Наборы диагностических реагентов DELFIA, (Auto)DELFIA, НеоГрам и Неонатал — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас 1 закупка, где это изделие полностью проходит по требованиям хотя бы в одной позиции.
| Закупка | Окончание подачи | Нач. цена |
|---|---|---|
| Поставка наборов реагентов для неонатального скрининга
№ 0137200001226008744 · ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ КАЛУЖСКОЙ ОБЛАСТИ "КАЛУЖСКАЯ ОБЛАСТНАЯ КЛИНИЧЕСКАЯ БОЛЬНИЦА" · Калужская область |
13.11.2026 | 976 700 ₽ |
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
=== файл: unknown__Инструкция 201006071 (1) (1).pdf ===
--- стр. 5 ---
Каждый ДЕЛФИЯ НЕОНАТАЛ ТТГ набор содержит реагентов необходимых для 960 определений. Срок годности набора указан на внешней стороне коробки. Хранение при +2+8 С. При однократном открытии или разведении компонентов набора, они должны быть использованы в течение 2 недель. РЕАГЕНТЫ: Компоненты Количество Срок годности и хранение _________________________________________________________________________________ Стандарты ТТГ 1 лист фильтр.бумаги +2+8С до окончания срока (приблизит.величины) (Шляйхер & Шуль №2992) годности указанного на содержащая 5 различных пластик. пакете концентраций ТТГ А 1 мкЕд/мл В 10 мкЕд/мл С 25 мкЕд/мл D 50 мкЕд/мл Е 100 мкЕд/мл F 250 мкЕд/мл Контроли (прибл. концентрации) I 15 мкЕд/мл 1 лист фильтровальной бумаги +2, +8 до окончания срока II 60 мкЕд/мл (Шляйхер и Шуль, №2992), со- годности указанного на держащая по 5 высушенных пятен упаковке. Убедитесь, что крови этих концентраций пластиковый конверт влажен при вскрытии. Точна концентрация ТТГ указана на пакете, прилагаемому к каждому набору. Стандарты и контроли приготовлены из цельной человеческой крови при гематокрите в 50-55% и калиброваны по стандарту ВОЗ (80/558) для определения человеческого ТТГ. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Анти-ТТГ-Eu метка 1 флакон, 1.5мл. +2+8С до окончания срока концентрированный годности указанной на флаконе раствор (-20мкг/мл) (мышиные, моноклональные) Метка растворена в ТРИС-HCL буфере (рН=7.8) солевом растворе с БСА, мышиными IgG и азидом натрия в качестве консерванта. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Концентрат промывочного 1 флакон 250мл +2+8С до окончания срока буфера годности указанной на флаконе Концентрированный раствор ТРИС-HCL буфера (рН=7.8) солевом растворе с консервантами Твин 20 и Гермалл II. Разводится в 25 раз. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Нео ТТГ инкубац. буфер 1 флакон 250мл +2+8С до окончания срока годности указанной на флаконе Готовый для использования ТРИС-HCL буфер (рН=7.8) солевой раствор с БСА, бычьим глобулином, Твин 40, полиэтиленгликолем 6000, с инертным красным красителем и азидом натрия как консервантом.
--- стр. 6 ---
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- УСИЛИВАЮЩИЙ реагент 1 флакон 250мл +2+8С до окончания срока годности указанной на флаконе (+20+25С, см. на флаконе) Избегать попадания прямых солнечных лучей Готовый для использования с Тритон Х-100, уксусной кислотой и хелаторами. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Анти-ТТГ микротитровальные 10 планшет +2+8 до окончания срока стрипы. годности указанной на 12х8 лунок покрытых антителами планшете. против бетта субъединицы Убедитесь, что пластиковый молекулы ТТГ тампон влажный _________________________________________________________________________________ Для каждой партии Сертификаты контроля качества 1 лист МАТЕРИАЛЫ НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ С НАБОРОМ: ДЕЛФИЯ НЕОНАТАЛ ТТГ набор является частью комплексной системы иммунодиагностических реагентов и оборудования. ДЕЛФИЯ система требует следующие компоненты, которые могут быть поставлены или от WALLAC OY или от его дистрибьютеров: 1. Флюорометр с временным разрешением плюс принтер и внешний компьютер. 2. Автоматический вошер - ДЕЛФИЯ плейтвошер (Кат.№1296-024 или1296-026) 3. Автоматический шейкер-ДЕЛФИЯ плейтшейкер(Кат.№1296-001или1296-003) 4. Автоматический панчер ДЕЛФИЯ ПЛЕЙТ ПАНЧЕР (1296-031) или ВАЛЛАК ДБС ПАНЧЕР (1296-071) или ручной панчер для выбивки бумажных дисков с диаметром около 3 мм. 5. Пипетка для разливки ДЕЛФИЯ буфера и метки - ЭППЕНДОРФ МУЛЬТИПИПЕТКА (1296-014) с 5 мл Комби наконечниками (1296-016) или в качестве альтернативы ДЕЛФИЯ плейт диспенсер с ДЕЛФИЯ диспенсер юнит (1296-041 или 1296-043). 6. Пипетка для разливки Усиливающего раствора - ЭППЕНДОРФ мультипипетка (1296-014) с 5 мл Комби наконечниками (1296-016) или альтернативно ДЕЛФИЯ плейт диспенсер (1296-041). 7. ДЕЛФИЯ ДИСК РЕМУВЕР (1296-061) для автоматического удаления жидкости и бумажных пятен из микротитровальных лунок. В дополнении к ДЕЛФИЯ системе необходимо следующее: - дозирующая пипетка для разливки микролитровых объемов - пипетки для разливки миллитровых объемов НЭ буфера требуемого для приготовления раствора метки и антител - дистиллированная вода - бланки для взятия крови новорожденных Шляйхер & Шулль №2992 СБОР ОБРАЗЦОВ И ХРАНЕНИЕ: ДЕЛФИЯ НЕОНАТАЛ ТТГ кит используется для образцов крови, полученных у новорожденных после прокола пятки и сбора крови на фильтровальный бланк. Не оказывает влияние на результаты желтуха (билирубин < 20 мг/дл) или присутствие жира (триглицериды < 5000 мг/л). Кровь собирается на 2-6 день после родов. Пятно крови покрывает отмеченный круг на фильтровальном бланке при однократном прикладывании к месту прокола пятки. Убедитесь. что
--- стр. 7 ---
образец полученной крови полностью заполняет круг. Полученный образец крови высушивается на воздухе в горизонтальном положении в течении минимум 3 часов при комнатной температуре при избегании попадания прямых солнечных лучей. Метод работы с кровью на фильтровальных бланках требует определенных навыков по взятию крови, хранению и транспортировке образцов. Мы рекомендуем использовать фильтровальную бумагу Шляйхер и Шуль (№2992) как для сбора крови, так и быть в качестве основы для 0-кровяных пятен. Образцы крови с ЭДТА или цитратом натрия не могут быть применены из-за хелатирующего эффекта на европий. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ: Для диагностики ин витро. Набор следует использовать только соответственно подготовленным персоналом. Набор содержит реагенты произведенные из компонентов человеческой крови. Источник протестирован на на наличие поверхностного антигена к гепатиту В, анти-гепатиту С, и анти-ВИЧ I и II. Тем не менее все рекомендации по мерам предосторожности при работе с производными крови должны быть соблюдены. Можно считать все образцы крови пациентов как потенциально инфицированные. Реагенты содержат азид натрия в качестве консерванта. Азид натрия может взаимодействовать с металлическими поверхностями с образованием азидов металлов. Для предотвращения образования азидов металлов необходимо промыть большим количеством воды. Лиофиллизированные стандарты Нео-ТТГ содержат азид натрия в качестве консерванта. Порошок опасен при ингаляции и попадании на кожу. Для дезинфекции всех сливных реагентов пользуйтесь правилами местных контролирующих организаций. ПРОТОКОЛ ОПРЕДЕЛЕНИЯ: Выполните каждое определение в дубликате как для стандартов, контролей, так и для тестируемых образцов. Стандартная кривая должна быть использована для каждого определения. Образцы и реагенты должны быть доведены до комнатной температуры (+20+25С) до использования. 1. Приготовление реагентов Стабильность после разведения _________________________________________________________________________________ Промывочный раствор 2 недели +2+25С в закрытом контейнере Перенести 100 мл из Промывочного Концентрата в чистый флакон и растворить добавляя 2400 мл дистиллированной воды для приготовления готового буферного раствора рН=7.8 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Анти-ТТГ-Eu метка Приготовить и использовать в течение 1 часа Приготовьте необходимый объем метки посредством смешивания 20 мкл концентрата метки с 3 мл Нео-ТТГ инкубационного буфера на один стрип (см. таблицу). Важно, чтобы раствор метки готовился раздельно и чтобы Нео ТТГ буфер не контактировал с раствором метки до использования в работе. Мы советуем использовать одноразовый пластиковый флакон для приготовления рабочих растворов метки и антисыворотки.
--- стр. 8 ---
_________________________________________________________________________________ 2. Перенести необходимое количество микротитровальных стрипов в рамку- держатель для стрипов (вернуть оставшиеся стрипы в пластиковую коробку и закрыть). 3. Выбить из бланков крови в дубле фильтровальные диски: стандарты, контроли и тестируемые образцы. Используются либо автоматический либо ручной панчер. Выбивание дисков происходит по следующей схеме. Диаметр диска составляет около 3 мм. Только один диск добавляется в каждую лунку. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. А А В В С С Д Д Е Е Ф Ф -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 1-й 1-й 2-й 2-й 3-й 3-й Кон.1 Кон.1Кон.2 Кон.2 Обр.1 Обр.2 и т.д. 4. Добавляется по 200 мкл разведенной антисыворотки в каждую лунку используя Эппендорф микропипетку или ДЕЛФИЯ диспенсер юнит. Избегайте касания поверхности лунок. 5. Инкубирование 10 минут в режиме “быстро”(FAST), используя ДЕЛФИЯ плейт шейкер и затем в течение 4 часов при медленном перемешивании. Возможно также и инкубация в течение ночи в холодильнике (+2- +8С) без шейкирования. Проверьте правильность температурного режима в холодильнике. Быстрое перемешивание необходимо, чтобы обеспечить полную экстракцию компонентов крови из фильтровальных дисков. Планшет следует поместить в холодильник сразу же после шейкирования. 6. После инкубации удалите раствор и фильтровальные диски, используя ДЕЛФИЯ диск ремувер или с помощью пастеровской пипетки, соединенной с вакуумным насосом. 7. Аспирируйте и промыть каждый стрип с помощью ДЕЛФИЯ плейт вошера, используя программу №12(промывка). 8. Добавить 200 мкл Усиливающего раствора прямо из реагентного флакона в каждую лунку, используя рекомендуемую ЭППЕНДОРФ мультипипетку, после заполнения Комбинаконечника раствором Усиливающего раствора или используя ДЕЛФИЯ плейт диспенсер. Избегайте касания носиком пипетки лунки или ее содержимого. 9. Встряхивайте в режиме “медленно”(slowly) 5 минут. Сигнал флюоресценции стабилен в течение нескольких часов, если нет сильного испарения жидкости. Однако, мы рекомендуем измерять в течение 1 часа, чтобы внешние факторы не оказали влияния на уровень сигнала, хотя это достаточно редкий фактор. 10. Флюоресценция измеряется на флюорометре с временным разрешением. Выберите номер программы 12 для автоматического измерения и подсчета результатов. Сверьте параметры группы для программы №12 и если необходимо произведите коррекцию в соответствии со следующим (см. описание к флюрометру для проведения редакции параметров считывания): КИТ НОМЕР 12 НЕО-ТТГ ASSAY TYPE IFMA тип определения ИФМА FITTING METHOD SPLINE SMOOTHED метод обработки метод “сглаживания”
--- стр. 9 ---
X-AXIS LOGARITHMIC х-ось логарифмическая Y-AXIS MEAS у-ось линейная BLANKS 0 бланки 0 STANDARDS 6 стандарты 6 STANDARD REPLICATES 2 Убедитесь, чтобы концентрация стандарты в дупликате 2 стандартов, указанная на пакете STANDARD CONC А совпадала с задаваемой. Если не стандарты конц. А совпадает, введите новые. STANDARD CONC В стандарты конц. В STANDARD CONC С стандарты конц. С STANDARD CONC D стандарты конц. Д STANDARD CONC Е стандарты конц. Е STANDARD CONC F стандарты конц. Ф UNKNOWN REPLICATES 1 неизвестные образцы в дубле 1 ОСОБЕННОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ: 1. Отношение к этому набору как к целому необходимо для успешного использования ДЕЛЬФИЯ наборов. Реагенты в этом наборе являются комплексными компонентами. Не смешивайте идентичные реагенты из различных лотов. Не используйте реагенты после срока годности, указанной на флаконе. 2. Реагенты должны быть доведены до комнатной температуры (+20+25С) до приготовления различных растворов. Замороженные образцы должны быть нагреты до комнатной температуры при медленном и осторожном перемешивании. Не используйте вортекс или смешанные образцы пациентов. 3. При промывке стрипов следите, чтобы все стрипы были заполнены полностью и одинаково до верхнего уровня как показано на картинке. После промывки стрипов, проверьте, что стрипы сухие. Если что-либо осталось в лунках, то необходимо перевернуть планшету и встряхнуть на фильтровальную бумагу. Аспирирующее/промывочное оборудование не должно находиться заполненным с промывочным раствором длительный период времени, поскольку промывочные иглы могут быть закупорены и трудно проходимы для жидкости. В конце рабочего дня аспирировать дистиллированную воду в аспирирующую/промывочную систему. Промывочное устройство должно быть регулярно промываться раствором NaCL (30г/Л), а затем дистиллированной водой и 50% этанолом и в конце промыто дистиллированной водой. 4. Для избежания примеси европия и как результат высокого флюресцентного фона высокие требования предъявляются к процедуре раскапывания и промывки. Поэтому необычайно важно использовать рекомендуемые и поставляемые вместе с ДЕЛФИЯ пипетки. Усиливающий раствор должен быть раскапан только с использованием рекомендуемой ЭППЕНДОРФ мультипипеткой, и при этом первый объем сбрасывается для полного заполнения. Тот же тип Комбинаконечника не может быть использован для раскапывания любого другого реагента. После работы ЭППЕНДОРФ мультипипетка помещается на штатив с наконечником. При использовании ДЕЛФИЯ плейт диспенсера и ДЕЛФИЯ диспенсера юнита ознакомьтесь с описанием.
