Набор для выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов — инструкция и характеристики

РУ: РЗН 2021/15704 от 08.11.2021 · класс риска 2а

Производитель: QIAGEN GmbH (КАЙДЖЕН ГмбХ) (Германия)

Вид изделия: Набор для экстракции/изоляции нуклеиновых кислот ИВД

Назначение: Для выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов методом селективного связывания на мембране из диоксида кремния.

В госконтрактах 44-ФЗ: 2 контракта, медианная цена за единицу 151 801 ₽.

Автоматически отфильтрованный фрагмент инструкции по применению (страницы, где похоже, что есть таблица технических характеристик) — не полный документ. Карточка РУ на портале Росздравнадзора →

Текст инструкции: технические характеристики

2
Оглавление
1. Наименование изделия .................................................................................................................... 5
2. Производитель ................................................................................................................................. 5
3. Назначение, показания к применению, противопоказания. ........................................................ 5
4. Сведения о потенциальных потребителях .................................................................................... 5
5. Общие сведения ............................................................................................................................... 6
6. Принцип действия ........................................................................................................................... 6
7. Комплектность набора .................................................................................................................... 7
8. Необходимые материалы, не входящие в комплект набора........................................................ 8
9. Перечень лекарственных средств, материалов животного и (или) человеческого
происхождения ........................................................................................................................................ 8
10. Предупреждения и меры предосторожности ............................................................................ 8
11. Срок годности. ........................................................................................................................... 10
12. Хранение и перемещение реагентов ........................................................................................ 10
13. Хранение и перемещение образцов ......................................................................................... 11
14. Процедура ................................................................................................................................... 11
14.1. Протокол: Выделение геномной ДНК из срезов FFPE-блоков ...................................... 14
15. Контроль качества ..................................................................................................................... 15
16. Эксплуатационные характеристики ......................................................................................... 15
16.1. Повторяемость .................................................................................................................... 15
16.2. Воспроизводимость ............................................................................................................ 16
16.3. Перекрестное загрязнение ................................................................................................. 19
16.4. Интерферирующие вещества ............................................................................................ 20
16.5. Чувствительность, специфичность и точность ................................................................ 20
16.6. Выход ДНК.......................................................................................................................... 20
17. Маркировка ................................................................................................................................ 20
18. Требование к охране окружающей среды. .............................................................................. 21
19. Утилизация ................................................................................................................................. 21
20. Контактная информация ........................................................................................................... 21
21. Гарантийные обязательства ...................................................................................................... 22
22. Рекламации ................................................................................................................................. 22
23. Редакция документа ................................................................................................................... 22
3
КАЙДЖЕН, Технологии для отбора образцов и проведения анализов
Компания QIAGEN — ведущий поставщик инновационных технологий отбора и анализа проб,
позволяющих выделять и распознавать компоненты любых биологических образцов. Наши вы-
сокотехнологичные продукты и услуги отличаются высоким качеством и обеспечивают успех
на всех этапах работы, от взятия образца до получения результата анализа.
QIAGEN задает стандарты в таких областях, как:
- Очистка ДНК, РНК и белков
- Анализ нуклеиновых кислот и белков
- Исследование микро-РНК и РНК-интерференции
- Автоматизация технологических процессов отбора и анализа проб
Наша миссия заключается в том, чтобы помогать вам добиваться выдающихся успехов и со-
вершать прорывы. Более подробную информацию см. на веб-сайте www.qiagen.com.
4
1. Наименование изделия
Набор для выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов в варианте исполнения:
Набор QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit:
1. Колонки QIAamp MinElute с промывочными пробирками (50 шт.).
2. Промывочные пробирки (2 мл) WT (3 х 50 шт.).
3. Пробирки для элюирования (1,5 мл) ЕТ (50 шт.).
4. Пробирки для лизиса (2 мл) LT (50 шт.).
5. Буфер для лизиса тканей (10 мл) ATL (1 шт.).
6. Буфер для лизиса (12 мл) AL (1 шт.).
7. Промывочный буфер 1 (концентрат) (19 мл) AW1 (1 шт.).
8. Промывочный буфер 2 (концентрат) (13 мл) AW2 (1 шт.).
9. Элюирующий буфер (12 мл) АТЕ (1 шт.).
10. Протеиназа К (1,25 мл) PK (1 шт.).
11. Инструкция по применению.
2. Производитель
QIAGEN GmbH (КАЙДЖЕН ГмбХ)
Qiagen Strasse 1, 40724 Hilden, Germany (Германия)
Номер телефона: +49-02103-29-0
Адрес электронной почты: info@qiagen.com;
Сайт: www.qiagen.com
3. Назначение, показания к применению, противопоказания.
Назначение
Для выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов методом селективного свя-
зывания на мембране из диоксида кремния.
Описание
Набор QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit (далее набор реагентов, QIAamp DSP DNA FFPE
Tissue Kit) представляет собой систему, использующую технологию селективного связывания
ДНК на мембране из диоксида кремния (QIAamp технология) для выделения и очистки ДНК из
образцов фиксированных в формалине и залитых парафином блоков ткани (FFPE-блоков).
Набор QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit - это готовое к использованию медицинское изделие
для выделения и очистки ДНК из образцов FFPE-блоков тканей.
Набор рассчитан на обработку 50 образцов.
Время полного цикла анализа с использованием набора не превышает 90 минут.
Показания к применению
Набор QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit предназначен для выделения ДНК в качестве этапа
пробоподготовки для последующего анализа очищенных нуклеиновых кислот в клинической ла-
бораторной диагностике, в частности методом ПЦР.
Является преаналитическим методом, набор QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit предназначен
для подготовки образцов, но не для получения результатов исследований, качественных или ко-
личественных.
Противопоказания к применению
При использовании специально обученным персоналом и с учетом применения по назначе-
нию противопоказания не выявлены.
4. Сведения о потенциальных потребителях
Набор должен использоваться только квалифицированным персоналом (лаборантами или
врачами клинической лабораторной диагностики, владеющими методами молекулярно-биоло-
5
гических исследований для диагностики in vitro) в условиях профессиональной клинико-диагно-
стической лаборатории. Пользователь также должен иметь навыки, необходимые для правиль-
ного выполнения исследований, описанных в данной инструкции по применению.
Медицинское изделие предназначено только для профессионального использования. Набор
предназначен для диагностики in vitro.
5. Общие сведения
В наборе QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit используется проверенная технология QIAamp
DNA для выделения и очистки геномной ДНК из небольших объемов или размеров образца. В
наборе используется сочетание селективных связующих способностей мембран на основе диок-
сида кремния и вариативность объемов элюирования.
Условия лизиса позволяют эффективно очищать геномную ДНК из срезов FFPE-блоков без
необходимости дополнительной инкубации. Инкубация при повышенных температурах после
воздействия протеиназы К частично удаляет перекрестное связывание высвобождаемой ДНК с
формалином, потенциально улучшая выход ДНК. Следует обратить внимание, что ДНК, выде-
ленная из FFPE-блоков, обычно имеет более низкую молекулярную массу, чем ДНК из свежих
или замороженных образцов ткани. Степень фрагментации зависит от типа и свежести образца и
условий, используемых для фиксации.
После лизиса образца, процедура QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit пригодная для большин-
ства операций.
6. Принцип действия
Процедура выделения ДНК с использованием набора QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit состоит
из шести этапов (Рисунок 1):
 Удаление парафина: Парафин растворяется в ксилоле и выводится
 Лизис: Образец проходит лизис при температуре 56ºС в присутствии протеиназы К
 Нагрев: Инкубация при 90оС разрушает перекрестное связывание с формалином
 Связывание: ДНК связывается с мембраной, а посторонние вещества проходят через нее
 Промывка: Вымываются остаточные вещества
 Элюирование: Чистая, концентрированная ДНК вымывается с мембраны
Процедура выделения ДНК с использованием
QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit
Образец
Удаление парафина
Лизис
Нагревание
6
Связывание ДНК
Промывка
Элюирование
Готовая к использованию ДНК
Рисунок 1. Процедура QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit.
7. Комплектность набора
Состав набора
Набор QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit
Каталожный номер 60404
Количество реакций 50
Обозначение Описание Идентификация Количество
Колонки QIAamp MinElute с
50 шт
QIAamp MinElute промывочными пробирками
Промывочные пробирки
3 х 50 шт
WT (2мл)
Пробирки для элюирования
50 шт
ET (1,5мл)
LT Пробирки для лизиса (2мл) 50 шт
Буфер для лизиса тканей
1 шт
ATL (10мл)
1 шт
AL Буфер для лизиза (12 мл)
Промывочный буфер 1*
1 шт
AW1 (концентрат) (19мл)
Промывочный буфер 2**
1 шт
AW2 (концентрат) (13 мл)
Элюирующий буфер **
1 шт
ATE (12мл)
PK Протеиназа К (1,25мл) 1 шт
Инструкция по применению 1 шт
* содержит гуанидина гидрохлорид.
** содержит азид натрия в качестве консерванта
7
Примечание: При работе с химикатами всегда надевайте лабораторный халат, одноразо-
вые перчатки и защитные очки. Для получения дополнительной информации обратитесь к
соответствующим паспортам безопасности (SDS), которые можно получить у постав-
щика продукта или в режиме онлайн в формате PDF по ссылке www.qiagen.com/safety.
8. Необходимые материалы, не входящие в комплект набора
 Ксилол
 Этанол (96-100%)*
 Пипетки (регулируемые) и наконечники для пипеток (во избежание перекрестного загряз-
нения рекомендуются наконечники для пипеток с аэрозольными барьерными фильтрами)
 Термомиксер или нагревательный блок** для лизиса образцов при 56°C, 70°C и 90°C
 Микроцентрифуга** (с ротором на 2 мл пробирки)
 Вортекс
 Для образцов менее 200 мкл: 0,9% раствор NaCl
* не используйте денатурированный этанол, который содержит примеси метанола и метилэтил-
кетона
** убедитесь, что инструменты проверены и откалиброваны согласно рекомендациям произво-
дителя
9. Перечень лекарственных средств, материалов животного и (или) чело-
веческого происхождения
Лекарственные средства, материалы человеческого и животного происхождения: не исполь-
зуются.
10. Предупреждения и меры предосторожности
Для диагностики in vitro
Правила техники безопасности
При работе с химикатами всегда используйте лабораторный халат, одноразовые перчатки и
защитные очки.
Для получения дополнительной информации ознакомьтесь с соответствующими паспортами
безопасности (SDS). Эти паспорта можно получить в компактном и удобном формате PDF на
сайте www.qiagen.com/safety, где можно найти, распечатать SDS каждого набора компании
QIAGEN и каждого компонента в наборе. Утилизацию образцов и отходов после анализа следует
проводить в соответствии с местными нормами безопасности.
Общие меры предосторожности
Следует всегда обращать внимание на следующее:
 Набор предназначен только для профессионального применения в клинической лаборатор-
ной диагностике.
 Анализ следует проводить с образцами срезов фиксированных в формалине и залитых па-
рафином блоков ткани (FFPE-блоков)
 Следует допускать к работе только обученный персонал.
 Следует использовать одноразовые перчатки без талька талька, халат и защитные очки. Для
получения дополнительной информации по безопасности можно обратиться к соответству-
ющим паспортам безопасности (SDS), которые размещены в режиме онлайн в формате PDF
по ссылке www.qiagen.com/safety.
 Запрещается использовать набор или компоненты с истекшим сроком годности и/или по-
врежденной упаковкой компонентов набора.
 Со всеми образцами следует обращаться как с потенциально биологически опасными ве-
ществами. Утилизацию образцов и отходов на различных стадиях обработки образца сле-
дует проводить в соответствии с местными/национальными правилами утилизации через
уполномоченные организации в данном регионе.
8
| Буфер AL | Содержит гуанидингидрохлорид, малеиновую кислоту. Может представлять опасность при попадании в пищеварительный тракт или ды- хательные пути. Вызывает раздражение кожи. Вызывает серьезное раздражение глаз. Может вызывать аллергические реакции кожи. В случае раздражения глаз: обратитесь за медицинской помощью. Надевайте защитные перчатки/защитную одежду/ средства защиты глаз и лица. |
| Буфер ATL | Внимание! Вызывает легкое раздражение кожи. При возникновении раздражения кожи: Обратитесь за врачебной консультацией / помощью |
| Буфер AW1 | Содержит гуанидингидрохлорид. Может представлять опасность при попадании в пищеварительный тракт или ды- хательные пути. Вызывает раздражение кожи. Вызывает серьезное раздражение глаз. Обратитесь в токсикологический центр или к врачу в случае плохого само- чувствия. Утилизируйте раствор/контейнер в специализированной установке, |
 До, вовремя и после применения этого набора, все потенциально опасные материалы (то
есть материалы, которые могли войти в контакт с клиническими образцами), включая про-
бирки, наконечники и прочие материалы, следует обрабатывать и утилизировать в соответ-
ствии с применимыми и соответствующими муниципальными / правительственными нор-
мами, действующими в месте применения этого продукта.
 Не следует хранить открытыми пробирки с реагентами.
 Следует использовать калиброванные пипетки и инструменты.
 Следует использовать наконечники с фильтрами для пипеток
 Все поставляемые реагенты в наборах предназначены для использования только с другими
реагентами из того же набора. Не следует заменять реагенты из набора на реагенты из дру-
гих наборов, в том числе аналогичных, так как это может снизить эффективность работы.
Примечание: Набор реагентов не содержит материалов биологического происхождения,
веществ, обладающих канцерогенным, мутагенным действием, а также влияющих на ре-
продуктивную функцию человека. При использовании по назначению и соблюдении мер
предосторожности является безопасным
Предупреждения
ВНИМАНИЕ: не добавляйте отбеливатель или кислотные растворы
непосредственно в отходы, содержащие буфер AL и буфер AW1
Буферы AL и AW1 содержат гуанидингидрохлорид, который способен создавать высоко ре-
акционноспособные вещества при соединении с отбеливателем.
В случае пролива жидкости, содержащей вышеперечисленные буферы, необходимо произве-
сти очистку с использованием лабораторных детергентов и воды. Если разлитая жидкость потен-
циально инфицирована, сначала очистите зараженную зону лабораторным детергентом и водой,
а затем 1 % раствором (объемного содержания) гипохлорита натрия.
В случае повреждения или протекания флаконов с буфером, наденьте перчатки и защитные
очки во время утилизации флаконов, чтобы избежать вреда для своего здоровья и здоровья окру-
жающих.
Компания QIAGEN не проводила испытаний жидких отходов, получаемых после выполнения
процедур с использованием набора, на остаточные инфекционные материалы. Загрязнение жид-
ких отходов остаточными инфекционными материалами маловероятна, но ее не стоит полностью
исключать. Следовательно, жидкие отходы необходимо считать инфекционными, обрабатывать
и утилизировать в соответствии с требованиями местных нормативно-правовых актов и прави-
лами утилизации в данном регионе.
К компонентам набора реагентов QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit применяются следующие
коды риска и безопасности.
9
предназначенной для утилизации отходов. Надевайте защитные перчатки/защит-
ную одежду/ средства защиты глаз и лица.
Протеиназа К Содержит: Протеиназу К. Опасно! Вызывает легкое раздражение кожи. Может
вызывать симптомы аллергии или астмы, или затрудненное дыхание при вдыха-
нии. Не вдыхайте пыль / дым / газ / туман / пары / спрей. Утилизируйте содержи-
мое / контейнер с помощью специализированной компании по утилизации отхо-
дов. В случае респираторных симптомов: Свяжитесь с Токсикологическим цен-
тром или врачом / терапевтом. ПРИ ВДЫХАНИИ: В случае затруднения дыхания,
выведите пострадавшего(ую) на свежий воздух и обеспечьте ему(ей) покой в по-
ложении, удобном для дыхания. Пользуйтесь средствами защиты дыхания.
Ограничения
Эффективность набора была определена при использовании образцов фиксированных в фор-
малине и залитых парафином блоков ткани (FFPE-блоков) для выделения ДНК.
Для достижения оптимальных результатов необходимо строгое соблюдение данной инструк-
ции по применению. Не рекомендуется разбавление реагентов, отличное от описанного в данной
инструкции, которое приводит к потере производительности.
Следует обратить внимание на сроки годности и условия хранения, указанные на упаковке и
этикетках всех компонентов. Не используйте просроченные или неправильно хранящиеся ком-
поненты.
Для того, чтобы минимизировать риск неправильной интерпретации результатов последую-
щей диагностики, необходимо использовать надлежащие контроли при последующих исследо-
ваниях.
Любые полученные диагностические результаты следует толковать вместе с другими клини-
ческими или лабораторными данными.
11. Срок годности.
Срок годности набора QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit составляет 24 месяца. Изделие ста-
бильно до истечения срока годности, указанного на этикетке, при соблюдении условий хранения
и транспортирования.
Условия хранения реагентов: при температуре 15-25°С,
Условия хранения колонок QIAamp MinElute - при температуре 2-8°С.
Условия транспортирования: при температуре от -20 до +45°С.
Если изделие предназначено только для периодического применения, после вскрытия флако-
нов, реагенты можно хранить при температуре 15-25ºС и колонки QIAamp MinElute при 2-8ºС в
течении 24 месяцев (до истечения срока годности набора). После добавления этанола (96-100%)
буферы AW1 и AW2 стабильны в течение 12 месяцев.
После истечения срока годности изделие использовать запрещено.
12. Хранение и перемещение реагентов
Колонки QIAamp MinElute должны храниться в при температуре 2–8С после прибытия.
Все буферы могут храниться при комнатной температуре (15–25С). Они сохраняют стабиль-
ность до истечения срока годности набора. При этом восстановленный буфер AW1 и AW2 можно
хранить при комнатной температуре (15-25°С) в течение 1 года или до истечения срока годности
набора, в зависимости от того, что наступит ранее.
Набор QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit содержит готовый к использованию раствор Про-
теиназы К, который поставляется в специальном буфере для хранения. Протеиназа К стабильна
до истечения срока годности набора при условии хранения при комнатной температуре (15-
25°С).
Срок хранения Набора QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit после вскрытия – 24 месяца. Бу-
феры AW1 и AW2 стабильны в течение 12 месяцев после разбавления этанолом.
10
13. Хранение и перемещение образцов
Следует использовать стандартные процедуры приготовления FFPE-блоков ткани. Для
предотвращения фрагментации ДНК, обязательно:
 Зафиксируйте образцы тканей в формалине в соответствии с лабораторным протоколом
(общепринятым является 10% нейтральный забуференный формалин) как можно быстрее после
хирургического извлечения образца.
 Время фиксации должно составлять 14-24 часа. Ограничивайте время фиксации, так как
длительная фиксация (например, более 24 часов) может приводить к сильной фрагментации
ДНК, что, в свою очередь, ведет к снижению эффективности дальнейших анализов.
 Тщательно обезвоживайте образцы перед их обработкой формалином (остаточный фор-
малин может ингибировать протеиназу К).
ДНК элюируется буфером АТЕ и уже сразу готова к использованию в реакции амплификации
или для хранения (условия зависят от требований пользователя). Обычно применимые условия
хранения: при температуре от +2 °С до +8 °С не более 24 часов; для хранения более 24 часов
раствор ДНК рекомендуется хранить при температуре от -20 °C.
Условия хранения биопсийного материала, предназначенного для выделения ДНК:
- при комнатной температуре — в течение 6 часов;
- при температуре от +2 до +8 °С — в течение 3 суток;
- при температуре минус -20 °С — в течение 1 недели;
- при температуре минус -70 °С — длительно.
14. Процедура
Важные пункты, которые необходимо учитывать перед началом процедуры
 После получения набора проверьте компоненты набора на наличие повреждений. Если упа-
ковки или флаконы с буфером повреждены, свяжитесь со Службой технической поддержки
QIAGEN или своим региональным дистрибьютором. В случае разлива жидкости см. пункт
«Предупреждения и меры предосторожности». Не используйте поврежденные компоненты
набора, поскольку их применение может снижать эффективность набора.
 Всегда меняйте наконечник дозатора между переносами жидкости. Для минимизации пе-
рекрестной контаминации мы рекомендуем использовать наконечники с аэрозольным ба-
рьером.
 Все этапы центрифугирования выполняйте при комнатной температуре (15-25°С).
 Всегда используйте одноразовые перчатки и регулярно проверяйте их на контаминацию
материалом образца. В случае загрязнения утилизируйте перчатки.
 Для минимизации перекрестной контаминации открывайте только по одной пробирке за
раз.
 Не рекомендуется использовать компоненты из других наборов, однако при необходимо-
сти, компоненты можно использовать только в том случае, если номера партий наборов
идентичны.
 Не допускайте микробную контаминацию реактивов из набора.
 Для минимизации риска инфицирования потенциально инфекционным материалом мы ре-
комендуем работать в проточном ламинарном шкафу до тех пор, пока образцы не пройдут
лизис.
 Данный набор могут использовать только сотрудники, обученные лабораторным процеду-
рам для диагностики in vitro.
 Неиспользованные буферы, фильтраты и остатки образов следует утилизировать в соответ-
ствии в соответствии с местными/национальными правилами утилизации через уполномо-
ченные организации в данном регионе.
 Если используются расходные пластиковые материалы, не входящие в комплект набора, то
рекомендуется использовать одноразовые конические пробирки на 1,5-2 мл из полипропи-
лена с низкой связывающей способностью без ДНКаз/РНКаз с надежными крышками.
11
 Выполняйте все этапы центрифугирования при комнатной температуре (15-25°С)
 Все буферы следует хранить при комнатной температуре (15-25°С) и тщательно перемеши-
вать перед использованием.
 Если Буфер AL или Буфер ATL содержат осадок, растворите его посредством нагревания
до 70°С с легким перемешиванием.
 Убедитесь, что Буфер AW1 и Буфер AW2 были подготовлены в соответствии с представ-
ленными ниже инструкциями.
Приготовление буферов
Приготовление Буфера ATL
Перед началом процедуры проверьте Буфер ATL на наличие сформировавшегося осадка. При
необходимости растворите осадок посредством нагревания до 70°С с легким перемешиванием.
Приготовление Буфера AL
Перед началом процедуры проверьте Буфер AL на наличие сформировавшегося осадка. При
необходимости растворите осадок посредством нагревания до 70°С с легким перемешиванием.
Приготовление Буфера AW1
Добавьте 25 мл этанола (96-100%) во флакон, содержащий 19 мл концентрированного Буфера
AW1. На этикетке сделайте отметку о том, что этанол был добавлен. Восстановленный Буфер
AW1 можно хранить при комнатной температуре (15-25°С) в течение 1 года или до истечения
срока годности набора, в зависимости от того, что наступит раньше. Рекомендуется записывать
дату приготовления на этикетке буфера.
Примечание: Перед началом процедуры перемешайте восстановленный Буфер AW1 посред-
ством встряхивания.
Приготовление Буфера AW2
Добавьте 30 мл этанола (96-100%) во флакон, содержащий 13 мл концентрированного Буфера
AW2. На этикетке сделайте отметку о том, что этанол был добавлен. Восстановленный буфер
AW2 можно хранить при комнатной температуре (15-25°С) в течение 1 года или до истечения
срока годности набора, в зависимости от того, что наступит раньше. Рекомендуется записывать
дату приготовления на этикетке буфера.
Примечание: Перед началом процедуры перемешайте восстановленный буфер AW2 посред-
ством встряхивания.
Биологические образцы
Исходный материал для выделения и очистки ДНК – срезы c FFPE-блоков (в идеале свежие).
Несколько срезов FFPE-блоков можно сочетать в одной процедуре. Если недостаточно информа-
ции о характере исходного материала, рекомендуется начинать процедуру не более чем с тремя
срезами FFPE-блоков тканей.
Пользователь должен оптимизировать количество образцов, толщину и площадь поверхности
срезов для любых процедур, осуществляемых в его лаборатории. Если набор будет использо-
ваться далее в сочетании с другими продуктами QIAGEN, смотрите инструкции к этим продук-
там.
Процедуры, помогающие избежать перекрестной контаминации
Из-за чувствительности методов амплификации нуклеиновых кислот, необходимо соблюдать
следующие меры безопасности при работе с колонками QIAamp MinElute во избежание кросс-
контаминации между образцами:
 Не переполняйте пробирки образцом ткани.
 Для каждого FFPE-блока при соскабливании парафина используйте новый скальпель.
 Аккуратно наносите образец или раствор на колонку QIAamp MinElute пипеткой, не до-
трагиваясь до стенок колонки.
 Для каждой из переносимых жидкостей используйте новые наконечники дозаторов. Реко-
мендуются наконечники дозаторов с аэрозольным барьером.
 Всегда используйте новые промывочные пробирки при выполнении этапов промывки об-
разцов.
12
 Убедитесь, что крышки пробирок полностью закрыты, перед тем, как перемешивать их в
вортексе или центрифугировать.
 Убедитесь, что колонка Qiaamp MinElute плотно закрыта перед центрифугированием.
 После этапов перемешивания и инкубирования при температуре 90оС центрифугируйте
пробирки в течение короткого времени, чтобы собрать капли с внутренней стороны крышек.
 Открывайте только по одной колонке QIAamp MinElute за раз и избегайте образования
аэрозолей.
 Всегда меняйте скальпели для новых образцов
 Всегда меняйте наконечники дозатора для разных жидкостей.
 Всегда надевайте одноразовые перчатки и регулярно проверяйте их на возможное загряз-
нение материалом образца. Не используйте перчатки в случае подозрений на контаминацию.
 Открывайте по одной пробирке за раз.
Центрифугирование
Колонки QIAamp MinElute соответствуют по размеру большинству стандартных 1,5-2 мл
микроцентрифужных пробирок. Центрифугирование колонок QIAamp MinElute выполняется
приблизительно при 6000 х g для снижения шума центрифуги. Центрифугирование на полной
скорости не улучшает выход ДНК. Однако центрифугирование колонок QIAamp MinElute на пол-
ной скорости необходимо в двух случаях во время протокола: этап центрифугирования после
промывки мембран для сушки и этап элюирования. Центрифугирование на полной скорости
также необходимо для осаждения образца после обработки ксилолом и этапа промывки этано-
лом.
Все этапы центрифугирования должны выполняться при комнатной температуре (15-25°С).
Использование колонок QIAamp MinElute в микроцентрифуге
 Всегда закрывайте колонки QIAamp MinElute перед размещением их в микроцентрифуге.
 Не дотрагивайтесь до мембраны колонки QIAamp MinElute наконечником дозатора.
 Отработанные растворы могут содержать некоторые опасные отходы и должны утилизи-
роваться соответствующим образом.
 Для эффективной параллельной обработки нескольких образцов рекомендуется использо-
вать штатив для промывочных пробирок, в которые могут быть перенесены колонки QIAamp
MinElute после центрифугирования. Использованные промывочные пробирки, содержащие
фильтраты, можно удалять в отходы, а новые промывочные пробирки, содержащие колонки QI-
Aamp MinElute, можно размещать непосредственно в микроцентрифуге.
Элюирование очищенной ДНК
Для приложений, которые требуют небольшие начальные объемы очищенной ДНК (напри-
мер, некоторые анализы ПЦР), более концентрированный элюат может увеличить чувствитель-
ность анализа, но также может приводить к повышению концентрации потенциальных ингиби-
торов.
Увеличение элюирующего объема снижает концентрацию ДНК в элюате. Оптимизация элю-
ирующего объема для процедур, используемых в лаборатории, является задачей пользователя.
Если используются продукты QIAGEN для дальнейшего анализа, смотрите рекомендованные
объемы в соответствующих инструкциях.
Объем элюата на выходе приблизительно на 5 мкл меньше объема Буфера ATE, добавляемого
в колонку QIAamp MinElute. Например, элюирующий объем 20 мкл дает примерно 15 мкл
элюата. Объем элюата на выходе также зависит от характера образца.
Выход ДНК может быть улучшен, если колонка инкубируется с Буфером АТЕ при комнатной
температуре, например, в течение 5 минут до центрифугирования. Элюированную ДНК можно
собирать в пробирки для элюирования 1,5 мл (входят в состав набора). Условия хранения для
элюированной ДНК зависят от требований, устанавливаемых пользователем. Если какие-либо
продукты QIAGEN используются в последующем исследовании выделенной ДНК, рекомендуе-
мые условия хранения для них смотрите в соответствующих инструкциях.
