл «К3 4к»
7. 35 мкл «ПКО» 8. 35 мкл «К2 4к»
3) Планшет заклеить пленкой для ПЦР. 9. 35 мкл «К2 4к»
В случае использования микропробирок закрыть 10. 35 мкл «К1 4к»
крышки. Перед постановкой в амплификатор рекоменду- 11. 35 мкл «К1 4к»
ется осадить капли со стенок пробирок кратким центри- 12. 35 мкл «ПКО»
фугированием (1-3 с) 13. 35 мкл «ПКО»
3) Планшет заклеить пленкой для ПЦР.
В случае использования микропробирок закрыть
крышки. Перед постановкой в амплификатор рекоменду-
ется осадить капли со стенок пробирок кратким центри-
фугированием (1-3 с)
9 ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»
9.1 Ввести программу в амплификатор («CFX96», «ДТпрайм», «ДТлайт», «Rotor Gene», «Applied Biosystems
QuantStudio 5»):
9.2 Для детекции следует выбирать два канала:
Канал детекции FAM/Green R6G/JOE/HEX/VIC/Yellow
Мишень ВК ВГС
9.3 Запрограммировать положение пробирок с контрольными и анализируемыми образцами согласно рекоменда-
циям, к соответствующему амплификатору
9.4 Поместить пробирки в амплификатор, запустить программу и провести ПЦР-РВ
10 ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Вычислить среднее значение Ct в канале FAM (x̅(Ct FAM)) всех анализируемых образцов, ПКО и ОКО. Исключить
все образцы, у которых значения Ct в канале FAM отличаются от x̅(Ct FAM) более чем на 3. После исключения
пересчитать x̅(Ct FAM) для оставшихся образцов.
50
Для «ОКО» Ct в каналах HEX должно быть более порогового значения или не определяться, в зависимости от типа
амплификатора это значение может меняться, в приложении к паспорту набора реагентов указаны значения для всех
типов амплификаторов.
Для «ПКО», «К1 4к», «К2 4к», «К3 4к», «К4 4к» полученные значения Ct, должны укладываться в диапазон значе-
ний, приведенный в приложении к паспорту набора реагентов.
Эффективность амплификации по HEX должна находиться в пределах от 90 до 110%, а коэффициент корреляции R2
– не меньше 0,97.
Расчет происходит с помощью таблицы Excel или с использованием программного обеспечения, анализирующего
файл с амплификатора. В таблицу необходимо внести значения Ct в канале FAM образцов и калибраторов и ПКО, а
также значения концентрации по HEX из постановки образцов, а также ПКО.
Таблица интерпретации результатов анализа образцов
Значение «Ct» по каналу Значение «Ct» по каналу HEX/ Yellow
Результат
FAM/Green (ВКО) (РНК ВГС)
׀Ct - x̅(Ct FAM)׀≤ 3 ˃ порогового значения/не определяется отсутствует РНК ВГС
׀Ct - x̅(Ct FAM)׀≤ 3 ≤ порогового значения обнаружена РНК ВГС
Недостоверный, требуется
׀Ct - x̅(Ct FAM)׀˃ 3 любое/не определяется
перестановка с этапа выделения
Если вычисленное значение концентрации РНК ВГС в образце превосходит 2,7*108 копий/мл (1*108 МЕ/мл), то
необходимо считать концентрацию неопределенной больше, чем 2,7*108 копий/мл (1*108 МЕ/мл).
Если вычисленное значение концентрации РНК ВГС в образце меньше, чем 20 копий/мл (7,4 МЕ/мл) и Ct образца по
HEX меньше, чем пороговое значение, то необходимо считать концентрацию неопределенной меньше, чем 20 ко-
пий/мл (7,4 МЕ/мл).
Внимание! Данный набор реагентов нельзя использовать для постановки диагноза.
Дата создания 25.05.2026 г.
51