--- стр. 14 ---
Каждый АВТОДЕЛФИЯ НЕОНАТАЛ ТТГ набор содержит реагентов необходимых для 1152 определений. Срок годности набора указан на внешней стороне коробки. Хранение при +2+8 С. При однократном открытии или разведении компонентов набора, они должны быть использованы в течение 2 недель. РЕАГЕНТЫ: Компоненты Количество Срок годности и хранение _________________________________________________________________________________ Стандарты ТТГ 1 лист фильтр.бумаги +2+8С до окончания срока (приблизит.величины) (Шляйхер & Шуль №2992) годности указанного на содержащая 5 различных пластик. пакете концентраций ТТГ А 1 мкЕд/мл В 10 мкЕд/мл С 25 мкЕд/мл D 50 мкЕд/мл Е 100 мкЕд/мл F 250 мкЕд/мл Контроли (прибл. концентрации) I 15 мкЕд/мл 1 лист фильтровальной бумаги +2, +8 до окончания срока II 60 мкЕд/мл (Шляйхер и Шуль, №2992), со- годности указанного на держащая по 5 высушенных пятен упаковке. Убедитесь, что крови этих концентраций пластиковый конверт влажен при вскрытии. Точна концентрация ТТГ указана на пакете, прилагаемому к каждому набору. Стандарты и контроли приготовлены из цельной человеческой крови при гематокрите в 50-55% и калиброваны по стандарту ВОЗ (80/558) для определения человеческого ТТГ. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Анти-ТТГ-Eu метка 1 флакон, 1.5мл. +2+8С до окончания срока концентрированный годности указанной на флаконе раствор (-20мкг/мл) (мышиные, моноклональные) Метка растворена в ТРИС-HCL буфере (рН=7.8) солевом растворе с БСА, мышиными IgG и азидом натрия в качестве консерванта. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Концентрат промывочного 1 флакон 250мл +2+8С до окончания срока буфера годности указанной на флаконе Концентрированный раствор ТРИС-HCL буфера (рН=7.8) солевом растворе с консервантами Твин 20 и Гермалл II. Разводится в 25 раз. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Нео ТТГ инкубац. буфер 1 флакон 250мл +2+8С до окончания срока годности указанной на флаконе
--- стр. 15 ---
Готовый для использования ТРИС-HCL буфер (рН=7.8) солевой раствор с БСА, бычьим глобулином, Твин 40, полиэтиленгликолем 6000, с инертным красным красителем и азидом натрия как консервантом. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- УСИЛИВАЮЩИЙ реагент 1 флакон 250мл +2+8С до окончания срока годности указанной на флаконе (+20+25С, см. на флаконе) Избегать попадания прямых солнечных лучей Готовый для использования с Тритон Х-100, уксусной кислотой и хелаторами. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Анти-ТТГ микротитровальные 10 планшет +2+8 до окончания срока стрипы. годности указанной на 12х8х12 лунок покрытых антителами планшете. против бетта субъединицы Убедитесь, что пластиковый молекулы ТТГ тампон влажный _________________________________________________________________________________ Для каждой партии Сертификаты контроля качества 1 лист МАТЕРИАЛЫ НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ С НАБОРОМ: АВТОДЕЛФИЯ НЕОНАТАЛ ТТГ набор является частью комплексной системы иммунодиагностических реагентов и оборудования. АВТОДЕЛФИЯ система требует следующие компоненты, которые могут быть поставлены или от WALLAC OY или от его дистрибьютеров: 1. Флюорометр с временным разрешением плюс принтер и внешний компьютер. 2. Автоматический вошер - АВТОДЕЛФИЯ плейтвошер (Кат.№1296-024 или1296-026) 3. Автоматический шейкер-АВТОДЕЛФИЯ плейтшейкер(Кат.№1296-001или1296-003) 4. Автоматический панчер АВТОДЕЛФИЯ ПЛЕЙТ ПАНЧЕР (1296-031) или ВАЛЛАК ДБС ПАНЧЕР (1296-071) или ручной панчер для выбивки бумажных дисков с диаметром около 3 мм. 5. Пипетка для разливки АВТОДЕЛФИЯ буфера и метки - ЭППЕНДОРФ МУЛЬТИПИПЕТКА (1296-014) с 5 мл Комби наконечниками (1296-016) или в качестве альтернативы АВТОДЕЛФИЯ плейт диспенсер с АВТОДЕЛФИЯ диспенсер юнит (1296-041 или 1296-043). 6. Пипетка для разливки Усиливающего раствора - ЭППЕНДОРФ мультипипетка (1296-014) с 5 мл Комби наконечниками (1296-016) или альтернативно АВТОДЕЛФИЯ плейт диспенсер (1296-041). 7. АВТОДЕЛФИЯ ДИСК РЕМУВЕР (1296-061) для автоматического удаления жидкости и бумажных пятен из микротитровальных лунок. В дополнении к АВТОДЕЛФИЯ системе необходимо следующее: - дозирующая пипетка для разливки микролитровых объемов - пипетки для разливки миллитровых объемов НЭ буфера требуемого для приготовления раствора метки и антител - дистиллированная вода - бланки для взятия крови новорожденных Шляйхер & Шулль №2992 СБОР ОБРАЗЦОВ И ХРАНЕНИЕ: АВТОДЕЛФИЯ НЕОНАТАЛ ТТГ кит используется для образцов крови, полученных у новорожденных после прокола пятки и сбора крови на фильтровальный бланк. Не оказывает
--- стр. 16 ---
влияние на результаты желтуха (билирубин < 20 мг/дл) или присутствие жира (триглицериды < 5000 мг/л). Кровь собирается на 2-6 день после родов. Пятно крови покрывает отмеченный круг на фильтровальном бланке при однократном прикладывании к месту прокола пятки. Убедитесь. что образец полученной крови полностью заполняет круг. Полученный образец крови высушивается на воздухе в горизонтальном положении в течении минимум 3 часов при комнатной температуре при избегании попадания прямых солнечных лучей. Метод работы с кровью на фильтровальных бланках требует определенных навыков по взятию крови, хранению и транспортировке образцов. Мы рекомендуем использовать фильтровальную бумагу Шляйхер и Шуль (№2992) как для сбора крови, так и быть в качестве основы для 0-кровяных пятен. Образцы крови с ЭДТА или цитратом натрия не могут быть применены из-за хелатирующего эффекта на европий. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ: Для диагностики ин витро. Набор следует использовать только соответственно подготовленным персоналом. Набор содержит реагенты произведенные из компонентов человеческой крови. Источник протестирован на на наличие поверхностного антигена к гепатиту В, анти-гепатиту С, и анти-ВИЧ I и II. Тем не менее все рекомендации по мерам предосторожности при работе с производными крови должны быть соблюдены. Можно считать все образцы крови пациентов как потенциально инфицированные. Реагенты содержат азид натрия в качестве консерванта. Азид натрия может взаимодействовать с металлическими поверхностями с образованием азидов металлов. Для предотвращения образования азидов металлов необходимо промыть большим количеством воды. Лиофиллизированные стандарты Нео-ТТГ содержат азид натрия в качестве консерванта. Порошок опасен при ингаляции и попадании на кожу. Для дезинфекции всех сливных реагентов пользуйтесь правилами местных контролирующих организаций. ПРОТОКОЛ ОПРЕДЕЛЕНИЯ: Выполните каждое определение в дубликате как для стандартов, контролей, так и для тестируемых образцов. Стандартная кривая должна быть использована для каждого определения. Образцы и реагенты должны быть доведены до комнатной температуры (+20+25С) до использования. 1. Приготовление реагентов Стабильность после разведения _________________________________________________________________________________ Промывочный раствор 2 недели +2+25С в закрытом контейнере Перенести 100 мл из Промывочного Концентрата в чистый флакон и растворить добавляя 2400 мл дистиллированной воды для приготовления готового буферного раствора рН=7.8 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Анти-ТТГ-Eu метка Приготовить и использовать в течение 1 часа Приготовьте необходимый объем метки посредством смешивания 20 мкл концентрата метки с 3 мл Нео-ТТГ инкубационного буфера на один стрип (см. таблицу). Важно, чтобы раствор метки готовился раздельно и чтобы Нео ТТГ буфер не контактировал с раствором метки до использования в работе.
--- стр. 17 ---
Мы советуем использовать одноразовый пластиковый флакон для приготовления рабочих растворов метки и антисыворотки. _________________________________________________________________________________ 2. Перенести необходимое количество микротитровальных стрипов в рамку- держатель для стрипов (вернуть оставшиеся стрипы в пластиковую коробку и закрыть). 3. Выбить из бланков крови в дубле фильтровальные диски: стандарты, контроли и тестируемые образцы. Используются либо автоматический либо ручной панчер. Выбивание дисков происходит по следующей схеме. Диаметр диска составляет около 3 мм. Только один диск добавляется в каждую лунку. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. А А В В С С Д Д Е Е Ф Ф -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 1-й 1-й 2-й 2-й 3-й 3-й Кон.1 Кон.1Кон.2 Кон.2 Обр.1 Обр.2 и т.д. 4. Добавляется по 200 мкл разведенной антисыворотки в каждую лунку используя Эппендорф микропипетку или АВТОДЕЛФИЯ диспенсер юнит. Избегайте касания поверхности лунок. 5. Инкубирование 10 минут в режиме “быстро”(FAST), используя АВТОДЕЛФИЯ плейт шейкер и затем в течение 4 часов при медленном перемешивании. Возможно также и инкубация в течение ночи в холодильнике (+2- +8С) без шейкирования. Проверьте правильность температурного режима в холодильнике. Быстрое перемешивание необходимо, чтобы обеспечить полную экстракцию компонентов крови из фильтровальных дисков. Планшет следует поместить в холодильник сразу же после шейкирования. 6. После инкубации удалите раствор и фильтровальные диски, используя АВТОДЕЛФИЯ диск ремувер или с помощью пастеровской пипетки, соединенной с вакуумным насосом. 7. Аспирируйте и промыть каждый стрип с помощью АВТОДЕЛФИЯ плейт вошера, используя программу №12(промывка). 8. Добавить 200 мкл Усиливающего растовра прямо из реагентного флакона в каждую лунку, используя рекомендуемую ЭППЕНДОРФ мультипипетку, после заполнения Комбинаконечника раствором Усиливающего раствора или используя АВТОДЕЛФИЯ плейт диспенсер. Избегайте касания носиком пипетки лунки или ее содержимого. 9. Встряхивайте в режиме “медленно”(slowly) 5 минут. Сигнал флюоресценции стабилен в течение нескольких часов, если нет сильного испарения жидкости. Однако, мы рекомендуем измерять в течение 1 часа, чтобы внешние факторы не оказали влияния на уровень сигнала, хотя это достаточно редкий фактор. 10. Флюоресценция измеряется на флюорометре с временным разрешением. Выберите номер программы 12 для автоматического измерения и подсчета результатов. Сверьте параметры группы для программы №12 и если необходимо произведите коррекцию в соответствии со следующим (см. описание к флюрометру для проведения редакции параметров считывания): КИТ НОМЕР 12 НЕО-ТТГ ASSAY TYPE IFMA
--- стр. 18 ---
тип определения ИФМА FITTING METHOD SPLINE SMOOTHED метод обработки метод “сглаживания” X-AXIS LOGARITHMIC х-ось логарифмическая Y-AXIS MEAS у-ось линейная BLANKS 0 бланки 0 STANDARDS 6 стандарты 6 STANDARD REPLICATES 2 Убедитесь, чтобы концентрация стандарты в дупликате 2 стандартов, указанная на пакете STANDARD CONC А совпадала с задаваемой. Если не стандарты конц. А совпадает, введите новые. STANDARD CONC В стандарты конц. В STANDARD CONC С стандарты конц. С STANDARD CONC D стандарты конц. Д STANDARD CONC Е стандарты конц. Е STANDARD CONC F стандарты конц. Ф UNKNOWN REPLICATES 1 неизвестные образцы в дубле 1 ОСОБЕННОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ: 1. Отношение к этому набору как к целому необходимо для успешного использования ДЕЛЬФИЯ наборов. Реагенты в этом наборе являются комплексными компонентами. Не смешивайте идентичные реагенты из различных лотов. Не используйте реагенты после срока годности, указанной на флаконе. 2. Реагенты должны быть доведены до комнатной температуры (+20+25С) до приготовления различных растворов. Замороженные образцы должны быть нагреты до комнатной температуры при медленном и осторожном перемешивании. Не используйте вортекс или смешанные образцы пациентов. 3. При промывке стрипов следите, чтобы все стрипы были заполнены полностью и одинаково до верхнего уровня как показано на картинке. После промывки стрипов, проверьте, что стрипы сухие. Если что-либо осталось в лунках, то необходимо перевернуть планшету и встряхнуть на фильтровальную бумагу. Аспирирующее/промывочное оборудование не должно находиться заполненным с промывочным раствором длительный период времени, поскольку промывочные иглы могут быть закупорены и трудно проходимы для жидкости. В конце рабочего дня аспирировать дистиллированную воду в аспирирующую/промывочную систему. Промывочное устройство должно быть регулярно промываться раствором NaCL (30г/Л), а затем дистиллированной водой и 50% этанолом и в конце промыто дистиллированной водой. 4. Для избежания примеси европия и как результат высокого флюресцентного фона высокие требования предъявляются к процедуре раскапывания и промывки. Поэтому необычайно важно использовать рекомендуемые и поставляемые вместе с АВТОДЕЛФИЯ пипетки. Усиливающий раствор должен быть раскапан только с использованием рекомендуемой ЭППЕНДОРФ мультипипеткой, и при этом первый объем сбрасывается для полного заполнения. Тот же тип Комбинаконечника не может быть использован для раскапывания любого другого реагента. После работы ЭППЕНДОРФ мультипипетка помещается на штатив с наконечником.
--- стр. 24 ---
Анти-ИРТ-Eu метка 3 флакона, 2.8мл. +2+8С до окончания срока концентрированный годности указанной на флаконе раствор (-50мкг/мл) (мышиные, моноклональные) Метка растворена в ТРИС-HCL буфере (рН=7.8) солевом растворе с БСА, мышиными IgG и азидом натрия в качестве консерванта. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Концентрат промывочного 1 флакон 250мл +2+8С до окончания срока буфера годности указанной на флаконе Концентрированный раствор ТРИС-HCL буфера (рН=7.8) солевом растворе с консервантами Твин 20 и Гермалл II. Разводится в 25 раз. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Нео ИРТ инкубац. Буфер 1 флакон 250мл +2+8С до окончания срока годности указанной на флаконе Готовый для использования ТРИС-HCL буфер (рН=7.8) солевой раствор с БСА, бычьим глобулином, Твин 40, полиэтиленгликолем 6000, с инертным красным красителем и азидом натрия как консервантом. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- УСИЛИВАЮЩИЙ реагент 1 флакон 250мл +2+8С до окончания срока годности указанной на флаконе (+20+25С, см. на флаконе) Избегать попадания прямых солнечных лучей Готовый для использования с Тритон Х-100, уксусной кислотой и хелаторами. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Анти-ИРТ микротитровальные 10 планшет +2+8 до окончания срока стрипы. годности указанной на 8х12 лунок покрытых антителами планшете. против специфических сайтов Убедитесь, что пластиковый на молекуле ИРТ тампон влажный (мышиные моноклональные) ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Специфические для каждого лота Сертификаты контроля качества 1 лист _________________________________________________________________________________ МАТЕРИАЛЫ НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ С НАБОРОМ: ДЕЛЬФИЯ ИРТ набор является частью комплексной системы иммунодиагностических реагентов и оборудования. ДЕЛЬФИЯ система требует следующие компоненты, которые могут быть поставлены или от PerkinElmer/Wallac Oy или от его дистрибьютеров: 1. Флюорометр с временным разрешением плюс принтер и внешний компьютер. 2. Автоматический вошер - ДЕЛЬФИЯ плейтвошер (Кат.№1296-026) 3. Автоматический шейкер-ДЕЛЬФИЯ плейтшейкер(Кат.№1296-003)
--- стр. 25 ---
4. Автоматический панчер ВАЛЛАК ДБС ПАНЧЕР (1296-071) или ручной панчер для выбивки бумажных дисков с диаметром около 3 мм. 5. Пипетка для разливки ДЕЛЬФИЯ буфера и метки - ЭППЕНДОРФ МУЛЬТИПИПЕТКА (1296-014) с 5 мл Комби наконечниками (1296-016) или в качестве альтернативы ДЕЛЬФИЯ плейт диспенсер с ДЕЛЬФИЯ диспенсер юнит (1296-041 или 1296-043). 6. Пипетка для разливки Усиливающего раствора - ЭППЕНДОРФ мультипипетка (1296-014) с 5 мл Комби наконечниками (1296-016) или альтернативно ДЕЛЬФИЯ плейт диспенсер (1296-041). 7. ДЕЛЬФИЯ ДИСК РЕМУВЕР (1296-061) для автоматического удаления жидкости и бумажных пятен из микротитровальных лунок. В дополнении к ДЕЛЬФИЯ системе необходимо следующее: - дозирующая пипетка для разливки микролитровых объемов - пипетки для разливки миллитровых объемов НЭ буфера требуемого для приготовления раствора метки и антител - дистиллированная вода СБОР ОБРАЗЦОВ И ХРАНЕНИЕ: Образцы крови следует забирать сразу же после прокола пятки на фильтровальный бланк. Липемические (триглицериды менее 5000 мг/л) и иктеричные (билирубин менее 30 мг/дл) образцы крови не оказывают влияния на результаты. Не используйте кровь собранную с ЭДТА или с цитратом натрия в качестве антикоагулянтных средств, поскольку эти агенты воздействуют на хелаты европиевой метки. Скрининговые программы различаются в зависимости от того какой тип образца используется. Кровь при проколе пятки обычно берется на 2-6 дни жизни и эта схема также годится и для Нео-ИРТ. Мы рекомендуем использовать фильтровальную бумагу производимую компанией Шляйхер/Шуль (№903) для сбора образцов крови и бумага должна быть та же самая как и для пятен стандартов. Метод основанный на образцах представленных на бланках предъявляет определенные требования к сбору образцов крови, хранению и транспортировке. Сбор образцов описан детально( NCCLS) в документе комитета по взятию крови LA4-A3: - протрите кожу спиртом и высушите - проколоть иглой для прокола кожи ребенка ланцетом или автоматическим ланцетом на глубину примерно 2.0 мм. Прокол глубже чем на 2.0 мм у маленьких плодов может вызвать повреждение кости - удалите первую каплю крови. Нежно промокнуть на фильтровальную бумагу большую каплю крови, позволяя ей промокнуть насквозь, полностью заполняя отмеченный кружок на фильтровальном бланке. Проверьте с другой стороны бланка, что кровь пропиталась насквозь. Не накрывайте полученное пятно крови. - Высушите пятна крови на воздухе в горизонтальной позиции по меньшей мере 3 часа при комнатной температуре, избегайте попадания прямых солнечных лучей. - Проверьте заполненность всех граф нужной информацией, включая имя, адрес, номер пациента, пол; название и адрес госпиталя; имя, адрес, телефон врача производящий заполнение граф. Укажите время и дату родов, а также дату и время забора крови. Укажите был ли ребенок доношенным и если да – то степень недоношенности. Укажите вес новорожденного, многоплодный или нет. - Поместите каждый образец в свой отдельный бумажный конверт и транспортируйте или перешлите его в лабораторию в течение 24 часов после взятия. Образцы хранимые при комнатной температуре показывают снижение уровня Нео-ИРТ на 6-9% за каждую неделю. Для более длительного хранения образцы помещаются в пластиковые пакеты и замораживаются. Известно о сезонных колебаниях уровня Нео-ИРТ. Причина вероятно вызвана сезонной нестабильностью ИРТ во время транспортировки и хранения. Считается, что необходимо учитывать такую сезонность изменяя пороговую концентрацию в зависимости от времени года. Пороговая концентрация может быть недостаточна для предотвращения ложно-положительных случаев летом, хотя это может также способствовать увеличению количества
--- стр. 26 ---
ложно-положительных случаев при скрининге зимой. Использование правильной транспортировки и измерение ИРТ сразу же после сбора позволяет минимизировать все эти отклонения. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ: Для диагностики ин витро. Используется в работе персоналом после предварительного обучения. Набор содержит реагенты произведенные из компонентов человеческой крови. Источник протестирован на на наличие поверхностного антигена к гепатиту В, анти-гепатиту С, и анти-ВИЧ I и II. Тем не менее все рекомендации по мерам предосторожности при работе с производными крови должны быть соблюдены. Можно считать все образцы крови пациентов как потенциально инфицированные. Реагенты содержат азид натрия в качестве консерванта. Азид натрия может взаимодействовать с металлическими поверхностями с образованием азидов металлов. Для предотвращения образования азидов металлов необходимо промыть большим количеством воды. Лиофиллизированные стандарты ИРТ содержат азид натрия в качестве консерванта. Порошок опасен при ингаляции и попадании на кожу. Для дезинфекции всех сливных реагентов пользуйтесь правилами местных контролирующих организаций. ПРОТОКОЛ ОПРЕДЕЛЕНИЯ: Выполните каждое определение в дубле для стандартов и контролей. Стандартная кривая должна быть использована для каждого определения. Тестируемые образцы определяются по одному. Образцы и реагенты должны быть доведены до комнатной температуры (+20+25С) до использования. 1. Приготовление реагентов Стабильность после разведения _________________________________________________________________________________ Промывочный раствор 2 недели +2+25С в закрытом контейнере Перенести 100 мл из Промывочного Концентрата в чистый флакон и растворить добавляя 2400 мл дистиллированной воды для приготовления готового буферного раствора рН=7.8 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Анти-ИРТ-Eu метка Приготовить и использовать в течение 1 часа Приготовьте необходимый объем метки посредством смешивания 60 мкл концентрата метки с 3 мл Нео-ИРТ инкубационного буфера на один стрип (см. таблицу). Важно, чтобы растворы антисыворотки и метки готовились раздельно и чтобы Нео ИРТ буфер не контактировал с раствором метки до использования в работе. Мы советуем использовать одноразовый пластиковый флакон для приготовления рабочих растворов метки и антисыворотки. _________________________________________________________________________________ 2. Перенести необходимое количество микротитровальных стрипов в рамку- держатель для стрипов (вернуть оставшиеся стрипы в пластиковую коробку и закрыть). _________________________________________________________________________________
--- стр. 27 ---
3. Выбить в дубле фильтровальные диски, используя автоматические или ручные панчеры в лунки плашки, согласно таблице Диаметр диска должен быть около 3.2 мм. Только один диск добавляется в каждую лунку. _________________________________________________________________________________ 4. Раскапывайте сразу же по 200 мкл растворенной анти-ИРТ метки в каждую лунку, используя рекомендованную Эппендорф Мультипипетку или ДЕЛЬФИЯ диспенсер юнит. Избегайте выплескивания из лунки раскапываемой жидкости, не касайтесь поверхности лунки или поверхности жидкости. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. А А В В С С Д Д Е Е Ф Ф ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 1-й 1-й 2-й 2-й 3-й 3-й 4-й 5-й 6-й Кон.I Кон.I Кон.II Кон.II Кон.III Кон.III Обр. Обр. Обр. Обр. Обр. Обр. и т.д. 5. Инкубирование 10 минут в режиме “быстро”(FAST), используя ДЕЛЬФИЯ плейт шейкер. Накрыть планшет пленкой и инкубировать 16-24 часа в холодильнике (+2-+8С) без шейкирования. Проверьте правильность температурного режима в холодильнике. Быстрое перемешивание необходимо, чтобы обеспечить полную экстракцию компонентов крови из фильтровальных дисков. Планшет следует поместить на холод сразу же после шейкирования. 6. После инкубации удалите раствор и фильтровальные диски, используя ДЕЛЬФИЯ диск ремувер или с помощью пастеровской пипетки, соединенной с вакуумным насосом. Не позволяйте планшету долго находиться при комнатной температуре и сразу же после холодильника удалите диски. 7. Аспирируйте и промойте каждый стрип с помощью ДЕЛЬФИЯ плейт вошера, используя программу №34 (промывка). 8. Добавить 200 мкл Усиливающего раствора прямо из реагентного флакона в каждую лунку, используя рекомендуемую ЭППЕНДОРФ мультипипетку, после заполнения Комбинаконечника раствором Усиливающего раствора или используя ДЕЛЬФИЯ плейт диспенсер. Избегайте касания носиком пипетки лунки или ее содержимого. 9. Встряхивайте в режиме “медленно”(slowly) 5 минут. Сигнал флюоресценции стабилен в течение нескольких часов, если нет сильного испарения жидкости. Однако, мы рекомендуем измерять в течение 1 часа, чтобы внешние факторы не оказали влияния на уровень сигнала, хотя это достаточно редкий фактор. 10. Вставьте каждый стрип в рамку-держатель и измеряйте флюоресценцию на флюорометре с временным разрешением. Когда используется модель флюорометра 1232 или 1234 выбирается номер программы 34 для автоматического измерения и подсчета результатов и протокол в Мультикалке «34 NIRT» Когда используется ВИКТОР Д старт измерения начинается со Start Wizard, затем выбирается программа NIRT из протоколов/китов в панели «Neonatal Europe» и определяется количество плашек и образцов.