13
14.1. Протокол: Выделение геномной ДНК из срезов FFPE-блоков
Процедура
1. С помощью скальпеля срежьте лишний парафин с образца.
2. Приготовьте срезы в соответствии со стандартной лабораторной процедурой (см. подраздел
«Биологические образцы»). Пользователь должен оптимизировать количество секций, толщину
и площадь поверхности среза для любых процедур, используемых в его лаборатории. В течение
всей процедуры необходимо обязательно сохранять прослеживаемость образцов.
3. Сразу же сделайте соскоб ткани из секций с помощью стерильного скальпеля в пробирку для
лизиса LT (входит в состав набора). Убедитесь, что в пробирку помещен весь доступный образец
ткани. Добавьте 1 мл ксилола в образец, закройте крышку и энергично перемешивайте в вортексе,
пока парафин не растворится (например, 10 сек). Убедитесь, что пробирка полностью закрыта,
чтобы избежать проливание ксилола и перекрестной контаминации между образцами.
4. Центрифугируйте на полной скорости в течение приблизительно 2 минут при комнатной тем-
пературе для сбора ткани в осадок. Если осадок собрать не удалось, повторите этот этап.
5. Соберите надосадочную жидкость с помощью дозатора и вылейте ее. Осадок сохраните. Надо-
садочная жидкость содержит ксилол, который является опасным отходом и должен утилизиро-
ваться в соответствующем порядке согласно регламенту.
6. Добавьте 1 мл этанола (96-100%) к осадку и тщательно перемешайте в вортексе. Этанол экс-
трагирует остаточный ксилол из образца и должен утилизироваться в соответствующем порядке.
7. Центрифугируйте на полной скорости в течение приблизительно 2 минут при комнатной тем-
пературе. Отберите надосадочную жидкость с помощью дозатора и вылейте ее. Не удаляйте оса-
док. Тщательно удалите остаточный этанол с помощью тонкого наконечника дозатора. Откройте
пробирку и инкубируйте при температуре 15-40оС, пока не испарится остаточный этанол. Удале-
ние остаточного этанола имеет критическое значения для успеха процесса выделения.
Примечание: низкая температура инкубации замедляет время испарения, при этом более
высокая температура может пересушить осадок.
8. Ресуспендируйте осадок в 180 мкл Буфера ATL. Добавьте 20 мкл протеиназы К и перемеши-
вайте в вортексе.
Примечание: Осадок должен быть хорошо ресуспендирован в буфере ATL, чтобы обеспе-
чить максимальное выход продукта.
9. Проинкубируйте при температуре 56оС ± 3оС в течение приблизительно 1 часа (пока образец
не будет полностью лизирован).
10. Проинкубируйте при температуре 90оС ± 5оС в течение 1 часа ± 5 мин. Инкубация при тем-
пературе 90оС в Буфере ATL частично восстанавливает нуклеиновую кислоту от формальдегида.
Более короткое время инкубации или более низкие температуры инкубации могут повлиять на
качество и количество ДНК. Если используется всего один нагревательный блок, оставьте обра-
зец при комнатной температуре после инкубации при 56оС, до момента пока нагревательный
блок не достигнет 90оС.
11. Кратко центрифугируйте пробирку, чтобы удалить капли с внутренней части крышки.
12. Добавьте 200 мкл Буфера AL в образец и перемешайте в вортексе. Далее добавьте 200 мкл
этанола (96-100%) и снова тщательно перемешайте в вортексе.
Для получения однородного раствора очень важно чтобы образец, Буфер AL и этанол сразу
же были тщательно перемешаны в вортексе или методом пипетирования. Чтобы сэкономить
время при обработке нескольких образцов, можно предварительно смешать Буфер AL и этанол и
добавить их вместе. При добавлении Буфера AL и этанола может формироваться белый осадок.
Этот осадок не влияет на эффективность выделения. Всегда используйте свежую смесь и утили-
зируйте ее немедленно после использования.
13. Центрифугируйте пробирку в течение короткого времени, чтобы удалить капли с внутренней
части крышки.
14. Аккуратно перенесите весь лизат в колонку QIAamp MinElute (в промывочной пробирке WT
2 мл), не смачивая ее край, закройте крышку и центрифугируйте приблизительно при 6000 х g в
14
течение ≥ 1 мин. Поместите колонку QIAamp MinElute в чистую промывочную пробирку WT
(входит в набор) и утилизируйте промывочную пробирку, содержащую фильтрат.
Если лизат не полностью прошел через мембрану после центрифугирования, снова центри-
фугируйте при более высокой скорости, пока колонка QIAamp MinElute не опустеет.
15. Аккуратно откройте колонку QIAamp MinElute и добавьте 500 мкл восстановленного Буфера
AW1, не смачивая край колонки. Закройте крышку и центрифугируйте при приблизительно 6000
х g в течение ≥ 1 мин. Поместите колонку QIAamp MinElute в чистую промывочную пробирку
WT 2 мл и утилизируйте промывочную пробирку, содержащую фильтрат.
16. Аккуратно откройте колонку QIAamp MinElute и добавьте 500 мкл восстановленного Буфера
AW2, не дотрагиваясь до края колонки. Закройте крышку и центрифугируйте приблизительно
при 6000 х g в течение ≥ 1 мин. Поместите колонку QIAamp MinElute в чистую промывочную
пробирку WT 2 мл и утилизируйте промывочную пробирку, содержащую фильтрат.
Следует избегать контакта между колонкой QIAamp MinElute и фильтратом. Обязательно
сбалансируйте ротор центрифуги. Проявляйте осторожность, вынимая колонку QIAamp MinElute
и промывочную пробирку из ротора, чтобы фильтрат не входил в контакт с колонкой QIAamp
MinElute.
17. Центрифугируйте при полной скорости (приблизительно 20000 х g) в течение приблизительно
3 минут, чтобы высушить мембрану.
Примечание: Перенос остатка этанола в элюат может влиять на ход дальнейшей проце-
дуры.
18. Поместите колонку QIAamp MinElute в чистую пробирку для элюирования ET 1,5 мл (входит
в состав набора) и удалите промывочную пробирку, содержащую фильтрат. Аккуратно откройте
крышку колонки QIAamp MinElute и добавьте 20-200 мкл Буфера АТЕ по центру мембраны ко-
лонки.
Важно: При использовании небольших элюирующих объемов (<50 мкл) распределите Буфер
АТЕ по центру мембраны, чтобы обеспечить полное элюирование связанной ДНК. Колонки
QIAamp MinElute предполагают гибкость выбора элюирующего объема. Выбирайте объем в
соответствии с требованиями последующего применения. Объем элюата будет приблизи-
тельно на 5 мкл меньше объема раствора для элюирования, применимого к колонке.
19. Закройте крышку и проинкубируйте при комнатной температуре (15-25оС) в течение не менее
1 минуты. Центрифугируйте при полной скорости (приблизительно 20000 х g) в течение ≥ 1 ми-
нуты.
Инкубирование колонки QIAamp MinElute, с добавленным Буфером АТЕ, в течение прибли-
зительно 5 минут при комнатной температуре перед центрифугированием, может увеличить вы-
ход ДНК.
15. Контроль качества
В соответствии с ISO-сертифицированной системой управления качеством QIAGEN каждая
партия набора QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit проходит испытание на соответствие установ-
ленным спецификациям для обеспечения постоянного качества продукции.
16. Эксплуатационные характеристики
16.1. Повторяемость
Повторяемость набора QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit проходила проверку на основании
данных, полученных для β-актина методом ПЦР в реальном времени. Повторяемость оценивали
с помощью статистического анализа с использованием значений стандартного отклонения ком-
понентов дисперсии, полученных для значений Ct.
Для оценки повторяемости использовались стандартизированные FFPE-блоки, предоставлен-
ные компанией Acrometrix в качестве образцов для испытания. Четыре среза FFPE-блоков про-
шли обработку с использованием испытуемого набора, а 2 дополнительных среза прошли обра-
ботку с использованием эталонного набора. Кроме того, та же ПЦР выполнялась с геномной ДНК
15
человека, которая не была обработана парафином, чтобы можно было оценить присутствие ин-
гибиторов ПЦР в испытуемых образцах или сниженный выход или целостность (т.е. повышен-
ную деградацию) ДНК, что как можно предположить приведет к сдвигу Ct по сравнению со зна-
чениями Ct для ДНК из FFPE-блоков, выделенной эталонным набором.
Были выполнены два отдельных анализа с использованием эталона мастер-микс Quantitect
SYBR Green Mastermix и праймеров, специфичных к гену β-актина на оборудовании Rotor-Gene
Q. ПЦР выполнялась для фрагментов 174 bp и 218 bp гена β-актина человека. Значения Ct, полу-
ченные в этом эксперименте, использовались для статистического анализа.
Стандартное отклонение представляет собой повторяемость, включающую как повторяе-
мость выделения, так и вариабельность ПЦР анализа β-актина. Полученные стандартные откло-
нения и 95% доверительные интервалы показаны для каждого из компонентов дисперсии в таб-
лице 1.
Таблица 1. Результаты анализа компонентов дисперсии. Стандартное отклонение и 95% довери-
тельный интервал, полученные для остаточной дисперсии, отражают повторяемость набора,
определенную по β-актин ПЦР в реальном времени.
Компонент дисперсии Стандартное Нижний 95% до- Верхний 95% Процент об-
отклонение верительный ин- доверительный щей диспер-
тервал интервал сии
Участок Компонент
ампликона дисперсии
174 bp Остаточный 0,258 0,220 0,312 50,96%
174 bp Запуск 0,110 0,052 1,572 9,30%
174 bp Образец 0,228 0,137 0,646 39,73%
218 bp Остаточный 0,342 0,291 0,413 50,37%
218 bp Запуск 0,137 0,065 2,206 8,14%
218 bp Образец 0,310 0,187 0,870 41,50%
Вариативность, наибольшая из полученных, может считаться финальной повторяемостью и
составляет 0,342 Ct.
16.2. Воспроизводимость
Оценка воспроизводимости выделения выполнялась в трех лабораториях (межлабораторное
исследование): QIAGEN Manchester (Соединенное Королевство), QIAGEN Hilden (Германия) и
QIAGEN Germantown (США).
Экспериментальные условия варьировались для каждой лаборатории с использованием 2 раз-
личных аппаратов Rotor-Gene Q, 2 операторов и 2 партий ПЦР набора для каждой лаборатории.
Во всех лабораториях использовалась одна и та же партия набора QIAamp DSP DNA FFPE Tissue
Kit для выделения ДНК.
В исследовании использовался Набор реагентов therascreen® EGFR RGQ PCR Kit для анализа
мутаций в гене EGFR в образцах ткани методом ПЦР. Образцы включали срезы, полученные из
клинических образцов FFPE-блоков немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), а также клеточ-
ные линии FFPE, полученные из клеточной линии аденокарциномы легкого человека (А549, из
Американской коллекции типовых культур - АТСС), залитых в парафиновый блок для получения
искусственного биопсийного образца. Стандарты FFPE использовались, когда отсутствовали
клинические образцы из-за редкости мутации. Клинические образцы FFPE-блоков отбирались
исходя из известного мутационного статуса в соответствии с отчетом о секвенировании по ме-
тоду Сэнгера полученных клинических образцов.
Чтобы отвечать критериям приемлемости, не менее 90% сигналов мутаций (для всех лабора-
ториях, образцов с мутациями и дикого типа) должны были быть корректными, а согласован-
ность определения мутаций во всех лабораториях (как для образцов с мутациями, так и для об-
разцов дикого типа) должна была быть 90% или выше.
16
| Мишень | Количество | Согласованный от- клик (количество) | Согласованный отклик (процент) |  | Нижний 90% двусто- |  |
|  |  |  |  |  | ронний доверительный |  |
|  |  |  |  |  | интервал |  |
| Всего | 692 | 690 | 99,7% | 99,1% |  |  |
| делеции | 454 | 454 | 100,0% | 99,3% |  |  |
| g719x | 46 | 44 | 95,7% | 86,9% |  |  |
| вставки | 72 | 72 | 100,0% | 95,9% |  |  |
| l858r | 24 | 24 | 100,0% | 88,3% |  |  |
| l861q | 24 | 24 | 100,0% | 88,3% |  |  |
| s768i | 24 | 24 | 100,0% | 88,3% |  |  |
| t790m | 24 | 24 | 100,0% | 88,3% |  |  |
| wt (дикий тип) | 24 | 24 | 100,0% | 88,3% |  |  |
| Мишень | Количество (общее) |  | Согласованный отклик |  |  | Корректный сигнал |  |
|  |  |  | (количество) |  |  | (процент) |  |
| Всего | 692 | 690 |  |  | 99,7% |  |  |
| Делеции 12367 | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| Делеции 12369 | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| Делеции 12370 | 23 | 23 |  |  | 100,0% |  |  |
| Делеции 12382 | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| Делеции 12393 | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| Делеции 12384 | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| Делеции 12387 | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| Делеции 12419 | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| Делеции 12422 | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| Делеции 12678 | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| Делеции 12728 | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| Делеции 13551 | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| Делеции 6210 | 23 | 23 |  |  | 100,0% |  |  |
| Делеции 6218 | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| Делеции 6220 | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| Делеции 6223 | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| Делеции 6225 | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| Делеции 6254 | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| Делеции 6255 | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| G719A | 24 | 22 |  |  | 91,7% |  |  |
| G719S | 22 | 22 |  |  | 100% |  |  |
| G719X | 46 | 44 |  |  | 95,7% |  |  |
| Вставки 12376 | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| Вставки 12377 | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| Вставки 12377 | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
Каждый исследовательский центр успешно продемонстрировал способность извлекать ДНК
с помощью набора QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit из срезов FFPE-блоков. Доля правильных
откликов мутаций (по всем лабораториям, выборкам мутаций и дикого типа) составила 99,7%.
Для всех анализов, кроме G719X, были получены 100% правильные результаты на всех исследо-
вательских площадках (таблица 2).
Таблица 2. Процент корректных сигналов мутаций.
Для каждого типа мутации из выборки (например, все мутации делеции, проанализированные
вместе) также был определен нижний 95%-ный односторонний точный доверительный интервал
(эквивалентный нижнему 90%-ному двустороннему доверительному интервалу). В таблице 3 по-
казаны доли правильных откликов от мутации к мутации.
Таблица 3. Процент корректных сигналов мутаций (по отдельному типу мутации)
17
| Мишень | Количество (общее) |  | Согласованный отклик |  |  | Корректный сигнал |  |
|  |  |  | (количество) |  |  | (процент) |  |
| L858R | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| L861Q | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| S768I | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| T790M | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| Дикий тип | 24 | 24 |  |  | 100,0% |  |  |
| Мишень |  | Стандартное |  |  | 95% ниж- |  |  | 95% верх- |  |
|  |  | отклонение |  |  | ний ДИ |  |  | ний ДИ |  |
| делеции 12367 | 0,27 |  |  | 0,22 |  |  | 0,36 |  |  |
| делеции 12369 | 0,46 |  |  | 0,37 |  |  | 0,61 |  |  |
| делеции 12370 | 0,24 |  |  | 0,20 |  |  | 0,33 |  |  |
| делеции 12382 | 0,26 |  |  | 0,21 |  |  | 0,35 |  |  |
| делеции 12383 | 0,19 |  |  | 0,16 |  |  | 0,26 |  |  |
| делеции 12384 | 0,34 |  |  | 0,27 |  |  | 0,45 |  |  |
| делеции 12387 | 0,26 |  |  | 0,21 |  |  | 0,34 |  |  |
| делеции 12419 | 0,38 |  |  | 0,31 |  |  | 0,50 |  |  |
| делеции 12422 | 0,13 |  |  | 0,10 |  |  | 0,17 |  |  |
| делеции 12678 | 0,36 |  |  | 0,29 |  |  | 0,47 |  |  |
| делеции 12728 | 0,30 |  |  | 0,24 |  |  | 0,39 |  |  |
| делеции 13551 | 0,32 |  |  | 0,26 |  |  | 0,42 |  |  |
| делеции 6210 | 0,25 |  |  | 0,20 |  |  | 0,34 |  |  |
| делеции 6218 | 0,42 |  |  | 0,34 |  |  | 0,56 |  |  |
| делеции 6220 | 0,31 |  |  | 0,25 |  |  | 0,41 |  |  |
| делеции 6223 | 0,24 |  |  | 0,20 |  |  | 0,32 |  |  |
| делеции 6225 | 0,27 |  |  | 0,22 |  |  | 0,36 |  |  |
| делеции 6254 | 0,50 |  |  | 0,40 |  |  | 0,66 |  |  |
| делеции 6255 | 0,22 |  |  | 0,18 |  |  | 0,29 |  |  |
| g719a | 0,44 |  |  | 0,36 |  |  | 0,59 |  |  |
| g719s | 0,37 |  |  | 0,30 |  |  | 0,50 |  |  |
| вставки 12376 | 0,27 |  |  | 0,22 |  |  | 0,36 |  |  |
| вставки 12377 | 0,30 |  |  | 0,24 |  |  | 0,40 |  |  |
| вставки 12378 | 0,38 |  |  | 0,31 |  |  | 0,51 |  |  |
| l858r | 0,34 |  |  | 0,27 |  |  | 0,45 |  |  |
| l861q | 0,47 |  |  | 0,38 |  |  | 0,63 |  |  |
| s768i | 0,35 |  |  | 0,28 |  |  | 0,46 |  |  |
| t790m | 0,38 |  |  | 0,31 |  |  | 0,51 |  |  |
Для каждой выборки была определена воспроизводимость значений ΔCt, в частности стан-
дартное отклонение и 95% доверительный интервал (таблица 3). Видно, что все стандартные от-
клонения воспроизводимости были равны или меньше 0,50. Все стандартные отклонения внутри
исследовательских лабораторий были равны или меньше 0,45. Различия в средней ΔCt между
центрами составляли до 0,76 Ct по величине (T790M центр 1 – центр 2) и не влияли на определе-
ние откликов мутаций.
Таблица 3. Воспроизводимость ΔCt (Общее стандартное отклонение по всем лабораториям).
Эффективность подготовки образцов с мутациями онкогена EGFR, включающей несколько
партий набора QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit, также была продемонстрирована в другом
исследовании, которое выполнялось в трех лабораториях (межлабораторное исследование):
QIAGEN Manchester (Соединенное Королевство), QIAGEN Hilden (Германия) и QIAGEN
Germantown (США). В исследовании использовались три клинических FFPE-блоков образца: в
18
| Клиниче- ский FFPE образец | Количе- ство поло- жительных откликов | Количе- ство отри- цательных откликов | Общее ко- личество | Процент коррект- ных откли- ков |  | Нижний |  |  | Верхний |  |
|  |  |  |  |  |  | двусторон- |  |  | двусторон- |  |
|  |  |  |  |  |  | ний 90% |  |  | ний 90% |  |
|  |  |  |  |  |  | довери- |  |  | довери- |  |
|  |  |  |  |  |  | тельный |  |  | тельный |  |
|  |  |  |  |  |  | интервал |  |  | интервал |  |
| делеция 6223 | 18 | 0 | 18 | 100.00% | 84.67% |  |  | 100.00% |  |  |
| l858r | 18 | 0 | 18 | 100.00% | 84.67% |  |  | 100.00% |  |  |
| wt | 0 | 18 | 18 | 100.00% | 84.67% |  |  | 100.00% |  |  |
одном было определено содержание мутации делеция 6223, в другом было наличие мутации
L858R, и один образец дикого типа (WT). Были исследованы 48 последовательных срезов FFPE-
блоков для каждого из клинических образцов с мутациями, которые были рандомизированы в
пары для использования в экстракции (всего 24 выделения). 24 пары секций FFPE были разде-
лены на четыре партии (6 пар секций FFPE на партию, на образец; одна партия на испытательный
центр и одна партия на случай непредвиденных обстоятельств). Для клинического образца FFPE
дикого типа 36 последовательных срезов FFPE были рандомизированы в пары для использования
в экстракции (всего 18 выделений). 18 пар секций FFPE были разделены на три партии (6 пар
секций FFPE на партию, одна партия на испытательный полигон). Клинические FFPE образцы
были отобраны на основе их известного мутационного статуса в соответствии с секвенированием
по Сэнгеру.
Для каждого образца с мутацией применялись модель дисперсионного анализа, где ΔCt был
в качестве переменной для запуска (случайный эффект внутри лаборатории) и лаборатории (слу-
чайный эффект между лабораториями). Были определены компоненты дисперсии в рамках од-
ного запуска, различных запусков и различных лабораторий. Для всех образцов из трех лабора-
торий было продемонстрировано 100% соответствие откликов мутации (таблица 4). Расчитанное
стандартное отклонение и доверительные интервалы для значений ΔCt приведены в таблице 5.
Таблица 4. Процент корректных откликов мутаций для клинических FFPE образцов.
Таблица 5. Стандартное отклонение и доверительные интервалы для ΔCt.
Клинический FFPE Стандартное откло- Нижний 95% дове- Верхний 95% дове-
образец нение рительный интервал рительный интервал
делеция 6223 0.24 0.20 0.32
l858r 0.34 0.27 0.45
Общее согласованность правильных откликов мутаций составило 18 из 18 (100%). Каждая
лаборатория успешно продемонстрировал способность воспроизводимо выделять ДНК с помо-
щью набора QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit.
16.3. Перекрестное загрязнение
Выделение ДНК набором QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit была протестирована на предмет
кросс-контаминации от образца к образцу в рамках исследования для набора therascreen® EGFR
PCR RGQ Kit.
Использовали два образца FFPE клеточной линии: дикого типа и образец FFPE клеточной
линии, несущий мутацию экзона 21 L858R. Мутация L858R была выбрана, поскольку она пред-
ставляет собой наиболее распространенную мутацию онкогена EGFR. Исследование было
направлено на имитацию ситуации, когда образцы с высоким содержанием мутации L858R (ΔCt
образцов составляла от -0,23 до 0,89) могут привести к перекрестному загрязнению других об-
разцов в процессе выделения. Исследование проводилось более пяти последовательных дней и
состояло из десяти тестовых запусков, предназначенных для изучения возможности загрязнения
образцов как во время, так и между выделениями.
19
Для проверки процедуры выделение ДНК проводилось из образцов с мутацией L858R, рас-
положенных рядом с образцами дикого типа, с использованием одной партии набора QIAamp
DSP DNA FFPE Tissue Kit. Результаты этого исследования указывают на отсутствие обнаружи-
ваемого перекрестного загрязнения как внутри процедуры выделения, так и между циклами. Ана-
лиз показал, что для 330 действительных повторов образца дикого типа не было ложноположи-
тельных вызовов.
Аналогичное исследование было проведено для системы therascreen® KRAS RGQ PCR Kit.
Чтобы продемонстрировать отсутствие перекрестного загрязнения, ПЦР набор должен был пра-
вильно идентифицировать все тестовые образцы дикого типа как отрицательные по мутации и
правильно идентифицировать все тестовые образцы с мутацией 12Ala как положительные по му-
тации 12Ala.
Результат показал отсутствие поддающейся обнаружению кросс-контаминации в рамках
цикла выделения и между разными циклами, поскольку ни один из действительных результатов
образца ДНК дикого типа не был неверным
16.4. Интерферирующие вещества
Набор QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit можно использовать для выделения ДНК из различных
типов ткани. Потенциально интерферирующие вещества могут происходить из различных источ-
ников, например, естественные метаболиты, специфичные для типа ткани и органа, метаболиты,
вырабатываемые во время патологических состояний, вещества, вводимые во время лечения па-
циента, или вещества, употребляемые пациентом. Широкий спектр потенциально интерфериру-
ющих веществ и разнообразие последующих диагностических наборов и методов не дают воз-
можности надежно и достоверно установить воздействие интерферирующих веществ исключи-
тельно на выделение ДНК без исследования влияния на конкретную дальнейшую реакцию. Поль-
зователям рекомендуется провести контроль возможных интерферентов для конкретной ткани с
использованием реагентов, специфичных для дальнейшего диагностического применения.
16.5. Чувствительность, специфичность и точность
Поскольку набор для экстракции не предназначен для прямых измерений (является преаналити-
ческим), невозможно установить чувствительность, специфичность и точность в отрыве от по-
следующих применений. Кроме того, точность метода не может быть проверена, поскольку не
существует ни сертифицированного эталонного стандарта, ни валидированного эталонного ме-
тода.
16.6. Выход ДНК
Рабочие характеристики набора подтверждалются исходя из концентрации и чистоты получае-
мой ДНК, а также функциональным анализом для нескольких дальнейших исследований, таких,
как обнаружение мутаций в онкогене KRAS, анализ мутаций в гене EGFR, 8-плексная конечная
ПЦР человека и амплификация целого генома с дальнейшим секвенированием по методу Сэн-
гера. Все соответствующие критерии приемлемости и требования к изделию были выполнены.
Элюированная геномная ДНК была пригодна для использования в различных дальнейших ана-
лизах.
17. Маркировка
На упаковке и этикетках могут присутствовать следующие обозначения:
Содержит реагенты, достаточные для тестов <N>
<N>
Смотрите инструкции по применению
Использовать до
20
Для диагностики In vitro
Каталожный номер
Номер партии
номер материала
Компоненты
Объем
Диапазон температур
Производитель
По прибытии
Открыть при доставке; храните колонки QIAamp MinElute при 2-8ºС
Запишите текущую дату после добавления этанола во флакон
Добавление
Содержит
Восстановить в
Этанол
Гуанидин гидрохлорид
Малеиновая кислота
Глобальный торговый номер
Внимание!
Rn R - версия инструкции, а n - номер пересмотра
→
Приводит к
18. Требование к охране окружающей среды.
Медицинское изделие при использовании, транспортировке и хранении, не оказывает нега-
тивного воздействия на человека и окружающую среду.
19. Утилизация
Чтобы избежать возможного загрязнения окружающей среды, изделие c истекшим сроком
годности, отходы использованных реагентов, а также, в случае видимых повреждений индиви-
дуальной упаковки, изделие должно утилизироваться местными публично-правовыми организа-
циями, в соответствии с требованиями местных нормативно-правовых актов и правилами утили-
зации в данном регионе.
На территории Российской Федерации набор QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit должен ути-
лизироваться в соответствии с нормативными требованиями для отходов класса Б – после хими-
ческих методов обеззараживания и аппаратных способов обеззараживания с применением физи-
ческих методов в соответствии с действующими санитарными правилами и нормами в соответ-
ствии с СанПиН 2.1.3684-21).
20. Контактная информация
Техническую поддержку и дополнительную информацию можно получить в центре техниче-
ской поддержки по ссылке www.qiagen.com/Support, позвонив по номеру 00800-22-44-6000, или
21
обратившись в отдел технической поддержки QIAGEN или к местным дистрибьюторам (см. на
сайте www.qiagen.com).
21. Гарантийные обязательства
Компания QIAGEN GmbH (КАЙДЖЕН ГмбХ) принимает на себя гарантийные обязательства
в отношении медицинского изделия по отсутствию дефектов и соответствию заявленным произ-
водителем характеристикам в течение всего срока годности, при соблюдении условий, указанных
в инструкции по применению.
Производитель не несёт ответственности за повреждения или несчастные случаи в результате
неправильного использования, ошибки пользователя или внешних чрезвычайных ситуаций. По
вопросам качества продукции обращайтесь к уполномоченному представителю производителя.