--- стр. 28 ---
Сверьте параметры группы для программы №34 и если необходимо произведите коррекцию в соответствии со следующим (см. описание к флюрометру для проведения редактирования параметров считывания): КИТ НОМЕР 34 НЕО-ИРТ ASSAY TYPE IFMA тип определения ИФМА FITTING METHOD SPLINE SMOOTHED метод обработки метод “сглаживания” X-AXIS LOGARITHMIC х-ось логарифмическая Y-AXIS LOG у-ось логарифмическая BLANKS 2(А) бланки 2(А) STANDARDS 5 стандарты 5 STANDARD REPLICATES 2 Убедитесь, чтобы концентрация стандарты в дупликате 2 стандартов, указанная на флаконах STANDARD CONC А совпадала с задаваемой. Если не стандарты конц. А совпадает, введите новые. STANDARD CONC В стандарты конц. В STANDARD CONC С стандарты конц. С STANDARD CONC D стандарты конц. Д STANDARD CONC Е стандарты конц. Е STANDARD CONC F стандарты конц. Ф UNKNOWN REPLICATES 1 неизвестные образцы в дубле 1 ОСОБЕННОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ: 1. Отношение к этому набору как к целому необходимо для успешного использования ДЕЛЬФИЯ наборов. Реагенты в этом наборе являются комплексными компонентами. Не смешивайте идентичные реагенты из различных лотов. Не используйте реагенты после срока годности, указанной на флаконе. 2. Реагенты должны быть доведены до комнатной температуры (+20+25С) до приготовления различных растворов. Замороженные образцы должны быть нагреты до комнатной температуры при медленном и осторожном перемешивании. Не используйте вортекс или смешанные образцы пациентов. 3. При промывке стрипов следите, чтобы все стрипы были заполнены полностью и одинаково до верхнего уровня как показано на картинке. После промывки стрипов, проверьте, что стрипы сухие. Если что-либо осталось в лунках, то необходимо перевернуть планшету и встряхнуть на фильтровальную бумагу. Аспирирующее/промывочное оборудование не должно находиться заполненным с промывочным раствором длительный период времени, поскольку промывочные иглы могут быть закупорены и трудно проходимы для жидкости. В конце рабочего дня аспирировать дистиллированную воду в аспирирующую/промывочную систему. Промывочное устройство должно быть регулярно промываться раствором NaCL (30г/Л), а затем дистиллированной водой и 50% этанолом и в конце промыто дистиллированной водой.
--- стр. 29 ---
4. Для избежания примеси европия и как результат высокого флюресцентного фона высокие требования предъявляются к процедуре раскапывания и промывки. Поэтому необычайно важно использовать рекомендуемые и поставляемые вместе с ДЕЛЬФИЯ пипетки. Усиливающий раствор должен быть раскапан только с использованием рекомендуемой ЭППЕНДОРФ мультипипеткой, и при этом первый объем сбрасывается для полного заполнения. Тот же тип Комбинаконечника не может быть использован для раскапывания любого другого реагента. После работы ЭППЕНДОРФ мультипипетка помещается на штатив с наконечником. При использовании ДЕЛЬФИЯ плейт диспенсера и ДЕЛЬФИЯ диспенсера юнита ознакомьтесь с описанием. ПОДСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ: ДЕЛЬФИЯ система включает программу для обработки результатов и получения данных в виде стандартной кривой, концентрации неизвестных пациентов и т.д. (для детали см. описание к флюорометру или к программе Мультикалк). КАЛИБРОВКА: Полная стандартная кривая для каждого определения ставится для каждой плашки. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА: Контрольные образцы следует использовать для подтверждения стабильности ежедневных определений. Контроли определяются также как и неизвестные образцы. Контроли двух различных уровней используются и включены в наборы. Эти контроли следует ставить в каждом определении, если количество определений более чем одна планшета, то и в каждой плашке. Каждой лаборатории следует установить свой собственный концентрационный диапазон. Полученная средняя величина определяемого контроля должна укладываться в диапазон +20% от величин указанных в сертификате контроля качества. Рекомендуется также использовать свои собственные контроли для каждой лаборатории в добавлении к контролям включенным в набор. Тестируемые образцы дают истинную концентрацию, если контрольные значения в пределах установленных норм. Мы также рекомендуем участие лабораторий во внешнем контроле качества. ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ: Как и для любых других скрининговых тестов ин витро, результаты получаемые с помощью ДЕЛЬФИЯ Нео-ИРТ могут быть использованы только для медицинских процедур и данные интерпретируются только совместно с клиническими исследованиями. Случаи при которых возможно получение аномальных результатов: - пятна не полностью пропитаны кровью - пятна выбиты панчером в месте, где имеет место плохая пропитка - плохо высушены пятна - нет элюции образца в буферный раствор, что вызвано либо нагреванием, либо свертыванием. - Примеси в пятне крови фекалий и др. Образцы на фильтровальных бланках не должны содержать ЭДТА, вследствие его воздействия на хелатирующий эффект европия. ОЖИДАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ : Измерение ИРТ в пятнах сухой крови используется для идентификации популяции новорожденных , имеющих высокий риск КФ. Идентификация основана на использовании величины пороговой концентрации или персентилей, которые позволяют максимально различать между больными и здоровыми новорожденными при максимуме чувствительности и специфичности. Имеется несколько различных протоколов скрининга с использованием Нео-ИРТ для выявления КФ. Наиболее часто используется двух стадийный протокол определения ИРТ/ДНК. На
--- стр. 30 ---
первой стадии измеряется ИРТ в массовом рутинном определении. Затем у тех образцов где уровень ИРТ превышает пороговый проводится ДНК исследование. Пороговая концентрация варьирует в зависимости от количества ложно-положительных случаев. Другой протокол использует при повторном определении повторное измерение ИРТ с последующей оценкой результатов потовой пробы. В обоих случаях те плоды которые идентифицированы как группа риска должны быть подтверждены генетически и клинически. Там, где частота мутации локуса F 508 низка используется вторая скрининговая технология. Данные представленные ниже были получены при использовании старой версии кита, Кат.№ 1244-034. Кит был использован в четырех лабораториях для измерения концентрации ИРТ для массового скрининга кистозного фиброза. Скрининиговые подходы в различных лабораториях суммированы ниже: __________________________________________________________________________________ Параметр Лаб.№1 Лаб.№2 Лаб.№3 Лаб.№4 Метод Скрининга ДЕЛФИЯ НЕО-ИРТ ДЕЛФИЯ НЕО-ИРТ ДЕЛФИЯ НЕО-ИРТ ДЕЛФИЯ НЕО-ИРТ Пороговая (<21дня) после (<21 дня) после Концентрация 90 нг/мл 7 мес. 100 нг/мл исследования (>21 дня) снижается (>21 дня) снижается 70 нг/мл на 5% в день 80 нг/мл на 4% день Повторное Повторы в Повторно тест на Повторы в F508 ДНК тестирование дубле. Если ИРТ и F508 и 15 дубле. Если (1-й образец) среднее из других мутаций среднее из трех результатов трех результатов выше порогового выше порогового требуется повторная требуется повторная проба на ИРТ проба на ИРТ Повторное ИРТ нет ИРТ нет Тестирование (2-й образец) Требования Если повторная ИРТ> 124 нг/мл и Если повторная ИРТ>170нг/мл для проведения проба положительна нет аллелей муко- проба положи- и нет F508 ал- потовой пробы висцидоза тельная лели и если ИРТ>5% от порогового ИРТ>5% и и имеется хотя бы есть хотя бы одна аллель одна 1 аллель Расы: Белые 91% 86.3% 87.7% 86.4% Испанцы 22.2% 9.6% 2.8% 4.6% Черные 4.6% 9.1% 0.3% 9.6% Америк. 1.1% 0.2% 11.0% 1.3% Индейцы Азиаты 2.8% 4.4% 1.0% 2.8% Феномен транзиентной (не КФ) неонатальной гипертрипсинемиии, имеющей место по преимуществу в первые несколько дней жизни, главная причина ложно положительных результатов. Ложно-положительные результаты имеют место у детей с низким АПГАР и у плодов Афро-Американского происхождения. Использование второго тестирования либо ДНК, либо ИРТ во втором образце снижает количество ложно-положительных результатов. Здоровые носители КФ также могут иметь ложно-положительные результаты в частоте в три раза выше, чем в общей популляции. Ложно-отрицательные результаты как известно имеют место у некоторых пациентов с мекониевым забросом. ИРТ скрининг в сочетании с ДНК анализом в повторном образце позволяет идентифицировать носителей КФ. Как считается это имеет преимущество, поскольку позволяет идентифицировать КФ на доклинических стадиях. Клиническая картина КФ наступает значительно
--- стр. 31 ---
позднее и не всегда ее легко идентифицировать. Данный скрининг предупреждает наступление клинической картины заболевания. УПОЛНОМОЧЕННЫЙ ПРЕДСТАВИТЕЛЬ АО «ПРИБОРЫ» 109028, город Москва, Певческий пер., д. 4 стр. 1, помещ. I, комната 10 Тел./факс: +7 (495) 937-45-94/ +7 (495)937-45-92 Адрес электронной почты: info@pribori.com
--- стр. 34 ---
ПРИНЦИП МЕТОДА: АВТОДЕЛФИЯ НЕОНАТАЛ ИММУНОРЕАКТИВНЫЙ ТРИПСИН (ИРТ) определение основано на твердофазном, дву-сайтовом флюороиммунометрическом определении с разрешением по времени на основе прямого сэндвич методе при котором два моноклональных антитела (оба мышиные) направлены против двух различных антигенных детерминантах на молекуле ИРТ. Стандарты, контроли и тестируемые образцы содержащие ИРТ одновременно реагируют и с иммобилизированными моноклональными антителами, направленными против специфических антигенных сайтов на молекуле ИРТ и меченными европием вторыми моноклональными антителами (направленными против разных антигенных детерминантов) в инкубационном ИРТ буфере. Буфер элюирует ИРТ из высушенных пятен крови. Для выполнения определения требуется только одна инкубационная ступень. Усиливающий раствор диссоциирует ионы европия из меченого антигена в раствор, где они формируют высокофлюоресцентные хелатные комплексы с компонентами усиливающего раствора. Флюоресценция каждой лунки в последующем измеряется. Флюоресцентный сигнал каждого образца прямо пропорционален количеству ИРТ в образце. СОСТАВ НАБОРА: Каждый АВТОДЕЛФИЯ НЕОНАТАЛ ИРТ набор содержит реагентов необходимых для 960 определений. Срок годности набора указан на внешней стороне коробки. Хранение при +2+8 С. РЕАГЕНТЫ: Компоненты Количество Срок годности и хранение _________________________________________________________________________________ Стандарты ИРТ Фильтровальный +2+8С до окончания срока (приблизит.величины) лист (Шляйхер&Шуль №903) годности указанного на флаконе с 5 пятнами высушенной крови Убедитесь, что пластиковый конверт закрыт. А 0 нг/мл В 25 нг/мл С 50 нг/мл D 100 нг/мл Точные концентрации ИРТ Е 250 нг/мл указаны в отдельно прилагаемом вкладыше-сертификате контроля F 500 нг/мл качества Контроли (приблизит.величины) 1 лист фильтровальной бумаги +2+8 С до срока годности, Шляйхер&Шуль 903 с 5 пятнами указанной на конверте. высушенной крови Убедитесь, что пластиковый I 30 нг/мл конверт с контролями закрыт II 70 нг/мл III 110 нг/мл Точные концентрации контролей для каждого лота даны во вкладыше сертификата контроля качества. Стандарты и контроли производятся из человеческой крови при гематокрите 50-55% и откалиброваны, используя гравиметрические методы. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Анти-ИРТ-Eu метка 2 флакона, 2.8мл. +2+8С до окончания срока концентрированный годности указанной на флаконе
--- стр. 35 ---
раствор (-50мкг/мл) (мышиные, моноклональные) Метка растворена в ТРИС-HCL буфере (рН=7.8) солевом растворе с БСА, мышиными IgG и азидом натрия в качестве консерванта. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Концентрат промывочного 1 флакон 250мл +2+8С до окончания срока буфера годности указанной на флаконе Концентрированный раствор ТРИС-HCL буфера (рН=7.8) солевом растворе с консервантами Твин 20 и Гермалл II. Разводится в 25 раз. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Нео ИРТ инкубац. Буфер 1 флакон 250мл +2+8С до окончания срока годности указанной на флаконе Готовый для использования ТРИС-HCL буфер (рН=7.8) солевой раствор с БСА, бычьим глобулином, Твин 40, полиэтиленгликолем 6000, с инертным красным красителем и азидом натрия как консервантом. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- УСИЛИВАЮЩИЙ реагент 1 флакон 250мл +2+8С до окончания срока годности указанной на флаконе (+20+25С, см. на флаконе) Избегать попадания прямых солнечных лучей Готовый для использования с Тритон Х-100, уксусной кислотой и хелаторами. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Анти-ИРТ микротитровальные 10 планшет +2+8 до окончания срока стрипы. годности указанной на 8х12 лунок покрытых антителами планшете. против специфических сайтов Убедитесь, что пластиковый на молекуле ИРТ тампон влажный (мышиные моноклональные) ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Специфические для каждого лота Сертификаты контроля качества 1 лист _________________________________________________________________________________ МАТЕРИАЛЫ НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ С НАБОРОМ: АВТОДЕЛФИЯ ИРТ набор является частью комплексной системы иммунодиагностических реагентов и оборудования. АВТОДЕЛФИЯ система требует следующие компоненты, которые могут быть поставлены или от PerkinElmer/Wallac Oy или от его дистрибьютеров: 1. Флюорометр с временным разрешением плюс принтер и внешний компьютер. 2. Автоматический вошер - АВТОДЕЛФИЯ плейтвошер (Кат.№1296-026) 3. Автоматический шейкер-АВТОДЕЛФИЯ плейтшейкер(Кат.№1296-003) 4. Автоматический панчер ВАЛЛАК ДБС ПАНЧЕР (1296-071) или ручной панчер для выбивки бумажных дисков с диаметром около 3 мм.