22. Рекламации
Производитель/разработчик медицинского изделия:
QIAGEN GmbH / КАЙДЖЕН ГмбХ
Qiagen Strasse 1, 40724 Hilden, Germany/ Кайджен Штрассе 1, 40724 Хильден, Германия
Номер телефона: +49-02103-29-0
Адрес электронной почты: info@qiagen.com;
Сайт: www.qiagen.com
Уполномоченный представитель производителя на территории Российской Федерации:
Общество с ограниченной ответственностью "Кайджен РУС" (ООО "Кайджен РУС")
123557, ГОРОД МОСКВА, улица Малая Грузинская, д. 28, помещ. 6/14
Номер телефона: 8 (499) 350-55-70
Адрес электронной почты: qiagenrus@qiagen.com
23. Редакция документа
Дата Изменения
R3, февраль 2017 Обновлен раздел Предупреждения и меры предосторожности
R4, февраль 2026 Обновлен раздел Рекламации
22
2
Оглавление
1. Наименование изделия .............................................................................................................................. 5
2. Производитель ............................................................................................................................................ 5
3. Назначение, показания к применению, противопоказания.................................................................... 5
4. Сведения о потенциальных потребителях ............................................................................................... 6
5. Общие сведения ......................................................................................................................................... 6
6. Принцип действия ...................................................................................................................................... 6
7. Комплектность набора ............................................................................................................................... 8
8. Необходимые материалы, не входящие в комплект набора .................................................................. 9
9. Перечень лекарственных средств, материалов животного и (или) человеческого происхождения .. 9
10. Предупреждения и меры предосторожности .......................................................................................... 9
11. Срок годности. ......................................................................................................................................... 12
12. Хранение и перемещение реагентов ...................................................................................................... 13
13. Хранение и перемещение образцов ........................................................................................................ 13
14. Процедура ................................................................................................................................................. 13
14.1. Протокол: Выделение вирусной нуклеиновой кислоты из плазмы и сыворотки .................. 16
15. Контроль качества.................................................................................................................................... 18
16. Эксплуатационные характеристики ....................................................................................................... 18
16.1. Линейность ................................................................................................................................... 18
16.2. Предел обнаружения .................................................................................................................... 18
16.3. Прецизионность и воспроизводимость ...................................................................................... 18
16.4. Перекрестная реактивность. Точность ....................................................................................... 18
16.5. Интерферирующие вещества ...................................................................................................... 19
16.6. Клиническая специфичность ...................................................................................................... 19
17. Маркировка............................................................................................................................................... 19
18. Требование к охране окружающей среды. ............................................................................................ 20
19. Утилизация ............................................................................................................................................... 20
20. Контактная информация .......................................................................................................................... 20
21. Гарантийные обязательства .................................................................................................................... 20
22. Уполномоченный представитель производителя на территории Российской Федерации: .............. 21
Приложение А: Автоматизированный процесс выделения с использованием станции QIAcube ........... 21
Редакция документа ......................................................................................................................................... 21
3
КАЙДЖЕН, Технологии для отбора образцов и проведения анализов
Компания QIAGEN — ведущий поставщик инновационных технологий отбора и анализа
проб, позволяющих выделять и распознавать компоненты любых биологических образцов.
Наши высокотехнологичные продукты и услуги отличаются высоким качеством и
обеспечивают успех на всех этапах работы, от взятия образца до получения результата
анализа.
QIAGEN задает стандарты в таких областях, как:
- Очистка ДНК, РНК и белков
- Анализ нуклеиновых кислот и белков
- Исследование микро-РНК и РНК-интерференции
- Автоматизация технологических процессов отбора и анализа проб
Наша миссия заключается в том, чтобы помогать вам добиваться выдающихся успехов и
совершать прорывы. Более подробную информацию см. на веб-сайте www.qiagen.com.
4
1. Наименование изделия
Набор для выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов в варианте исполнения:
Вариант 4:
Набор QIAamp DSP Virus Spin Kit,
в составе:
1. Колонки QIAamp MinElute с промывочными пробирками (2 мл) WT (50 шт.).
2. Пробирки для лизиса (2 мл) LT (50 шт.).
3. Пробирки для элюирования (1,5 мл) ЕТ (50 шт.).
4. Промывочные пробирки (2 мл) WT (5 х 50 шт.).
5. Буфер для лизиса (33 мл) AL (1 шт.).
6. Промывочный буфер 1 (концентрат) (19 мл) AW1 (1 шт.).
7. Промывочный буфер 2 (концентрат) (13 мл) AW2 (1 шт.).
8. Элюирующий буфер (2 мл) АVЕ (4 шт.).
9. Растворитель протеиназы (4,4 мл) PS (1 шт.).
10. Носитель РНК Carrier (310 мкг) (1 шт.).
11. Протеиназа QIAGEN (760 мкл) (1 шт.).
12. Инструкция по применению.
2. Производитель
QIAGEN GmbH (КАЙДЖЕН ГмбХ)
Qiagen Strasse 1, 40724 Hilden, Germany (Германия)
Номера телефонов: +49-02103-29-0
Адрес электронной почты: info@qiagen.com;
Сайт: www.qiagen.com
3. Назначение, показания к применению, противопоказания.
Назначение
Для выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов методом селективного
связывания на мембране из диоксида кремния.
Описание
Набор QIAamp DSP Virus Spin Kit (далее набор, набор реагентов, QIAamp DSP Virus Spin
Kit) представляет собой систему, использующую технологию селективного связывания
нуклеиновых кислот (НК) на мембране из диоксида кремния (QIAamp технология) для
выделения и очистки вирусных нуклеиновых кислот из биологических образцов сыворотки и
плазмы крови.
Набор QIAamp DSP Virus Spin Kit - это готовое к использованию медицинское изделие для
выделения и очистки вирусных нуклеиновых кислот из образцов ЭДТА-плазмы и сыворотки
крови.
Набор рассчитан на обработку 50 образцов.
Время полного цикла анализа с использованием набора не превышает 90 минут.
Показания к применению
Набор QIAamp DSP Virus Spin Kit предназначен для выделения вирусных нуклеиновых
кислот в качестве этапа пробоподготовки для последующего анализа очищенных
нуклеиновых кислот в клинической лабораторной диагностике, в частности методом ПЦР.
Является преаналитическим методом, набор QIAamp DSP Virus Spin Kit предназначен для
подготовки образцов, но не для получения результатов исследований, качественных или
количественных.
Противопоказания к применению
При использовании специально обученным персоналом и с учетом применения по
назначению противопоказания не выявлены.
5
4. Сведения о потенциальных потребителях
Набор должен использоваться только квалифицированным персоналом (лаборантами или
врачами клинической лабораторной диагностики, владеющими методами молекулярно-
биологических исследований для диагностики in vitro) в условиях профессиональной
клинико-диагностической лаборатории. Пользователь также должен иметь навыки,
необходимые для правильного выполнения исследований, описанных в данной инструкции по
применению.
Медицинское изделие предназначено только для профессионального использования.
Набор предназначен для диагностики in vitro.
5. Общие сведения
В наборе QIAamp DSP Virus Spin Kit используется известная технология для
одновременного выделения и очистки вирусных ДНК и РНК. В наборе используется
сочетание селективности мембран на основе диоксида кремния и вариативность объемов
элюирования от 20 до 150 мкл. Процедура может использоваться для плазмы и сыворотки
крови. Могут использоваться как свежие, так и замороженные образцы при условии, что они
замораживались и размораживались не более одного раза. Вирусные нуклеиновые кислоты,
элюированные буфером AVE, могут сразу использоваться в дальнейших исследованиях или
храниться при температуре от -25ºС до - 15ºС.
6. Принцип действия
Процедура выделения вирусных ДНК и РНК с использованием набора QIAamp DSP Virus
Spin Kit включает 4 этапа (лизис, связывание, промывка и элюирование) и проводится с
использованием колонок QIAamp MinElute в стандартной центрифуге или полностью
автоматически при использовании станции QIAcube (Приложение А). Данная процедура
позволяет минимизировать перекрёстную контаминацию образцов и повысить безопасность
во время работы с потенциально инфицированными образцами. Набор QIAamp DSP Virus Spin
Kit подходит для одновременной обработки 50 образцов. Набор может использоваться для
выделения вирусной ДНК и РНК широкого диапазона вирусов, однако эффективность
данного набора регентов для каждого отдельного вида вирусов не определялась и должна
оцениваться пользователем.
Лизис с использованием протеиназы QIAGEN
Образцы лизируются в денатурирующих условиях при повышенной температуре. Лизис
осуществляется в присутствии Протеиназы QIAGEN и буфера AL, которые совместно
инактивируют РНКазы.
Адсорбция на мембране QIAamp MinElute.
Адсорбция регулируется путем добавления этанола для оптимизации связывания НК с
мембраной. Лизаты затем перемещаются на колонку QIAamp MinElute и вирусные
нуклеиновые кислоты адсорбируются на мембране из диоксида кремния по мере того, как
лизат проходит через мембрану при центрифугировании. Солевой баланс и уровень рН
обеспечивают, что белки и загрязнения, которые могут ингибировать последующий анализ
методом ПЦР, не остаются на мембране колонки QIAamp MinElute.
Пробирки 2 мл (в комплекте) необходимы для колонок QIAamp MinElute в процессе
загрузки и элюирования.
Удаление остаточных примесей
Нуклеиновые кислоты остаются связанными на мембране, в то время как загрязнения
вымываются в процессе трех стадий. В упрощенной процедуре изначально достаточно чистая
вирусная ДНК и РНК элюируется буфером AVE при комнатной температуре.
Элюирование очищенной нуклеиновой кислоты
6
Элюирование осуществляется с использованием буфера AVE. Колонки QIAamp MinElute
обеспечивают минимальный элюирующий объем в 20 мкл. Меньший объем приводит к
сильноконцентрированным элюатам НК.
При последующих исследованиях, которые нуждаются в небольших изначальных объемах
пробы (например, ПЦР и ПЦР с обратной транскрипцией), элюат с большей концентрацией
НК может повысить чувствительность анализа.
При проведении последующего анализа, который нуждается в большем исходном объеме,
объем элюирования можно увеличить до 150 мкл. Однако увеличение элюирующего объема
приведет к уменьшению концентрации нуклеиновых кислот в элюате.
Получаемый объем элюата может быть до 5 мкл меньше объема используемого
элюирующего буфера, например, при элюирующем объеме в 20 мкл объем конечного элюата
будет >15 мкл. Объем получаемого элюата также зависит от характера образца.
Элюированная нуклеиновая кислота собирается в 1,5 мл пробирки для элюирования
(поставляются в комплекте). Рекомендуется хранить полученные ДНК или РНК при
температуре ниже -20 ºС.
Выход вирусной нуклеиновой кислоты, выделенной из биологических образцов, обычно
составляет менее 1 мкг. Для определения выхода НК рекомендуются методы количественной
амплификации. При количественном определении нуклеиновых кислот, выделенных с
помощью протокола для QIAamp DSP Virus Spin Kit, необходимо учитывать, что в образце
будет значительно больше РНК-носителя, чем вирусной РНК.
7
Носитель РНК
Носитель РНК служит для двух целей. Во-первых, он усиливает связь между вирусными
нуклеиновыми кислотами и мембраной QIAamp MinElute, особенно если в образце
присутствует незначительное количество целевых молекул. Во-вторых, добавление носителя
РНК снижает вероятность деградации вирусной РНК в том редком случае, когда молекулы
РНКазы избегают денатурации хаотропными солями и детергентом в буфере для лизиса AL.
Если носитель РНК не добавляется в буфер AL, это приведет к уменьшению количества
выделяемых РНК и ДНК.
Эффективность амплификационных систем варьируются в зависимости от общего
количества нуклеиновой кислоты, которая присутствует в реакции. Элюаты, полученные с
использованием данного набора, содержат вирусные нуклеиновые кислоты и носитель РНК.
Количество носителя РНК значительно превышает количество вирусных нуклеиновых кислот.
Поэтому расчеты того, сколько элюата следует добавить в последующую амплификацию,
должны основываться на количестве добавленного РНК-носителя. Для получения наиболее
высоких уровней чувствительности в реакциях амплификации может потребоваться
корректировка количества носителя РНК, добавляемого в буфер АL.
Добавление внутреннего контроля
Использование протокола выделения вирусных НК в комбинации с доступными
амплификационными системами может требовать использование внутреннего контроля в
процессе выделения и очистки НК. Внутренний контроль РНК или ДНК должен добавляться
вместе с носителем РНК в буфер для лизиса. Для оптимальной эффективности очистки,
молекулы внутреннего контроля должны быть длиннее 200 нуклеотидов, так как более мелкие
молекулы не извлекаются эффективно. Для определения оптимальной концентрации
обратитесь к инструкциям производителя. Использование концентрации, отличной от
рекомендованной, может снизить эффективность амплификации.
7. Комплектность набора
Состав набора
Набор QIAamp DSP Virus Spin Kit
Каталожный номер 61704
Количество реакций 50
Обозначение Описание Идентификация Количество
Колонки QIAamp MinElute с
QIAamp
промывочными пробирками (2 мл) 50 шт
MinElute
WT
LT Пробирки для лизиза (2 мл) LT 50 шт
Пробирки для элюирования (1,5мл)
ET 50 шт
ET
WT Промывочные пробирки (2 мл) WT 5 х 50 шт
AL Буфер для лизиза* (33мл) AL 1 шт
Промывочный буфер 1*
AW1 1 шт
(концентрат) (19 мл) AW1
Промывочный буфер 2**
AW2 1 шт
(концентрат) (13 мл) AW2
Элюирующий буфер** (2 мл) AVE
AVE 4 шт
(фиолетовые колпачки)
Растворитель протеиназы** (4,4
PS 1 шт
мл) PS
Носитель РНК Carrier (310 мкг)
Carrier 1 шт
(красные колпачки)
QP Протеиназа QIAGEN*** (760 мкл) 1 шт
Руководство пользователя 1 шт
8
* содержит хаотропные соли. См. раздел «Предупреждения и меры предосторожности»
** содержит азид натрия в качестве консерванта
*** см. «Подготовка реагентов и буферов»
Примечание: При работе с химикатами всегда надевайте лабораторный халат,
одноразовые перчатки и защитные очки. Для получения дополнительной информации
обратитесь к соответствующим паспортам безопасности (SDS), которые можно
получить у поставщика продукта или в режиме онлайн в формате PDF по ссылке
www.qiagen.com/safety.
8. Необходимые материалы, не входящие в комплект набора
 Этанол (96-100%)*
 Пипетки (регулируемые) и наконечники для пипеток, свободные от нуклеаз (во
избежание перекрестного загрязнения рекомендуются наконечники для пипеток с
аэрозольными барьерными фильтрами)
 Термомиксер или нагревательный блок** для лизиса при 56°C
 Микроцентрифуга** (с ротором на 1,5 и 2 мл пробирки)
 Вортекс
 Для образцов менее 200 мкл: 0,9% раствор NaCl
* не используйте денатурированный этанол, который содержит примеси метанола и
метилэтилкетона
** убедитесь, что инструменты проверены и откалиброваны согласно рекомендациям
производителя
9. Перечень лекарственных средств, материалов животного и (или)
человеческого происхождения
Лекарственные средства, материалы человеческого и животного происхождения: не
используются.
10. Предупреждения и меры предосторожности
Для диагностики in vitro
Правила техники безопасности
При работе с химикатами всегда используйте лабораторный халат, одноразовые перчатки
и защитные очки.
Для получения дополнительной информации ознакомьтесь с соответствующими
паспортами безопасности (SDS). Эти паспорта можно получить в компактном и удобном
формате PDF на сайте www.qiagen.com/safety, где можно найти, распечатать SDS каждого
набора компании QIAGEN и каждого компонента в наборе. Утилизацию образцов и отходов
после анализа следует проводить в соответствии с местными нормами безопасности.
Общие меры предосторожности
Следует всегда обращать внимание на следующее:
 Набор предназначен только для профессионального применения в клинической
лабораторной диагностике.
 Анализ следует проводить с образцами сыворотки или плазмы крови
 Следует допускать к работе только обученный персонал.
 Следует использовать одноразовые перчатки без талька талька, халат и защитные очки.
Для получения дополнительной информации по безопасности можно обратиться к
соответствующим паспортам безопасности (SDS), которые размещены в режиме онлайн
в формате PDF по ссылке www.qiagen.com/safety.
 Запрещается использовать набор или компоненты с истекшим сроком годности и/или
поврежденной упаковкой компонентов набора.
 Со всеми образцами следует обращаться как с потенциально биологически опасными
веществами. Утилизацию образцов и отходов на различных стадиях обработки образца
9
следует проводить в соответствии с местными/национальными правилами утилизации
через уполномоченные организации в данном регионе.
 До, вовремя и после применения этого набора, все потенциально опасные материалы (то
есть материалы, которые могли войти в контакт с клиническими образцами), включая
пробирки, наконечники и прочие материалы, следует обрабатывать и утилизировать в
соответствии с применимыми и соответствующими муниципальными /
правительственными нормами, действующими в месте применения этого продукта.
 Не следует хранить открытыми флаконы с реагентами.
 Следует использовать калиброванные пипетки и инструменты.
 Следует использовать наконечники с фильтрами для пипеток
 Все поставляемые реагенты в наборах предназначены для использования только с
другими реагентами из того же набора. Не следует заменять реагенты из набора на
реагенты из других наборов, в том числе аналогичных, так как это может снизить
эффективность работы.
Примечание: Набор реагентов не содержит материалов биологического происхождения,
веществ, обладающих канцерогенным, мутагенным действием, а также влияющих на
репродуктивную функцию человека. При использовании по назначению и соблюдении мер
предосторожности является безопасным
Предупреждения
ВНИМАНИЕ: не добавляйте отбеливатель или кислотные растворы
непосредственно в отходы, содержащие буфер AL и буфер AW1
Буферы AL и AW1 содержат гуанидингидрохлорид, который способен создавать высоко
реакционноспособные вещества при соединении с отбеливателем.
В случае пролива жидкости, содержащей вышеперечисленные буферы, необходимо
произвести очистку с использованием лабораторных детергентов и воды. Если разлитая
жидкость потенциально инфицирована, сначала очистите зараженную зону лабораторным
детергентом и водой, а затем 1 % раствором (объемного содержания) гипохлорита натрия.
В случае повреждения или протекания флаконов с буфером, наденьте перчатки и
защитные очки во время утилизации флаконов, чтобы избежать вреда для своего здоровья и
здоровья окружающих.
Компания QIAGEN не проводила испытаний жидких отходов, получаемых после
выполнения процедур с использованием набора, на остаточные инфекционные материалы.
Загрязнение жидких отходов остаточными инфекционными материалами маловероятна, но ее
не стоит полностью исключать. Следовательно, жидкие отходы необходимо считать
инфекционными, обрабатывать и утилизировать в соответствии с требованиями местных
нормативно-правовых актов и правилами утилизации в данном регионе.
К компонентам набора QIAamp DSP Virus Spin Kit применяются следующие коды риска и
безопасности.
Буфер AL, Содержит гуанидин гидрохлорид.
Буфер AW1 Может представлять опасность при попадании в пищеварительный тракт или
дыхательные пути. Вызывает раздражение кожи. Вызывает серьезное
раздражение глаз. Обратитесь в токсикологический центр или к врачу в случае
плохого самочувствия. Утилизируйте раствор/контейнер в специализированной
установке, предназначенной для утилизации отходов. Надевайте защитные
перчатки/защитную одежду/ средства защиты глаз и лица.
Протеиназа Содержит субтилизин.
QIAGEN Вызывает умеренное раздражение кожи. Вызывает серьезное повреждение глаз.
Вызывает аллергическую реакцию, приступ астмы или затрудненное дыхание в
случае попадания в дыхательные пути. Не вдыхайте
пыль/пары/газ/испарения/распыленный продукт.
Утилизируйте раствор/контейнер в специализированной установке,
10
предназначенной для утилизации отходов. Обратитесь в токсикологический
центр или к врачу. В случае попадания в глаза промойте глаза водой в течение
нескольких минут. Снимите контактные линзы, если есть. Продолжайте
промывать глаза. При попадании в дыхательные пути: в случае затрудненного
дыхания перенесите пострадавшего на свежий воздух и оставьте его в покое, в
положении, удобном для дыхания. Немедленно обратитесь в токсикологический
центр или к врачу. Надевайте защитные перчатки/защитную одежду/ средства
защиты глаз и лица. Используйте средства для защиты дыхательных путей.
Меры предотвращения загрязнения
Рибонуклеазы (РНКазы) являются очень стабильными и активными ферментами, которым
обычно не требуются дополнительные факторы для функционирования. Так как РНКазы
трудно инактивировать, даже небольшого их количества достаточно для того, чтобы
разрушить РНК. Не используйте пластиковую или стеклянную посуду без предварительного
удаления РНКаз. Необходимо предпринять соответствующие меры для того, чтобы
предотвратить попадание РНКаз в образец во время или после процедуры выделения РНК.
Для того, чтобы создать среду, не содержащую РНКаз, необходимо соблюдать следующие
условия во время предварительной обработки и использования многоразовых или
одноразовых сосудов и растворов во время работы с РНК.
Работу с РНК необходимо проводить в чистых помещениях. В пыли и на руках могут
находиться бактерии и плесневые грибки. Они являются наиболее частыми источниками
РНКаз. Всегда надевайте перчатки во время работы с реагентами и образцами для того, чтобы
предотвратить попадание РНКаз с поверхности кожи или запыленного лабораторного
оборудования. Часто меняйте перчатки и держите пробирки закрытыми, если вы их не
используете в данный момент. Во время работы с очищенной РНК при дальнейшем
использовании храните аликвоты на льду.
Одноразовая пластиковая посуда
Используйте стерильные, одноразовые полипропиленовые пробирки с маркировкой «без
РНКаз». Данные пробирки не содержат РНКаз и не нуждаются в предварительной обработке
при использовании.
Многоразовая пластиковая посуда
Пластиковая посуда многоразового использования должна предварительно
обрабатываться для того, чтобы предотвратить загрязнение РНКазами.
Пластиковая посуда должна тщательно промываться 0,1 М NaОН, 1 мМ ЭДТА, а затем
водой, не содержащей РНК. Также пластиковую посуду, устойчивую к хлороформу, можно
промыть раствором хлороформа для того, чтобы инактивировать РНКазы.
Стеклянная посуда
Стеклянная посуда должна обрабатываться перед использованием для того, чтобы
предотвратить загрязнение РНКазами. Стеклянная посуда, использующаяся для работы с
РНК, должна очищаться моющим средством, хорошо промываться и термически
обрабатываться при температуре 240ºС, по меньшей мере, в течение 4 часов (в течение ночи,
если возможно) перед использованием. Обработка посуды только в автоклаве не
инактивирует все РНКазы. Кроме того, стеклянная посуда может обрабатываться
диэтилпирокарбонатом. Заполните посуду раствором 0,1% диэтилпирокарбоната (0,1 % в
воде) и оставьте на ночь (12 часов) при температуре 37ºС. Затем обработайте в автоклаве или
при нагревании при 100ºС в течение 15 минут для того, чтобы устранить остатки
диэтилпирокарбоната.
Резервуары для электрофореза
Резервуары для электрофореза должны быть очищены раствором детерегента (например,
0,5% SDS), тщательно промыты водой, высушены с этанолом, обработаны 3% перекисью
водорода (пластики, используемые в резервуарах для электрофореза, не всегда являются
устойчивыми к этанолу, предпримите необходимые меры и ознакомьтесь с инструкциями
11
поставщика). Через 10 минут при комнатной температуре следует промыть резервуары для
электрофореза водой, не содержащей РНКазу.
Растворы
Растворы (водные и другие растворы) должны обрабатываться 0,1%
диэтилпирокарбонатом. Диэтилпирокарбонат является эффективным, но не единственным
средством, поглощающим РНКазы. Он обычно используется в концентрации 0,1 % для
инактивации РНКаз на поверхности стеклянной и пластиковой посуды или для создания
растворов и воды, не содержащих РНКаз. Диэтилпирокарбонат инактивирует РНКазы за счет
ковалентной реакции. Добавьте 0,1 мл диэтилпирокарблоната в 100 мл обрабатываемого
раствора и хорошо встряхните для того, чтобы диэтилпирокарбонат смешался с раствором.
Проинкубируйте раствор в течение 12 часов при температуре 37ºС. Обработайте раствор в
автоклаве в течение 15 минут для того, чтобы удалить остатки диэтилпирокарбоната.
Диэтилпирокарбонат вступает в реакцию с первичными аминами и не может использоваться
непосредственно для обработки буфера Трис. Диэтилпирокарбонат очень неустойчив в
присутствии буферов Трис и быстро распадается. При приготовлении буферов Трис
необходимо в первую очередь обработать воду диэтилпирокарбонатом, а затем растворить
Трис для того, чтобы создать подходящий буфер. Даже незначительное количество
диэтилпирокарбоната изменяет пуриновые остатки в РНК за счет карбэтоксилирования.
Карбэтоксилированная РНК транслируется во внеклеточных системах с очень низкой
эффективностью. Однако ее способность создавать гибриды ДНК:РНК или РНК:РНК не
сильно меняется, пока не изменится большее количество пуриновых остатков.
ВАЖНО: Буферы, входящие в набор QIAamp DSP Virus Spin Kit, не обрабатываются
диэтилпирокарбонатом с целью удаления РНКаз и поэтому не считаются загрязненными
диэтилпирокарбонатом.
ВАЖНО: Во время работы с химическими веществами, всегда одевайте подходящий
лабораторный халат, одноразовые перчатки и защитные очки. Чтобы получить
дополнительную информацию, смотрите подходящие паспорта безопасности материала,
которые предоставляются поставщиком продукции.
Ограничения
Эффективность набора была определена при использовании плазмы и сыворотки крови
для выделения вирусных НК.
Для достижения оптимальных результатов необходимо строгое соблюдение данной
инструкции по применению. Не рекомендуется разбавление реагентов, отличное от
описанного в данной инструкции, которое приводит к потере производительности.
Следует обратить внимание на сроки годности и условия хранения, указанные на упаковке
и этикетках всех компонентов. Не используйте просроченные или неправильно хранящиеся
компоненты.
Для того, чтобы минимизировать риск неправильной интерпретации результатов
последующей диагностики, необходимо использовать надлежащие контроли при
последующих исследованиях.
Любые полученные диагностические результаты следует толковать вместе с другими
клиническими или лабораторными данными.
11. Срок годности.
Срок годности набора QIAamp DSP Virus Spin Kit составляет 24-месяца. Изделие
стабильно до истечения срока годности, указанного на этикетке, при соблюдении условий
хранения и транспортирования.
Условия хранения реагентов: при температуре 15-25°С,
Условия хранения колонок QIAamp MinElute - при температуре 2-8°С.
Условия транспортирования: при температуре от -20 до +45°С.
12
Если изделие предназначено только для периодического применения, после вскрытия
флаконов, реагенты необходимо хранить при температуре 15-25°С не более 6 месяцев или до
указанного срока годности, в зависимости от того, что наступит раньше.
После истечения срока годности изделие использовать запрещено.
12. Хранение и перемещение реагентов
Колонки QIAamp MinElute должны храниться в при температуре 2–8С после прибытия.
Все буферы могут храниться при комнатной температуре (15–25С).
Лиофилизированный носитель РНК может храниться при комнатной температуре (15–
25С) до истечения срока годности, указанного на этикетке. Носитель РНК может быть
растворен только в буфере AVE; разбавленный носитель РНК должен сразу добавляться в
буфер AL. Данный раствор должен приготавливаться непосредственно перед использованием
и остается стабильным при температуре 2–8С до 48 часов. Разбавленный в буфере AVE
носитель РНК может быть заморожен в аликвотах и храниться при температуре от 15 до
30С до 24 месяцев.
Лиофилизированная Протеиназа QIAGEN (QP) может храниться при комнатной
температуре (15-25ºС) до окончания срока годности без ухудшения характеристик.
Протеиназа QIAGEN (QP), восстановленная в растворителе протеиназы (PS), остается
стабильной в течение одного года при хранении при температуре 2-8 ºС, но не дольше даты
окончания срока годности, указанного для набора. Следует избегать хранения
восстановленной протеиназы QIAGEN при комнатной температуре продолжительный период
времени.
Разбавленный промывочный буфер 1 (AW1) и промывочный буфер 2 (AW2) остаются
стабильными при комнатной температуре (15-25ºС) до окончания срока годности, указанного
на упаковке.
Срок хранения Набора QIAamp DSP Virus Spin Kit после вскрытия – 6 месяцев.
13. Хранение и перемещение образцов
Сыворотку и плазму хранят не более 6 часов при +2°С +8°С, для длительного хранения
рекомендуется заморозить в аликвотах при -20°С -80°С. Замороженная плазма или сыворотка
не может быть разморожена более одного раза. Многократная заморозка и размораживание
приводят к денатурации и осаждению белков, что, в свою очередь, приводит к уменьшению
концентрации вируса и выхода вирусных нуклеиновых кислот. Кроме того, криопреципитаты,
образующиеся при размораживании замороженных образцов, закупоривают мембрану
колонки QIAamp MinElute. Если криопреципитаты видны визуально, их можно осадить путем
центрифугирования при 6800 х g в течение 3 минут. Раствор должен использоваться сразу.