--- стр. 36 ---
5. Пипетка для разливки АВТОДЕЛФИЯ буфера и метки - ЭППЕНДОРФ МУЛЬТИПИПЕТКА (1296-014) с 5 мл Комби наконечниками (1296-016) или в качестве альтернативы АВТОДЕЛФИЯ плейт диспенсер с АВТОДЕЛФИЯ диспенсер юнит (1296-041 или 1296-043). 6. Пипетка для разливки Усиливающего раствора - ЭППЕНДОРФ мультипипетка (1296-014) с 5 мл Комби наконечниками (1296-016) или альтернативно АВТОДЕЛФИЯ плейт диспенсер (1296-041). 7. АВТОДЕЛФИЯ ДИСК РЕМУВЕР (1296-061) для автоматического удаления жидкости и бумажных пятен из микротитровальных лунок. В дополнении к АВТОДЕЛФИЯ системе необходимо следующее: - дозирующая пипетка для разливки микролитровых объемов - пипетки для разливки миллитровых объемов НЭ буфера требуемого для приготовления раствора метки и антител - дистиллированная вода СБОР ОБРАЗЦОВ И ХРАНЕНИЕ: Образцы крови следует забирать сразу же после прокола пятки на фильтровальный бланк. Липемические (триглицериды менее 5000 мг/л) и иктеричные (билирубин менее 30 мг/дл) образцы крови не оказывают влияния на результаты. Не используйте кровь собранную с ЭДТА или с цитратом натрия в качестве антикоагулянтных средств, поскольку эти агенты воздействуют на хелаты европиевой метки. Скрининговые программы различаются в зависимости от того какой тип образца используется. Кровь при проколе пятки обычно берется на 2-6 дни жизни и эта схема также годится и для Нео-ИРТ. Мы рекомендуем использовать фильтровальную бумагу производимую компанией Шляйхер/Шуль (№903) для сбора образцов крови и бумага должна быть та же самая как и для пятен стандартов. Метод основанный на образцах представленных на бланках предъявляет определенные требования к сбору образцов крови, хранению и транспортировке. Сбор образцов описан детально( NCCLS) в документе комитета по взятию крови LA4-A3: - протрите кожу спиртом и высушите - проколоть иглой для прокола кожи ребенка ланцетом или автоматическим ланцетом на глубину примерно 2.0 мм. Прокол глубже чем на 2.0 мм у маленьких плодов может вызвать повреждение кости - удалите первую каплю крови. Нежно промокнуть на фильтровальную бумагу большую каплю крови, позволяя ей промокнуть насквозь, полностью заполняя отмеченный кружок на фильтровальном бланке. Проверьте с другой стороны бланка, что кровь пропиталась насквозь. Не накрывайте полученное пятно крови. - Высушите пятна крови на воздухе в горизонтальной позиции по меньшей мере 3 часа при комнатной температуре, избегайте попадания прямых солнечных лучей. - Проверьте заполненность всех граф нужной информацией, включая имя, адрес, номер пациента, пол; название и адрес госпиталя; имя, адрес, телефон врача производящий заполнение граф. Укажите время и дату родов, а также дату и время забора крови. Укажите был ли ребенок доношенным и если да – то степень недоношенности. Укажите вес новорожденного, многоплодный или нет. - Поместите каждый образец в свой отдельный бумажный конверт и транспортируйте или перешлите его в лабораторию в течение 24 часов после взятия. Образцы хранимые при комнатной температуре показывают снижение уровня Нео-ИРТ на 6-9% за каждую неделю. Для более длительного хранения образцы помещаются в пластиковые пакеты и замораживаются. Известно о сезонных колебаниях уровня Нео-ИРТ. Причина вероятно вызвана сезонной нестабильностью ИРТ во время транспортировки и хранения. Считается, что необходимо учитывать такую сезонность изменяя пороговую концентрацию в зависимости от времени года. Пороговая концентрация может быть недостаточна для предотвращения ложно-положительных случаев летом, хотя это может также способствовать увеличению количества ложно-положительных случаев при скрининге зимой. Использование правильной транспортировки и измерение ИРТ сразу же после сбора позволяет минимизировать все эти отклонения.
--- стр. 37 ---
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ: Для диагностики ин витро. Используется в работе персоналом после предварительного обучения. Набор содержит реагенты произведенные из компонентов человеческой крови. Источник протестирован на на наличие поверхностного антигена к гепатиту В, анти-гепатиту С, и анти-ВИЧ I и II. Тем не менее все рекомендации по мерам предосторожности при работе с производными крови должны быть соблюдены. Можно считать все образцы крови пациентов как потенциально инфицированные. Реагенты содержат азид натрия в качестве консерванта. Азид натрия может взаимодействовать с металлическими поверхностями с образованием азидов металлов. Для предотвращения образования азидов металлов необходимо промыть большим количеством воды. Лиофиллизированные стандарты ИРТ содержат азид натрия в качестве консерванта. Порошок опасен при ингаляции и попадании на кожу. Для дезинфекции всех сливных реагентов пользуйтесь правилами местных контролирующих организаций. ПРОТОКОЛ ОПРЕДЕЛЕНИЯ: Выполните каждое определение в дубле для стандартов и контролей. Стандартная кривая должна быть использована для каждого определения. Тестируемые образцы определяются по одному. Образцы и реагенты должны быть доведены до комнатной температуры (+20+25С) до использования. 1. Приготовление реагентов Стабильность после разведения _________________________________________________________________________________ Промывочный раствор 2 недели +2+25С в закрытом контейнере Перенести 100 мл из Промывочного Концентрата в чистый флакон и растворить добавляя 2400 мл дистиллированной воды для приготовления готового буферного раствора рН=7.8 -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Анти-ИРТ-Eu метка Приготовить и использовать в течение 1 часа Приготовьте необходимый объем метки посредством смешивания 60 мкл концентрата метки с 3 мл Нео-ИРТ инкубационного буфера на один стрип (см. таблицу). Важно, чтобы растворы антисыворотки и метки готовились раздельно и чтобы Нео ИРТ буфер не контактировал с раствором метки до использования в работе. Мы советуем использовать одноразовый пластиковый флакон для приготовления рабочих растворов метки и антисыворотки. _________________________________________________________________________________ 2. Перенести необходимое количество микротитровальных стрипов в рамку- держатель для стрипов (вернуть оставшиеся стрипы в пластиковую коробку и закрыть). _________________________________________________________________________________ 3. Выбить в дубле фильтровальные диски, используя автоматические или ручные панчеры в лунки плашки, согласно таблице Диаметр диска должен быть около 3.2 мм. Только один диск добавляется в каждую лунку.
--- стр. 38 ---
_________________________________________________________________________________ 4. Раскапывайте сразу же по 200 мкл растворенной анти-ИРТ метки в каждую лунку, используя рекомендованную Эппендорф Мультипипетку или АВТОДЕЛФИЯ диспенсер юнит. Избегайте выплескивания из лунки раскапываемой жидкости, не касайтесь поверхности лунки или поверхности жидкости. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. Ст. А А В В С С Д Д Е Е Ф Ф ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 1-й 1-й 2-й 2-й 3-й 3-й 4-й 5-й 6-й Кон.I Кон.I Кон.II Кон.II Кон.III Кон.III Обр. Обр. Обр. Обр. Обр. Обр. и т.д. 5. Инкубирование 10 минут в режиме “быстро”(FAST), используя АВТОДЕЛФИЯ плейт шейкер. Накрыть планшет пленкой и инкубировать 16-24 часа в холодильнике (+2-+8С) без шейкирования. Проверьте правильность температурного режима в холодильнике. Быстрое перемешивание необходимо, чтобы обеспечить полную экстракцию компонентов крови из фильтровальных дисков. Планшет следует поместить на холод сразу же после шейкирования. 6. После инкубации удалите раствор и фильтровальные диски, используя АВТОДЕЛФИЯ диск ремувер или с помощью пастеровской пипетки, соединенной с вакуумным насосом. Не позволяйте планшету долго находиться при комнатной температуре и сразу же после холодильника удалите диски. 7. Аспирируйте и промыть каждый стрип с помощью АВТОДЕЛФИЯ плейт вошера, используя программу №34 (промывка). 8. Добавить 200 мкл Усиливающего растовра прямо из реагентного флакона в каждую лунку, используя рекомендуемую ЭППЕНДОРФ мультипипетку, после заполнения Комбинаконечника раствором Усиливающего раствора или используя АВТОДЕЛФИЯ плейт диспенсер. Избегайте касания носиком пипетки лунки или ее содержимого. 9. Встряхивайте в режиме “медленно”(slowly) 5 минут. Сигнал флюоресценции стабилен в течение нескольких часов, если нет сильного испарения жидкости. Однако, мы рекомендуем измерять в течение 1 часа, чтобы внешние факторы не оказали влияния на уровень сигнала, хотя это достаточно редкий фактор. 10. Вставьте каждый стрип в рамку-держатель и измеряйте флюоресценцию на флюорометре с временным разрешением. Когда используется модель флюорометра 1232 или 1234 выберается номер программы 34 для автоматического измерения и подсчета результатов и протокол в Мультикалке «34 NIRT» Когда используется ВИКТОР Д старт измерения начинается со Start Wizard, затем выбирается программа NIRT из протоколов/китов в панели «Neonatal Europe» и определяется количество плашек и образцов. Сверьте параметры группы для программы №34 и если необходимо произведите коррекцию в соответствии со следующим (см. описание к флюрометру для проведения редактирования параметров считывания):
--- стр. 39 ---
КИТ НОМЕР 34 НЕО-ИРТ ASSAY TYPE IFMA тип определения ИФМА FITTING METHOD SPLINE SMOOTHED метод обработки метод “сглаживания” X-AXIS LOGARITHMIC х-ось логарифмическая Y-AXIS LOG у-ось логарифмическая BLANKS 2(А) бланки 2(А) STANDARDS 5 стандарты 5 STANDARD REPLICATES 2 Убедитесь, чтобы концентрация стандарты в дупликате 2 стандартов, указанная на флаконах STANDARD CONC А совпадала с задаваемой. Если не стандарты конц. А совпадает, введите новые. STANDARD CONC В стандарты конц. В STANDARD CONC С стандарты конц. С STANDARD CONC D стандарты конц. Д STANDARD CONC Е стандарты конц. Е STANDARD CONC F стандарты конц. Ф UNKNOWN REPLICATES 1 неизвестные образцы в дубле 1 ОСОБЕННОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ: 1. Отношение к этому набору как к целому необходимо для успешного использования АВТОДЕЛФИЯ наборов. Реагенты в этом наборе являются комплексными компонентами. Не смешивайте идентичные реагенты из различных лотов. Не используйте реагенты после срока годности, указанной на флаконе. 2. Реагенты должны быть доведены до комнатной температуры (+20+25С) до приготовления различных растворов. Замороженные образцы должны быть нагреты до комнатной температуры при медленном и осторожном перемешивании. Не используйте вортекс или смешанные образцы пациентов. 3. При промывке стрипов следите, чтобы все стрипы были заполнены полностью и одинаково до верхнего уровня как показано на картинке. После промывки стрипов, проверьте, что стрипы сухие. Если что-либо осталось в лунках, то необходимо перевернуть планшету и встряхнуть на фильтровальную бумагу. Аспирирующее/промывочное оборудование не должно находиться заполненным с промывочным раствором длительный период времени, поскольку промывочные иглы могут быть закупорены и трудно проходимы для жидкости. В конце рабочего дня аспирировать дистиллированную воду в аспирирующую/промывочную систему. Промывочное устройство должно быть регулярно промываться раствором NaCL (30г/Л), а затем дистиллированной водой и 50% этанолом и в конце промыто дистиллированной водой. 4. Для избежания примеси европия и как результат высокого флюресцентного фона высокие требования предъявляются к процедуре раскапывания и промывки. Поэтому необычайно важно использовать рекомендуемые и поставляемые вместе с АВТОДЕЛФИЯ пипетки.
--- стр. 40 ---
Усиливающий раствор должен быть раскапан только с использованием рекомендуемой ЭППЕНДОРФ мультипипеткой, и при этом первый объем сбрасывается для полного заполнения. Тот же тип Комбинаконечника не может быть использован для раскапывания любого другого реагента. После работы ЭППЕНДОРФ мультипипетка помещается на штатив с наконечником. При использовании АВТОДЕЛФИЯ плейт диспенсера и АВТОДЕЛФИЯ диспенсера юнита ознакомьтесь с описанием. ПОДСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ: АВТОДЕЛФИЯ система включает программу для обработки результатов и получения данных в виде стандартной кривой, концентрации неизвестных пациентов и т.д. (для детали см. описание к флюорометру или к программе Мультикалк). КАЛИБРОВКА: Полная стандартная кривая для каждого определения ставится для каждой плашки. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА: Контрольные образцы следует использовать для подтверждения стабильности ежедневных определений. Контроли определяются также как и неизвестные образцы. Контроли двух различных уровней используются и включены в наборы. Эти контроли следует ставить в каждом определении, если количество определений более чем одна планшета, то и в каждой плашке. Каждой лаборатории следует установить свой собственный концентрационный диапазон. Полученная средняя величина определяемого контроля должна укладываться в диапазон +20% от величин указанных в сертификате контроля качества. Рекомендуется также использовать свои собственные контроли для каждой лаборатории в добавлении к контролям включенным в набор. Тестируемые образцы дают истинную концентрацию, если контрольные значения в пределах установленных норм. Мы также рекомендуем участие лабораторий во внешнем контроле качества. ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ: Как и для любых других скрининговых тестов ин витро, результаты получаемые с помощью АВТОДЕЛФИЯ Нео-ИРТ могут быть использованы только для медицинских процедур и данные интерпретируются только совместно с клиническими исследованиями. Случаи при которых возможно получение аномальных результатов: - пятна не полностью пропитаны кровью - пятна выбиты панчером в месте, где имеет место плохая пропитка - плохо высушены пятна - нет элюции образца в буферный раствор, что вызвано либо нагреванием, либо свертыванием. - Примеси в пятне крови фекалий и др. Образцы на фильтровальных бланках не должны содержать ЭДТА, вследствие его воздействия на хелатирующий эффект европия. ОЖИДАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ : Измерение ИРТ в пятнах сухой крови используется для идентификации популяции новорожденных , имеющих высокий риск КФ. Идентификация основана на использовании величины пороговой концентрации или персентилей, которые позволяют максимально различать между больными и здоровыми новорожденными при максимуме чувствительности и специфичности. Имеется несколько различных протоколов скрининга с использованием Нео-ИРТ для выявления КФ. Наиболее часто используется двух стадийный протокол определения ИРТ/ДНК. На первой стадии измеряется ИРТ в массовом рутинном определении. Затем у тех образцов где уровень ИРТ превышает пороговый проводится ДНК исследование. Пороговая концентрация варьирует в зависимости от количества ложно-положительных случаев. Другой протокол использует при
--- стр. 41 ---
повторном определении повторное измерение ИРТ с последующей оценкой результатов потовой пробы. В обоих случаях те плоды которые идентифицированы как группа риска должны быть подтверждены генетически и клинически. Там, где частота мутации локуса F 508 низка используется вторая скрининговая технология. Данные представленные ниже были получены при использовании старой версии кита, Кат.№ 1244-034. Кит был использован в четырех лабораториях для измерения концентрации ИРТ для массового скрининга кистозного фиброза. Скрининговые подходы в различных лабораториях суммированы ниже: __________________________________________________________________________________ Параметр Лаб.№1 Лаб.№2 Лаб.№3 Лаб.№4 Метод Скрининга АВТОДЕЛФИЯ НЕО-ИРТ АВТОДЕЛФИЯ НЕО-ИРТ АВТОДЕЛФИЯ НЕО-ИРТ АВТОДЕЛФИЯ НЕО-ИРТ Пороговая (<21дня) после (<21 дня) после Концентрация 90 нг/мл 7 мес. 100 нг/мл исследования (>21 дня) снижается (>21 дня) снижается 70 нг/мл на 5% в день 80 нг/мл на 4% день Повторное Повторы в Повторно тест на Повторы в F508 ДНК тестирование дубле. Если ИРТ и F508 и 15 дубле. Если (1-й образец) среднее из других мутаций среднее из трех результатов трех результатов выше порогового выше порогового требуется повторная требуется повторная проба на ИРТ проба на ИРТ Повторное ИРТ нет ИРТ нет Тестирование (2-й образец) Требования Если повторная ИРТ> 124 нг/мл и Если повторная ИРТ>170нг/мл для проведения проба положительна нет аллелей муко- проба положи- и нет F508 ал- потовой пробы висцидоза тельная лели и если ИРТ>5% от порогового ИРТ>5% и и имеется хотя бы есть хотя бы одна аллель одна 1 аллель Расы: Белые 91% 86.3% 87.7% 86.4% Испанцы 22.2% 9.6% 2.8% 4.6% Черные 4.6% 9.1% 0.3% 9.6% Америк. 1.1% 0.2% 11.0% 1.3% Индейцы Азиаты 2.8% 4.4% 1.0% 2.8% Феномен транзиентной (не КФ) неонатальной гипертрипсинемиии, имеющей место по преимуществу в первые несколько дней жизни, главная причина ложно положительных результатов. Ложно-положительные результаты имеют место у детей с низким АПГАР и у плодов Афро-Американского происхождения. Использование второго тестирования либо ДНК, либо ИРТ во втором образце снижает количество ложно-положительных результатов. Здоровые носители КФ также могут иметь ложно-положительные результаты в частоте в три раза выше, чем в общей популляции. Ложно-отрицательные результаты как известно имеют место у некоторых пациентов с мекониевым забросом. ИРТ скрининг в сочетании с ДНК анализом в повторном образце позволяет идентифицировать носителей КФ. Как считается это имеет преимущество, поскольку позволяет идентифицировать КФ на доклинических стадиях. Клиническая картина КФ наступает значительно позднее и не всегда ее легко идентифицировать. Данный скрининг предупреждает наступление клинической картины заболевания.
--- стр. 42 ---
УПОЛНОМОЧЕННЫЙ ПРЕДСТАВИТЕЛЬ АО «ПРИБОРЫ» 109028, город Москва, Певческий пер., д. 4 стр. 1, помещ. I, комната 10 Тел./факс: +7 (495) 937-45-94/ +7 (495)937-45-92 Адрес электронной почты: info@pribori.com
--- стр. 52 ---
Lot specific 1 шт. quality control certificate (Индивидуальный сертификат контроля качества партии) МАТЕРИАЛЫ, НЕОХОДИМЫЕ ДЛЯ ТЕСТА, НО НЕ ИДУЩИЕ В КОМПЛЕКТЕ Набор DELFIA Neonatal 17-ОНР представляет собой одну часть полной системы иммунодиагностических реактивов и аппаратуры. Система DELFIA требует наличия следующих позиций, которые можно приобрести у компании PerkinElmer Life and Analytical Sciences или у ее дистрибьюторов. 1. Флуорометр с временным разрешением плюс принтер и (дополнительный) компьютер 2. Автоматический мойщик-смыватель дисков фильтровальной бумаги DELFIA Washer-Diskremove (произв. № 1296-0010) или промывочное устройство для микротитрационных планшет и стрипов - DELFIA Platewash (произв. № 1296-026) 3. Автоматический встряхиватель - DELFIA Plateshake (произв. № 1296-003/004) _________________________ 3 Triton - зарегистрированная торговая марка компании Rohm and Haas Co 13905601-5 (ru) 9
--- стр. 53 ---
4. Автоматический перфоратор Wallac DBS Puncher (произв. № 1296-071), мультиперфоратор MultiPuncher™ 4 (произв. № 1296-081) или автоперфоратор Wallac AutoPuncher™ 5 (произв. № 1296-091) или ручной перфоратор для выбивки из фильтровальной бумаги кружочков диаметром 3.2 мм (1/8 дюйм) 5. Пипетка для распределения разбавленного индикаторного раствора и разбавленного раствора иммунной сыворотки - Eppendorf Multipette (произв. № 1296-014) с 5 мл насадкой Combitips (произв. № 1296-016) или альтернативно диспенсер DELFIA Plate Dispense для раскапывания раствора в лунки плашки с диспенсером DELFIA Dispense Unit (произв. № 1296-041 и 1296-043) 6. Пипетка для распределения раствора-усилителя (Enhancement Solution) - Eppendorf Multipette (произв. № 1296-014) с 5 мл насадкой Combitips (произв. №1296-016) или альтернативно диспенсер DELFIA Plate Dispense для раскапывания раствора в лунки плашки (произв. № 1296-041) В дополнение к системе DELFIA требуется следующее: - точные пипетки для распределения объемов в микролитрах и пипетки для распределения объемов в миллилитрах - дистиллированная вода - образцы на фильтровальной бумаге, одобренной FDA (Управление по контролю за продуктами и лекарствами США) СБОР И ХРАНЕНИЕ ОБРАЗЦОВ Образцы крови должны помещаться на фильтровальную бумагу сразу после взятия из пятки новорожденного. Если проба не нанесена прямо на фильтровальную бумагу (не метод выбора), не используйте EDTA или цитратные трубки или капилляры, чтобы собрать кровь, поскольку эти антикоагуляционные реактивы будут воздействовать на пробу, хелатируя метку европия. Обработка матери или ребенка дексаметазоном может привести к ложноотрицательным результатам (13).