14. Процедура
Важные пункты, которые необходимо учитывать перед началом процедуры
 После получения набора проверьте компоненты набора на наличие повреждений. Если
упаковки или флаконы с буфером повреждены, свяжитесь со Службой технической
поддержки QIAGEN или своим региональным дистрибьютором. В случае разлива
жидкости см. пункт «Предупреждения и меры предосторожности». Не используйте
поврежденные компоненты набора, поскольку их применение может снижать
эффективность набора.
 Всегда меняйте наконечник дозатора между переносами жидкости. Для минимизации
перекрестной контаминации мы рекомендуем использовать наконечники с аэрозольным
барьером.
 Все этапы центрифугирования выполняйте при комнатной температуре (15-25°С).
 Всегда используйте одноразовые перчатки и регулярно проверяйте их на контаминацию
материалом образца. В случае загрязнения утилизируйте перчатки.
13
 Для минимизации перекрестной контаминации открывайте только по одной пробирке за
раз.
 Не рекомендуется использовать компоненты из других наборов, однако при
необходимости, компоненты можно использовать только в том случае, если номера
партий наборов идентичны.
 Не допускайте микробную контаминацию реактивов из набора.
 Для минимизации риска инфицирования потенциально инфекционным материалом мы
рекомендуем работать в проточном ламинарном шкафу до тех пор, пока образцы не
пройдут лизис.
 Данный набор могут использовать только сотрудники, обученные лабораторным
процедурам для диагностики in vitro.
Использование колонок QIAamp MinElute
Из-за высокой чувствительности технологии амплификации нуклеиновых кислот,
необходимо предпринять следующие меры безопасности во время использования колонок
QIAamp MinElute с целью предотвращения перекрестной контаминации образцами:
 Аккуратно пипеткой переносите образец или раствор в колонку QIAamp MinElute, не
касаясь при этом ободка колонки.
 Меняйте наконечники дозаторов при каждом переносе жидкостей. Рекомендуется
использовать наконечники с аэрозольным барьером.
 Не касайтесь мембраны колонки QIAamp MinElute наконечником.
 После перемешивания растворов отцентрифугируйте пробирки в течение короткого
времени для того, чтобы удалить капли с внутренней части крышки.
 Надевайте перчатки во время выполнения процедур. В случае контакта перчаток с
образцом, их необходимо незамедлительно заменить.
Центрифугирование
 Промывочные и элюирующие пробирки входят в состав набора.
 Колонки QIAamp MinElute центрифугируются при скорости приблизительно 6000 х g с
целью уменьшения уровня шума. Скорость центрифугирования колонок QIAamp
MinElute не влияет на выход ДНК и РНК.
 Для элюирования и сушки по окончанию процедуры промывки, центрифугирование
должно проводиться при полной скорости.
 Центрифугирование должно осуществляться при комнатной температуре (15-25ºС).
Работа с колонками QIAamp MinElute в микроцентрифуге
 Закройте крышку пробирки с колонкой QIAamp MinElute, прежде чем разместить
колонку в микроцентрифуге. Процентрифугируйте в течение необходимого периода
времени.
 Достаньте колонку QIAamp MinElute и промывочные пробирки из микроцентрифуги.
 Поместите колонку QIAamp MinElute в новую промывочную пробирку. Утилизируйте
фильтрат и промывочную пробирку. Необходимо отметить, что фильтрат может
содержать опасные отходы и должен соответствующим образом утилизироваться.
 Открывайте только одну колонку QIAamp MinElute за раз. Примите меры для того,
чтобы предотвратить образование аэрозолей.
Для параллельной обработки большого количества образцов мы рекомендуем
устанавливать промывочные пробирки на штативе таким образом, чтобы можно было
перенести колонки QIAamp MinElute после центрифугирования. Использованные
промывочные пробирки, содержащие фильтрат, должны утилизироваться, а новые
промывочные пробирки, содержащие колонки QIAamp MinElute, могут устанавливаться
непосредственно в центрифугу.
Подготовка реагентов и буферов
 Подготовка РНК. При работе с РНК необходимо соблюдать оперативность на всех
этапах процедуры (см. «Предупреждения и меры предосторожности».
 Приготовление протеиназы QIAGEN
14
|  | Объем | Объём носителя |  |  | Объём носителя |
| Количество |  |  | Кол-во | Объем буфера |  |
|  | буфера AL | РНК в буфере AVE |  |  | РНК в буфере AVE |
| образцов |  |  | образцов | AL (мл) |  |
|  | (мл) | (мкл) |  |  | (мкл) |
| 1 | 0,22 мл | 6,2 мкл | 13 | 2,86 мл | 80,1 мкл |
| 2 | 0,44 мл | 12,3 мкл | 14 | 3,08 мл | 86,3 мкл |
| 3 | 0,66 мл | 18,5 мкл | 14 | 3,30 мл | 92,4 мкл |
| 4 | 0,88 мл | 24,6 мкл | 16 | 3,52 мл | 98,6 мкл |
| 5 | 1,10 мл | 30,8 мкл | 17 | 3,74 мл | 104,7 мкл |
| 6 | 1,32 мл | 37,0 мкл | 18 | 3,96 мл | 110,9 мкл |
| 7 | 1,54 мл | 43,1 мкл | 19 | 4,18 мл | 117,0 мкл |
| 8 | 1,76 мл | 49,3 мкл | 20 | 4,40 мл | 123,2 мкл |
| 9 | 1,98 мл | 55,4 мкл | 21 | 4,62 мл | 129,4 мкл |
| 10 | 2,20 мл | 61,6 мкл | 22 | 4,84 мл | 135,5 мкл |
| 11 | 2,42 мл | 67,8 мкл | 23 | 5,06 мл | 141,7 мкл |
| 12 | 2,64 мл | 73,9 мкл | 24 | 5,28 мл | 147,8 мкл |
Добавьте все содержимое пробирки с растворителем протеиназы (PS) в пробирку с
лиофилизированной протеиназой QIAGEN (QP) и тщательно перемешайте. Для того, чтобы
предотвратить образование пены, перемешивайте содержимое, переворачивая пробирку
несколько раз. Убедитесь в том, что протеиназа QIAGEN (QP) полностью растворилась.
Протеиназа QIAGEN (QP), восстановленная в растворителе протеиназы (PS), остается
стабильной в течение одного года при хранении при температуре 2-8ºС, но не дольше даты
окончания срока годности набора, указанного на этикетке. Следует избегать хранения
восстановленной протеиназы QIAGEN при комнатной температуре продолжительный период
времени.
ВАЖНО: Не добавляйте Протеиназу QIAGEN (QP) непосредственно в буфер AL.*
 Добавление носителя РНК в буфер AL*
Добавьте 310 мкл буфера AVE в пробирку, содержащую 310 мкг лиофилизированного
носителя РНК для того, чтобы получить раствор с концентрацией 1 мкг/мкл. Тщательно
растворите носитель РНК, разделите его на равные аликвоты и храните при температуре от -
15ºС до -25ºС. Не размораживайте/замораживайте аликвоты носителя РНК более 3 раз.
ВАЖНО: Носитель РНК не растворяется в буфере AL. Его следует развести в буфере
AVE, а только затем добавить в буфер AL.
*Содержит хаотропную соль. Соблюдайте меры предосторожности и надевайте перчатки
во время работы. Не совместим с дезинфицирующими средствами, содержащими
отбеливатель. См. раздел «Предупреждения и меры предосторожности»
Рассчитайте объем смеси буфера AL и носителя РНК, необходимого для одной партии
исследуемых образцов, выбрав количество образцов, которое должно одновременно
обрабатываться, из таблицы 1 ниже. Если используется большое количество образцов, объемы
можно рассчитать следующим образом:
n x 0,22 мл = y мл
y мл х 28 мкл/мл = z мкл
Где: n = количество образцов, которые должны обрабатываться одновременно
y = рассчитанный объем буфера AL
z = количество носителя РНК в буфере AVE, которое должно добавляться в буфер AL.
Аккуратно перемешайте, переворачивая пробирки 10 раз. Для того, чтобы избежать
пенообразования, не встряхивайте раствор.
Таблица 1. Объемы буфера AL и раствора носителя РНК в буфере AVE, необходимые для
выделения вирусных ДНК и РНК с использованием набора QIAamp DSP Virus Spin Kit.
ВАЖНО: Процедура подготовки образцов оптимизирована для 5,6 мкг носителя РНК на
образец. Если меньшее количество носителя РНК является оптимальным для вашей системы
15
амплификации, переносите только необходимое количество носителя РНК в пробирки,
содержащие буфер AL. На каждый микрограмм носителя РНК, необходимого для подготовки
образца, необходимо добавлять 5 мкл растворенного в буфере AVE носителя РНК на
миллилитр буфера AL. Использование менее 5.6 мкг носителя РНК для одного образца
должно подтверждаться для каждого отдельного типа образца и анализа.
Буфер АW1
Перед использованием добавьте 25 мл этанола (96-100%) во флакон, содержащий 19 мл
концентрата буфера АW1. Пометьте этикетку для того, чтобы указать, что этанол уже
добавлялся. Храните восстановленный буфер АW1 при комнатной температуре (15-25ºС).
Разбавленный буфер AW1 остается стабильным в течение года, но не дольше срока годности
набора, указанного на упаковке.
ВАЖНО: Всегда перемешивайте восстановленный буфер АW1 перед использованием,
встряхивая его.
Буфер АW2
Добавьте 30 мл этанола (96-100%) во флакон, содержащий 13 мл концентрата буфера
АW2. Пометьте этикетку для того, чтобы указать, что этанол уже добавлялся. Храните
растворенный буфер АW2 при комнатной температуре (15-25ºС). Разбавленный буфер AW2
остается стабильным в течение года, но не дольше срока годности набора, указанного на
упаковке.
ВАЖНО: Всегда перемешивайте восстановленный буфер АW2 перед использованием,
встряхивая его.
Элюирование нуклеиновых кислот
Температура элюирующего буфера перед использованием должна быть доведена до
комнатной температуры.
14.1. Протокол: Выделение вирусной нуклеиновой кислоты из плазмы и сыворотки
Данный протокол описывает процедуру выделения вирусной нуклеиновой кислоты из 200
мкл плазмы или сыворотки с использованием набора реагентов QIAamp DSP Virus Spin Kit и
микроцентрифуги. Для того, чтобы ознакомиться с процедурой автоматического выделения
вирусной нуклеиновой кислоты, используя набор реагентов QIAamp DSP Virus Spin Kit и
станцию QIAcube (Приложение А), смотрите инструкцию по эксплуатации станции QIAcube и
соответствующий протокол.
Действия, которые необходимо выполнить перед началом процедуры
 Обработка в центрифуге должна осуществляться при комнатной температуре (15-25ºС).
 Доведите температуру образцов до комнатной (15-25ºС).
 Доведите температуру буфера AVE до комнатной с целью элюирования на этапе 14.
 Установите нагревательный блок на температуру 56ºС (+ 3ºС) с целью его
использования на этапе 4.
 Убедитесь в том, что буфер AW1, буфер AW2 и Протеиназа QIAGEN (QP) подготовлены
в соответствии с инструкциями в разделе «Подготовка реагентов и буферов».
 Добавляйте носитель РНК, восстановленный в буфере AVE, в буфер AL в соответствии с
инструкциями в разделе «Подготовка реагентов и буферов».
Процедура
1. Добавьте 25 мкл Протеиназы QIAGEN (QP) в пробирку для лизиза (LT).
ВАЖНО: Ознакомьтесь с разделом «Подготовка реагентов и буферов» для того, чтобы
правильно провести ресуспендирование Протеиназы QIAGEN (QP) в растворителе протеиназы
(PS).
2. Добавьте 200 мкл плазмы/сыворотки в пробирку для лизиса (LT).
Если объем образца меньше 200 мкл, добавьте раствор 0,9% хлорида натрия для того,
чтобы довести объем образца до 225 мкл.
3. Добавьте 200 мкл буфера AL. Закройте крышку и перемешайте в вортексе > 15 секунд.
16
Для того, чтобы обеспечить эффективный лизис, необходимо тщательно перемешать
буфер AL и образец, получив однородный раствор.
ВАЖНО: Не добавляйте Протеиназу QIAGEN (QP) непосредственно в буфер AL.
4. Проинкубируйте при температуре 56ºС (+ 3ºС) в течении 15 минут (+1 ) в
нагревательном блоке.
5. Центрифугируйте пробирки для лизиса (LT) в течение ≥5 секунд для того, чтобы
удалить капли с внутренней части крышки.
6. Добавьте 250 мкл этанола (96-100%) в образец. Закройте крышку и перемешайте в
вортексе в течение > 15 секунд. Проинкубируйте лизат с этанолом в течение 5 минут (±30
секунд) при комнатной температуре (15-25ºС).
ВАЖНО: Если окружающая температура превышает 25ºС, следует охладить этанол на льду
перед добавлением в лизат.
7. Процентрифугируйте пробирки в течение ≥5 секунд для того, чтобы удалить капли с
внутренней части крышки.
8. Аккуратно перенесите весь лизат, полученный на этапе 7, в колонку QIAamp MinElute,
не касаясь края колонки. Закройте крышку и процентрифугируйте при 6000 х g в течение >1
минуты. Поместите колонку QIAamp MinElute в чистую 2 мл промывочную пробирку (WT) и
утилизируйте пробирку, содержащую фильтрат.
Если после центрифугирования лизат не прошел через колонку полностью, проведите
повторное центрифугирование при большей скорости, пока колонка QIAamp MinElute не
будет пустой.
9. Аккуратно откройте колонку QIAamp MinElute и добавьте 500 мкл буфера AW1, не
касаясь края колонки. Закройте крышку и процентрифугируйте при 6000 х g в течение >1
минуты. Поместите колонку QIAamp MinElute в чистую 2 мл промывочную пробирку (WT) и
утилизируйте промывочную пробирку, содержащую фильтрат.
10. Аккуратно откройте колонку QIAamp MinElute и добавьте 500 мкл буфера AW2, не
касаясь края колонки. Закройте крышку и процентрифугируйте при 6000 х g в течение >1
минуты. Поместите колонку QIAamp MinElute в чистую 2 мл промывочную пробирку (WT) и
утилизируйте промывочную пробирку, содержащую фильтрат.
11 Аккуратно откройте колонку QIAamp MinElute и добавьте 500 мкл этанола (96-100%),
не касаясь края колонки. Закройте колпачок и процентрифугируйте при 6000 х g в течение >1
минуты. Удалите промывочную пробирку, содержащую фильтрат.
Попадание этанола в элюат может привести к возникновению проблем при последующих
анализах. Некоторые центробежные роторы могут вибрировать, в результате чего этанол
может разбрызгаться. При снятии колонки QIAamp MinElute и промывочной пробирки с
ротора, необходимо соблюдать аккуратность.
12. Разместите колонку QIAamp MinElute в чистой 2 мл промывочной пробирке (WT).
Процентрифугируйте при полной скорости (приблизительно при 20,000 х g) в течение 3 минут
(+ 30 секунд) для того, чтобы полностью высушить мембрану.
13. Поместите колонку QIAamp MinElute в новую 2 мл промывочную пробирку (WT),
откройте крышку и проинкубируйте при температуре 56ºС (+3ºС) в течение 3 минут (±30
секунд) для того, чтобы полностью высушить мембрану.
Данное действие необходимо для того, чтобы испарилась оставшаяся жидкость.
14. Поместите колонку QIAamp MinElute в пробирку для элюирования (ЕТ) и
утилизируйте промывочную пробирку. Аккуратно откройте крышку колонки QIAamp
MinElute и разместите 20-150 мкл буфера AVE по центру мембраны. Закройте крышку и
проинкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут. Процентрифугируйте на
полной скорости (приблизительно при 20, 000 х g) в течение > 1минуты.
ВАЖНО: Убедитесь в том, что температура элюирующего буфера равна комнатной
температуре. Если элюирование осуществляется в небольших объемах (<50 мкл),
элюирующий буфер должен размещаться по центру мембраны с целью полного элюирования
связанных ДНК и РНК.
17
Элюирующий объем может быть скорректирован в зависимости от требований
последующих анализов. Учитывайте, что объем элюата будет приблизительно на 5 мкл
меньше объема элюирующего буфера, нанесенного на колонку.
15. Контроль качества
В соответствии с ISO-сертифицированной системой управления качеством QIAGEN
каждая партия набора QIAamp DSP Virus Spin Kit проходит испытание на соответствие
установленным спецификациям для обеспечения постоянного качества продукции.
16. Эксплуатационные характеристики
16.1. Линейность
Оценка линейности проводилась путем тестирования рабочих стандартов вируса гепатита
А и парвовируса В 19 в различных концентрациях (от 1 до 6 lg для вируса гепатита А и от 1,3
до 7,3 lg для парвовируса В 19). Данные образцы тестировались с использованием набора
QIAamp DSP Virus Spin Kit методом ПЦР в режиме реального времени. Те же самые образцы
тестировались методом ПЦР в режиме реального времени с использованием эталонного
метода подготовки образца BioRobot 9604. Результаты демонстрируют сопоставимую
линейность между методами пробоподготовки. Средний титр и коэффициенты вариации
каждого этапа подготовки также сопоставимы.
16.2. Предел обнаружения
Предел обнаружения вируса гепатита А для набора QIAamp DSP Virus Spin Kit был
определен в 8,84 МЕ/мл. Предел обнаружения парвовируса В 19 для набора QIAamp DSP
Virus Spin Kit был определен в 14,97 МЕ/мл. Чувствительность набора QIAamp DSP Virus Spin
Kit, для обоих вирусов была определена как превышающая чувствительность BioRobot 9604
приблизительно в 2 раза.
16.3. Прецизионность и воспроизводимость
В рамках исследования параметры точности испытывались по двум параметрам:
воспроизводимость и прецизионность. Испытания проводились с использованием ПЦР
наборов реагентов artus HCV RG RT-PCR Kit и artus HBV RG PCR Kit, образцов плазмы и
сыворотки со средним содержанием вируса гепатита HBV/HCV в концентрации 1х104 МЕ/мл
при использовании протокола ручного лизиса с использованием набора QIAamp DSP Virus
Spin Kit и частично стандартному протоколу для автоматической станции QIAcube в
следующих комбинациях:
• Протокол извлечения из большого объема образца (плазма)
• Протокол извлечения из большого объема образца (сыворотка)
• Протокол извлечения из малого объема образца (плазма)
• Протокол извлечения из малого объема образца (плазма)
Были соблюдены все критерии приемлимости для каждого из параметров
(воспроизводимость и прецизионность) и общей точности - коэффициент вариации (%) и
общая точность (%) были < 45%.
Использование различных протоколов, исходных объемов образцов и целевых аналитов
продемонстрировало сопоставимые результаты в отношении определения вирусной нагрузки,
а также анализа точности определения вируса гепатита HCV и HBV.
16.4. Перекрестная реактивность. Точность
Была оценена возможность перекрёстного загрязнения при использовании высоко
положительных образцов (5.00x107 МЕ/мл вируса гепатита В) и отрицательных образцов при
выделении ДНК из образца с помощью набора QIAamp DSP Virus Spin Kit при ручном
выделении в комбинации с набором реагентов artus HВV RG PCR и амплификатором Rotor-
Gene Q.
Все положительные образцы были определены положительными, а все отрицательные
образцы были определены отрицательными в целевом (Green) канале. Данное исследование
18
продемонстрировало, что процесс очистки и выделения ДНК вируса гепатита В, не приводит
к перекрёстному загрязнению.
Результат количественного определения всех положительных образцов не превышал 0,22
Lg от номинального значения 5.00x107 МЕ/мл, что соответствует критериям приемлимости,
допускающим погрешность в 0,5 Lg.
16.5. Интерферирующие вещества
Образцы, содержащие повышенные уровни эндогенных ингибиторов: гемоглобина (в
высокой концентрации), триглицеридов и биллирубина, не препятствуют обнаружению
низкой концентрации вируса гепатита С (3хLOD 714 МЕ/мл) и средней концентрации вируса
гепатита С (1 х 104 МЕ/мл) набором artus® HCV RG PCR при выделении НК с
использованием набора QIAamp DSP Virus Spin Kit.
16.6. Клиническая специфичность
При проведении тестов на ВИЧ и вирус гепатита В была продемонстрирована 100%
клиническая специфичность при использовании набора QIAamp DSP Virus Spin Kit и
амплификатора Rotor-Gene Q для ПЦР ВИЧ в режиме реального времени и системы
LightCycler для ПЦР вируса гепатита В в качестве последующего анализа.
17. Маркировка
На упаковке и этикетках могут присутствовать следующие обозначения:
Содержит реагенты, достаточные для тестов <N>
<N>
Смотрите инструкции по применению
Использовать до
Для диагностики In vitro
Каталожный номер
Номер партии
номер материала
Компоненты
Объем
Диапазон температур
Производитель
По прибытии
Открыть при доставке; храните колонки QIAamp MinElute при 2-8ºС
Запишите текущую дату после добавления этанола во флакон
Добавление
Содержит
Лиофилизованный
19
Восстановить в
Этанол
Гуанидин гидрохлорид
Малеиновая кислота
Субтилизин
Глобальный торговый номер
Внимание!
Rn R - версия инструкции, а n - номер пересмотра

Приводит к
18. Требование к охране окружающей среды.
Медицинское изделие при использовании, транспортировке и хранении, не оказывает
негативного воздействия на человека и окружающую среду.
19. Утилизация
Чтобы избежать возможного загрязнения окружающей среды, изделие c истекшим сроком
годности, отходы использованных реагентов, а также, в случае видимых повреждений
индивидуальной упаковки, изделие должно утилизироваться местными публично-правовыми
организациями, в соответствии с требованиями местных нормативно-правовых актов и
правилами утилизации в данном регионе.
На территории Российской Федерации набор QIAamp DSP Virus Spin Kit должен
утилизироваться в соответствии с нормативными требованиями для отходов класса Б (как
материалы и инструменты, предметы, загрязненные кровью или другими биологическими
жидкостями) – после химических методов обеззараживания и аппаратных способов
обеззараживания с применением физических методов в соответствии с действующими
санитарными правилами и нормами в соответствии с СанПиН 2.1.3684-21).
20. Контактная информация
Техническую поддержку и дополнительную информацию можно получить в центре
технической поддержки по ссылке www.qiagen.com/Support, позвонив по номеру 00800-22-44-
6000, или обратившись в отдел технической поддержки КАЙДЖЕН или к местным
дистрибьюторам (см. на сайте www.qiagen.com).
21. Гарантийные обязательства
Компания QIAGEN GmbH (КАЙДЖЕН ГмбХ) принимает на себя гарантийные
обязательства в отношении медицинского изделия по отсутствию дефектов и соответствию
заявленным производителем характеристикам в течение всего срока годности, при
соблюдении условий, указанных в инструкции по применению.
Производитель не несёт ответственности за повреждения или несчастные случаи в
результате неправильного использования, ошибки пользователя или внешних чрезвычайных
ситуаций. По вопросам качества продукции обращайтесь к уполномоченному представителю
производителя.
20
22. Уполномоченный представитель производителя на территории
Российской Федерации:
Общество с ограниченной ответственностью "Кайджен РУС" (ООО "Кайджен РУС")
123557, ГОРОД МОСКВА, улица Малая Грузинская, д. 28, помещ. 6/14
Номер телефона: 8 (499) 350-55-70
Адрес электронной почты: qiagenrus@qiagen.com
Приложение А: Автоматизированный процесс выделения с
использованием станции QIAcube
Выделение и очистка вирусных нуклеиновых кислот с использованием набора QIAamp
DSP Virus Spin Kit может быть полностью автоматизирована на оборудовании QIAcube.
Инновационная автоматическая станция для выделения нуклеиновых кислот QIAcube
использует современную технологию для обработки центрифужных колонок QIAamp
MinElute, обеспечивая непрерывную автоматизированную подготовку образцов. Подготовка
образцов с использованием станции QIAcube включает те же этапы, что и ручная подготовка
(лизис, связывание, промывка и элюирование) и позволяет использовать набор QIAamp DSP
Virus Spin Kit для высококачественного выделения вирусных нуклеиновых кислот.
При автоматической обработке образцов в станции QIAcube с использованием набора
QIAamp DSP Virus Spin Kit может оказаться так, что прибор обработает менее 50 образцов
крови из-за мертвых объемов, испарения и дополнительного потребления реагентов
автоматическим дозатором. Компания QIAGEN гарантирует обработку 50 образцов только
при ручном использовании набора QIAamp DSP Virus Spin Kit.
Рисунок 1. Станция QIAcube
Редакция документа
Дата Изменения
R6, март 2015 Изменения в маркировке
R7, февраль 2026 Изменение в разделе Уполномоченный представитель
производителя
21
2
Оглавление
1. Наименование изделия 5
2. Производитель 5
3. Назначение, показания к применению, противопоказания. 5
4. Сведения о потенциальных потребителях 6
5. Общие сведения 6
6. Принцип действия 6
7. Комплектность набора 8
8. Необходимые материалы, не входящие в комплект набора 8
9. Перечень лекарственных средств, материалов животного и (или)
человеческого происхождения 9
10. Предупреждения и меры предосторожности 9
11. Срок годности. 11
12. Хранение и перемещение реагентов 11
13. Хранение образцов и обращение с ними 12
14. Процедура 13
14.1. Протокол: Выделение геномной ДНК из образцов крови с
использованием вакуума 15
14.2. Протокол: Выделение геномной ДНК из образцов крови с
использованием микроцентрифуги 17
15. Контроль качества 18
16. Эксплуатационные характеристики 18
16.1. Выход очищенной ДНК 18
16.2. Производительность в последующих анализах 19
16.3. Исследуемый образец 19
16.4. Объем буфера для элюирования 20
16.5. Сравнение центрифугирования и вакуумной процедуры 20
16.6. Прецизионность 20
17. Маркировка 20
18. Требование к охране окружающей среды. 21
19. Утилизация 21
20. Контактная информация 22
21. Гарантийные обязательства 22
22. Рекламации 22
23. Редакция документа 22
Приложение А: Автоматизированный процесс выделения с использованием
станции QIAcube 22
3
КАЙДЖЕН, Технологии для отбора образцов и проведения анализов
Компания QIAGEN — ведущий поставщик инновационных технологий отбора и
анализа проб, позволяющих выделять и распознавать компоненты любых
биологических образцов. Наши высокотехнологичные продукты и услуги
отличаются высоким качеством и обеспечивают успех на всех этапах работы, от
взятия образца до получения результата анализа.
QIAGEN задает стандарты в таких областях, как:
- Очистка ДНК, РНК и белков
- Анализ нуклеиновых кислот и белков
- Исследование микро-РНК и РНК-интерференции
- Автоматизация технологических процессов отбора и анализа проб
Наша миссия заключается в том, чтобы помогать вам добиваться выдающихся
успехов и совершать прорывы. Более подробную информацию см. на веб-сайте
www.qiagen.com.
4
1. Наименование изделия
Набор для выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов в варианте
исполнения:
Набор QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit:
1. Центрифужные колонки QIAamp Mini с промывочными пробирками (2 мл)
WT (50 шт.).
2. Пробирки для элюирования (1,5 мл) ЕТ (50 шт.).
3. Коннекторы VacConnectors VC (50 шт.).
4. Пробирки для лизиса (1,5 мл) LT (50 шт.).
5. Промывочные пробирки (2 мл) WT (3 х 50 шт.).
6. Буфер для лизиса (12 мл) AL (1 шт.).
7. Промывочный буфер 1 (концентрат) (19 мл) AW1 (1 шт.).
8. Промывочный буфер 2 (концентрат) (13 мл) AW2 (1 шт.).
9. Элюирующий буфер (25 мл) АЕ (1 шт.).
10. Растворитель протеазы (2 мл) PS (1 шт.).
11. Протеиназа QIAGEN (165 мкл) (1 шт.).
12. Инструкция по применению.
2. Производитель
QIAGEN GmbH (КАЙДЖЕН ГмбХ)
Qiagen Strasse 1, 40724 Hilden, Germany (Германия)
Номер телефона: +49-02103-29-0
Адрес электронной почты: info@qiagen.com;
Сайт: www.qiagen.com
3. Назначение, показания к применению, противопоказания.
Назначение
Для выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов методом
селективного связывания на мембране из диоксида кремния.
Описание
Набор QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit (далее набор, набор реагентов, QIAamp
DSP DNA Blood Mini Kit) представляет собой систему, использующую технологию
селективного связывания ДНК на мембране из диоксида кремния (QIAamp
технология) из образцов цельной крови.
Набор QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit - это готовое к использованию
медицинское изделие для выделения и очистки геномной ДНК из свежих образцов
цельной крови или крови с ЭДТА в качестве антикоагулянта.
Набор рассчитан на обработку 50 образцов.
Время полного цикла анализа с использованием набора не превышает 90 минут.
Показания к применению
Набор QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit предназначен для выделения
нуклеиновых кислот в качестве этапа пробоподготовки для последующего анализа
очищенных нуклеиновых кислот в клинической лабораторной диагностике, в
частности методом ПЦР.
Является преаналитическим методом, набор QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit
предназначен для подготовки образцов, но не для получения результатов
исследований, качественных или количественных.
Противопоказания к применению
При использовании специально обученным персоналом и с учетом применения
по назначению противопоказания не выявлены.
5
4. Сведения о потенциальных потребителях
Набор должен использоваться только квалифицированным персоналом
(лаборантами или врачами клинической лабораторной диагностики, владеющими
методами молекулярно-биологических исследований для диагностики in vitro) в
условиях профессиональной клинико-диагностической лаборатории. Пользователь
также должен иметь навыки, необходимые для правильного выполнения
исследований, описанных в данной инструкции по применению.
Медицинское изделие предназначено только для профессионального
использования. Набор предназначен для диагностики in vitro.
5. Общие сведения
В наборе QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit используется испытанная
технология, обеспечивающая быстрый и легкий способ выделения и очистки
геномной ДНК из 200 мкл цельной крови.
Набор QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit позволяет одновременно обрабатывать
несколько образцов крови, дает очищенную ДНК, готовую к использованию в
дальнейших приложениях. Процедура подходят для использования со свежей или
замороженной цельной кровью и кровью с ЭДТА.
Многие процедуры с использованием колонок QIAamp Mini могут быть
полностью автоматизированы на станции выделения нуклеиновых кислот QIAcube
для повышения надежности и простоты использования (см. Приложение А).
Предварительное разделение лейкоцитов не требуется. Протокол выделения не
требует ни экстракции фенолом/хлороформом, ни осаждения спиртом и сводит к
минимуму операции пользователя, что позволяет безопасно обращаться с
потенциально инфицированными образцами. Процедура разработана таким
образом, чтобы свести к минимуму перекрестное загрязнение между образцами.
Очищенная ДНК готова к использованию в ПЦР или других приложениях или, в
качестве альтернативы, может храниться при температуре от -25°C до -15°C для
последующего использования.
6. Принцип действия
Каждая процедура выделения ДНК набором QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit
состоит из 4 этапов:
 Лизис клеток в образце крови
 Связывание геномной ДНК в клеточном лизате с мембраной центрифужной
колонки QIAamp Mini
 Промывка мембраны
 Элюирование чистой геномной ДНК из мембраны
В настоящем руководстве представлены 2 протокола для QIAamp DSP DNA
Blood Mini Kit: процедура с использованием центрифугирования, и процедура, для
которой требуется вакуумная система (рис.1). Кроме того, процедура выделения
может быть автоматизировано с использованием станций выделения и очистки
нуклеиновых кислот QIAcube.
Лизис клеток крови
Образцы проходят лизис при денатурирующих условиях при повышенных
температурах. Лизис осуществляется в присутствии Протеиназы QIAGEN (QP) и
буфера для лизиса (AL).
Связывание геномной ДНК с мембраной центрифужной колонки QIAamp
Mini
Для оптимизации связывания геномной ДНК с мембраной колонки QIAamp
Mini cначала в лизаты добавляется этанол. Далее лизат переносится в
6
центрифужную колонку QIAamp Mini и геномная ДНК адсорбируется на мембране
из диоксида кремния при прохождении лизата через мембрану под воздействием
вакуума или центробежной силы.
Рисунок 1. Процедуры выделения набором QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit
Удаление остаточных загрязнений
В то время как геномная ДНК остается связанной с мембраной колонки QIAamp
Mini загрязнения эффективно вымываются с помощью промывочного буфера 1
AW1 и промывочного буфера 2 AW2.
Элюирование чистой геномной ДНК
Геномная ДНК элюируется с мембраны колонки QIAamp Mini с
использованием 50-200 мкл элюирующего буфера (АЕ). Элюированная ДНК готова
к использованию для различных дальнейших исследованиях.
7
Объем ДНК, вымываемой из центрифужной колонки QIAamp Mini, может быть
на 20 мкл меньше объема Элюирующего буфера (АЕ), вносимого в колонку. Объем
элюата также зависит от характера образца. Элюирующий буфер (АЕ) должен быть
доведен до комнатной температуры (15-25°С) перед нанесением в колонку.
Элюированную ДНК собирают в пробирки для элюирования (ЕТ). Если требуется
хранение ДНК до 4х недель, рекомендуется хранить ее при 2-8°С. В случае
длительного хранения рекомендуется хранение при температуре -20°С.
Выход и количество геномной ДНК
Выход и количество выделенной геномной ДНК подходит для многих типов
исследований в молекулярной диагностике. Дальнейшие диагностические анализы
следует проводить в соответствии с инструкциями производителей на
используемые реагенты.
7. Комплектность набора
Состав набора
Набор QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit
Каталожный номер 61104
Количество реакций 50
Обозначение Описание Идентификация Количество
Центрифужные колонки QIAamp
QIAamp Mini
Mini с промывочными пробирками 50 шт
Spin
(2мл) WT
Пробирки для элюирования (1,5мл)
50 шт
ET ET
VC Коннекторы VacConnectors VC 50 шт
LT Пробирки для лизиса (1,5мл) LT 50 шт
WT Промывочные пробирки (2мл) WT 3 х 50 шт
AL Буфер для лизиса* (12мл) AL 1 шт
Промывочный буфер 1*
1 шт
AW1 (концентрат) (19мл) AW1
Промывочный буфер 2**
1 шт
AW2 (концентрат) (13мл) AW2
1 шт
AE Элюирующий буфер ** (25мл) AE
Растроритель протеиназы** (2мл)
1 шт
PS PS
QP Протеиназа QIAGEN (165мкл) 1 шт
Инструкция по применению 1 шт
* содержит гидрохлорид гуанидина.
** содержит азид натрия в качестве консерванта
Примечание: При работе с химикатами всегда надевайте лабораторный
халат, одноразовые перчатки и защитные очки. Для получения
дополнительной информации обратитесь к соответствующим паспортам
безопасности (SDS), которые можно получить у поставщика продукта или в
режиме онлайн в формате PDF по ссылке www.qiagen.com/safety.
8. Необходимые материалы, не входящие в комплект набора
 Этанол (96-100%)*
 Пипетки (регулируемые) и наконечники для пипеток, свободные от нуклеаз
(во избежание перекрестного загрязнения рекомендуются наконечники для
пипеток с аэрозольными барьерными фильтрами)
8
 Термомиксер или нагревательный блок** для лизиса при 56°C
 Микроцентрифуга** (с ротором на 1,5 и 2 мл пробирки)
 Вортекс
 Лабораторный цилиндр (50мл)
 Для образцов менее 200 мкл: 0,9% раствор NaCl
Для вакуумной процедуры:
 Вакуумный насос создающий вакуум от -800 до -900 мбар, (кат. № 84010,
84020 QIAGEN или аналог), Вакуумный коллектор (QIAvac 24 Plus кат.№
19413 QIAGEN или аналог), Опционально (на выбор): VacValves (кат. №
19408 QIAGEN) или аналог).
* не используйте денатурированный этанол, который содержит примеси метанола и
метилэтилкетона
** убедитесь, что инструменты проверены и откалиброваны согласно
рекомендациям производителя
9. Перечень лекарственных средств, материалов животного и
(или) человеческого происхождения
Лекарственные средства, материалы человеческого и животного
происхождения: не используются.
10. Предупреждения и меры предосторожности
Для диагностики in vitro
Правила техники безопасности
При работе с химикатами всегда используйте лабораторный халат, одноразовые
перчатки и защитные очки.
Для получения дополнительной информации ознакомьтесь с
соответствующими паспортами безопасности (SDS). Эти паспорта можно получить
в компактном и удобном формате PDF на сайте www.qiagen.com/safety, где можно
найти, распечатать SDS каждого набора компании QIAGEN и каждого компонента
в наборе. Утилизацию образцов и отходов после анализа следует проводить в
соответствии с местными нормами безопасности.
Общие меры предосторожности
Следует всегда обращать внимание на следующее:
 Набор предназначен только для профессионального применения в
клинической лабораторной диагностике.
 Анализ следует проводить с образцами крови
 Следует допускать к работе только обученный персонал.
 Следует использовать одноразовые перчатки без талька талька, халат и
защитные очки. Для получения дополнительной информации по безопасности
можно обратиться к соответствующим паспортам безопасности (SDS),
которые размещены в режиме онлайн в формате PDF по ссылке
www.qiagen.com/safety.
 Запрещается использовать набор или компоненты с истекшим сроком
годности и/или поврежденной упаковкой компонентов набора.
 Со всеми образцами следует обращаться как с потенциально биологически
опасными веществами. Утилизацию образцов и отходов на различных
стадиях обработки образца следует проводить в соответствии с
местными/национальными правилами утилизации через уполномоченные
организации в данном регионе.
 До, вовремя и после применения этого набора, все потенциально опасные
материалы (то есть материалы, которые могли войти в контакт с
9
клиническими образцами), включая пробирки, наконечники и прочие
материалы, следует обрабатывать и утилизировать в соответствии с
применимыми и соответствующими муниципальными / правительственными
нормами, действующими в месте применения этого продукта.
 Не следует хранить открытыми флаконы с реагентами.
 Следует использовать калиброванные пипетки и инструменты.
 Следует использовать наконечники с фильтрами для пипеток
 Все поставляемые реагенты в наборах предназначены для использования
только с другими реагентами из того же набора. Не следует заменять
реагенты из набора на реагенты из других наборов, в том числе аналогичных,
так как это может снизить эффективность работы.
Примечание: Набор реагентов не содержит материалов биологического
происхождения, веществ, обладающих канцерогенным, мутагенным
действием, а также влияющих на репродуктивную функцию человека. При
использовании по назначению и соблюдении мер предосторожности является
безопасным
Предупреждения
ВНИМАНИЕ: не добавляйте отбеливатель или кислотные растворы
непосредственно в отходы, содержащие буфер AL и буфер AW1
Буферы AL и AW1 содержат гуанидингидрохлорид, который способен
создавать высоко реакционноспособные вещества при соединении с отбеливателем.
В случае пролива жидкости, содержащей вышеперечисленные буферы,
необходимо произвести очистку с использованием лабораторных детергентов и
воды. Если разлитая жидкость потенциально инфицирована, сначала очистите
зараженную зону лабораторным детергентом и водой, а затем 1 % раствором
(объемного содержания) гипохлорита натрия.
В случае повреждения или протекания флаконов с буфером, наденьте перчатки
и защитные очки во время утилизации флаконов, чтобы избежать вреда для своего
здоровья и здоровья окружающих.
Компания QIAGEN не проводила испытаний жидких отходов, получаемых
после выполнения процедур с использованием набора, на остаточные
инфекционные материалы. Загрязнение жидких отходов остаточными
инфекционными материалами маловероятна, но ее не стоит полностью исключать.
Следовательно, жидкие отходы необходимо считать инфекционными,
обрабатывать и утилизировать в соответствии с требованиями местных
нормативно-правовых актов и правилами утилизации в данном регионе.
К компонентам набора реагентов QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit
применяются следующие коды риска и безопасности.
Буфер AL, Содержит гуанидин гидрохлорид.
Буфер AW1 Может представлять опасность при попадании в пищеварительный тракт или
дыхательные пути. Вызывает раздражение кожи. Вызывает серьезное
раздражение глаз. Обратитесь в токсикологический центр или к врачу в случае
плохого самочувствия. Утилизируйте раствор/контейнер в специализированной
установке, предназначенной для утилизации отходов. Надевайте защитные
перчатки/защитную одежду/ средства защиты глаз и лица.
Протеиназа Содержит субтилизин.
QIAGEN Вызывает умеренное раздражение кожи. Вызывает серьезное повреждение глаз.
Вызывает аллергическую реакцию, приступ астмы или затрудненное дыхание в
случае попадания в дыхательные пути. Не вдыхайте
пыль/пары/газ/испарения/распыленный продукт.
Утилизируйте раствор/контейнер в специализированной установке,
10
предназначенной для утилизации отходов. Обратитесь в токсикологический
центр или к врачу. В случае попадания в глаза промойте глаза водой в течение
нескольких минут. Снимите контактные линзы, если есть. Продолжайте
промывать глаза. При попадании в дыхательные пути: в случае затрудненного
дыхания перенесите пострадавшего на свежий воздух и оставьте его в покое, в
положении, удобном для дыхания. Немедленно обратитесь в токсикологический
центр или к врачу. Надевайте защитные перчатки/защитную одежду/ средства
защиты глаз и лица. Используйте средства для защиты дыхательных путей.
Ограничения
Эффективность набора была определена при использовании цельной крови для
выделения геномной ДНК из цельной крови.
Для достижения оптимальных результатов необходимо строгое соблюдение
данной инструкции по применению. Не рекомендуется разбавление реагентов,
отличное от описанного в данной инструкции, которое приводит к потере
производительности.
Следует обратить внимание на сроки годности и условия хранения, указанные
на упаковке и этикетках всех компонентов. Не используйте просроченные или
неправильно хранящиеся компоненты.
Для того, чтобы минимизировать риск неправильной интерпретации
результатов последующей диагностики, необходимо использовать надлежащие
контроли при последующих исследованиях.
Любые полученные диагностические результаты следует толковать вместе с
другими клиническими или лабораторными данными.
11. Срок годности.
Срок годности набора QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit составляет 24-месяца.
Изделие стабильно до истечения срока годности, указанного на этикетке, при
соблюдении условий хранения и транспортирования.
Условия хранения реагентов: при температуре 15-25°С,
Условия хранения колонок QIAamp Mini - при температуре 2-8°С.
Условия транспортирования: при температуре от -20 до +45°С.
Если изделие предназначено только для периодического применения, после
вскрытия флаконов, реагенты необходимо хранить при температуре 15-25°С не
более 6 месяцев или до указанного срока годности, в зависимости от того, что
наступит раньше.
После истечения срока годности изделие использовать запрещено.
12. Хранение и перемещение реагентов
Колонки QIAamp Mini должны храниться в при температуре 2–8С после
прибытия.
Все буферы могут храниться при комнатной температуре (15–25С).
Лиофилизированная Протеиназа QIAGEN (QP) может храниться при комнатной
температуре (15-25ºС) до окончания срока годности без ухудшения характеристик.
Протеиназа QIAGEN (QP), восстановленная в растворителе протеиназы (PS),
остается стабильной в течение одного года при хранении при температуре 2-8 ºС,
но не дольше даты окончания срока годности, указанного для набора. Следует
избегать хранения восстановленной протеиназы QIAGEN при комнатной
температуре продолжительный период времени.
Восстановленный промывочный буфер 1 (AW1) и восстановленный
промывочный буфер 2 (AW2) при хранении при комнатной температуре (15-25°C)
11
стабильны в течение 1 года, но не дольше даты окончания срока годности,
указанного для набора
Срок хранения Набора QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit после вскрытия – 6
месяцев.
13. Хранение образцов и обращение с ними
Криопреципитаты, формирующиеся при размораживании замороженных
образцов, закупоривают мембрану колонки QIAamp Mini. Если криопреципитаты
видны визуально, их можно осадить путем центрифугирования при 6800 х g в
течение 3 минут. Раствор должен использоваться сразу.
Замораживание и размораживание образцов крови не более 3 раз не оказывает
существенного эффекта на выделение ДНК с использованием набора QIAamp DSP
DNA Blood Mini Kit (см. Рисунок 2).
к
ю % )
и
е
н
у
(
шц
з
оа
нр
тб
оо
о у
пм
д,
ж
е
о
ы х с в е
В
Свежий
Количество циклов замораживания/размораживания
Рисунок 2. Эффект замораживания и размораживания образцов крови. Кровь,
обработанная ЭДТА, подвергалась замораживанию и размораживанию до 3 раз, а
далее проходила процесс выделения ДНК с использованием набора QIAamp DSP
DNA Blood Mini Kit. Рассчитанные выходы ДНК нормализованы к выходу из
свежего образца (100%). Каждый столбец на графике представляет собой
результаты исследования 32 образцов (среднее значение ± стандартное
отклонение).
Количество ДНК, выделяемой набором QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit,
зависит от содержания лейкоцитов в образце крови. Геномную ДНК выделяют из
200 мкл образцов крови. Для процедуры QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit могут
использоваться различные пробирки для сбора крови и антикоагулянты (табл.1),
однако рекомендуется использование ЭДТА в качестве антикоагулянта, что не
приводит к последующим ошибкам в анализе выделенной ДНК, в частности
методом ПЦР.
Таблица 1. Средний выход ДНК в зависимости от пробирок для сбора крови и
антикоагулянта.
Пробирки сбора крови Производитель Каталожный № Объем, Средний
мл выход*
BD® Vacutainer® 9NC BD 366007 9 6.4 мкг
12
Геномная ДНК была выделена из 200 мкг образцов крови здоровых доноров (от 4.0
x 106 клеток/мл до 9.0 x 106 клеток/мл).
*Для каждой пробирки средний выход определялся на 11 повторах
14. Процедура
Важные пункты, которые необходимо учитывать перед началом процедуры
 После получения набора проверьте компоненты набора на наличие
повреждений. Если упаковки или флаконы с буфером повреждены, свяжитесь
со Службой технической поддержки QIAGEN или своим региональным
дистрибьютором. В случае разлива жидкости см. пункт «Предупреждения и
меры предосторожности». Не используйте поврежденные компоненты
набора, поскольку их применение может снижать эффективность набора.
 Всегда меняйте наконечник дозатора между переносами жидкости. Для
минимизации перекрестной контаминации мы рекомендуем использовать
наконечники с аэрозольным барьером.
 Все этапы центрифугирования выполняйте при комнатной температуре (15-
25°С).
 Всегда используйте одноразовые перчатки и регулярно проверяйте их на
контаминацию материалом образца. В случае загрязнения утилизируйте
перчатки.
 Для минимизации перекрестной контаминации открывайте только по одной
пробирке за раз.
 Не рекомендуется использовать компоненты из других наборов, однако при
необходимости, компоненты можно использовать только в том случае, если
номера партий наборов идентичны.
 Не допускайте микробную контаминацию реактивов из набора.
 Для минимизации риска инфицирования потенциально инфекционным
материалом мы рекомендуем работать в проточном ламинарном шкафу до тех
пор, пока образцы не пройдут лизис.
 Данный набор могут использовать только сотрудники, обученные
лабораторным процедурам для диагностики in vitro.
Подготовка реагентов и буферов
 Подготовка Протеиназы QIAGEN. Добавьте 1,2 мл растворителя Протеиназы
(PS) во флакон с лиофилизированной Протеиназой QIAGEN (QP) и тщательно
перемешайте. Во избежание пенообразования, перемешивайте, перевернув
флакон несколько раз. Убедитесь, что Протеиназа QIAGEN (QP) полностью
растворилась.
Важно: Не добавляйте Протеиназу QIAGEN (QP) непосредственно в Буфер
для лизиса (AL).
 Приготовление Промывочного буфера 1. С помощью мерного цилиндра
добавьте 25 мл этанола (96-100%) во флакон, содержащий 19 мл концентрата
Промывочного буфера 1 (AW1). Храните восстановленный Промывочный
буфер 1 (AW1) при комнатной температуре (15-25°С). Перед началом
13
процедуры всегда перемешивайте восстановленный Промывочный буфер 1
(AW1), переворачивая флакон несколько раз.
 Приготовление Промывочного буфера 2. С помощью мерного цилиндра
добавьте 30 мл этанола (96-100%) во флакон, содержащий 13 мл концентрата
Промывочного буфера 2 (AW2). Храните восстановленный Промывочный
буфер 2 (AW2) при комнатной температуре (15-25°С).
Важно: Перед началом процедуры всегда перемешивайте восстановленный
Промывочный буфер 2 (AW2), переворачивая флакон несколько раз.
 Приготовление Элюирующего буфера. В набор входит один флакон
Элюирующего буфера (АЕ). Для предотвращения контаминации
Элюирующего буфера (АЕ) настоятельно рекомендуется использовать
наконечники дозаторов с аэрозольными барьерами для отбора буфера из
флакона, а также рекомендуется закрывать крышку флакона сразу же после
этого.
ВАЖНО: Элюирующий буфер (АЕ) содержит консервант азид натрия,
который имеет поглощающую способность при 260 нм. Следовательно, при
количественном определении ДНК в элюате путем измерения оптической
плотности при 260 нм и 280 нм, или при сканировании поглощающей
способности в диапазоне между 220 нм и 350 нм, убедитесь, что образец
сравнения содержит ту же концентрацию азида натрия, что и элюат.
Например, если Вы готовите элюат для измерения поглощающей способности
разведением 50 мкл элюата водой в объеме 100 мкл, то подготовьте раствор
сравнения разведением 50 мкл Элюирующего буфера (АЕ) водой в объеме
100 мкл. Для разведений используйте свежую дистиллированную воду.
Работа с колонками QIAamp Mini
Из-за чувствительности методов амплификации нуклеиновых кислот
необходимы следующие меры предосторожности при работе с колонками QIAamp
Mini во избежание перекрестной контаминации между образцами:
 Аккуратно наносите образец или раствор на колонку QIAamp Mini. Пипеткой
поместите образец в колонку QIAamp Mini, не дотрагиваясь до края колонки.
 Всегда меняйте наконечники дозаторов между переносами жидкостей.
Рекомендуется использовать наконечники с аэрозольным барьером.
 Не дотрагивайтесь до мембраны колонки QIAamp Mini наконечником
пипетки.
 После выполнения всех этапов перемешивания кратко центрифугируйте
пробирки для сбора капель с внутренней части крышек.
 Открывайте по одной колонке QIAamp Mini за раз, избегайте формирования
аэрозолей.
 В течение всей процедуры используйте перчатки. В случае контакта между
перчатками и образцом – незамедлительно смените перчатки.
Подготовка для вакуумной процедуры
Убедитесь, что Вы корректно соединили колонку QIAamp Mini и коннектор
VacConnector (VC) (см. Рисунок 3). Коннекторы VacConnectors VC по сути
представляют собой одноразовые переходники, которые устанавливаются между
центрифужными колонками QIAamp Mini и разъемами вакуумного коллектора.
Коннекторы VacConnectors VC утилизируются после однократного использования.
14
Рисунок 3. Компоненты набора QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit для вакуумной
обработки образцов. 1 - коннектор VacConnector (VC), 2 – центрифужная колонка
QIAamp Mini
14.1. Протокол: Выделение геномной ДНК из образцов крови с
использованием вакуума
Для выделения и очистки геномной ДНК из 200 мкл образцов цельной крови,
обработанных ЭДТА, с использованием вакуума. Описанная ниже процедура
содержит инструкции по обработке одного образца крови. Однако в зависимости от
используемой вакуумной системы можно обрабатывать различное количество
образцов одновременно.
Действия перед началом процедуры
 Довести образцы крови до комнатной температуры (15-25ºС) и хорошо их
перемешать.
 Если в Буфере для лизиса (AL) сформировался осадок, растворите его
инкубированием при 56°С.
 Убедитесь, что Промывочный буфер 1 (AW1), Промывочный буфер 2 (AW2)
и Протеиназа QIAGEN (QP) были подготовлены в соответствии с
инструкциями, представленными в разделе «Приготовление реактивов и
буферов».
 Выдержите Буфер для элюирования (АЕ) при комнатной температуре (15-
25°С) для применения в этапе 14.
 Установите нагревательный блок на 56°С для применения на этапе 4.
 Процедуры контроля качества в компании QIAGEN предусматривают
проведение функционального аттестационного испытания каждой отдельной
партии наборов. Поэтому не совмещайте реактивы из различных партий
наборов и не смешивайте отдельные реактивы из различных партий
реактивов.
Процедура
1. С помощью дозатора добавьте 20 мкл Протеиназы QIAGEN (QP) в пробирку
для лизиса (LT).
Примечание: Перед использованием проверьте срок годности разбавленной
Протеазы.
2. Добавьте 200 мкл образца крови в пробирку для лизиса (LT).
3. Добавьте 200 мкл Буфера для лизиса (AL) в пробирку для лизиса (LT),
закройте крышку и перемешайте в вортексе в течение 15 секунд. Чтобы лизис
прошел успешно важно, чтобы образец и Буфер для лизиса были тщательно
перемешаны и получался однородный раствор.
15
Примечание: Поскольку Буфер для лизиса (AL) имеет высокую вязкость,
убедитесь, что отобран верный объем. Этого можно достичь медленным
пипетированием или использованием специального дозатора.
Примечание: Не добавляйте Протеиназу QIAGEN (QP) непосредственно в
Буфер для лизиса (AL).
4. Проинкубируйте при температуре 56°С (±1°С) в течение 10 минут (±1 минута).
5. Центрифугируйте пробирку для лизиса (LT) в течение ≥5 секунд на полной
скорости, чтобы удалить капли с внутренней стороны крышки.
6. Добавьте 200 мкл этанола (96-100%) в пробирку для лизиса (LT), закройте
крышку и тщательно перемешайте в вортексе в течение ≥ 15 секунд.
7. Центрифугируйте пробирку для лизиса (LT) в течение ≥ 5 секунд на полной
скорости, чтобы собрать капли с внутренней стороны крышки.
8. Подсоедините центрифужную колонку QIAamp Mini с коннектором
VacConnector (VC) к вакуумной системе.
9. Аккуратно добавьте весь лизат из этапа 7 в центрифужную колонку QIAamp
Mini, не дотрагиваясь до краев колонки. Избегайте контакта между мембраной
колонки QIAamp Mini и наконечником дозатора.
Примечание: При обработке нескольких образцов открывайте по одной
пробирке для лизиса (LT) за раз.
10. Включите вакуумный насос. После полного переноса лизата через мембрану
колонки выключите вакуумный насос и сбросьте давление до 0 бар.
Примечание: Если по истечении 10 минут лизат не прошел полностью через
мембрану, поместите колонку QIAamp Mini в чистую промывочную пробирку
(WT), закройте крышку и центрифугируйте при 6000 х g в течение 3 минут
для полного прохождения лизата. Поместите колонку QIAamp Mini в другую
чистую промывочную пробирку (WT) и продолжайте этап 10 протокола.
Примечание: Если лизат все же не проходит через мембрану во время
центрифугирования, утилизируйте образец и повторите выделение и очистку
с исходным материалом образца, начиная с этапа 1.
11. Добавьте 750 мкл Промывочного буфера 1 (AW1) в центрифужную колонку
QIAamp Mini, не дотрагиваясь до ее края. Избегайте контакта между
мембраной колонки QIAamp Mini и наконечником дозатора. Оставьте крышку
колонки открытой и включите вакуумный насос. После прохождения
Промывочного буфера 1 (AW1) через колонку QIAamp Mini выключите
вакуум и сбросьте давление до 0 бар.
12. Добавьте 750 мкл Промывочного буфера 2 (AW2) в колонку QIAamp Mini, не
дотрагиваясь до ее края. Избегайте контакта между мембраной колонки
QIAamp Mini и наконечником дозатора. Оставьте крышку колонки открытой и
подайте вакуум. После прохождения Промывочного буфера 2 (AW2) через
колонку QIAamp Mini сбросьте вакуум до 0 бар.
13. Закройте крышку колонки QIAamp Mini, отсоедините ее от вакуумной
системы. Поместите колонку в чистую промывочную пробирку (WT) и
центрифугируйте на полной скорости (приблизительно 20 000 х g или 14 000
rpm) в течение 3 минут, чтобы полностью высушить мембрану.
Примечание: Не высушенная полностью мембрана может привести к
ингибированию при дальнейших анализах.
14. Поместите центрифужную колонку QIAamp Mini в чистую пробирку для
элюирования (ЕТ) и утилизируйте промывочную пробирку (WT), которая
содержит фильтрат. Аккуратно откройте крышку колонки QIAamp Mini и
добавьте от 50 до 200 мкл Элюирующего буфера (АЕ) по центру мембраны.
Закройте крышку и инкубируйте при комнатной температуре (15-25°С) в
16
течение 1 минуты. Центрифугируйте при 6000 х g в течение 1 минуты, чтобы
элюировать ДНК.