--- стр. 54 ---
Программы скрининга новорожденных отличаются друг от друга необходимыми для исследования образцами. В США рекомендуемый диаметр капли крови составляет 12.7 мм ( /2 дюйм), образец берется из пятки и помещается на фильтровальную бумагу. Кровь обычно берется через 2-6 дней после рождения, но в некоторых программах скрининга время взятия и количество образцов различается. Подходящее время взятия образцов необходимо уточнять в местных нормативных документах. Прибор для взятия образцов должен соответствовать требованиям FDA (Управление по контролю за продуктами и лекарствами США). Метод исследования сухих образцов крови требует профессиональных навыков их взятия, хранения и транспортировки. Способ сбора образцов детально описан в документе LA4-A4 (14) Национального комитета по клиническим и лабораторным стандартам (NCCLS), его основные пункты приведены ниже: _______________________________________ 10 13905601-5 (ru) - Очистить кожу тампоном, смоченном в спирте, и дать ей высохнуть. - Проколоть пятку ребенка стерильным ланцетом или специальным прокалывающим инструментом на глубину 1.0–2.0 мм. Прокалывание на глубину более 2 мм у младенцев может повредить кость. - Вытереть первую каплю крови. Аккуратно приложить фильтровальную бумагу к большой капле крови и дать ей хорошо впитаться, чтобы заполнился круг, отпечатанный на фильтровальной бумаге. Осмотреть обе стороны фильтровальной бумаги и убедиться, что кровь хорошо впиталась. Чрезмерное сдавливание места прокола может вызвать гемолиз или примешивание к образцу тканевой жидкости. Не накладывайте следующие капли крови на готовый образец, это ведет к образованию сгустков. - Высушите образец крови на воздухе вдали от источников света в течение 3 часов при комнатной температуре (+18–+25°C). Не нагревайте и не складывайте вместе образцы в процессе сушки. - Убедитесь, что контрольная карта образца полностью заполнена. Минимум необходимой информации напечатан на сборочном устройстве и включает в себя:
--- стр. 55 ---
- фамилия (имя, если есть), пол, дата рождения (время рождения), вес при рождении и возраст ребенка (отметить если менее 24 часов) и идентификационный номер пациента/ - имя и фамилия матери - дата забора образца (время забора) - название и адрес учреждения места рождения birth facility) - имя и телефонный номер врача (сотрудник здравоохранения) - название программы скрининга новорожденного и адрес - каждая карта должна иметь уникальный серийный номер и срок хранения - Перед транспортировкой в контейнере сухие капли крови на картах должны быть отделены друг от друга для предотвращения их контакта между собой. Образцы можно поместить в защитные конверты или проложить между ними пергамин. - Следуйте инструкциям местных почтовых и транспортных служб для упаковки и перевозки образцов. Нельзя помещать образцы в герметичные контейнеры (пластиковые или фольговые пакеты). При необходимости образцы должны перевозиться во влагопоглощающей упаковке. Сырость и влага недопустимы для сухих образцов крови. - Образцы необходимо доставить в лабораторию в течение 24 часов, если не указан иной срок. Некоторые лаборатории могут запросить дополнительную информацию, в частности, был ли ребенок недоношен или переношен и если да, то насколько, является ли он или она близнецом, а также информацию о питании, приеме антибиотиков или переливании крови. Минимальный объем информации необходимо уточнять в местных нормативных документах и организациях. 13905601-5 (ги) 11
--- стр. 57 ---
ПРОЦЕДУРА АНАЛИЗА Производите каждое определение на калибраторе и контрольной карте. Для каждой плашки должна быть построена отдельная калибровочная кривая. Исследуемые образцы могут ставиться единичными определениями (1 лунка на образец). К моменту использования все реагенты и образцы должны иметь комнатную температуру (от +20 до 25°C). 12 1390601-5 (ru) 1. Приготовление реагентов Стабильность после разведения Промывочный раствор 2 недели при температуре от +2 до +25°C в герметичном контейнере. Влейте 100 мл промывочного концентрата в чистую емкость и разбавьте его, добавив 2400 мл дистиллированной воды. Основной раствор радиоактивного индикатора 17-OHP-Eu 3 недели при температуре +2–+8°C. Добавьте точно 1.5 мл дистиллированной воды в пробирку и осторожно перемешайте. Надо дать постоять не менее 30 минут перед использованием. ПРИМЕЧАНИЕ. Порошок содержит в качестве консерванта азид натрия (<1%) в качестве фиксатора, а он вреден при вдыхании, при контакте с кожей и при проглатывании. Растворенная радиоактивный индикатор содержит <0.1% азид натрия и не считается вредным. 17-OHP раствор иммунной сыворотки Подготовка в течение часа использования. Приготовьте необходимый объем раствора антисыворотки, смешав 62.5 мкл основного раствора иммунной сыворотки с 1.5 мл буферного раствора 17-OHP на полоску (см. таблицу в Итоговой ведомости протокола).
--- стр. 58 ---
Раствор радиоактивного индикатора 17-OHP-Eu Подготовка в течение часа использования. Приготовьте необходимый объем раствора радиоактивного индикатора, смешав 15 мкл основного раствора иммунной сыворотки с 1.5 мл буферного раствора 17-OHP на полоску (см. таблицу в Итоговой ведомости протокола). Важно, чтобы раствор иммунной сыворотки и раствор индикатора готовились отдельно. Для подготовки рабочих растворов радиоактивного индикатора и иммунной сыворотки мы советуем использовать одноразовые пластмассовые емкости. 2. Поместите требуемое количество полос микротитрования на рамку. Замечание. Откройте фольгу только с трех сторон и сложите ее, оставив специфичную для пластины информацию на упаковке. Положите оставшиеся полоски обратно в упаковку и как можно сильнее прижмите покрытие из фольги обратно. Оставьте высушивающее средство в упаковке. Альтернативно, сохраните оставшиеся полосы в герметизируемом полиэтиленовом пакете с высушивающим средством. 13905601-5 (ru) 13 3. Проперфорируйте диски фильтровальной бумаги в лунки, используя автоматический или ручной перфоратор. Диаметр диска должен быть приблизительно 3.2 мм (1/8 дюйм). В каждую ячейку помещается только один диск. Далее идет карта заполнения планшета как в образце. Каждая лаборатория самостоятельно выбирает оптимальное размещение контрольных и опытных образцов.
--- стр. 59 ---
4. Накапайте пипеткой 100 мкл раствора иммунной сыворотки anti-17-OHP в каждую лунку, используя рекомендованное устройство Eppendorf Multipette после слива первой аликвотной пробы, или используйте дозатор DELFIA Dispense Unit. Избегайте переноса, удерживая кончик пипетки на незначительном расстоянии от верхней части лунки, а также не прикасайтесь к пластиковой полоске или поверхности жидкости. 5. Плавно взболтайте рамку в течение 5 минут (максимум 10 минут) при комнатной температуре, используя устройство DELFIA Plateshake, чтобы инициировать элюцию пробы. 6. Добавьте 100 мкл раствора метки 17-OHP-Eu в каждую лунку. Капание из пипетки должно выполняться так же, как для раствора иммунной сыворотки на шаге 4, описанном выше. 7. Плавно взболтайте рамку в течение 1 минуты, используя устройство DELFIA Plateshake. Закройте планшет и инкубируйте в течение 18–22 часов в холодильнике (максимальная температура +8°C). Альтернативно, после плавного взбалтывания в течение 1 минуты инкубируйте на 3 часа (±15 минут) при комнатной температуре, не встряхивая (максимальная температура +32°C). 8. После инкубации удалите раствор и диски фильтровальной бумаги из лунок и промойте каждую лунку используя программу 17OHP (24) для устройства DELFIA Trio или DELFIA Washer-Diskremove. Альтернативно, удалите раствор и диски фильтровальной бумаги, используя наконечник всасывания, например пипетку Пастера, связанную с адекватным источником вакуума. Промойте каждую полоску, используя программу 48 устройства DELFIA Platewash.
--- стр. 60 ---
9. Накапайте 200 мкл раствора -усилителя прямо из бутылки с реактивом в каждую лунку, используя рекомендованное устройство Eppendorf Multipette после однократной промывки насадки Combitip раствором-усилителем (вылить), или 14 13905601-5 (ru) используйте дозатор DELFIA Plate Dispense. Снова наполните насадку Combitip и выбросьте первую аликвотную пробу. Не допускайте касания края лунки или ее содержимого. 10. Плавно взболтайте рамку в течение 5 минут. Флюоресценция стабильна в течение нескольких часов, если предотвратить испарение. Однако, мы рекомендуем провести измерение в пределах 1 часа, поскольку внешние факторы могут вызвать уменьшение сигнала со временем, хотя это случается чрезвычайно редко. 11. Гарантируйте, что каждая полоска была твердо зафиксирована в рамке, и измерьте флюоресценцию флюориметром с временным разрешением. При использовании флуорометра 1232 или 1234 создайте новую программу набора или протокол "N170HP" в программе MultiCalc®6 для автоматического измерения и вычисления результата. При использовании VICTOR2 D начните измерение с мастера запуска, выберите протокол7 "N170HP" и задайте количество плашек и проб. Проверьте группу параметров для программы или протокола MultiCalc protocol "N170HP". Если вы изменяете число повторов для исследуемых величин, соответственно измените, пожалуйста, протокол (см. руководство флуорометра или руководство MultiCalc®6 для редактирования параметров).
--- стр. 61 ---
ПРОЦЕДУРНЫЕ ПРИМЕЧАНИЯ 1. Для успешного использования набора DELFIA требуется полное понимание содержимого упаковки. Реагенты, входящие в составе теста, предназначены для комплексного использования. Не смешивайте идентичные реагенты из разных партий. Не используйте реагенты после окончания срока хранения, указанного на этикетке. _______________________________________ 6 MultiCalc - зарегистрированная торговая марка компании PerkinElmer, Inc. VICTOR является товарным знаком компании PerkinElmer, Inc. 7 При использовании этого набора впервые протокол должен быть установлен в VICTOR2 D. 13905601-5 (ru) 15 2. Любые отклонения от процедуры анализа могут негативно повлиять на результат. 3. Перед подготовкой пробы реактивы должны достигнуть комнатной температуры (+20-+25°С). 4. При промывке полосок, обеспечьте, чтобы каждая лунка была полностью наполнена до верхнего края, как показано на рисунке. После промывки полосок, убедитесь, что лунки сухие. Если в них осталась влага, переверните пластину и промокните гигроскопичной бумагой .
--- стр. 68 ---
13905601-5 (ги) 20 Замечание: Младенцы с очень низким весом при рождении (<1400 г) могут дать намного более высокие значения. В исследовании 3-5-дневных младенцев (25) с использованием фильтровальной бумаги Whatman 2992 значение отсечки для выношенных младенцев принималось равным 30 нмоль/л, что является также рекомендацией Рабочей группы по скринигу новорожденных европейского Общества Педиатрической Эндокринологии (Working Group on Neonatal Screening of the European Society for Paediatric Endocrinology) (13). Значения между 30 и 90 нмоль/л требуют последующих мероприятий, а значения, превышающие 90 нмоль/л, указывают на высокую вероятность врожденной надпочечной гиперплазии. Для родившихся преждевременно (27-36 недель) младенцев была принята отсечка в 60 нмоль/л (25). Однако, каждая лаборатория должна выработать свои собственные значения отсечки, которые могут базироваться на процентиле, или на основе нормального диапазона (26). 20 13905601-5 (ru) Из результатов исследования А015-110 DELFIA Neonatal 17-ОНР, при помощи программы STATGRAPHICS11 Plus были рассчитаны следующие процентили: Набор Срок беременности (недели)
n Процентили 17-ОНР(нг/мл сыворотка) 17-ОНР (нмоль/л кровь) 97.5 98.0 99.0 97.5 98.0 99.0
--- стр. 69 ---
A015-110
36 1787 14.1 14.8 16.4 19.3 20.3 22.5
< 36 87 78.1 83.2 98.6 107 114 135 A048-210
36 1787 11.7 12.2 13.3 16.0 16.7 18.2 <36 87 79.6 80.3 103 109 110 141 Поздняя постнатальная не классическая врожденная надпочечная гиперплазия точно не обнаруживается при скрининге новорожденных (26,27). ХАРАКТЕРИСТИКА АНАЛИТИЧЕСКОЙ ПРОИЗВОДИТЕЛЬНОСТИ12 Типичная калибровочная кривая, полученная при исследовании с использованием А015-110 DELFIA Neonatal 17-ОНР, показана ниже. _________________________ 11 STATGRAPHICS - зарегистрированная торговая компании Statistical Graphics Corp. 12 Исследования проведены PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Wallac Oy, Turku, Finland. 13905601-5 (ru) 21 LEUEL 4.0 :STD.CUBUE 44 N17P3 16 04-ГЕВ-25.О1
--- стр. 70 ---
Точность: Вариация исследования A015-110 DELFIA Neonatal 17-OHP была определена с использованием зубчатых высушенных точечных проб крови и 3 партий наборов в 36 сериях с 4 повторениями тремя техниками, использующими системы 2 DELFIA. Анализ подхода отклонения использовался для расчета следующих отклонений: А Процедура в течение ночи Образец Общее среднее значение (нг/мл сыворотка)
Общее среднее значение (нмоль/л кровь)
Отклонение внутри анализа (% КВ)
Вариация между исследованиями (% КВ)
Общее отклонение (% КВ)
1 25.1 34.4 6.7 9.1 11.3 2 51.2 70.1 6.8 8.3 10.7 3 112 153 7.3 6.8 9.9
--- стр. 82 ---
АВТОДЕЛФИЯ 17-оксипрогестерон 17-ОНР DELFIA Neonatal 17a-OH-Progesterone Флюрометрический анализ с разрешением по времени для количественного определения неонатального 17-альфа-ОН-прогетстерона (НЕО-17ОНР) Производитель - WALLAC Oy Финляндия Для диагностического применения in vitro. ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В IN VITRO ДИАГНОСТИКЕ 1152 ОПРЕДЕЛЕНИЙ НАЗНАЧЕНИЕ: Данный тест предназначен для количественного определения неонатального 17-альфа-ОН-прогетстерона (НЕО-17ОНР) в образцах крови на фильтровальных бланках для скрининга новорожденных на адреногенитальный синдром. СОСТАВ НАБОРА: 1.НЕО-17ОНР стандарты - образцы крови человека высушенные на фильтровальной бумаге. К-во - 1 шт. 2.НЕО-17ОНР контроли - образцы крови человека высушенные на фильтровальной бумаге. К-во - 1 шт. 3.НЕО-17ОНР Eu раствор. 1 флакон, лиофилизированные 4.Анти-НЕО-17ОНР раствор (кроличьи, поликлональные) 1.5 мл (фл). К-во - 1 шт. 5.Промывочный концентрат; 250 мл(фл). К-во - 1 шт. 6.НЕО-17ОНР инкубационный буфер; 250 мл(фл). К-во - 1 шт. 7.Усиливающий реагент; 250 мл(фл). К-во - 1 шт. 8.Анти-кроличьи IgG микротитрационные стрипы (мышиные антитела); 96 луночные; К-во - 10 шт ПРИНЦИП МЕТОДА: АВТОДЕЛФИЯ 17-оксипрогестерон (17-ОНР) определение основано на твердофазном, дву-сайтовом флюороиммунометрическом определении с разрешением по времени на основе прямого сэндвич методе при котором два антитела (кроличьи и мышиные) направлены против двух различных антигенных детерминантах на молекуле 17-ОНР . Стандарты, контроли и тестируемые образцы содержащие 17-ОНР одновременно реагируют и с иммобилизированными моноклональными антителами, направленными против специфических антигенных сайтов на молекуле 17-ОНР и меченными европием вторыми моноклональными антителами (направленными против разных антигенных детерминантов) в инкубационном 17-ОНР буфере. Буфер элюирует 17-ОНР из высушенных пятен крови. Для выполнения определения требуется только одна инкубационная ступень. Усиливающий раствор диссоциирует ионы европия из меченого антигена в раствор, где они формируют высокофлюоресцентные хелатные комплексы с компонентами усиливающего раствора. Флюоресценция каждой лунки в последующем измеряется. Флюоресцентный сигнал каждого образца прямо пропорционален количеству 17-ОНР в образце. Каждый АВТОДЕЛФИЯ 17-оксипрогестерон (17-ОНР) набор содержит реагентов необходимых для 1152 определений. Срок годности набора указан на внешней стороне коробки. Хранение при +2+8 С. МАТЕРИАЛЫ НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ С НАБОРОМ:
--- стр. 83 ---