14.2. Протокол: Выделение геномной ДНК из образцов крови с
использованием микроцентрифуги
Для выделения и очистки геномной ДНК из 200 мкл образцов цельной крови,
обработанных ЭДТА с использованием микроцентрифуги. Описанная ниже
процедура содержит инструкции по обработке одного образца крови. При этом
возможно обработывать несколько образцов одновременно, их количество зависит
от вместимости используемой микроцентрифуги.
Действия перед началом процедуры
 Довести образцы крови до комнатной температуры (15-25°С) и хорошо их
перемешать.
 Если в Буфере для лизиса (AL) сформировался осадок, растворите его
инкубированием при 56°С.
 Убедитесь, что Промывочный буфер 1 (AW1), Промывочный буфер 2 (AW2)
и Протеиназа QIAGEN (QP) были подготовлены в соответствии с
инструкциями, представленными в разделе «Приготовление реактивов и
буферов».
 Выдержите Буфер для элюирования (АЕ) при комнатной температуре (15-
25°С) для применения на этапе 15.
 Установите нагревательный блок на 56°С для применения на этапе 4.
 Процедуры контроля качества в компании QIAGEN предусматривают
проведение аттестационного испытания каждой отдельной партии наборов.
Поэтому не совмещайте реактивы из различных партий наборов и не
смешивайте отдельные реактивы из различных партий реактивов.
Процедура
1. С помощью дозатора добавьте 20мкл Протеиназы QIAGEN (QP) в пробирку
для лизиса (LT).
Примечание: Перед использованием проверьте срок годности
восстановленной Протеиназы QIAGEN.
2. Добавьте 200мкл образца крови в пробирку для лизиса (LT).
3. Добавьте 200мкл Буфера для лизиса (AL) в пробирку для лизиса (LT), закройте
крышку и перемешивайте в вортексе в течение 15 секунд. Чтобы лизис прошел
успешно важно, чтобы образец и Буфер для лизиса были тщательно
перемешаны и давали однородный раствор.
Примечание: Поскольку Буфер для лизиса (AL) имеет высокую вязкость,
убедитесь, что вы отобрали верный объем. Этого можно достичь медленным
пипетированием или использованием специального дозатора.
Примечание: Не добавляйте Протеазу QIAGEN (QP) непосредственно в Буфер
для лизиса (AL).
4. Проинкубируйте при температуре 56°С (±1°С) в течение 10 минут (±1 минута).
5. Центрифугируйте пробирку для лизиса (LT) в течение ≥5 секунд на полной
скорости, чтобы удалить капли с внутренней стороны крышки.
6. Добавьте 200мкл этанола (96-100%) в пробирку для лизиса (LT), закройте
крышку и тщательно перемешивайте в вортексе в течение ≥ 15 секунд.
7. Центрифугируйте пробирку для лизиса (LT) в течение ≥ 5 секунд на полной
скорости, чтобы собрать капли с внутренней стороны крышки.
8. Аккуратно добавьте весь лизат из этапа 7 в центрифужную колонку QIAamp
Mini, не смачивая края колонки. Избегайте контакта между мембраной
колонки QIAamp Mini и наконечником пипетки.
17
Примечание: При обработке нескольких образцов открывайте по одной
пробирке для лизиса (LT) за раз.
9. Закройте крышку колонки QIAamp Mini и центрифугируйте при
приблизительно 6000 х g в течение 1 минуты. Поместите колонку QIAamp Mini
в чистую промывочную пробирку (WT) и утилизируйте пробирку,
содержащую фильтрат.
Примечание: Если после центрифугирования при 6000 х g лизат прошел через
мембрану не полностью, центрифугируйте снова на полной скорости (до
20000 х g) в течение 1 минуты.
Примечание: Если лизат все же не проходит через мембрану во время
центрифугирования, утилизируйте образец и повторите выделение и очистку
с новым материалом образца, начиная с этапа 1.
10. Аккуратно откройте колонку QIAamp Mini и добавьте 500мкл Промывочного
буфера 1 (AW1), не смачивая край колонки. Избегайте контакта между
мембраной колонки QIAamp Mini и наконечником пипетки.
11. Закройте крышку колонки QIAamp Mini и центрифугируйте при
приблизительно 6000 х g в течение 1 минуты. Поместите колонку QIAamp Mini
в чистую промывочную пробирку (WT) и утилизируйте пробирку,
содержащую фильтрат.
12. Аккуратно откройте колонку и добавьте 500 мкл Промывочного буфера 2
(AW2), не смачивая край колонки. Избегайте контакта между мембраной
колонки QIAamp Mini и наконечником пипетки.
13. Закройте крышку колонки QIAamp Mini и центрифугируйте на полной
скорости (приблизительно 20000 х g) в течение 1 минуты. Поместите колонку в
чистую промывочную пробирку (WT) и утилизируйте пробирку, содержащую
фильтрат.
14. Центрифугируйте на полной скорости (приблизительно 20000 х g) в течение 3
минут, чтобы полностью высушить мембрану.
Примечание: Не высушенная полностью мембрана может привести к
ингибированию при дальнейших анализах.
15. Поместите колонку QIAamp Mini в чистую пробирку для элюирования (ЕТ) и
утилизируйте промывочную пробирку (WT), которая содержит фильтрат.
Аккуратно откройте крышку колонки QIAamp Mini и добавьте от 50 до 200
мкл Элюирующего буфера (АЕ) по центру мембраны. Закройте крышку и
инкубируйте при комнатной температуре (15-25°С) в течение 1 минуты.
Центрифугируйте при 6000 х g в течение 1 минуты, чтобы элюировать ДНК.
15. Контроль качества
В соответствии с ISO-сертифицированной системой управления качеством
QIAGEN каждая партия набора QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit проходит
испытание на соответствие установленным спецификациям для обеспечения
постоянного качества продукции.
16. Эксплуатационные характеристики
16.1. Выход очищенной ДНК
Линейная область выхода ДНК при использовании набора для вакуумной
процедуры была определена для здоровых доноров с количеством белых кровяных
клеток от 3,8 х 106 до 1,34 х 107 клеток/мл (см. рис.4)
18
Рис.4. Линейный диапазон для выхода ДНК при использовании набора при
вакуумной процедуре с 200 мкл объема элюирования.
16.2. Производительность в последующих анализах
Элюированная геномная ДНК готова к использованию в различных анализах,
включая различные диагностические анализы in vitro (табл.2). Установлено
отсутствие влияния объема элюирования и объема элюата, используемого в ПЦР,
на эффективность анализа ПЦР (см. таблицу 3).
Таблица 2. Генотипирование фактора V Leiden (FV) с использованием ПЦР и
пиросеквенирования с набором PSQ-96 SNP-Reagent Kit на PSQ 96MA
Генотип Number
Дикий тип 17
FV G16191 A гетерозиготный 13
FV G16191 A гомозиготный 0
Цельная кровь была отобрана у 30 отдельных доноров, и геномная ДНК была
выделена из 200 мкл цельной крови набором QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit.
Аллельный статус в локусе FV G1691 A определяли с помощью ПЦР и анализа
пиросеквенирования с помощью набора PSQ-96 SNP-Reagent Kit на
пиросеквенаторе PSQ 96MA (Biotage).
Таблица 3. Эффект объема элюирования на ПЦР реакции
Объем элюата на 50 мкл ПЦР*
Объем элюирования 2 мкл 5 мкл 10 мкл
50 мкл 100% 100% 100%
100 мкл 100% 100% 97%
200 мкл 100% 100% 100%
*Значения показывают успешные ПЦР и представляют среднее значение 48 образцов.
Набор QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit подходит для применения в сочетании
с различными последующими диагностическими исследованиями in vitro.
Геномную ДНК, выделенную и очищенную набором QIAamp DSP DNA Blood Mini
Kit, можно использовать для HLA-типирования, ПЦР и секвенирования
16.3. Исследуемый образец
Геномная ДНК, выделенная и очищенная из крови, собранной в различные
пробирки для сбора крови, содержащие ЭДТА в качестве антикоагулянта, отвечала
всем критериям приемлемости к количеству и качеству полученной ДНК. Выход и
19
целостность геномной ДНК, выделенной и очищенной из образцов крови,
собранных в пробирки, содержащие гепарин, были сопоставимы с результатами,
полученными по образцам из крови, стабилизированной ЭДТА, однако, как
ожидалось, гепарин, оставшийся в элюатах, приводил к ингибированию ПЦР.
Набор рекомендован к использованию с образцами крови с ЭДТА в качестве
антикоагулянта.
16.4. Объем буфера для элюирования
Геномная ДНК выделялась и проходила очистку под вакуумом. Геномная ДНК
отвечала всем критериям приемлемости к количеству и качеству и элюировалась в
50 мкл, 100 мкл и 200 мкл Элюирующего буфера АЕ. Даже при низком объеме
элюирования 50 мкл и использовании 10 мкл элюата в ПЦР значительного
ингибирования не наблюдалось. Следовательно, снижение элюирующего объема до
50мкл можно использовать для достижения более высоких концентраций геномной
ДНК в элюатах, для применения в дальнейших диагностических процедурах in vitro
диагностики.
16.5. Сравнение центрифугирования и вакуумной процедуры
Набора QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit позволяет использовать вакуумный
протокол и протокол центрифугирования для выделения и очистки геномной ДНК
из 200 мкл цельной крови, поэтому было выполнено исследование для сравнения
эффективности обоих протоколов. Количество и качество геномной ДНК,
полученных при использовании обеих систем, эквивалентны.
16.6. Прецизионность
Для анализа на восприимчивость к изменениям условий окружающей среды
была проведена серия из 12 исследований с изменением таких переменных, как
день испытания, оператор, оборудование и лаборатория.
Для оценки повторяемости, в одном из двенадцати исследований
дополнительно один и тот же оператор выполнял по два эксперимента, используя
одно и то же оборудование в один и тот же день.
Эти исследования подтвердили, что параметр «оператор» был единственным
параметром, который влиял на эффективность набора QIAamp DSP DNA Blood
Mini Kit. В трех экспериментах, в которых все переменные (день испытания;
оператор; оборудование; лаборатория) оставались без изменений, достоверных
различий не наблюдалось, что указывало на хорошую воспроизводимость набора.
17. Маркировка
На упаковке и этикетках могут присутствовать следующие обозначения:
Содержит реагенты, достаточные для тестов <N>
<N>
Смотрите инструкции по применению
Использовать до
Для диагностики In vitro
Каталожный номер
Номер партии
Номер материала
Компоненты
20
Объем
Диапазон температур
Производитель
По прибытии
Открыть при доставке; храните колонки QIAamp Mini при 2-8ºС
Запишите текущую дату после добавления этанола во флакон
Добавление
Содержит
Лиофилизованный
Восстановить в
Этанол
Гуанидин гидрохлорид
Субтилизин
Номер
Глобальный торговый номер
Внимание!
Rn R - версия инструкции, а n - номер пересмотра

Приводит к
18. Требование к охране окружающей среды.
Медицинское изделие при использовании, транспортировке и хранении, не
оказывает негативного воздействия на человека и окружающую среду.
19. Утилизация
Чтобы избежать возможного загрязнения окружающей среды, изделие c
истекшим сроком годности, отходы использованных реагентов, а также, в случае
видимых повреждений индивидуальной упаковки, изделие должно
утилизироваться местными публично-правовыми организациями, в соответствии с
требованиями местных нормативно-правовых актов и правилами утилизации в
данном регионе.
На территории Российской Федерации набор QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit
должен утилизироваться в соответствии с нормативными требованиями для
отходов класса Б (как материалы и инструменты, предметы, загрязненные кровью
или другими биологическими жидкостями) – после химических методов
обеззараживания и аппаратных способов обеззараживания с применением
физических методов в соответствии с действующими санитарными правилами и
нормами в соответствии с СанПиН 2.1.3684-21).
21
20. Контактная информация
Техническую поддержку и дополнительную информацию можно получить в
центре технической поддержки по ссылке www.qiagen.com/Support, позвонив по
номеру 00800-22-44-6000, или обратившись в отдел технической поддержки
QIAGEN или к местным дистрибьюторам (см. на сайте www.qiagen.com).
21. Гарантийные обязательства
Компания QIAGEN GmbH (КАЙДЖЕН ГмбХ) принимает на себя гарантийные
обязательства в отношении медицинского изделия по отсутствию дефектов и
соответствию заявленным производителем характеристикам в течение всего срока
годности, при соблюдении условий, указанных в инструкции по применению.
Производитель не несёт ответственности за повреждения или несчастные
случаи в результате неправильного использования, ошибки пользователя или
внешних чрезвычайных ситуаций. По вопросам качества продукции обращайтесь к
уполномоченному представителю производителя.
22. Рекламации
Производитель/разработчик медицинского изделия:
QIAGEN GmbH / КАЙДЖЕН ГмбХ
Qiagen Strasse 1, 40724 Hilden, Germany/ Кайджен Штрассе 1, 40724 Хильден,
Германия
Номер телефона: +49-02103-29-0
Адрес электронной почты: info@qiagen.com;
Сайт: www.qiagen.com
Уполномоченный представитель производителя на территории Российской
Федерации:
Общество с ограниченной ответственностью "Кайджен РУС" (ООО "Кайджен
РУС")
123557, ГОРОД МОСКВА, улица Малая Грузинская, д. 28, помещ. 6/14
Номер телефона: 8 (499) 350-55-70
Адрес электронной почты: qiagenrus@qiagen.com
23. Редакция документа
Дата Изменения
R2, январь 2021 Обновлен раздел Автоматизированный процесс выделения с
использованием станции QIAcube,
Обновлены Предупреждения и Меры предосторожности
R3, февраль 2026 Обновлен раздел Рекламации
Приложение А: Автоматизированный процесс выделения с
использованием станции QIAcube
Выделение и очистка нуклеиновых кислот с использованием набора QIAamp
DSP DNA Blood Mini Kit может быть полностью автоматизирована на
оборудовании QIAcube. Инновационная автоматическая станция для выделения
нуклеиновых кислот QIAcube использует современную технологию для обработки
центрифужных колонок QIAamp Mini, обеспечивая непрерывную
автоматизированную подготовку образцов. Подготовка образцов с использованием
станции QIAcube включает те же этапы, что и ручная подготовка (лизис,
22
связывание, промывка и элюирование) и позволяет использовать набор QIAamp
DSP DNA Blood Mini Kit для высококачественного выделения нуклеиновых кислот.
При автоматической обработке образцов в станции QIAcube с использованием
набора QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit может оказаться так, что прибор
обработает менее 50 образцов крови из-за мертвых объемов, испарения и
дополнительного потребления реагентов автоматическим дозатором. Компания
QIAGEN гарантирует обработку 50 образцов только при ручном использовании
набора QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit.
Рисунок 5. Станция QIAcube
23
2
Оглавление
1. Наименование изделия ...................................................................................................................... 5
2. Производитель .................................................................................................................................... 5
3. Назначение, показания к применению, противопоказания. .......................................................... 5
4. Сведения о потенциальных потребителях ....................................................................................... 6
5. Общие сведения ................................................................................................................................. 6
6. Принцип действия .............................................................................................................................. 6
7. Комплектность набора....................................................................................................................... 8
8. Необходимые материалы, не входящие в комплект набора .......................................................... 9
9. Перечень лекарственных средств, материалов животного и (или) человеческого
происхождения .......................................................................................................................................... 9
10. Предупреждения и меры предосторожности .............................................................................. 9
11. Срок годности. .............................................................................................................................. 12
12. Хранение и перемещение реагентов .......................................................................................... 12
13. Хранение и перемещение образцов ............................................................................................ 12
14. Процедура ..................................................................................................................................... 13
14.1. Краткий протокол: Выделение циркулирующих ДНК из 1-5 мл плазмы крови
человека ................................................................................................................................................ 15
14.2. Классический протокол: Выделение циркулирующих ДНК из 1-5 мл плазмы крови
человека ................................................................................................................................................ 18
15. Контроль качества ........................................................................................................................ 20
16. Эксплуатационные характеристики ........................................................................................... 20
16.1. Исследуемый образец ........................................................................................................... 20
16.2. Эквивалентность протоколов .............................................................................................. 20
16.3. Кросс-контаминация ............................................................................................................. 21
16.4. Объем буфера для элюирования .......................................................................................... 21
16.5. Воспроизводимость .............................................................................................................. 21
16.6. Интерферирующие вещества ............................................................................................... 21
16.7. Выход ДНК ............................................................................................................................ 22
17. Маркировка ................................................................................................................................... 23
18. Требование к охране окружающей среды.................................................................................. 24
19. Утилизация .................................................................................................................................... 24
20. Контактная информация .............................................................................................................. 24
21. Гарантийные обязательства ........................................................................................................ 24
22. Рекламации ................................................................................................................................... 24
23. Ссылки ........................................................................................................................................... 25
24. Руководство по устранению неисправностей............................................................................ 25
25. Редакция документа ..................................................................................................................... 27
Приложение 1: Рекомендации по получению и хранению плазмы крови ........................................ 27
3
КАЙДЖЕН, Технологии для отбора образцов и проведения анализов
Компания QIAGEN — ведущий поставщик инновационных технологий отбора и анализа
проб, позволяющих выделять и распознавать компоненты любых биологических образцов.
Наши высокотехнологичные продукты и услуги отличаются высоким качеством и обеспе-
чивают успех на всех этапах работы, от взятия образца до получения результата анализа.
QIAGEN задает стандарты в таких областях, как:
- Очистка ДНК, РНК и белков
- Анализ нуклеиновых кислот и белков
- Исследование микро-РНК и РНК-интерференции
- Автоматизация технологических процессов отбора и анализа проб
Наша миссия заключается в том, чтобы помогать вам добиваться выдающихся успехов и
совершать прорывы. Более подробную информацию см. на веб-сайте www.qiagen.com.
4
1. Наименование изделия
Набор для выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов в варианте исполне-
ния:
Набор QIAamp DSP Circulating NA Kit,
1. Центрифужные колонки QIAamp Mini с промывочными пробирками (2 мл) WT (50 шт.).
2. Удлинители колонок (20 мл) EXT (2 х 25 шт.).
3. Промывочные пробирки (2 мл) WT (50 шт.).
4. Пробирки для элюирования (1,5 мл) ЕТ (50 шт.).
5. Коннекторы VacConnectors VC (50 шт.).
6. Буфер для лизиса (220 мл) ACL (1 шт.).
7. Связывающий буфер (концентрат) (300 мл) ACB (1 шт.).
8. Промывочный буфер 1 (концентрат) (19 мл) ACW1 (1 шт.).
9. Промывочный буфер 2 (концентрат) (13 мл) ACW2 (1 шт.).
10. Элюирующий буфер (2 мл) АVЕ (5 шт.).
11. Протеиназа К (7 мл) PK (4 шт.).
12. Носитель РНК Carrier (310 мкг) (1 шт.).
13. Инструкция по применению.
2. Производитель
QIAGEN GmbH (КАЙДЖЕН ГмбХ)
Qiagen Strasse 1, 40724 Hilden, Germany (Германия)
Номера телефонов: +49-02103-29-0
Адрес электронной почты: info@qiagen.com;
Сайт: www.qiagen.com
3. Назначение, показания к применению, противопоказания.
Назначение
Для выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов методом селективного
связывания на мембране из диоксида кремния.
Описание
Набор для выделения нуклеиновых кислот QIAamp DSP Circulating NA Kit (далее набор,
набор реагентов, QIAamp DSP Circulating NA Kit) представляет собой систему, использую-
щую технологию селективного связывания нуклеиновых кислот на мембране из диоксида
кремния (QIAamp технология) для выделения и очистки циркулирующих, внеклеточных
ДНК из образцов плазмы крови человека.
Набор QIAamp Circulating NA Kit - это готовое к использованию медицинское изделие
для выделения и очистки ДНК из образцов плазмы, стабилизированной ЭДТА.
Набор рассчитан на обработку 50 образцов.
Время полного цикла анализа с использованием набора не превышает 90 минут.
Показания к применению
Набор QIAamp Circulating NA Kit предназначен для выделения ДНК в качестве этапа
пробоподготовки для последующего анализа очищенных нуклеиновых кислот в клинической
лабораторной диагностике, в частности методом ПЦР.
Является преаналитическим методом, набор QIAamp Circulating NA Kit предназначен для
подготовки образцов, но не для получения результатов исследований, качественных или ко-
личественных.
Противопоказания к применению
При использовании специально обученным персоналом и с учетом применения по назна-
чению противопоказания не выявлены.
5
4. Сведения о потенциальных потребителях
Набор должен использоваться только квалифицированным персоналом (лаборантами или
врачами клинической лабораторной диагностики, владеющими методами молекулярно-
биологических исследований для диагностики in vitro) в условиях профессиональной клини-
ко-диагностической лаборатории. Пользователь также должен иметь навыки, необходимые
для правильного выполнения исследований, описанных в данной инструкции по примене-
нию.
Медицинское изделие предназначено только для профессионального использования.
Набор предназначен для диагностики in vitro.
5. Общие сведения
Свободно-циркулирующие ДНК присутствуют в плазме крови в качестве коротких фраг-
ментов <1000 bp, при этом их концентрация в плазме человека обычно низкая и варьируется
в диапазоне от 1 до 100 нг/мл [1-5]. Набор QIAamp DSP Circulating NA Kit позволяет эффек-
тивно выделять циркулирующие нуклеиновые кислоты из плазмы человека. Могут исполь-
зоваться как свежие, так и замороженные образцы. При использовании Удлинителей колонок
(EXT) и вакуумной процедуры можно обрабатывать образцы объемом до 5 мл, а вариатив-
ность объема элюирования от 20 до 150 мкл позволяет концентрировать нуклеиновые кисло-
ты, присутствующие в низких количествах. Элюированная свободноциркулирующая ДНК
готова к использованию в дальнейших реакциях (например, амплификации) или хранению.
Набор позволяет эффективно удалять белки, нуклеазы и другие примеси.
6. Принцип действия
Процедура выделения циркулирующих ДНК набором QIAamp DSP Circulating NA Kit
включает 4 этапа (лизис, связывание, промывка и элюирование) и проводится с использова-
нием центрифужных колонок QIAamp Mini и вакуумной системы. Процедура позволяет
предотвратить перекрёстную контаминацию образцов и повысить безопасность пользователя
во время работы с потенциально инфицированными образцами. В зависимости от использу-
емого протокола, обработку могут проходить одновременно до 50 образцов менее чем за 2
часа. Принцип процедуры представлен на рис.1.
6
Рис.1. Процедура выделения набором QIAamp DSP Circulating NA Kit
Объем образцов
Миниколонки QIAamp Mini связывают даже сильно фрагментированные нуклеиновые
кислоты, которые короче чем 20 bp, при этом выход ДНК зависит от объема образца и кон-
центрации циркулирующих нуклеиновых кислот (обычно 1-100 нг/мл в плазме). Процедура
выделения набором QIAamp DSP Circulating NA Kit оптимизирована для образцов объемом
до 5мл.
Лизис образцов
Свободно-циркулирующие ДНК в биологических жидкостях обычно связяны с белками
или обволакиваются везикулами, что требует эффективной стадии лизиса для высвобожде-
ния нуклеиновых кислот для их селективного связывания с мембраной колонки QIAamp
Mini. Таким образом, образцы лизируются в сильно денатурирующих условиях при повы-
шенных температурах в присутствии протеиназы К и буфера ACL, что обеспечивает инакти-
вацию ДНКаз и высвобождение нуклеиновых кислот из связанных белков, липидов и вези-
кул.
Связывание с мембраной центрифужной колонки QIAamp Mini
Для оптимизации связывания циркулирующих ДНК с мембраной, для лизата использует-
ся буфер АСВ. Лизаты затем переносятся на миниколонку QIAamp Mini и циркулирующие
нуклеиновые кислоты адсорбируются мембраной из диоксида кремния при перемещении
лизата под вакуумом. Солевой состав и уровень рН гарантируют, что большинство белков и
других загрязнений, которые могут ингибировать ПЦР и последующие реакции, не удержи-
ваются на мембране колонки QIAamp Mini.
Удаление остаточных примесей
7
Нуклеиновые кислоты остаются связанными с мембраной, когда загрязнения эффективно
удаляются в процессе трех этапов промывки.
Элюирование очищенных нуклеиновых кислот
Элюирование осуществляется с использованием буфера AVE при комнатной температу-
ре. Объем элюирования может варьироваться от 50 до 150 мкл. Если требуются более высо-
кие концентрации ДНК, объем элюирования необходимо снизить до 20 мкл. Объем элюиро-
вания менее чем 50 мкл ведет к повышению концентрации нуклеиновой кислоты в элюате,
но и приводит к снижению общего выхода ДНК.
Элюированный объем может быть на 5мкл меньше, чем объем добавленного в колонку
буфера AVE.
Выход и размер нуклеиновых кислот
Выход свободноциркулирующих ДНК, выделенных из биологических образцов, обычно
ниже 1 мкг, что трудно определяется спектрофотомотрически. Кроме того, абсолютный вы-
ход циркулирующих ДНК, полученных из образца с применением набора, варьируется от
образца к образцу и также зависит от других факторов (например, конкретной стадии забо-
левания). Для определения выхода ДНК рекомендуются количественные амплификационные
методы.
Разброс по размерам циркулирующих нуклеиновых кислот, очищенных с использовани-
ем набора, может быть проверен электрофорезом на агарозном геле или гибридизацией со
специфичными меченными зондами [5].
Описание протоколов
В данной инструкции по применению содержатся два протокола.
«Краткий Протокол: Выделение циркулирующих нуклеиновых кислот из 1-5 мл плазмы
крови человека», рассчитанный на объем до 5мл плазмы с шагом 1мл и оптимизированный
для быстрого выполнения.
«Классический протокол: Выделение циркулирующих нуклеиновых кислот из 1-5 мл
плазмы крови человека», рассчитанный на объем до 5 мл плазмы с шагом 1 мл и представ-
ляющий собой первоначально разработанную версию протокола для QIAamp DSP Circulating
NA Kit.
7. Комплектность набора
Состав набора
Набор QIAamp DSP Circulating NA Kit
Каталожный номер 61504
Количество реакций 50
Обозначение Описание Идентификация Количество
Центрифужные колонки QIAamp
Mini с промывочными пробирка- 50 шт
QIAamp Mini ми (2мл) WT
EXT Удлинители колонок (20мл) EXT 2х25 шт
Промывочные пробирки (2мл)
50 шт
WT WT
Пробирки для элюирования
50 шт
ET (1,5мл) ET
VC Коннекторы VacConnectors VC 50 шт
ACL Буфер для лизиса* (220мл) ACL 1 шт
Связывающий буфер* (концен-
1 шт
ACB трат) (300мл) ACB
8
Промывочный буфер 1* (концен-
19 мл
ACW1 трат) (19мл) ACW1
Промывочный буфер 2** (кон-
13 мл
ACW2 центрат) (13мл) ACW2
Элюирующий буфер** (фиолето-
5 шт
AVE вые колпачки) (2мл) AVE
PROTK Протеиназа К (7мл) PK 4 шт
Носитель РНК (красные колпач-
1 шт
Carrier ки) (310мкг) Carrier
Инструкция по применению 1 шт
* содержит хаотропные соли. См. раздел «Предупреждения и меры предосторожности»
** содержит азид натрия в качестве консерванта
Примечание: При работе с химикатами всегда надевайте лабораторный халат, одно-
разовые перчатки и защитные очки. Для получения дополнительной информации обра-
титесь к соответствующим паспортам безопасности (SDS), которые можно полу-
чить у поставщика продукта или в режиме онлайн в формате PDF по ссылке
www.qiagen.com/safety.