Данный набор является частью комплексной системы иммунодиагностических реагентов и оборудования. АВТОДЕЛФИЯ система требует следующие компоненты, которые могут быть поставлены или от WALLAC OY или от его дистрибьютеров: 1. Флюорометр с временным разрешением плюс принтер и внешний компьютер. 2. Автоматический вошер - АВТОДЕЛФИЯ плейтвошер (Кат.№1296-024 или1296-026) 3. Автоматический шейкер-АВТОДЕЛФИЯ плейтшейкер(Кат.№1296-001или1296-003) 4. Пипетка для разливки АВТОАВТОДЕЛФИЯ буфера и метки - ЭППЕНДОРФ МУЛЬТИПИПЕТКА (1296-014) с 5 мл Комби наконечниками (1296-016) или в качестве альтернативы АВТОАВТОДЕЛФИЯ плейт диспенсер с АВТОАВТОДЕЛФИЯ диспенсер юнит (1296-041 или 1296-043). 5. Пипетка для разливки Усиливающего раствора - ЭППЕНДОРФ мультипипетка (1296-014) с 5 мл Комби наконечниками (1296-016) или альтернативно АВТОАВТОДЕЛФИЯ плейт диспенсер (1296-041). 6. АВТОАВТОДЕЛФИЯ растворитель I (Кат.№ В127-100, В128-100). В дополнении к АВТОДЕЛФИЯ системе необходимо следующее: - дозирующая пипетка для разливки микролитровых объемов - пипетки для разливки миллитровых объемов НЭ буфера требуемого для приготовления раствора метки и антител - дистиллированная вода СБОР ОБРАЗЦОВ И ХРАНЕНИЕ: Получение крови посредством венопункции, образование сгустка и выделение сыворотки посредством центрифугирования. Плазма, полученна с использованием ЭДТА и цитрата натрия не может быть использована, вследствии воздействия на хелатирующий европий. Однако может применяться плазма крови полученная с гепарином. Гемолитическая (гемоглобин>2г/Л), липемическая (>2 г/Л) и иктерическая (билирубин>30 мкмоль/Л) сыворотки использовать не рекомендуется. Если концентрация превышает 50 нмоль/Л следует развести сыворотки или нормальной женской сывороткой или АВТОДЕЛФИЯ дилюентом I. Образцы могут быть сохранены 12 часов при комнатной температуре или 3 дня при +2+8С. Для более длительного периода неразведенные образцы могут храниться при -20 С. Избегайте повторного замораживания размораживания. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ: Для диагностики ин витро. Следует соблюдать правила предосторожности США №CDC 88-8395 или местные правила. Можно считать все образцы крови пациентов как потенциально инфицированные. Реагенты содержат азид натрия в качестве консерванта. Азид натрия может взаимодействовать с металлическими поверхностями с образованием азидов металлов. Для предотвращения образования азидов металлов необходимо промыть большим количеством воды. Для дезинфекции всех сливных реагентов пользуйтесь правилами местных контролирующих организаций. Флюоресценция измеряется на флюорометре с временным разрешением. Выберите номер программы 50 для автоматического измерения и подсчета результатов. Сверьте параметры группы для программы №50 и если необходимо произведите коррекцию в соответствии со следующим (см. описание к флюрометру для проведения редакции параметров считывания): ASSAY TYPE FIA тип определения ФИА FITTING METHOD SPLINE SMOOTHED метод обработки метод “сглаживания” X-AXIS LOGARITHMIC х-ось логарифмическая
--- стр. 84 ---
Y-AXIS B/Bмакс у-ось B/Bмакс BLANKS 0 бланки 0 STANDARDS 6 стандарты 6 STANDARD REPLICATES 2 Убедитесь, чтобы концентрация стандарты в дупликате 2 стандартов, указанная на флаконах STANDARD CONC А совпадала с задаваемой. Если не стандарты конц. А совпадает, введите новые. STANDARD CONC В стандарты конц. В STANDARD CONC С стандарты конц. С STANDARD CONC D стандарты конц. Д STANDARD CONC Е стандарты конц. Е STANDARD CONC F стандарты конц. Ф UNKNOWN REPLICATES 2 неизвестные образцы в дубле 2 ОСОБЕННОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ: 1. Отношение к этому набору как к целому необходимо для успешного использования АВТОАВТОДЕЛФИЯ наборов. Реагенты в этом наборе являются комплексными компонентами. Не смешивайте идентичные реагенты из различных лотов. Не используйте реагенты после срока годности, указанной на флаконе. 2. Реагенты должны быть доведены до комнатной температуры (+20+25С) до приготовления различных растворов. Замороженные образцы должны быть нагреты до комнатной температуры при медленном и осторожном перемешивании. Не используйте вортекс или смешанные образцы пациентов. 3. При промывке стрипов следите, чтобы все стрипы были заполнены полностью и одинаково до верхнего уровня как показано на картинке. После промывки стрипов, проверьте, что стрипы сухие. Если что-либо осталось в лунках, то необходимо перевернуть планшету и встряхнуть на фильтровальную бумагу. Аспирирующее/промывочное оборудование не должно находиться заполненным с промывочным раствором длительный период времени, поскольку промывочные иглы могут быть закупорены и трудно проходимы для жидкости. В конце рабочего дня аспирировать дистиллированную воду в аспирирующую/промывочную систему. Промывочное устройство должно быть регулярно промываться раствором NaCL (30г/Л), а затем дистиллированной водой и 50% этанолом и в конце промыто дистиллированной водой. 4. Для избежания примеси европия и как результат высокого флюресцентного фона высокие требования предъявляются к процедуре раскапывания и промывки. Поэтому необычайно важно использовать рекомендуемые и поставляемые вместе с АВТОАВТОДЕЛФИЯ пипетки. Усиливающий раствор должен быть раскапан только с использованием рекомендуемой ЭППЕНДОРФ мультипипеткой, и при этом первый объем сбрасывается для полного заполнения. Тот же тип Комбинаконечника не может быть использован для раскапывания любого другого реагента. После работы ЭППЕНДОРФ мультипипетка помещается на штатив с наконечником. При использовании АВТОАВТОДЕЛФИЯ плейт диспенсера и АВТОАВТОДЕЛФИЯ диспенсера юнита ознакомьтесь с описанием. ПОДСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ: АВТОАВТОДЕЛФИЯ система включает программу для обработки результатов и получения данных в виде стандартной кривой, концентрации неизвестных пациентов и т.д. (для детали см. описание к флюорометру или к программе Мультикалк).
--- стр. 86 ---
ДЕЛФИЯ Тироксин (Нео-Т4) DELFIA Neonatal Thyroxine (T4) Флюрометрический анализ с разрешением по времени для количественного определения неонатального тироксина (НЕО-Т4) в образцах высушенной крови человека Производитель - WALLAC Oy, Финляндия Для диагностического применения in vitro. ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В IN VITRO ДИАГНОСТИКЕ 960 ОПРЕДЕЛЕНИЙ НАЗНАЧЕНИЕ: Набор предназначен для определения тироксина (НЕО-Т4) в образцах фильтровальных бланках для скрининга новорожденных на врожденный гипотиреоз (подтверждающая диагностика. Принцип основан на иммунофлю-оресцентом анализе, в котором определяемая молекула антител к НЕО-Т4 взаимодействует по типу реакции антиген антитело с сорбированными на поверхности планшета антигеном против антител к НЕО-Т4 и вторыми антителами, меченые флюоресцентной меткой. В результате реакции образуется высокофлюоресцентное соединение, концентрация которого определяется на приборе-флюорометре ДЕЛФИЯ/ВИКТОР. Концентрация определяемого флюоресцирующего соединения прямо пропорциональна количеству антител к НЕО-Т4 в образцах сыворотки крови человека. СОСТАВ НАБОРА: 1.НЕО-Т4 стандарты - образцы крови человека высушенные на фильтровальной бумаге. К-во - 1 шт. 2.НЕО-Т4 контроли - образцы крови человека высушенные на фильтровальной бумаге. К-во - 1 шт. 3.НЕО-Т4 Eu раствор. 1 флакон, лиофилизированные 4.Анти-НЕО-Т4 раствор (мышиные, моноклональные) 1.5 мл (фл). К-во - 1 шт. 5.Промывочный концентрат; 250 мл(фл). К-во - 1 шт. 6.НЕО-Т4 инкубационный буфер; 250 мл(фл). К-во - 1 шт. 7.Усиливающий реагент; 250 мл(фл). К-во - 1 шт. 8.Анти-мышиные IgG микротитрационные стрипы (мышиные антитела); 96 луночные; К-во – 10 шт. ПРИНЦИП МЕТОДА: ДЕЛФИЯ Нео-Т4 определение основано на твердофазном, флюороиммуном определении с разрешением по времени на основе конкуренции между меченым европием Т4 и Т4 в тестируемом образце за ограниченное количество мест связывания на Т4 -специфических моноклональных антителах (мышиные). Стандарты, контроли и образца пациентов, содержащие Т4 ингибируют связывание меченого европием Т4 с антителами. Блокирующие агенты в Т4 инкубационном буфере предотвращают выделение Т4 из связанного с белками состояния. Второе антитело взаимодействующее с анти-мышиными антителами, которые покрывают поверхность лунок и представляют твердую фазу, определяя высококачественное разделение антител-связанных и свободных антигенов Т4. В этом определении только одна инкубационная ступень. Усиливающий раствор диссоциирует ионы европия из меченого Т4 в раствор, где они формируют высокофлюоресцентные хелатные комплексы с компонентами усиливающего раствора. Флюоресценция каждой лунки в последующем измеряется. Флюоресцентный сигнал каждого образца обратно пропорционален количеству Т4 в образце. Каждый ДЕЛФИЯ Нео-Т4 набор содержит реагентов необходимых для 960 определений. Срок годности набора указан на внешней стороне коробки. Хранение при +2+8 С.
--- стр. 87 ---
МАТЕРИАЛЫ НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ С НАБОРОМ: Данный набор является частью комплексной системы иммунодиагностических реагентов и оборудования. ДЕЛФИЯ система требует следующие компоненты, которые могут быть поставлены или от WALLAC OY или от его дистрибьютеров: 1. Флюорометр с временным разрешением плюс принтер и внешний компьютер. 2. Автоматический вошер - ДЕЛФИЯ плейтвошер (Кат.№1296-024 или1296-026) 3. Автоматический шейкер-ДЕЛФИЯ плейтшейкер(Кат.№1296-001или1296-003) 4. Пипетка для разливки ДЕЛФИЯ буфера и метки - ЭППЕНДОРФ МУЛЬТИПИПЕТКА (1296-014) с 5 мл Комби наконечниками (1296-016) или в качестве альтернативы ДЕЛФИЯ плейт диспенсер с ДЕЛФИЯ диспенсер юнит (1296-041 или 1296-043). 5. Пипетка для разливки Усиливающего раствора - ЭППЕНДОРФ мультипипетка (1296-014) с 5 мл Комби наконечниками (1296-016) или альтернативно ДЕЛФИЯ плейт диспенсер (1296-041). 6. ДЕЛФИЯ растворитель I (Кат.№ В127-100, В128-100). В дополнении к ДЕЛФИЯ системе необходимо следующее: - дозирующая пипетка для разливки микролитровых объемов - пипетки для разливки миллитровых объемов НЭ буфера требуемого для приготовления раствора метки и антител - дистиллированная вода СБОР ОБРАЗЦОВ И ХРАНЕНИЕ: Получение крови посредством венопункции, образование сгустка и выделение сыворотки посредством центрифугирования. Плазма, полученна с использованием ЭДТА и цитрата натрия не может быть использована, вследствии воздействия на хелатирующий европий. Однако может применяться плазма крови полученная с гепарином. Гемолитическая (гемоглобин>2г/Л), липемическая (>2 г/Л) и иктерическая (билирубин>30 мкмоль/Л) сыворотки использовать не рекомендуется. Если концентрация превышает 50 нмоль/Л следует развести сыворотки или нормальной женской сывороткой или ДЕЛФИЯ дилюентом I. Образцы могут быть сохранены 12 часов при комнатной температуре или 3 дня при +2+8С. Для более длительного периода неразведенные образцы могут храниться при -20 С. Избегайте повторного замораживания размораживания. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ: Для диагностики ин витро. Следует соблюдать правила предосторожности США №CDC 88-8395 или местные правила. Можно считать все образцы крови пациентов как потенциально инфицированные. Реагенты содержат азид натрия в качестве консерванта. Азид натрия может взаимодействовать с металлическими поверхностями с образованием азидов металлов. Для предотвращения образования азидов металлов необходимо промыть большим количеством воды. Для дезинфекции всех сливных реагентов пользуйтесь правилами местных контролирующих организаций. Флюоресценция измеряется на флюорометре с временным разрешением. Выберите номер программы 50 для автоматического измерения и подсчета результатов. Сверьте параметры группы для программы №50 и если необходимо произведите коррекцию в соответствии со следующим (см. описание к флюрометру для проведения редакции параметров считывания): ASSAY TYPE FIA
--- стр. 88 ---
тип определения ФИА FITTING METHOD SPLINE SMOOTHED метод обработки метод “сглаживания” X-AXIS LOGARITHMIC х-ось логарифмическая Y-AXIS B/Bмакс у-ось B/Bмакс BLANKS 0 бланки 0 STANDARDS 6 стандарты 6 STANDARD REPLICATES 2 Убедитесь, чтобы концентрация стандарты в дупликате 2 стандартов, указанная на флаконах STANDARD CONC А совпадала с задаваемой. Если не стандарты конц. А совпадает, введите новые. STANDARD CONC В стандарты конц. В STANDARD CONC С стандарты конц. С STANDARD CONC D стандарты конц. Д STANDARD CONC Е стандарты конц. Е STANDARD CONC F стандарты конц. Ф UNKNOWN REPLICATES 2 неизвестные образцы в дубле 2 ОСОБЕННОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ: 1. Отношение к этому набору как к целому необходимо для успешного использования ДЕЛФИЯ наборов. Реагенты в этом наборе являются комплексными компонентами. Не смешивайте идентичные реагенты из различных лотов. Не используйте реагенты после срока годности, указанной на флаконе. 2. Реагенты должны быть доведены до комнатной температуры (+20+25С) до приготовления различных растворов. Замороженные образцы должны быть нагреты до комнатной температуры при медленном и осторожном перемешивании. Не используйте вортекс или смешанные образцы пациентов. 3. При промывке стрипов следите, чтобы все стрипы были заполнены полностью и одинаково до верхнего уровня как показано на картинке. После промывки стрипов, проверьте, что стрипы сухие. Если что-либо осталось в лунках, то необходимо перевернуть планшету и встряхнуть на фильтровальную бумагу. Аспирирующее/промывочное оборудование не должно находиться заполненным с промывочным раствором длительный период времени, поскольку промывочные иглы могут быть закупорены и трудно проходимы для жидкости. В конце рабочего дня аспирировать дистиллированную воду в аспирирующую/промывочную систему. Промывочное устройство должно быть регулярно промываться раствором NaCL (30г/Л), а затем дистиллированной водой и 50% этанолом и в конце промыто дистиллированной водой. 4. Для избежания примеси европия и как результат высокого флюресцентного фона высокие требования предъявляются к процедуре раскапывания и промывки. Поэтому необычайно важно использовать рекомендуемые и поставляемые вместе с ДЕЛФИЯ пипетки. Усиливающий раствор должен быть раскапан только с использованием рекомендуемой ЭППЕНДОРФ мультипипеткой, и при этом первый объем сбрасывается для полного заполнения. Тот же тип Комбинаконечника не может быть использован для раскапывания любого другого реагента. После работы ЭППЕНДОРФ мультипипетка помещается на штатив с наконечником. При использовании ДЕЛФИЯ плейт диспенсера и ДЕЛФИЯ диспенсера юнита ознакомьтесь с описанием. ПОДСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ:
--- стр. 90 ---
АвтоДелфия Тироксин (Нео-Т4) DELFIA Neonatal Thyroxine (T4) Флюрометрический анализ с разрешением по времени для количественного определения неонатального тироксина (НЕО-Т4) в образцах высушенной крови человека Производитель - WALLAC Oy, Финляндия Для диагностического применения in vitro. ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В IN VITRO ДИАГНОСТИКЕ 1152 ОПРЕДЕЛЕНИЙ НАЗНАЧЕНИЕ: Набор предназначен для определения тироксина (НЕО-Т4) в образцах фильтровальных бланках для скрининга новорожденных на врожденный гипотиреоз (подтверждающая диагностика. Принцип основан на иммунофлю-оресцентом анализе, в котором определяемая молекула антител к НЕО-Т4 взаимодействует по типу реакции антиген антитело с сорбированными на поверхности планшета антигеном против антител к НЕО-Т4 и вторыми антителами, меченые флюоресцентной меткой. В результате реакции образуется высокофлюоресцентное соединение, концентрация которого определяется на приборе-флюорометре АВТОДЕЛФИЯ/ВИКТОР. Концентрация определяемого флюоресцирующего соединения прямо пропорциональна количеству антител к НЕО-Т4 в образцах сыворотки крови человека. СОСТАВ НАБОРА: 1.НЕО-Т4 стандарты - образцы крови человека высушенные на фильтровальной бумаге. К-во - 1 шт. 2.НЕО-Т4 контроли - образцы крови человека высушенные на фильтровальной бумаге. К-во - 1 шт. 3.НЕО-Т4 Eu раствор. 1 флакон, лиофилизированные 4.Анти-НЕО-Т4 раствор (мышиные, моноклональные) 1.5 мл (фл). К-во - 1 шт. 5.Промывочный концентрат; 250 мл(фл). К-во - 1 шт. 6.НЕО-Т4 инкубационный буфер; 250 мл(фл). К-во - 1 шт. 7.Усиливающий реагент; 250 мл(фл). К-во - 1 шт. 8.Анти-мышиные IgG микротитрационные стрипы (мышиные антитела); 96 луночные; К-во – 10 шт. ПРИНЦИП МЕТОДА: АВТОДЕЛФИЯ Нео-Т4 определение основано на твердофазном, флюороиммуном определении с разрешением по времени на основе конкуренции между меченым европием Т4 и Т4 в тестируемом образце за ограниченное количество мест связывания на Т4 -специфических моноклональных антителах (мышиные). Стандарты, контроли и образца пациентов, содержащие Т4 ингибируют связывание меченого европием Т4 с антителами. Блокирующие агенты в Т4 инкубационном буфере предотвращают выделение Т4 из связанного с белками состояния. Второе антитело взаимодействующее с анти-мышиными антителами, которые покрывают поверхность лунок и представляют твердую фазу, определяя высококачественное разделение антител-связанных и свободных антигенов Т4. В этом определении только одна инкубационная ступень. Усиливающий раствор диссоциирует ионы европия из меченого Т4 в раствор, где они формируют высокофлюоресцентные хелатные комплексы с компонентами усиливающего раствора. Флюоресценция каждой лунки в последующем измеряется. Флюоресцентный сигнал каждого образца обратно пропорционален количеству Т4 в образце. Каждый АВТОДЕЛФИЯ Нео-Т4 набор содержит реагентов необходимых для 1152 определений. Срок годности набора указан на внешней стороне коробки. Хранение при +2+8 С.
--- стр. 91 ---
МАТЕРИАЛЫ НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ С НАБОРОМ: Данный набор является частью комплексной системы иммунодиагностических реагентов и оборудования. АВТОДЕЛФИЯ система требует следующие компоненты, которые могут быть поставлены или от WALLAC OY или от его дистрибьютеров: 1. Флюорометр с временным разрешением плюс принтер и внешний компьютер. 2. Автоматический вошер - АВТОДЕЛФИЯ плейтвошер (Кат.№1296-024 или1296-026) 3. Автоматический шейкер-АВТОДЕЛФИЯ плейтшейкер(Кат.№1296-001или1296-003) 4. Пипетка для разливки АВТОДЕЛФИЯ буфера и метки - ЭППЕНДОРФ МУЛЬТИПИПЕТКА (1296-014) с 5 мл Комби наконечниками (1296-016) или в качестве альтернативы АВТОДЕЛФИЯ плейт диспенсер с АВТОДЕЛФИЯ диспенсер юнит (1296-041 или 1296-043). 5. Пипетка для разливки Усиливающего раствора - ЭППЕНДОРФ мультипипетка (1296-014) с 5 мл Комби наконечниками (1296-016) или альтернативно АВТОДЕЛФИЯ плейт диспенсер (1296-041). 6. АВТОДЕЛФИЯ растворитель I (Кат.№ В127-100, В128-100). В дополнении к АВТОДЕЛФИЯ системе необходимо следующее: - дозирующая пипетка для разливки микролитровых объемов - пипетки для разливки миллитровых объемов НЭ буфера требуемого для приготовления раствора метки и антител - дистиллированная вода СБОР ОБРАЗЦОВ И ХРАНЕНИЕ: Получение крови посредством венопункции, образование сгустка и выделение сыворотки посредством центрифугирования. Плазма, полученна с использованием ЭДТА и цитрата натрия не может быть использована, вследствии воздействия на хелатирующий европий. Однако может применяться плазма крови полученная с гепарином. Гемолитическая (гемоглобин>2г/Л), липемическая (>2 г/Л) и иктерическая (билирубин>30 мкмоль/Л) сыворотки использовать не рекомендуется. Если концентрация превышает 50 нмоль/Л следует развести сыворотки или нормальной женской сывороткой или АВТОДЕЛФИЯ дилюентом I. Образцы могут быть сохранены 12 часов при комнатной температуре или 3 дня при +2+8С. Для более длительного периода неразведенные образцы могут храниться при -20 С. Избегайте повторного замораживания размораживания. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ: Для диагностики ин витро. Следует соблюдать правила предосторожности США №CDC 88-8395 или местные правила. Можно считать все образцы крови пациентов как потенциально инфицированные. Реагенты содержат азид натрия в качестве консерванта. Азид натрия может взаимодействовать с металлическими поверхностями с образованием азидов металлов. Для предотвращения образования азидов металлов необходимо промыть большим количеством воды. Для дезинфекции всех сливных реагентов пользуйтесь правилами местных контролирующих организаций. Флюоресценция измеряется на флюорометре с временным разрешением. Выберите номер программы 50 для автоматического измерения и подсчета результатов. Сверьте параметры группы для программы №50 и если необходимо произведите коррекцию в соответствии со следующим (см. описание к флюрометру для проведения редакции параметров считывания): ASSAY TYPE FIA тип определения ФИА
--- стр. 92 ---
FITTING METHOD SPLINE SMOOTHED метод обработки метод “сглаживания” X-AXIS LOGARITHMIC х-ось логарифмическая Y-AXIS B/Bмакс у-ось B/Bмакс BLANKS 0 бланки 0 STANDARDS 6 стандарты 6 STANDARD REPLICATES 2 Убедитесь, чтобы концентрация стандарты в дупликате 2 стандартов, указанная на флаконах STANDARD CONC А совпадала с задаваемой. Если не стандарты конц. А совпадает, введите новые. STANDARD CONC В стандарты конц. В STANDARD CONC С стандарты конц. С STANDARD CONC D стандарты конц. Д STANDARD CONC Е стандарты конц. Е STANDARD CONC F стандарты конц. Ф UNKNOWN REPLICATES 2 неизвестные образцы в дубле 2 ОСОБЕННОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ: 1. Отношение к этому набору как к целому необходимо для успешного использования АВТОДЕЛФИЯ наборов. Реагенты в этом наборе являются комплексными компонентами. Не смешивайте идентичные реагенты из различных лотов. Не используйте реагенты после срока годности, указанной на флаконе. 2. Реагенты должны быть доведены до комнатной температуры (+20+25С) до приготовления различных растворов. Замороженные образцы должны быть нагреты до комнатной температуры при медленном и осторожном перемешивании. Не используйте вортекс или смешанные образцы пациентов. 3. При промывке стрипов следите, чтобы все стрипы были заполнены полностью и одинаково до верхнего уровня как показано на картинке. После промывки стрипов, проверьте, что стрипы сухие. Если что-либо осталось в лунках, то необходимо перевернуть планшету и встряхнуть на фильтровальную бумагу. Аспирирующее/промывочное оборудование не должно находиться заполненным с промывочным раствором длительный период времени, поскольку промывочные иглы могут быть закупорены и трудно проходимы для жидкости. В конце рабочего дня аспирировать дистиллированную воду в аспирирующую/промывочную систему. Промывочное устройство должно быть регулярно промываться раствором NaCL (30г/Л), а затем дистиллированной водой и 50% этанолом и в конце промыто дистиллированной водой. 4. Для избежания примеси европия и как результат высокого флюресцентного фона высокие требования предъявляются к процедуре раскапывания и промывки. Поэтому необычайно важно использовать рекомендуемые и поставляемые вместе с АВТОДЕЛФИЯ пипетки. Усиливающий раствор должен быть раскапан только с использованием рекомендуемой ЭППЕНДОРФ мультипипеткой, и при этом первый объем сбрасывается для полного заполнения. Тот же тип Комбинаконечника не может быть использован для раскапывания любого другого реагента. После работы ЭППЕНДОРФ мультипипетка помещается на штатив с наконечником. При использовании АВТОДЕЛФИЯ плейт диспенсера и АВТОДЕЛФИЯ диспенсера юнита ознакомьтесь с описанием. ПОДСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ:
--- стр. 94 ---
13905201-2 1 MS-8970EY
NeoGram® Набор для определения аминокислот и ацилкарнитинов методом тандемной масс-спектрометрии.
Инструкция по использованию. Реагенты для 1920 анализов.
Произведено: Wallac Oy, Турку, Финляндия. Для диагностики in vitro.
--- стр. 95 ---
13905201-2 2 NeoGram® Набор для определения аминокислот и ацилкарнитинов методом тандемной масс-спектрометрии. Предназначение Набор предназначен для измерения и оценки концентрации аминокислот, свободного карнитина и ацилкарнитина в высушенном на фильтровальной бумаге образце крови полученном из прокола пятки новорожденного. Измерение концентрации аминокислот, свободного карнитина и ацилкарнитина а также соотношения их концентраций помогает при скрининге нарушений метаболизма аминокислот и нарушениях при окислении жирных и органических кислот. Краткий обзор и объяснение принципа анализа. Повышенный уровень аминокислот, свободного карнитина и ацилкарнитина в крови новорожденных указывает на одно или несколько отдельных нарушений метаболизма. Свободный карнитин и ацилкарнитин являются индикаторами нарушений метаболизма, которые обычно классифицируются как нарушения в окислении жирных кислот (ОЖК) и нарушения органической ацидурии (ОА) (1-5). Подобно карнитинам, аминокислоты используются как индикаторы группы из нескольких метаболических нарушений известных под общим названием Ацидопатий. Эти расстройства являются врожденными нарушениями метаболизма (или генетическими недостатками метаболизма) (1-6). Представленный набор позволяет измерить более 40 веществ, хотя он поставляется с 24 внутренними стандартами и 23 контролями. Это возможно потому что разные ацилкарнитины с одинаковой длиной углеродной цепочки имеют одинаковые характеристики при анализе данным методом. Таким образом принимается допущение что например С18, С18:1, С18:2 и С18:0Н имеют похожие рабочие характеристики, и для измерения их концентраций можно использовать один внутренний стандарт С18. Предполагается что может меняться правильность, но не точность измерений. Таким образом пока внутренний стандарт, выбранный что бы подсчитать концентрацию определенного вещества, остается постоянным при анализах образцов пациентов, можно отличить образцы с предположительно нормальной и предположительно повышенной концентрацией исследуемого вещества. Похожий аргумент может быть применен для обоснования использования внутренних стандартов аминокислот при измерении концентрации аминокислот не представленных в наборе внутренних стандартов. Нарушения метаболизма аминокислот. При аминоацидопатиях ферменты, ответственные за метаболизм определенных аминокислот, недоступны или имеют пониженную активность. Как результат этого концентрация соответствующих аминокислот и альтернативных метаболитов в теле новорожденного повышается, что может привести к тяжелым вредным воздействиям на здоровье новорожденного включая смерть. Вот некоторые обычно изучаемые ацидопатии: Фенилкетонурия (ФКН) – нарушение метаболизма ароматических аминокислот, при котором фенилаланин не может быть превращен в тирозин. Если ФКН не лечить, то она ведет к задержкам умственного развития различной степени тяжести.
--- стр. 96 ---
13905201-2 3 Гиперфенилаланинемия - ведет к задержке умственного развития и мышечной ригидности. Гомоцистеинурия – ведет к заболеваним связанным с окклюзией сосудов, остеопорозу, накоплению гомоцистеина и метионина, и различнм задержкам в развитии. Заболевание «Моча как кленовый сироп» (лейциноз)Вызвано нарушениями метаболизма альфа кетокислот: аминокислот с разветвленной цепью, в результате которых в крови накапливаются лейцин, изолейцин и валин. Нелеченное заболевание приводит к задержке развития, конвульсиям, развивается летаргия переходящая в кому. Тирозинемия тип 1 ( наследственная тирозинемия) ведет к отказу печени или хроническому циррозу и гепатоцеллюлярной карциноме. Цитрулиннемия ведет к конвульсиям, анорексии, рвоте и летаргии с быстроследующей, потенциально летальной, комой. Нарушения окисления жирных кислот (ОЖК) При нарушеняж ОЖК, необходимые ферменты недоступны или их активность снижена. Деградация или окисление жирных кислот необходимы для обеспечения энергией в случаях пониженного уровня глюкозы в крови. Без этого источника энергии некоторые люди могут быть подверженны влияниям низкого уровня сахара в крови. В случаях голодания, часто вызываемого такими заболеваниями как инфекция уха или грипп, может случится метаболический кризис. Он вызывает рвоту, диарею, летаргию, припадки или кому. Непродиогностированные нарушения ОЖК могут привести к черезмерному накоплению жира в печени, сердце и почках. Ожирение этих органов может вызвать различные симптомы начиная от отказа печени, энцефалопатии, нарушения работы сердца и глаз, общих проблемах с мышечным развитием. Многие из этих клинических симптомов приводят к смерти. Смерти связанные с нарушениями ОЖК могут быть неправильно продиагностированы как синдром внезапной смерти младенцев, синдром Рейе (Reye’s Syndrome).(1-6) Нарушения органической ацидурит (ОА) При нарушениях ОА прерываются метаболические пути деградации органических кислот что ведет к их накоплению в крови и моче и изменению кислотно-основного баланса тела. Модификации и адаптации промежуточных метаболических путей, вызванные этими нарушением, могут вызвать различные клинические синдромы такие как метаболический ацидоз, кетоз, гипераммонемия, остановка роста, сепсис или кома. Принципы анализа Измерения количества аминокислот, свободного карнитина, и ацилкарнитинов начинаются с экстракции, высушенных на фильтровальной бумаге, капель крови взятых у новорожденных пациентов, раствором, содержащим внутренние стандарты, меченные стабильными изотопами. Далее производится анализ системой тандемной масс-спектрометрии (MS/MS). Ответ каждого из анализируемых веществ относительно соответствующего внутреннего стандарта пропорционален его концентрации. В наборе NeoGram® для определения аминокислот и ацилкарнитинов методом тандемной масс-спектрометрии, экспериментальные данные получают в режимах «средней потери 102», «йона предшественника 85» и режиме мониторинга многократных реакций «MMR». При сканировании, йоны, полученные в результате столкновения каждого из анализируемых веществ с атомами азота, измеряются в течении установленного времени.
--- стр. 100 ---
13905201-2 7 C18) Стандарты аминокислот 15N,2-13C-Глицин 91795-59-42 2.5 2H4-Аланин 56-41-7 0.5 2H8-Валин 72-18-4 0.5 2H3-Лейцин 87828-86-2 0.5 2H3-Метионин 13010-53-2 0.5 2H5-Фенилаланин 63-91-2 0.5 13C6-Тирозин 60-18-4 0.5 2H3-Аспартат 56-84-8 0.5 2H3-Глютамат 96927-56-9 0.5 2H2-Орнитин 2HCl 3184-13-2 0.5 2H2-Цитруллин 372-75-8 0.5 2H4,-13C-Аргинин HCl 1119-34-2 0.5 Компонент Количество Срок и условия хранения Контроли: Высушеннные пятна крови Низкий уровень АК, К, АцК Высокий уровень
2 карточки из фильтровальной бумаги (Shleicher & Schuell, no.903) содержащие по 5 пятен каждого уровня на карточку
Хранить охлажденными, защищенным от влаги и света в оригинальных упаковках с диссикантом. Стабилен при +2 - +8 оС, дата окончания срока хранения указана на упаковке. Убедитесь что пластиковый конверт остается запечатанным все время хранения. Вещества включенные в контроли и их приблизительная средняя концентрация (мкмоль/Л). Вещество Контроль, низкий уровень Контроль, высокий уровень Свободный карнитин (С0) 163.3 394.6 Ацетилкарнитин (С2) 41.2 82.9 Пропионилкарнитин (С3) 5.5 14.3 Бутирилкарнитин (С4) 4.2 11.3 Гексаноилкарнитин (С6) 0.8 2.2 Октаноилкарнитин (С8) 1.2 3.1 Деканоилкарнитин (С10) 0.6 1.5 Лаурилокарнитин (С12) 2.7 8.0 Миристоилкарнитин (С14) 1.7 4.8 Пальмитоилкарнитин (С16) 10.7 30.5 Октадеканоилкарнитин (С18) 1.9 4.5 Аланин 580 1336 Аспартат 336 836 Цитруллин 189 572 Глютамат 417 903 Глицин 578 1468 Лейцин 578 1466 Метионин 120 369 Фенилаланин 283 827 Тирозин 329 1033
--- стр. 101 ---
13905201-2 8 Валин 329 770 Номинальные концентрации (среднее и стандартное отклонение) для каждого вещества даны в приложенном к каждому набору сертификате контроля качества. Контроли приготовлены из цельной человеческой крови. Перед распылением на бумагу Schleicher & Schuell но.903, концентрация гемоглобина около 179гр/л, гематокрит 50-55%, что примерно соответствует крови новорожденного. NeoGram АААС растворитель 3 бутылки по 473мл +2 - +300С до окончания срока хранения указанного на упаковке. Защищать от света и нагревания. Реагент готов к использованию; содержит ацетонитрил (чистоты HPLC) и воду. Примечание: Обращаться с особой осторожностью! Использовать под колпаком защищающим от химических паров. При работе необходимо носить подходящую защитную одежду, перчатки и защиту для глаз. Легко воспламеним. Вреден при вдыхании, контакте с кожей и проглатывании. Раздражает глаза. При случайном попадании в глаза немедленно сполосните большим количеством воды и обратитесь к врачу. Не выливать в водопровод. Неограм АААС раствор для экстракции 1 бут. 237 мл. Неограм АААС раствор для реконституции 1 бут. 180 мл. 3-х нормальная соляная кислота в н-бутаноле 2 бут. по 100 мл. Микропланшеты непокрытые, 96-ти луночные 40 шт. Алюминиевая фольга для покрытия планшет 20 листов Адгезивное покрытие для планшет 20 листов Запаивающая пленка 20 шт. Требуемые материалы не включенные в набор. Набор NeoGram AAAC является частью полного набора реагентов и инструментов для неонатального скрининга. Он включает в себя следующие компоненты, доступные через Revvity Inc. или его дистрибьютеров: 1. Масс спетрометр Wallac MS2 (н.п. 1445-001) 2. Компьютерная программа NeoGram 3. Ваккумный дегазатор PerkinElmer серия 200 (н.п.MS-1110) 4. Автосемплер PerkinElmer серия 200 (н.п.MS-1050) или Gilson 215 (н.п.MS-1250) 5. Микронасос PerkinElmer серия 200 (н.п. MS-1030) 6. Концентратор для плашек с образцами. 7. Автоматический пробойник Wallac DBS (н.п.1296-071) или Wallac MultiPuncher™ 3 (н.п.1296-081) или ручной пробойник для вырезания дисков диаметром 3.2мм (1/8 дюйма) из фильтровальной бумаги. 8. Thermo iEMS инкубатор шейкер (н.п.1296-008 или н.п.1296-009) 9. Abgene заклеиватель плашек (110 вольт н.п. MS-2500 или 240 вольт MS-2501) Дополнительно для работы системы необходимы: 3 MultiPuncher - торговая марка PerkinElmer, inc.
--- стр. 102 ---
13905201-2 9 - Ручной или автоматический 8 канальный дозатор, но объемы 30-300мкл, или автосемплер Apricot Sample Processor (н.п. MS-550XD) - Наконечники для пипеток - Пипетки или градуированные цилиндры для измерения милилитровых объемов реагентов. - Емкости для реагентов (например емкости для растворов фирмы Labcor Products, inc.) - Колпак защищающий от химических испарений. - Источник сжатого воздуха для высушивания плашек (в отсутствии сжатого воздуха могут быть использованы цилиндры сосжатым азотом) - Бумажные карточки для образцов (использовать бумагу одобренную FDA). Отбор и манипуляции с образцами. Капли крови из прокола в пятке новорожденного должны быть перемещены непосредственно на фильтровальную бумагу. Программы неонатального скрининга отличаются одна от другой по типам требуемых образцов. В США рекомендуется капля крови диаметром 12.7мм (1/2 дюйма), собранная через прокол в пятке и перенесенная на фильтровальную бумагу. Мы рекомендуем использовать фильтровальную бумагу одобренную FDA для сбора образцов. Анализы основанные на использовании в качестве образцов высушенных капель крови, требуют опытного отбора, манипуляции и транспортировки образцов (7). Техника отбора образцов детально описана в документе NCCLS (Национальный Комитет по Клиническим Лабораторным Стандартам) под номером LA4-A3 (8). - Очистить кожу на пятке новорожденного тампоном смоченном в спирте и дать ей подсохнуть. - Проколоть кожу стерильным ланцетом (или автоматическим устройством). Прокол глубже 2х миллиметров может вызвать повреждение кости новорожденного. - Стереть первую каплю крови. Аккуратно коснуться фильтровальной бумагой большой капли крови и дать крови промочить фильтровальную бумагу насквозь в один прием. Пятна крови должен быть больше диаметра круга напечатанного на бумаге. Проверьте обе стороны бумаги чтобы убедиться что кровь промочила её насквозь. «Доение» или сжимание прокола может вызвать гемолиз образца или подмешивание тканевой жидкости к образцу. Не наслаивайте последовательно капли крови на бумагу, так как это вызывает спекание. - Высушивайте образцы на воздухе в течении как минимум 3х часов при комнатной температуре. Не помещайте под прямой свет. - Убедитесь что в карточку приложенную к образцу занесена необходимая информация которая включает имя, адрес, идентификационный номер новорожденного; название и адрес больницы; имя, адрес и телефон врача который должен быть извещен. Запишите время и дату рождения ребенка, а также время и дату сборки образца. Запишите был ли новорожденный недоношенным или родился позднее срока; Запишите вес ребенка при рождении и отметьте был ли он одним из близнецов.
--- стр. 103 ---
13905201-2 10 -Поместите каждый образец в отдельный бумажный конверт и доставьте его в лабораторию в течении 24 часов после сбора. Образцы можно хранить при комнатной температуре (+20 - +25оС) или охлажденными (+2 - +8оС) в течении 21 дня. Предупреждения и предосторожности. Использовать только для диагностики in vitro. Анализы должны проводится адекватно обученным персоналом Все оборудование должно обслуживаться квалифицированными специалистами Настоящий набор содержит реагенты, изготовленные из компонентов человеческой крови. Исходные материалы давали отрицательный результат на наличие поверхностных антигенов гепатита Б, антител 1 и 2 анти-гепатита С и анти-ВИЧ и в иммуноанализе. Тем не менее, при обращении с производными крови следует соблюдать все рекомендуемые меры предосторожности. Вы можете ознакомиться с ними в публикации Департамента Здоровья и Сферы Услуг США «Биобезопасность в микробиологических и биомедицинских лабораториях» или в любых иных местных или национальных документах, определяющих такие меры. Обращайтесь со всеми образцами как с потенциально инфекционными. Ацетонитрил содержащийся в растворителе (NeoGram AAAC Flow Solvent), растворе для реконституции (NeoGram reconstitution solution) легко воспламеним. Вреден при вдыхании, при контакте с кожей и при проглатывании. В случае контакта с кожей немедленно промойте большим количеством воды и обратитесь к врачу. Не выливайте в канализацию. Метанол содержащийся в растворе для экстракции (NeoGram AAAC Extraction Solution) легко воспламеним. Токсичен: имеется опасность очень тяжелых необратимых поражений при вдыхании, контакте с кожей и проглатывании. Обратитесь к доктору немедленно в случае контакта, аварии или если вы плохо себя чувствуете после работы с данным реактивом. Обратитесь к доктору немедленно (покажите этикетку если возможно). Не выливайте в канализацию. - 3х нормальная HCl в n-бутаноле едкая жидкость, вызывает тяжелые ожоги. Раствор легко воспламеним; испаряясь может вызвать сонливость, слабость. При работе носите специальную защитную одежду, перчатки, защиту глаз/лица. В случае контакта с глазами немедленно промойте их большим количеством воды и обратитесь к врачу. В случае аварии или если вы чувствуете нездоровье – немедленно обратитесь к врачу (возьмите этикетку если можно) Следуйте местным инструкциям по обращению и утилизации опасных отходов. Процедура анализа 1. Подготовка внутренних стандартов. а) Добавьте 1 мл экстракционного раствора NeoGram (NeoGram AAAC extraction solution) в пробирку с лиофилизованными стандартами аминокислот. Добейтесь их полного растворения (это может занять до 2х часов). Раствор стабилен в течении 30 дней при температуре +2 - +8оС.
--- стр. 104 ---
13905201-2 11 б) Добавьте 1 мл экстракционного раствора NeoGram (NeoGram AAAC extraction solution) в пробирку с высушенными стандартами ацилкарнитинов. Этот раствор стабилен в течении 30 дней при температуре +2 - +8оС. в) Смешайте одинаковое количество растворов внутренних стандартов (полученных в пунктах а и б), затем разведите их экстракционным раствором NeoGram 1:200 (NeoGram AAAC extraction solution) В таблице ниже даны несколько примеров такого разведения. Этот раствор будет экстракционным раствором для ежедневной работы. Он содержит внутренние стандарты аминокислот и ацилкарнитинов. Срок хранения раствора 24часа. Его необходимо готовить ежедневно. Хранить предпочтительно при температуре +2 - +8оС в защищенном от света месте. Количество плашек АК внутренний стандарт (мкл) АцК внутренний стандарт (мкл) Экстракционный раствор (мл) Конечный объем (мл) 1 50 50 9.9 10 2 100 100 19.8 20 3 150 150 29.7 30 4 200 200 39.6 40 5 250 250 49.5 50 10 500 500 99.0 100 20 1000 1000 198 200 2. Вырежьте диск из фильтровальной бумаги содержащий высушенные образцы крови. Используя автоматический или ручной вырезатель. в ячейки с V-образным дном предоставленных обрезанных чистых микроплашек. Диаметр дисков должен быть приблизительно 3.2мм (1/8 дюйма). В одну ячейку можно добавить только один диск. Рекомендуется использовать первые 2-4 ячейки каждой плашки как бланковые (добавлять только ежедневным рабочий экстракционный раствор, содержащий внутренние стандарты аминокислот и ацилкарнитинов). 3. Используя мультиканальный пиппетор и обратное пиппетирование добавьте 90 мкл дневным рабочим экстракционный раствор к каждой ячейке содержащей диск из фильтровальной бумаги. Закройте плашку липучим покрытием для микроплашек и убедитесь, что хорошо закрыто чтобы минимизировать испарение. 4. Немедленно после закрытия поместите плашку в инкубатор/шейкер при +30оС на 30 минут. (Плашки можно встряхивать на скоростях от 650 до 750 об/мин. 5. Уберите плашку из инкубатора/шейкера и удалите покрытие с плашки. Переместите по 60мкл раствора в жароустойчивую микроплашку фирмы Nunc с дном V-образной формы. 6. Дайте жидкости в образцах полностью испарится. 7. Используя технику обратного пиппетирования налейте 50мкл 3 нормальной соляной кислоты в n-бутакноле в каждую ячейку (жароустойчивой микроплашки фирмы Nunc с дном V-образной формы). 8. Закройте плашку пленкой, которая запаяет ее при разогреве; инкубируйте 30мин при +60оС. 9. Снимите защитную пленку и дайте жидкости в образцах полностью испарится. 10. Используя технику обратного пиппетирования добавьте 75мкл раствора для реконституции (NeoGram reconstitution solution) в каждую ячейку в микроплашке. Закройте плашку алюминиевой фольгой, встряхивайте ее в течении 10 минут при +27оС (плашки можно встряхивать на скоростях от 400 до 750 об/мин) 11. Поместите плашку с образцами в автосемплер. 12. Чтобы приступить к анализу запустите программу NeoGram, создайте рабочие листы, и выберите подходящий метод получения данных. За подробной информацией обращайтесь к инструкции по использованию программы.
--- стр. 105 ---
13905201-2 12 Примечание: - Во время установки прибора, квалифицированный персонал высоту спрея для вашего отдельного инструмента. Эта оптимальная позиция будет обозначена местоположение посещение отчете. Убедитесь что вы настроили высоту до оптимальной позиции перед тем как начать анализ. - Используйте только те концентрации внутренних стандартов (радиоактивно меченных аминокислот, свободного карнитина и ацилкарнитинов) которые указаны в сертификате контроля качества приложенном к каждому из наборов. - Служебные файлы сбора данных должны изменяться только квалифицированным персоналом. Использование штрихкодовых наклеек Наклейки со штрихкодами прилагаемые к этому набору предназначены для того чтобы плашки могли быть распознаны прибором, и связаны с соответствующим рабочим листом в программе. Этикетка со штрихкодом может быть помещена на любую боковую поверхность плашки. Примечания по процедуре. 1. Полное понимание того что написано в этой инструкции необходимо для успешного использования набора NeoGram AAAC. Реагенты поставляемые с набором предназначены для использования как единое целое. Не смешивайте идентичные реагенты из наборов с разными номерами партий. Не используйте реагенты после окончания срока хранения указанного на этикетке набора. 2. Адгезивное покрытие микроплашки используемое на этапе экстракции и пленка используемая на этапе получения производных должны покрывать все ячейки с реагентами целиком, что бы снизить до минимума испарение. 3. Алюминивая фольга используемая для закрытия микроплашки должна плотно прилегать к поверхности плашки и обернута вокруг всех сторон чтобы минимизировать испарение. 4. Используйте обратное пиппетирование для добавления растворов реагентов в ячейки для анализа (соляной кислоты в бутаноле и раствор для реконституции ). Обратное пиппетирование в целом более точно при работе с малыми объемами. 5. Использование растворов, однажды вылитых, не рекомендуется. 6. Проверьте выдавился ли диск в ячейку. Подсчет результатов Система анализа NeoGram AAAC включает в себя программу для подсчета концентрации аминокислот, карнитина и всех видов ацилкарнитинов (насыщенных, ненасыщенных, гидроксилированных и дикарбоксилированных), а также соотношений концентраций этих веществ. Эти значения вычисляются путем сравнения измеренных интенсивностей анализируемых веществ с интенсивностями внутренних стандартов (находящихся в экстракционном растворе для ежедневной работы). Результаты измерений выдаются ввиде распечаток этих значений (см. Инструкцию по использованию программы NeoGram). Контроль качества Контрольные образцы крови содержащие верхний и нижний уровень концентраций исследуемых веществ должны присутствовать в двух экземплярах на каждой плашке. Средние значение и стандартное отклонение анализируемых веществ в каждом из
--- стр. 106 ---
13905201-2 13 контролей, указаны в прилагаемом сертификате контроля качества. В добавок ко включенным внутренним контролям, хорошо использовать измерять образцы внешнего контроля – они помогут объединить результаты измерений полученные с использованием наборов разных номеров партий. Мы также рекомендуем использование внешних схемах оценки качества. Примечание: Средние значения контролей получены путем многократного их измерения с использованием набора NeoGram AAAC. Эти значения являются средним от всех измерений. Ограничения процедуры Как и любой другой тест in-vitro, информация, полученная при использовании набора NeoGram AAAC должна интерпретироваться совместно с данными, полученными в других медицинских исследованиях. Результаты должны быть интерпретироваться совместно с другой клинической информацией доступной врачу. Данная диагностическая процедура должна быть использована для подтверждения предположительно повышенных профилей концентрации аминокислот и ацилкарнитинов. Условия, вызывающие получение аномальных результатов анализа: - Анализируемое пятно не равномерно насыщено кровью - Анализируемые пятна вырезаны слишком близко к кровяным пятнам. - Неправильно собранные или высушенные образцы - Неэлюированные кровяные пятна, это связано с порчей образца вызванной нагреванием и влажностью. - Загрязнение фильтровальной бумаги или образца фекальными массами. Такие переменные как гематокрит, недоношенность, или возраст новорожденного могут повлиять на интерпретацию результатов. Неполное бутилирование ацилкарнитинов с соотношением m/z в пределах от 260 (С6) до 428.2 (С18) может интерферировать с определением бутилированных ацилкарнитинов с меньшим размером цепей (С2-С14).Избыток 3х нормальной соляной кислоты в бутаноле используемый в этом методе минимизирует этот эффект. Дибутилированный глютамат и бутилированный С2 имеют одно и тоже соотношение m/z (260). Во время активации столкновением, оба дают йон фрагмент с m/z 85. Таким образом а режиме «предшественника йона 85», используемом при анализе ацилкарнитинов имеется потенциальная возможность интерференции с глютамином при подсчете С2. Однако эффект глютамата на результаты измерений С2 более всего значим (снаружи диапазона 2 СД) при концентрациях глютамата более чем 204 мкмоль/литр (3 мг/дл) в крови. Таким образом в нормальной ситуации уровень глютамата в крови не превышает 204 мкмоль/литр и следовательно не ожидается значительной интерференции. Сообщалось что пивалиевая кислота (Pivalic Acid, антибиотик, который мог приниматься во время беременности матерью или назначаться младенцу) является предшественником пивалилкарнитина. Пивалилкарнитин является изомером изовалерилкарнитина (диагностического маркера Isovaleric academia IVA) и следовательно присутствие повышенного пивалилкарнитина у новорожденного который принимал пивалиевую кислоту может вызвать ложноположительный результат на IVA. Далее см. Секцию «Примечания по процедуре анализа» Ожидаемые значения и интерпретация результатов. Каждая лаборатория должна провести предварительные исследования чтобы определить распределение концентраций каждого из веществ в их собственной субпопуляции. Из этих
--- стр. 107 ---
13905201-2 14 распределений должны быть определены значения средних и отсечек . Значения отсечек должны быть сравнены с опубликованными данными, и в тоже время детально определены исходя из используемой методологии и популяции пациентов. Значения отсечек для определения ненормальных концентраций каждого вещества должны быть установлены с использованием статистических измерений (например распределений, средних и стандартных отклонений) при консультации со специалистами по метаболическим нарушениям. Подтверждение предполагаемых ненормальных концентрационных профилей аминокислот и ацилкарнитинов должны быть основаны на предопределенных значениях отсечек, полученных из предварительных исследований в которых измерено не менее 5000 образцов с помощью набора NeoGram AAAC. С увеличением числа образцов и подтверждений предположительно позитивных результатов, полученных в данной лаборатории, рекомендуется чтобы эти данные были использованы для пересмотра значений отсечек на регулярной основе. Лаборатории могут установить два значения отсечек для определения ненормальных результатов. Одно значение – будет концентрации при которой подтверждаются необходимо немедленное отправление результатов в клинику, для принятия соответственно немедленное направление команды клинической управления чтобы следовать. Второе значение будет пограничной концентрацией при которой требуется взятие новых образцов и проведение повторных тестов (3). В дополнении к определению концентраций исследуемых веществ, лаборатории должны также анализировать соотношения между их концентрациями, чтобы лучше отображать аминокислотные и ацилкарнитиновые профили для каждого образца. Результаты анализов на ацилкарнитины могут варьировать в зависимости от возраста младенца и времени взятия анализов; это связано с тем что концентрация ацилкарнитинов существенно уменьшается со временем. Примечания: - Эта информация предоставлена в качестве рекомендации. Настоятельно рекомендуется каждой лаборатории провести предварительные исследования чтобы определить частоту распределений концентраций и значения отсечек для своих пациентов. - Подтверждение диагностической тестовой процедурой может быть выполнено для образцов с предполагаемыми ненормальными значение профилей концентраций. - Следуйте местным требованиям по слежению за тестированием. Предположительно отрицательные: Каждая лаборатория должна также установить нижнее значение отсечки. Аналитические рабочие характеристики4 Линейность Линейность анализа была определена тестированием образцов (высушенные пятна крови) содержащих различные концентрации аминокислот и ацилкарнитинов. Были приготовлены образцы (высушенные на фильтровальной бумаге пятна крови) с высокими концентрациями аминокислот и ацилкарнитинов. Эти пятна были вырезаны из бумаги и 4 Исследования проведены PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Нортон ОН США, использовалась бумага S&S №903
--- стр. 108 ---
13905201-2 15 экстрагированы с помощью раствора для экстракции. Были сделаны последовательные 2х кратные разведения этих экстрактов с помощью нулевого экстракционного раствора. Чистый экстракционный раствор был использован в качестве нулевой концентрации. Для каждого анализируемого вещества средняя измеренная концентрация была отложена на графике напротив теоретически рассчитанного количеством добавленного вещества. Затем был выполнен анализ линейной регрессии. Результаты этих построений представлены в таблицах 1 и 2. Таблица 1.Верхние и нижние пределы линейности (мкмоль/литр) Ацилкарнитины Пределы C0 C2 C3 C4 C5DC C6 C8 C10 C12 C14 C16 C18
Верхний 1062.5 127.5 57.18 27.03 2.50 10.03 8.22 5.4 15.97 24.5 61.4 10.25
Нижний 2.13 0.13 0.09 0.02 0.16 0.01 0.02 0.01 0.04 0.01 0.04 0.01 R2 0.9986 0.9954 0.9990 0.9985 0.9964 0.9971 0.9984 0.9971 0.9988 0.9989 0.9969 0.9982
Таблица 2.Верхние и нижние пределы линейности (мкмоль/литр) Аминокислоты Пределы Ала Арг Асп Цит Глю Гли Лей Мет Орн Фен Тир Вал
Верхний 2397.5 404.3 595.0 1527.5 1907.5 3805.0 1950.0 913.3 978.0 1665.5 2787.5 1840.0
Нижний 4.92 0.31 1.54 0.53 1.11 9.81 9.06 8.03 1.60 0.75 1.42 114.8 R2 0.9980 0.9992 0.9994 0.9954 0.9985 0.9962 0.9929 0.9988 0.9996 0.9974 0.9986 0.9957
Функциональная чувствительность Нижние пределы линейности