8. Необходимые материалы, не входящие в комплект набора
 Этанол (96-100%)*
 Изопропанол (100%)
 Пипетки (регулируемые) и наконечники для пипеток (во избежание перекрестного за-
грязнения рекомендуются наконечники для пипеток с аэрозольными барьерными филь-
трами)
 Термомиксер или нагревательный блок** для лизиса при 56°C, рассчитанный на 2мл
промывочные пробирки
 Водяная баня или нагревательный блок, рассчитанный на 50мл центрифужные пробир-
ки, с температурой от 56°C до 60°C*
 Пробирки на 50 мл
 Вакуумный насос создающий вакуум от -800 до -900 мбар, (кат. № 84010, 84020
QIAGEN или аналог), Вакуумный коллектор (QIAvac 24 Plus кат.№ 19413 QIAGEN
или аналог), опционально (на выбор): VacValves (кат. № 19408 QIAGEN) или аналог)
 Микроцентрифуга** (с ротором на 2 мл пробирки)
 Измельченный лед (только для «Классического протокола»)
 Некоторые образцы могут потребовать разведения фосфатно буференным физиологи-
ческим раствором (PBS)
 Вортекс
* не используйте денатурированный этанол, который содержит примеси метанола и ме-
тилэтилкетона
** убедитесь, что инструменты проверены и откалиброваны согласно рекомендациям
производителя
9. Перечень лекарственных средств, материалов животного и (или) че-
ловеческого происхождения
Лекарственные средства, материалы человеческого и животного происхождения: не ис-
пользуются.
10. Предупреждения и меры предосторожности
Для диагностики in vitro
Правила техники безопасности
9
При работе с химикатами всегда используйте лабораторный халат, одноразовые перчатки
и защитные очки.
Для получения дополнительной информации ознакомьтесь с соответствующими паспор-
тами безопасности (SDS). Эти паспорта можно получить в компактном и удобном формате
PDF на сайте www.qiagen.com/safety, где можно найти, распечатать SDS каждого набора
компании QIAGEN и каждого компонента в наборе. Утилизацию образцов и отходов после
анализа следует проводить в соответствии с местными нормами безопасности.
Общие меры предосторожности
 Следует всегда обращать внимание на следующее:
 Набор предназначен только для профессионального применения в клинической лабора-
торной диагностике.
 Анализ следует проводить с образцами плазмы крови
 Следует допускать к работе только обученный персонал.
 Следует использовать одноразовые перчатки без талька талька, халат и защитные очки.
Для получения дополнительной информации по безопасности можно обратиться к со-
ответствующим паспортам безопасности (SDS), которые размещены в режиме онлайн в
формате PDF по ссылке www.qiagen.com/safety.
 Запрещается использовать набор или компоненты с истекшим сроком годности и/или
поврежденной упаковкой компонентов набора.
 Со всеми образцами следует обращаться как с потенциально биологически опасными
веществами. Утилизацию образцов и отходов на различных стадиях обработки образца
следует проводить в соответствии с местными/национальными правилами утилизации
через уполномоченные организации в данном регионе.
 До, вовремя и после применения этого набора, все потенциально опасные материалы
(то есть материалы, которые могли войти в контакт с клиническими образцами), вклю-
чая пробирки, наконечники и прочие материалы, следует обрабатывать и утилизиро-
вать в соответствии с применимыми и соответствующими муниципальными / прави-
тельственными нормами, действующими в месте применения этого продукта.
 Не следует хранить открытыми флаконы с реагентами.
 Следует использовать калиброванные пипетки и инструменты.
 Следует использовать наконечники с фильтрами для пипеток
 Все поставляемые реагенты в наборах предназначены для использования только с дру-
гими реагентами из того же набора. Не следует заменять реагенты из набора на реаген-
ты из других наборов, в том числе аналогичных, так как это может снизить эффектив-
ность работы.
Примечание: Набор реагентов не содержит материалов биологического происхожде-
ния, веществ, обладающих канцерогенным, мутагенным действием, а также влияющих
на репродуктивную функцию человека. При использовании по назначению и соблюдении
мер предосторожности является безопасным
Предупреждения
ВНИМАНИЕ: не добавляйте отбеливатель или кислотные растворы
непосредственно в отходы, содержащие буфер ACL, ACB и ACW1
Буферы ACL, ACB и ACW1 содержат гуанидингидрохлорид, который способен создавать
высоко реакционноспособные вещества при соединении с отбеливателем.
В случае пролива жидкости, содержащей вышеперечисленные буферы, необходимо про-
извести очистку с использованием лабораторных детергентов и воды. Если разлитая жид-
кость потенциально инфицирована, сначала очистите зараженную зону лабораторным детер-
гентом и водой, а затем 1 % раствором (объемного содержания) гипохлорита натрия.
10
| Буфер ACВ, ACL | Содержит: гуанидин тиоцианат. Опасность! Вреден при проглатывании. Может быть вреден при контакте с кожей или при вдыхании. Вызывает сильные ожоги кожи и повреждения глаз. Вреден для водных организмов с длительными по- следствиями. При контакте с кислотами выделяется очень токсичный газ. Ис- пользуйте защитные перчатки/ защитную одежду/ средства защиты глаз/ сред- ства защиты лица. ПРИ ПОПАДАНИИ В ГЛАЗА: осторожно промыть водой в течение нескольких минут. Снимите контактные линзы, если они есть, и это лег- ко сделать. Продолжайте промывание. Немедленно обратитесь в ТОКСИКОЛО- ГИЧЕСКИЙ ЦЕНТР или к врачу/ терапевту. |
| Буфер ACW1 | Содержит гуанидин гидрохлорид. Может представлять опасность при попадании в пищеварительный тракт или дыхательные пути. Вызывает раздражение кожи. Вызывает серьезное раздраже- ние глаз. Обратитесь в токсикологический центр или к врачу в случае плохого самочувствия. Утилизируйте раствор/контейнер в специализированной установ- ке, предназначенной для утилизации отходов. Надевайте защитные перчат- ки/защитную одежду/ средства защиты глаз и лица. |
| Протеиназа К | Содержит: Протеиназу К. Опасность! Вызывает легкое раздражение кожи. Мо- жет вызвать симптомы аллергии или астмы или затруднение дыхания при вды- хании. Избегайте вдыхания пыли/ дыма/ газа/ тумана/ паров/ брызг. Используйте защитные перчатки/ защитную одежду/ средства защиты глаз/ средства защиты лица. Используйте средства защиты органов дыхания. Если вы подверглись воз- действию или появились симптомы: обратитесь в ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЙ ЦЕНТР или к врачу/ терапевту. Обеспечьте доступ к свежему воздуху. |
В случае повреждения или протекания флаконов с буфером, наденьте перчатки и защит-
ные очки во время утилизации флаконов, чтобы избежать вреда для своего здоровья и здоро-
вья окружающих.
Компания QIAGEN не проводила испытаний жидких отходов, получаемых после выпол-
нения процедур с использованием набора, на остаточные инфекционные материалы. Загряз-
нение жидких отходов остаточными инфекционными материалами маловероятна, но ее не
стоит полностью исключать. Следовательно, жидкие отходы необходимо считать инфекци-
онными, обрабатывать и утилизировать в соответствии с требованиями местных норматив-
но-правовых актов и правилами утилизации в данном регионе.
К компонентам набора реагентов QIAamp DSP Circulating NA Kit применяются следую-
щие коды риска и безопасности.
Ограничения
Эффективность набора была определена при использовании плазмы крови для выделения
свободно циркулирующей внеклеточной ДНК.
Для достижения оптимальных результатов необходимо строгое соблюдение данной ин-
струкции по применению. Не рекомендуется разбавление реагентов, отличное от описанного
в данной инструкции, которое приводит к потере производительности.
Следует обратить внимание на сроки годности и условия хранения, указанные на упаков-
ке и этикетках всех компонентов. Не используйте просроченные или неправильно хранящие-
ся компоненты.
Для того, чтобы минимизировать риск неправильной интерпретации результатов после-
дующей диагностики, необходимо использовать надлежащие контроли при последующих
исследованиях.
Любые полученные диагностические результаты следует толковать вместе с другими
клиническими или лабораторными данными.
11
11. Срок годности.
Срок годности набора QIAamp DSP Circulating NA Kit составляет 24 месяца. Изделие
стабильно до истечения срока годности, указанного на этикетке, при соблюдении условий
хранения и транспортирования.
Условия хранения реагентов: при температуре 15-25°С,
Условия хранения центрифужных колонок QIAamp Mini - при температуре 2-8°С.
Условия транспортирования: при температуре от -20 до +45°С.
Если изделие предназначено только для периодического применения, после вскрытия
флаконов, реагенты необходимо хранить при температуре 15-25°С не более 24 месяцев (до
указанного срока годности).
После истечения срока годности изделие использовать запрещено.
12. Хранение и перемещение реагентов
Колонки QIAamp MinElute должны храниться в при температуре 2–8С после прибытия.
Все буферы могут храниться при комнатной температуре (15–25С).
Лиофилизированный носитель РНК может храниться при комнатной температуре (15–
25С) до истечения срока годности, указанного на этикетке. Носитель РНК может быть рас-
творен только в буфере AVE; разбавленный носитель РНК должен сразу добавляться в буфер
ACL. Данный раствор должен приготавливаться непосредственно перед использованием и
остается стабильным при температуре 2–8С до 48 часов. Разбавленный в буфере AVE носи-
тель РНК может быть заморожен в аликвотах и храниться при температуре от 15 до 30С
до 24 месяцев.
Набор QIAamp DSP Circulating NA Kit содержит готовый для использования раствор
Протеиназы К в специальном буфере для хранения. При условии хранения при комнатной
температуре (15–25°С) Протеиназа К стабильна до даты окончания срока годности, указан-
ной на этикетке набора.
Срок хранения Набора QIAamp DSP Circulating NA Kit после вскрытия – 24 месяцев (до
истечения срока годности).
13. Хранение и перемещение образцов
Подготовка и хранение образцов крови:
Во избежание фрагментации внеклеточной ДНК и высвобождения клеточных нуклеино-
вых кислот, рекомендуется хранить цельную кровь максимум 6 часов при температуре +2°С
+8°С (например, с ЭДТА). При использовании пробирок для сбора крови, придерживайтесь
условий хранения, указанных производителем.
Подготовка и хранение плазмы:
Рекомендуется выполнять разделение плазмы и выделение нуклеиновых кислот немед-
ленно после отбора пробы при использовании ЭДТА в качестве антикоагулянта. Кратковре-
менно плазма может храниться до 24 часов при +2°С ... +8°С
Для длительного хранения аликвоты плазмы как из стабилизированных, так и нестабили-
зированных пробирок для сбора крови могут храниться при -20°С (в течении 3 недель) или -
80°С (в течении 2 месяцев).
Хранение элюированных нуклеиновых кислот:
Выделенные нуклеиновые кислоты собираются в 1,5 мл Пробирки для элюирования ET
(входят в состав набора). Очищенные циркулирующие ДНК должны храниться до 24 часов
при температуре 2–8С. Если период хранения превышает 24 часа, рекомендуемая темпера-
тура хранения от 15 до 30С для ДНК.
12
14. Процедура
Важные пункты, которые необходимо учитывать перед началом процедуры
После получения набора проверьте компоненты набора на наличие повреждений. Если
упаковки или флаконы с буфером повреждены, свяжитесь со Службой технической под-
держки QIAGEN или своим региональным дистрибьютором. В случае разлива жидкости см.
пункт «Предупреждения и меры предосторожности». Не используйте поврежденные компо-
ненты набора, поскольку их применение может снижать эффективность набора.
Всегда меняйте наконечник дозатора между переносами жидкости. Для минимизации пе-
рекрестной контаминации мы рекомендуем использовать наконечники с аэрозольным барье-
ром.
Все этапы центрифугирования выполняйте при комнатной температуре (15-25°С).
Всегда используйте одноразовые перчатки и регулярно проверяйте их на контаминацию
материалом образца. В случае загрязнения утилизируйте перчатки.
Для минимизации перекрестной контаминации открывайте только по одной пробирке за
раз.
Не рекомендуется использовать компоненты из других наборов, однако при необходимо-
сти, компоненты можно использовать только в том случае, если номера партий наборов
идентичны.
Не допускайте микробную контаминацию реактивов из набора.
Для минимизации риска инфицирования потенциально инфекционным материалом мы
рекомендуем работать в проточном ламинарном шкафу до тех пор, пока образцы не пройдут
лизис.
Данный набор могут использовать только сотрудники, обученные лабораторным проце-
дурам для диагностики in vitro.
Вакуумный коллектор
Вакуумный коллектор (QIAvac 24 Plus от QIAGEN или аналогичный) предназначен для
быстрой и эффективной параллельной вакуумной обработки 24 колонок QIAamp Mini для
очистки нуклеиновых кислот от примесей. Образцы и промывочные растворы проходят че-
рез мембраны колонок под вакуумом вместо центрифугирования, что обеспечивает большую
скорость и снижает время операции по выделению.
Примечание: Всегда соблюдайте осторожность и надевайте защитные очки во время
работы возле вакуумного коллектора
Примечание: Для правильной работы необходимо, чтобы вакуумный насос мог созда-
вать давление от 800 до 900 мбар. Избегайте более высокого вакуума. Использование
вакуумного давления ниже рекомендованного может уменьшить выход ДНК и снизить
ее чистоту.
Использование центрифужных колонок QIAamp Mini
Центрифужные колонки QIAamp Mini используются в вакуумном коллекторе через разъ-
емы с одноразовыми Коннекторами VacConnectors VC. Это обеспечивает стабильный вакуум
и ток жидкости, облегчая тем самым параллельную обработку различных объемов образцов.
Коннекторы VacConnectors VC по сути представляют собой одноразовые переходники, кото-
рые устанавливаются между центрифужными колонками QIAamp Mini и разъемами вакуум-
ного коллектора. Коннекторы VacConnectors VC утилизируются после однократного исполь-
зования. Схема подключения колонок к вакуумному коллектору показана на рис.2. Из-за
больших объемов используемого раствора следует использовать емкости для отходов филь-
трата, прошедшего через мембрану центрифужных колонок, который подлежит утилизации.
13
Рисунок 2. Вакуумный коллектор с центрифужными колонками QIAamp Mini.
1 - Вакуумный коллектор, 2 - Разъемы вакуумного коллектора (закрываются заглушками ес-
ли не используются), 3 - Коннектор VacConnector VC, 4 - Центрифужная колонка QIAamp
Mini, 6 - Удлинитель колонки EXT.
Подготовка буферов и реагентов
Буфер АСВ
Перед использованием добавьте 200 мл изопропанола (100%) к 300 мл Связывающего
буфера (концентрат) АСВ для того, чтобы получить 500 мл готового буфера АСВ. Хорошо
перемешайте после добавления изопропанола.
Буфер АСW1
Перед использованием добавьте 25 мл этанола (96–100%) в 19 мл Промывочного буфера
(концентрат) АСW1 для того, чтобы получить 44 мл готового буфера АСW1. Хорошо пере-
мешайте после добавления этанола.
Буфер АСW2
Перед использованием добавьте 30 мл этанола (96–100%) в 13 мл Промывочного буфера
(концентрат) АСW2 для того, чтобы получить 43 мл готового буфера АСW2. Хорошо пере-
мешайте после добавления этанола.
Добавление носителя РНК Carrier в буфер для лизиса АСL
Носитель РНК Carrier служит для двух целей. Во-первых, он усиливает связывание нук-
леиновых кислот с мембраной колонки QIAamp Mini, что особенно важно, если в образце
присутствует малое количество молекул. Во-вторых, добавление большого количества Носи-
теля РНК Carrier уменьшает шанс распада нуклеиновых кислот в Буфере для лизиза ACL.
Количества лиофилизированного Носителя РНК Carrier в наборе достаточно для входя-
щего в состав набора объема Буфера для лизиса ACL. Концентрация носителя РНК Carrier
подобрана таким образом, что позволяет использовать протокол QIAamp DSP Circulating NA
14
Kit в качестве универсальной процедуры выделения нуклеиновых кислот, совместимой со
многими различными системами амплификации и подходящей для широкого спектра мише-
ней ДНК.
Эффективность разных амплификационных систем варьируются в зависимости от обще-
го количества нуклеиновой кислоты, которая присутствует в реакции. Элюаты, полученные
при помощи данного набора, содержат и циркулирующие нуклеиновые кислоты, и Носитель
РНК Carrier. В большинстве случаев количество носителя РНК будет в значительной степени
превышать количество циркулирующих нуклеиновых кислот в образце. Поэтому количе-
ственный анализ выделенных циркулирующих ДНК методом УФ-спектрометрии не будет
достоверным, так как результаты таких измерений будут определяться и присутствием до-
бавленного носителя.
Для амплификационных систем, использующих олигонуклеотидные (dT) праймеры, во
время выделения свободно-циркулирующих нуклеиновых кислот носитель РНК Carrier до-
бавляться не должен.
Добавьте 1550 мкл Элюирующего буфера AVE* в пробирку, содержащую 310 мкг лио-
филизированного Носителя РНК Carrier чтобы получить раствор концентрацией в 0,2
мкг/мкл. Тщательно растворите содержимое, разделите его на аликвоты необходимого объё-
ма и храните при температуре от 15 до 30С, при этом не допускается более трех циклов
замораживания/размораживания аликвот.
Следует отметить, что Носитель РНК Carrier не растворяется напрямую в Буфере для ли-
зиса ACL. Сначала его необходимо растворить в Элюирующем буфере AVE, а затем добав-
лять буфер ACL. Выберите количество образцов, которые должны обрабатываться одновре-
менно и рассчитайте объем смеси Буфер для лизиса ACL - Носитель РНК Carrier, необходи-
мый для данной партии образцов, в соответствии с таблицами, указанными в протоколах
ниже. Перед работой аккуратно перемешайте смесь, переворачивая пробирку 10 раз. Не ис-
пользуйте вортекс.
Примечание: Процедура подготовки образцов оптимизирована для 1,0 мкг Носителя
РНК Carrier на один образец. Если для вашей амплификационной системы лучше ис-
пользовать меньшее количество, уменьшите объем растворенного носителя, добавляе-
мого в буфер ACL.
14.1. Краткий протокол: Выделение циркулирующих ДНК из 1-5 мл плазмы крови
человека
Данный протокол для выделения и очистки циркулирующей ДНК из 1-5 мл плазмы крови
человека и оптимизирован для оперативной и не требующей ручной работы процесса. Для
выверенных и отработанных пользователем процессов можно использовать раннюю версию
протокола (см. подраздел «Классический протокол: Выделение циркулирующих ДНК из 1-5
мл плазмы крови человека»)
Важные моменты перед началом работы:
 Все стадии центрифугирования проводятся при комнатной температуре (15-25 С)
 Сбрасывайте вакуум между этапами процедуры для того, чтобы обеспечить равномер-
ный вакуум во время обработки образцов.
 Вакуумное давление должно быть от -800 до -900мБар
 Доведите температуру образцов до комнатной.
 С помощью фосфатно-буферного физиологического раствора доведите объем образца
до ближайшего кратного значения от 1 до 5мл.
 Подогрейте водяную баню или нагревательный блок до температуры 60ºС для исполь-
зования с 50мл центрифужными пробирками на этапе 3
 Подогрейте нагревательный блок до температуры 56ºС для использования с 2мл про-
мывочными пробирками на этапе 14
15
 Выдержите центрифужные колонки QIAamp Mini по меньшей мере 1 час при комнат-
ной температуре.
 Убедитесь в том, что Связывающий буфер АСВ, Промывочный буфер ACW1 и ACW2
были предварительно подготовлены (см. подраздел «Подготовка буферов и реаген-
тов»).
 Добавьте Носитель РНК Carrier, разбавленный в Элюирующем буфере AVE в Буфер
для лизиса ACL в соответствии с инструкциями в таблице 1.
Таблица 1. Объем буфера для лизиса ACL и носителя РНК Carrier (растворенного в буфере
AVE), необходимый для анализа 1-5 мл плазмы крови человека
A B C D E
Объем плазмы
1 ml 2 ml 3ml 4 ml 5 ml Носитель РНК Carrier в
Количество буфере AVE (мкл)
Буфер для лизиса ACL (мл)
образцов
1 0,9 1,8 2,6 3,5 4,4 5,6
2 1,8 3,5 5,3 7,0 8,8 11,3
3 2,6 5,3 7,9 10,6 13,2 16,9
4 3,5 7,0 10,6 14,1 17,6 22,5
5 4,4 8,8 13,2 17,6 22,0 28,1
6 5,3 10,6 15,8 21,1 26,4 33,8
7 6,2 12,3 18,5 24,6 30,8 39,4
8 7,0 14,1 21,1 28,2 35,2 45,0
9 7,9 15,8 23,8 31,7 39,6 50,6
10 8,8 17,6 26,4 35,2 44,0 56,3
11 9,7 19,4 29,0 38,7 48,4 61,9
12 10,6 21,1 31,7 42,2 52,8 67,5
13 11,4 22,9 34,3 45,8 57,2 73,1
14 12,3 24,6 37,0 49,3 61,6 78,8
15 13,2 26,4 39,6 52,8 66,0 84,4
16 14,1 28,2 42,2 56,3 70,4 90,0
17 15,0 29,9 44,9 59,8 74,8 95,6
18 15,8 31,7 47,5 63,4 79,2 101,3
19 16,7 33,4 50,2 66,9 83,6 106,9
20 17,6 35,2 52,8 70,4 88,0 112,5
21 18,5 37,0 55,4 73,9 92,4 118,1
22 19,4 38,7 58,1 77,4 96,8 123,8
23 20,2 40,5 60,7 81,0 101,2 129,4
24 21,1 42,2 63,4 84,5 105,6 135,0
Процедура: Краткий протокол
1. С помощью пипетки перенесите Протеиназу К, образец плазмы и буфер для лизиса ACL в
соответствующих пропорциях в 50 мл пробирку для центрифуги (не входит в комплект).
A B C D E
Протеиназа К (мкл) 100 200 300 400 500
Плазма (мл) 1 2 3 4 5
Буфер ACL (мл) 0,8 1,6 2,4 3,2 4,0
2. Закройте крышкой и перемешайте в вортексе в течение 30 секунд
Убедитесь в том, что содержимое хорошо перемешалось в пробирке. Для того, чтобы обес-
печить надлежащий лизис, необходимо, чтобы буфер ACL и образец хорошо перемешались
и представляли собой однородный раствор.
16
Примечание: Не прерывайте процедуру на данном этапе. Сразу перейдите к этапу 3
для того, чтобы начать инкубацию.
3. Проинкубируйте при температуре 56ºС (±1ºС) в течение 15 (±1) минут.
4. Поставьте пробирку на лабораторный стол и откройте крышку.
5. Добавьте приготовленный буфер АСB в лизат, находящийся в пробирке. Выберите объем,
соответствующий стадии 1.
A B C D E
Буфер ACВ (мл) 1,8 3,6 5,4 7,2 9,0
6. Закройте крышку и тщательно перемешайте в вортексе 5 х 2 секунды. Убедитесь в том,
что содержимое хорошо перемешалось в пробирке. Для того, чтобы обеспечить надлежащий
лизис, необходимо, чтобы буфер ACВ и образец хорошо перемешались и представляли со-
бой однородный раствор.
7. Проинкубируйте смесь лизата и буфера АСВ в пробирке в течение 5 (±1) минут при ком-
натной температуре.
8. Поместите центрифужную колонку QIAamp Mini в коннектор VacConnector, размещенный
на вакуумном коллекторе (см. подраздел «Использование центрифужных колонок QIAamp
Mini»). Вставьте 20 мл удлинитель колонки в открытую колонку QIAamp Mini. Убедитесь,
что удлинитель колонки надежно закреплен, чтобы предотвратить утечку образца.
9. Аккуратно переместите лизат, полученный на этапе 7, в удлинитель колонки QIAamp Mini.
Включите вакуумный насос. После полного переноса лизатов через колонки выключите ва-
куумный насос и сбросьте давление до 0 бар. Аккуратно снимите и утилизируйте удлинитель
колонки. Необходимо отметить, что для большого объема лизата (около 18мл со стартовых
5мл образца) может потребоваться до 20 минут чтобы лизат полностью прошел через мем-
брану центрифужной колонки QIAamp Mini.
Примечание: во избежание кросс-контаминации, соседние колонки QIAamp Mini не
должны соприкасаться между собой.
10. Добавьте 600 мкл приготовленного буфера ACW1 в центрифужную колонку QIAamp
Mini. Оставьте крышку колонки открытой и включите вакуумный насос. После того, как бу-
фер ACW1 полностью пройдет через мембрану колонки, отключите вакуумный насос и
сбросьте давление до 0 бар.
11. Добавьте 750 мкл приготовленного буфера ACW2 в центрифужную колонку QIAamp
Mini. Оставьте крышку колонки открытой и включите вакуумный насос. После того, как бу-
фер ACW 2 полностью пройдет через мембрану колонки, отключите вакуумный насос и
сбросьте давление до 0 бар.
12. Добавьте 750 мкл этанола (96-100%) в центрифужную колонку QIAamp Mini. Оставьте
крышку колонки открытой и включите вакуумный насос. После того, как этанол полностью
переместится через колонку, отключите вакуумный насос и сбросьте давление до 0 бар.
13. Закройте крышку центрифужной колонки QIAamp Mini. Снимите колонку с вакуумного
коллектора и утилизируйте коннектор VacConnector. Поместите колонку в чистую 2 мл про-
мывочную пробирку и центрифугируйте на полной скорости (20000 х g; 14,000 rpm) в тече-
ние 3 (±0,5) минут.
14. Поместите центрифужную колонку QIAamp Mini в новую 2 мл промывочную пробирку.
Откройте крышку и проинкубируйте при комнатной температуре в течении3 минут для того,
чтобы полностью высушить мембрану.
15. Поместите центрифужную колонку QIAamp Mini в чистую 1,5 мл пробирку для элюиро-
вания ET (входит в состав набора) и утилизируйте 2 мл промывочную пробирку, использо-
ванную на этапе 14. Аккуратно добавьте 20-150 мкл элюирующего буфера AVE по центру
мембраны колонки QIAamp Mini. Закройте крышку и проинкубируйте при комнатной темпе-
ратуре в течение 3 (±0,5) минут.
17
Важно: убедитесь в том, что температура элюирующего буфера AVE соответствует
комнатной температуре (15-25ºС). Если элюирование осуществляется в небольших
объемах (<50 мкл), элюирующий буфер должен наноситься по центру мембраны для
лучшего вымывания связанных нуклеиновых кислот. Объем элюирования варьируется в
зависимости от требований испытания. Объем элюата будет приблизительно на 5 мкл
меньше элюирующего объема.
16. Центрифугируйте в микроцентрифуге при полной скорости (20000 х g) в течение 1 мину-
ты для вымывания нуклеиновых кислот.
14.2. Классический протокол: Выделение циркулирующих ДНК из 1-5 мл плазмы
крови человека
Данный протокол представлен в ранней версии инструкции по применению QIAamp DSP
circulating NA Kit для использования, и может использоваться например, с существующими
выверенными пользователями рабочими процессами для 1-5 мл плазмы крови человека.
Важные моменты перед началом работы:
 Все стадии центрифугирования проводятся при комнатной температуре (15-25°С)
 Сбрасывайте вакуум между этапами процедуры для того, чтобы обеспечить равномер-
ный вакуум во время обработки образцов.
 Вакуумное давление должно быть от -800 до -900мБар
 Доведите температуру образцов до комнатной.
 С помощью фосфатно-буферного физиологического раствора доведите объем образца
до ближайшего кратного значения от 1 до 5мл.
 Подогрейте водяную баню или нагревательный блок до температуры 60ºС для исполь-
зования с 50мл центрифужными пробирками на этапе 3
 Подогрейте нагревательный блок до температуры 56ºС для использования с 2мл про-
мывочными пробирками на стадии 14
 Выдержите центрифужные колонки QIAamp Mini по меньшей мере 1 час при комнат-
ной температуре.
 Убедитесь в том, что Связывающий буфер АСВ, Промывочный буфер ACW1 и ACW2
были предварительно подготовлены (см. подраздел «Подготовка буферов и реаген-
тов»).
 Добавьте Носитель РНК Carrier, разбавленный в Элюирующем буфере AVE в Буфер
для лизиса ACL в соответствии с инструкциями в таблице 2.
Таблица 2. Объем буфера для лизиса ACL и носителя РНК Carrier (растворенного в буфере
AVE), необходимый для анализа 1-5 мл плазмы крови человека
Объем A B C D E
плазмы 1 мл 2 мл 3 мл 4 мл 5 мл Носитель РНК Carrier
Количество в буфере AVE (мкл)
Буфер ACL (мл)
образцов
1 0,9 1,8 2,6 3,5 4,4 5,6
2 1,8 3,5 5,3 7,0 8,8 11,3
3 2,6 5,3 7,9 10,6 13,2 16,9
4 3,5 7,0 10,6 14,1 17,6 22,5
5 4,4 8,8 13,2 17,6 22,0 28,1
6 5,3 10,6 15,8 21,1 26,4 33,8
7 6,2 12,3 18,5 24,6 30,8 39,4
8 7,0 14,1 21,1 28,2 35,2 45,0
9 7,9 15,8 23,8 31,7 39,6 50,6
10 8,8 17,6 26,4 35,2 44,0 56,3
18
11 9,7 19,4 29,0 38,7 48,4 61,9
12 10,6 21,1 31,7 42,2 52,8 67,5
13 11,4 22,9 34,3 45,8 57,2 73,1
14 12,3 24,6 37,0 49,3 61,6 78,8
15 13,2 26,4 39,6 52,8 66,0 84,4
16 14,1 28,2 42,2 56,3 70,4 90,0
17 15,0 29,9 44,9 59,8 74,8 95,6
18 15,8 31,7 47,5 63,4 79,2 101,3
19 16,7 33,4 50,2 66,9 83,6 106,9
20 17,6 35,2 52,8 70,4 88,0 112,5
21 18,5 37,0 55,4 73,9 92,4 118,1
22 19,4 38,7 58,1 77,4 96,8 123,8
23 20,2 40,5 60,7 81,0 101,2 129,4
24 21,1 42,2 63,4 84,5 105,6 135,0
Процедура: Классический протокол
1. С помощью пипетки добавьте Протеиназу К, образец плазмы и буфер для лизиса ACL в
соответствующих пропорциях в 50 мл пробирку для центрифуги (не входит в комплект).
A B C D E
Протеиназа К (мкл) 100 200 300 400 500
Плазма (мл) 1 2 3 4 5
Буфер ACL (мл) 0,8 1,6 2,4 3,2 4,0
2. Закройте крышкой и перемешайте в вортексе в течение 30 секунд
Убедитесь в том, что содержимое хорошо перемешалось в пробирке. Для того, чтобы обес-
печить надлежащий лизис, необходимо, чтобы буфер для лизиса ACL и образец хорошо пе-
ремешались и представляли собой однородный раствор.
Примечание: Не прерывайте процедуру. Сразу перейдите к этапу 3 для того, чтобы
начать инкубацию.
3. Проинкубируйте при температуре 60ºС (±1ºС) в течение 30 (±2) минут.
4. Поставьте пробирку на лабораторный стол и откройте крышку.
6. Добавьте приготовленный буфер АСB в лизат, находящийся в пробирке. Выберите объем,
соответствующий стадии 1.
A B C D E
Буфер ACВ (мл) 1,8 3,6 5,4 7,2 9,0
6. Закройте крышку и тщательно перемешайте в вортексе в течение 30 секунд. Убедитесь в
том, что содержимое хорошо перемешалось в пробирке. Для того, чтобы обеспечить надле-
жащий лизис, необходимо, чтобы буфер ACВ и образец хорошо перемешались и представля-
ли собой однородный раствор.
7. Проинкубируйте смесь лизата и буфера АСВ в пробирке в течение 5 (±1) минут на льду.
8. Поместите центрифужную колонку QIAamp Mini в коннектор VacConnector на вакуумном
коллекторе (см. подраздел «Использование центрифужных колонок QIAamp Mini»). Вставьте
20 мл удлинитель колонки в открытую колонку QIAamp Mini. Убедитесь, что удлинитель
колонки надежно закреплен, чтобы предотвратить утечку образца.
9. Аккуратно переместите лизат, полученный на этапе 7, в удлинитель колонки QIAamp Mini.
Включите вакуумный насос c вакуумным давлением от -800 до -900 мбар. После полного пе-
реноса лизатов через колонки выключите вакуумный насос и сбросьте давление до 0 бар.
Аккуратно снимите и утилизируйте удлинитель колонки.
Необходимо отметить, что для большого объема лизата (около 18мл со стартовых 5мл образ-
ца) может потребоваться до 20 минут чтобы лизат полностью прошел через мембрану цен-
трифужной колонки QIAamp Mini.
19
Примечание: для того, чтобы избежать кросс-контаминации, соседние колонки
QIAamp Mini не должны соприкасаться между собой.
10. Добавьте 600 мкл приготовленного буфера ACW1 в центрифужную колонку QIAamp
Mini. Оставьте крышку колонки открытой и включите вакуумный насос. После того, как бу-
фер ACW1 полностью пройдет через мембрану колонки, отключите вакуумный насос и
сбросьте давление до 0 бар.
11. Добавьте 750 мкл приготовленного буфера ACW2 в центрифужную колонку QIAamp
Mini. Оставьте крышку колонки открытой и включите вакуумный насос. После того, как бу-
фер ACW 2 полностью переместится через мембрану колонки, отключите вакуумный насос и
сбросьте давление до 0 бар.
12. Добавьте 750 мкл этанола (96-100%) в центрифужную колонку QIAamp Mini. Оставьте
крышку колонки открытой и включите вакуумный насос. После того, как этанол полностью
пройдет через мембрану колонки, отключите вакуумный насос и сбросьте давление до 0 бар.
13. Закройте крышку центрифужной колонки QIAamp Mini. Снимите колонку с вакуумного
коллектора и утилизируйте коннектор VacConnector. Поместите колонку в чистую 2 мл про-
мывочную пробирку WT и центрифугируйте на полной скорости (20000 х g; 14,000 rpm) в
течение 3 (±0,5) минут.
14. Поместите центрифужную колонку QIAamp Mini в новую 2 мл промывочную пробирку
WT. Откройте крышку и проинкубируйте при температуре 56ºС в течение 10 (±1) минут для
того, чтобы полностью высушить мембрану.
15. Поместите центрифужную колонку QIAamp Mini в чистую 1,5 мл пробирку для элюиро-
вания ЕТ (входит в состав набра) и утилизируйте 2 мл промывочную пробирку, использо-
ванную на этапе 13. Аккуратно добавьте 20-150 мкл элюирующего буфера AVE по центру
мембраны колонки QIAamp Mini. Закройте крышку и проинкубируйте при комнатной темпе-
ратуре в течение 3 (±0,5) минут.
Важно: убедитесь в том, что температура элюирующего буфера AVE соответствует
комнатной температуре (15-25ºС). Если элюирование осуществляется в небольших
объемах (<50 мкл), элюирующий буфер должен наноситься по центру мембраны для
полного вымывания связанных нуклеиновых кислот. Объем элюирования варьируется в
соответствии с требованиями испытаний. Объем элюата будет приблизительно на 5
мкл меньше элюирующего объема.
16. Центрифугируйте в микроцентрифуге при полной скорости (20000 х g; 14,0000 rpm) в те-
чение 1 минуты для того, чтобы элюировать нуклеиновые кислоты.
15. Контроль качества
В соответствии с ISO-сертифицированной системой управления качеством QIAGEN каж-
дая партия набора QIAamp DSP Circulating NA Kit проходит испытание на соответствие
установленным спецификациям для обеспечения постоянного качества продукции.
16. Эксплуатационные характеристики
16.1. Исследуемый образец
Циркулирующие внеклеточные нуклеиновые кислоты, выделенные и очищенные из кро-
ви, собранной в различные пробирки, содержащие ЭДТА в качестве антикоагулянта, отвеча-
ли всем критериям приемлемости к количеству и качеству полученной ДНК. На основании
данных исследования были выработаны рекомендации по сбору и хранению образцов (см.
раздел «Хранение и перемещение образцов», а также Приложение 1).
16.2. Эквивалентность протоколов
Целью исследования было подтвердить эквивалентность протоколов выделения – «крат-
кий» протокол, внесенный в редакцию 3 инструкции по применению и «классический» про-
токол, который использовался ранее. Точность определялась ПЦР в реальном времени для
20
cfДНК (18S, 66bp). Критерием приемлимости являлось, что соответствующий 95%-ный до-
верительный интервал разницы в средних копиях/мл между «кратким» протоколом и «клас-
сическим» протоколом должен быть в пределах ± 2xSTD, что является стандартным откло-
нением наблюдаемой точности классического протокола для плазмы (эталонное условие).
Критерии приемлимости были выполнены. Среднее число копий/мл «краткого» протоко-
ла по плазме (34283/1 мл; 26753/5 мл) находится в пределах ± 2xSTD (9992/1 мл; 2357/5 мл),
что является стандартным отклонением наблюдаемой точности «классического» протокола
по плазме (контрольное условие, среднее 32255/1 мл; 26778/5 мл).
16.3. Кросс-контаминация
Целью этого теста было проверить, что набор QIAamp DSP Circulation NA Kit способен
обрабатывать положительные образцы рядом с отрицательными и в процессе этапов выделе-
ния не наблюдается перекрестное загрязнение.
В рамках верификации набора Therascreen® PIK3CA RGQ PCR Kit было проведено ис-
следование кросс-контаминации. Это исследование было сосредоточено на выделении ДНК
из положительных образцов с мутацией и образцов плазмы дикого типа с использованием
набора QIAamp DSP Circulating NA Kit и последующим ПЦР анализом на мутации выделен-
ной ДНК с использованием набора Therascreen® PIK3CA RGQ PCR Kit.
Все положительные образцы были определены как положительные. Никакого пере-
крестного загрязнения не наблюдалось. Критерии приемлимости были соблюдены.
16.4. Объем буфера для элюирования
Циркулирующие внеклеточные ДНК, выделенные и очищенные набором QIAamp DSP
Circulating NA Kit, отвечали всем критериям приемлемости к количеству и качеству при вы-
мывании с мембраны центрифужных колонок с использованием 20 мкл, 50 мкл и 150 мкл
элюирующего буфера АVЕ. Даже при низком объеме элюирования 20 мкл и использовании
10 мкл элюата в дальнейших исследованиях статистически значимых различий не наблюда-
лось. Следовательно, снижение элюирующего объема до 20 мкл можно использовать для до-
стижения более высоких концентраций внеклеточных ДНК в элюатах, для применения в
дальнейших диагностических процедурах in vitro диагностики.
16.5. Воспроизводимость
Целью этого теста было проверить, что набор QIAamp DSP Circulation NA Kit способен
одинаково обрабатывать образцы в рамках одного цикла выделения (повторяемость) и в раз-
ных циклах выделения при использовании разных партий набора QIAamp DSP Circulation
NA Kit (вариабельность от партии к партии). Общая точность (STD) Log10 копий на мл для
внутрилотовой (повторяемость) и межлотовой воспроизводимости составила ≤ 0,086 для
каждого процесса выделения, а % CV составил 0,7% и 3,7% копий/мл соответственно.
Кроме того, была проверена эффективность обработки образцов в разные дни с разными
операторами и оборудованием (промежуточная точность). Результаты показали, что пара-
метр «оператор» был единственным параметром, который влиял на эффективность выделе-
ния набором QIAamp DSP Circulating NA Kit. В тех экспериментах, в которых все перемен-
ные (день испытания; оператор; оборудование) оставались без изменений, достоверных раз-
личий не наблюдалось, что указывает на высокую воспроизводимость набора.
16.6. Интерферирующие вещества
Поскольку набор QIAamp DSP Circulating NA Kit служит для пробоподготовки и является
преаналитическим методом, влияние потенциально интерферирующих веществ можно оце-
нить только в совокупности с последующими диагностическими методами. Было исследова-
но влияние эндогенных интерферентов при ПЦР анализе набором therascreen® PIK3CA RGQ
PCR Kit на мутации ДНК, выделенной набором QIAamp DSP Circulating NA Kit в концентра-
циях интерферирующих веществ, представленных в таблице 3.
Таблица 3: Концентрации эндогенных интерферентных веществ
Интерферент Концентрация
21
| Гемоглобин | 2 г/л |
| Триглицериды | 37 ммоль/л (32.7 г/л) |
| Альбумин | 30 мг/мл |
| Конъюгированный билирубин | 342 ммоль/л (0.288 г/л) |
| Неконъюгированный билирубин | 342 ммоль/л (0.2 г/л) |
| Мутация | E542K | E545K | Q546R | C420R | H1047R |
| Альбумин | 0.216 | 0.122 | 0.083 | 0.681 | 0.007* |
| C-билирубин | 0.057 | 0.081 | 0.846 | 0.099 | 0.769 |
| Гемоглобин | 0.005* | 0.169 | 0.13 | 0.636 | 0.482 |
| Триглицериды | 0.31 | 0.081 | 0.279 | 0.213 | 0.473 |
| Uc-билирубин | 0.537 | 0.169 | 0.796 | 0.249 | 0.374 |
|  |  | Расчетная |  | Критерии приемли- |
| Мутация | Интерферент |  | 3 x точность |  |
|  |  | разница |  | мости выполнены |
|  | ACL | -0.28 | 1.002 | Да |
| E542K |  |  |  |  |
|  | Гемоглобин | -0.307 | 1.002 | Да |
| E545K | ACW2 | -0.54 | 1.851 | Да |
| Q546R | ACW2 | -0.392 | 1.332 | Да |
|  | ЭДТА | -0.315 | 1.332 | Да |
| H1047R | Альбумин | -0.35 | 1.692 | Да |
Для проверки того, что интерферент не влияет на эффективность анализа, должны были
выполняться следующие критерии приемлимости:
• Для положительных по мутации образцов «Образцы для испытаний» расчетная раз-
ница между образцом с интерферентом и контролем, не содержащим интерферента, не
должна быть статистически значимой (значение p > 0,05, результаты показаны в таблице 4),
или, если значение p значимо, то;
• Абсолютное значение разницы в ΔCt между образцом с введенным интерферентом и
контрольным образцом без интерферента должно быть меньше 3х промежуточных точностей
анализа (результаты показаны в таблице 5).
Таблица 4: Статистическая значимость разницы между образцами с интерферентами и
пустыми пробами (p-значение)
* Статистически значимые различия
Таблица 5: Разница и значение трехкратной точности для статистически значимых разли-
чий
Критерии приемлемости для этого исследования были выполнены. Данные этого иссле-
дования показали, что тестируемые интерференты не влияли на экстракцию и ПЦР анализ
образцов с мутациями и дикого типа. Даже в случаях, где наблюдалась значительная разни-
ца, она была в пределах 3-кратной промежуточной точности (таблица 5) анализа и, следова-
тельно, это в пределах присущей анализу вариативности.
Данные этого исследования подтвердили, что эндогенные вещества, которые могут при-
сутствовать в исследуемом образце, не влияют на эффективность выделения ДНК.
16.7. Выход ДНК
Набор QIAamp DSP Circulating NA Kit подходит для применения в сочетании с различными
последующими диагностическими исследованиями in vitro. Нуклеиновые кислоты, выделен-
22
ные и очищенные с помощью набора QIAamp DSP Circulating NA Kit, можно использовать
для ПЦР, секвенирования и масс-спектрометрии.
17. Маркировка
На упаковке и этикетках могут присутствовать следующие обозначения:
Содержит реагенты, достаточные для тестов <N>
<N>
Смотрите инструкции по применению
Использовать до
Для диагностики In vitro
Каталожный номер
Номер партии
номер материала
Компоненты
Объем
Диапазон температур
Производитель
По прибытии
Открыть при доставке; храните колонки QIAamp MinElute при 2-8ºС
Запишите текущую дату после добавления этанола во флакон
Добавление
Запишите текущую дату после добавления изопропанола во флакон
Изопропанол
Содержит
Лиофилизованный
Восстановить в
Этанол
Гуанидин тиоцианат
23
Гуанидин гидрохлорид
Малеиновая кислота
Субтилизин
Глобальный торговый номер
Внимание!
Rn
R - версия инструкции, а n - номер пересмотра
→
Приводит к
18. Требование к охране окружающей среды.
Медицинское изделие при использовании, транспортировке и хранении, не оказывает
негативного воздействия на человека и окружающую среду.
19. Утилизация
Чтобы избежать возможного загрязнения окружающей среды, изделие c истекшим сро-
ком годности, отходы использованных реагентов, а также, в случае видимых повреждений
индивидуальной упаковки, изделие должно утилизироваться местными публично-правовыми
организациями, в соответствии с требованиями местных нормативно-правовых актов и пра-
вилами утилизации в данном регионе.
На территории Российской Федерации набор QIAamp DSP Circulating NA Kit должен
утилизироваться в соответствии с нормативными требованиями для отходов класса Б (как
материалы и инструменты, предметы, загрязненные кровью или другими биологическими
жидкостями) – после химических методов обеззараживания и аппаратных способов обезза-
раживания с применением физических методов в соответствии с действующими санитарны-
ми правилами и нормами в соответствии с СанПиН 2.1.3684-21).
20. Контактная информация
Техническую поддержку и дополнительную информацию можно получить в центре тех-
нической поддержки по ссылке www.qiagen.com/Support, позвонив по номеру 00800-22-44-
6000, или обратившись в отдел технической поддержки QIAGEN или к местным дистрибью-
торам (см. на сайте www.qiagen.com).
21. Гарантийные обязательства
Компания QIAGEN GmbH (КАЙДЖЕН ГмбХ) принимает на себя гарантийные обяза-
тельства в отношении медицинского изделия по отсутствию дефектов и соответствию заяв-
ленным производителем характеристикам в течение всего срока годности, при соблюдении
условий, указанных в инструкции по применению.
Производитель не несёт ответственности за повреждения или несчастные случаи в ре-
зультате неправильного использования, ошибки пользователя или внешних чрезвычайных
ситуаций. По вопросам качества продукции обращайтесь к уполномоченному представителю
производителя.
22. Рекламации
Производитель/разработчик медицинского изделия:
QIAGEN GmbH / КАЙДЖЕН ГмбХ
24
| а) Пробирка для забора образцов крови содержит антикоагулянт, ко- торый не является ЭДТА | Использование другого антикоагулянта, нежели ЭДТА, может привести к ускоренному распаду ДНК в образцах крови |
| б) Длительный период времени меж- ду получением образцов крови и подготовкой плазмы | Клетки крови могут распасться и высвобождать в плазму геномную ДНК, разбавляющую целевую нуклеиновую кислоту |
| в) Процесс замороз- ки/размораживания образцов проис- ходил более одного раза | Запрещается многократно замораживать и размораживать образцы, так как это может привести к распаду ДНК. Всегда используйте свежие образцы или образцы, кото- рые размораживались всего один раз. |
| г) Низкое содержание целевой ДНК в образцах | Образцы слишком долго хранились при комнатной тем- пературе. Необходимо повторить процедуру выделения, используя свежие образцы. |
| д) Неполное растворение образца в буфере ACL | Если протеиназа К была подвержена воздействию повы- шенной температуры продолжительный период времени, она может утратить свою активность. Повторите проце- дуру, используя новые образцы и свежую протеиназу К |
| е) Смесь буфера AСL с носителем | Перемешайте буфер ACL с носителем РНК Carrier, пере- |
Qiagen Strasse 1, 40724 Hilden, Germany/ Кайджен Штрассе 1, 40724 Хильден, Германия
Номер телефона: +49-02103-29-0
Адрес электронной почты: info@qiagen.com;
Сайт: www.qiagen.com
Уполномоченный представитель производителя на территории Российской Федера-
ции:
Общество с ограниченной ответственностью "Кайджен РУС" (ООО "Кайджен РУС")
123557, ГОРОД МОСКВА, улица Малая Грузинская, д. 28, помещ. 6/14
Номер телефона: 8 (499) 350-55-70
Адрес электронной почты: qiagenrus@qiagen.com
23. Ссылки
1. Levy, B. (2019) Prenatal Diagnosis. Methods in Molecular Biology. 2nd ed. New York: Humana
Press.
2. Hahn, S. and Zimmermann, B.G. (2010) Cell-free DNA in maternal plasma: has the size-
distribution puzzle been solved? Clin Chem. 56, 1210-1211.
3. Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., and Calin, G. (2018) Clinical utility of circulating non-
coding RNAs - an update. Nat Rev Clin Oncol 15, 541-563.
4. Babayan, A. and Pantel, K. (2018) Advances in liquid biopsy approaches for early detection and
monitoring of cancer. Genome Med 10, 21.
5. Terrinoni, A.,et al (2019) The circulating miRNAs as diagnostic and prognostic markers. Clin
Chem Lab Med. 57, 932-953.
24. Руководство по устранению неисправностей
Руководство по поиску и устроению неисправностей может помочь в решении потенци-
альных проблем. Для того, чтобы получить более подробную информацию в отношении ин-
формации и протоколов, содержащихся в данной инструкции, или технологий анализа и по-
лучения образцов, обратитесь к специалистам технической службы QIAGEN (контактные
данные доступны по адресу: www.qiagen.com) или к своему дистрибьютеру.
Комментарии и предложения по устранению неисправностей
Незначительное количество или отсутствие нуклеиновой кислоты в элюате.
25
| РНК Carrier недостаточно эффектив- но перемешана | ворачивая пробирку с со смесью по меньшей мере 10 раз. |
| ж) Используется низкопроцентный этанол вместо 96-100% | Повторите процедуру очистки, используя новые образцы и 96-100% этанол. Не используйте денатурированный спирт, который может содержать другие вещества, такие, как метанол или метилэтилкетон |
| з) Буфер АСВ подготовлен непра- вильно | Убедитесь в том, что концентрат буфера АСВ был раз- веден достаточным объемом изопропанола (без этано- ла). |
| и) Буфер ACW1 или ACW 2 подго- товлен неверно | Убедитесь в том, что концентраты промывочногобуфера ACW1 или ACW 2 разведены правильным объемом эта- нола. Повторите процедуру выделения, используя новые образцы. |
| к) Буфер ACW1 или ACW 2 приго- товлен с использованием низкопро- центного этанола вместо 96-100% | Убедитесь в том, что концентраты промывочных буфе- ров ACW1 или ACW 2 разбавлены 96-100% этанолом. Повторите процедуру выделения, используя новые об- разцы. |
| а) Низкое содержание или отсут- ствие ДНК в элюате | Смотрите «Низкое содержание или отсутствие нуклеи- новой кислоты в элюате» для того, чтобы установить возможные причины. Увеличьте количество элюата, до- бавляемого в реакцию, если это возможно. |
| б) Используется ненадлежащий элю- ирующий объем | Определите максимальный объем элюата, подходящий для вашей реакции амплификации. Увеличьте или уменьшите объем элюата, добавляемого в реакцию ам- плификации. При необходимости скорректируйте элюи- рующий объем. |
| в) Буферы не перемешаны должным образом | Соли и этанол промывочного буфера ACW2 могут отде- ляться друг от друга, если смесь не используется в тече- ние продолжительного периода времени. Всегда тща- тельно перемешивайте буферы перед каждым использо- ванием. |
| д) Интерференция от Носителя РНК Carrier | Если присутствие носителя РНК Carrier в элюате препят- ствует ферментативным реакциям, необходимо умень- шить его количество или не использовать. |
ДНК функционирует ненадлежащим образом во время последующих ферментативных реак-
ций
Общее использование
а) Забита мембрана центрифужной Аккуратно извлеките колонку QIAamp Mini из узла, со-
колонки QIAamp Mini стоящего из удлинителя колонки и коннектора
VacConenctor. Разместите ее в 2 мл промывочной про-
бирке и обработайте в центрифуге при полной скорости
до тех пор, пока образец не пройдет через мембрану
полностью. Установите на место колонку QIAamp Mini и
содержащий остатки лизата узел, состоящий из удлини-
теля колонки и коннектора VacConenctor. Включите ва-
куумный насос и продолжите пропускать оставшийся
лизат через колонку.
Повторите вышеуказанную процедуру, если колонка
QIAamp Mini все еще забита.
26
|  | Из-за заморозки и размораживания в плазме могут обра- зовываться криопреципитаты. Данные криопреципитаты могут засорить колонку QIAamp Mini. Не используйте плазму, если она замораживалась и размораживалась бо- лее одного раза. Если присутствуют криопреципитаты, очистите образец путем его обработки в центрифуге в течение 5 минут при 16,000 g. |
| б) Переменные объемы элюирования | Для различных образцов могут потребоваться различные объемы элюирующего раствора. Объем элюирующего раствора должен быть на 5 мкл больше требуемого объ- ема элюата. |
| в) Вакуумное давление от -800 до - 900 мбар не было достигнуто | Вакуумный коллектор негерметичен. Нажмите на крыш- ку вакуумного коллектора после ее закрытия. Убедитесь в том, что было достигнуто необходимое вакуумное дав- ление. Прокладка крышки коллектора изношена. Визуально проверьте герметичность коллектора и замените про- кладку крышки, если необходимо. Соединение с вакуумным насосом негерметично. За- кройте все разъемы с помощью заглушек и включите ва- куумный насос. Убедитесь в том, что вакуумное давле- ние является стабильным после включения насоса. За- мените соединения между насосом и вакуумным коллек- тором, если необходимо. |
25. Редакция документа
Дата Изменения
R4, сентябрь 2019 Добавлен краткий протокол
R5, февраль 2026 Обновлен раздел Рекламации
Приложение 1: Рекомендации по получению и хранению плазмы
крови
Для того, чтобы выделить циркулирующие внеклеточные нуклеиновые кислоты из об-
разцов плазмы крови, мы рекомендуем соблюдать протокол, который предусматривает обра-
ботку образцов в центрифуге на большой скорости с целью удаления клеточных примесей,
тем самым уменьшая количество клеточных и геномных ДНК в образце.
1. Отбирайте образцы крови в пробирки, которые содержат ЭДТА в качестве антикоагу-
лянта. При необходимости перенесите образцы крови с ЭДТА в центрифужные пробирки.
2. Обработайте образцы крови в центрифуге в течение 10 минут при 1900 g (3000 rpm)
при температуре 4ºС.
3. Тщательно аспирируйте супернатант плазмы, не нарушая межклеточного слоя плазмы.
Около 4-5 мл плазмы можно получить из одной первичной пробирки объемом 10 мл.
Примечание: На этой стадии плазму можно использовать для экстракции циркулиру-
ющих нуклеиновых кислот. Однако последующее высокоскоростное центрифугирование
удалит дополнительный клеточный мусор и загрязнения циркулирующих нуклеиновых
кислот геномной ДНК из поврежденных клеток крови
4. Собранная плазма переносится в новые центрифужные пробирки.
5. Обработайте в центрифуге образцы плазмы в течение 10 минут при 16000 g при темпе-
ратуре 4ºС. Это позволит удалить оставшиеся в плазме клеточные примеси и геномные ДНК
из повреждённых клеток.
27
6. Аккуратно извлеките раствор и перенесите его в новую пробирку с помощью пипетки,
не поднимая осадок.
7. Если плазма будет использоваться для выделения нуклеиновых кислот в тот же день,
храните ее при температуре 2-8ºС для дальнейшего использования. В случае необходимости
более длительного хранения заморозьте плазму при температуре -80ºС. Перед использовани-
ем разморозьте пробирки с плазмой при комнатной температуре.
Примечание: Для удаления криопреципитатов образцы плазмы центрифугируют в тече-
ние 5 минут при 16 000 x g (в роторе с фиксированным углом наклона).
Примечание: Перенесите супернатант в новую пробирку, а затем начните протокол
выделения циркулирующих нуклеиновых кислот..
28
Фотографические изображения
медицинского изделия
Набор для выделения нуклеиновых кисло
биологических образцов,
в вариантах исполнения
Производства QIAGEN GmbH (КАЙДЖЕН Гм
«УТВЕРЖДАЮ»
Директор
ООО «Кайджен РУС»
Куксин Д. Н.
03.02.2026
Набор для выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов. Вариант 1: Набор QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit
(общий вид)
инн vim iii' in шин
VNCJ dsa QcduioviO
••
QiAGEN
QIAamp® DSP DNA
FFPE Tissue Kit
\ REF ) 60404
ri ^И04053ЭТв002е7 I
* CE5IJ I 44018,24
MMCM
| 8. Элюирующий буфер (2 мл) АV | Е (4 | шт.) |  |
| 9. Растворитель протеиназы (4,4 | мл) | PS (1 | шт.) |
| 10. Носитель РНК Carrier (310 мкг | ) (1 | шт.) |  |
| 11. Протеиназа QIAGEN (760 мкл | ) (1 | шт.) |  |
| 8 |  |  | 10 |
| 8. Элюирующий |  |  |  |
| буфер (2 мл) АVЕ, 1 | шт. |  |  |
|  |  |  | 8 |
Набор QIAamp DSP Virus Spin Kit. Компоненты набора:
9
11
10
Макеты дополнительной маркировки потребительской упаковки на русском языке
Набор для выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов.
Вариант 1: Набор QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit
Набор для выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов.
Вариант 2: Набор QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit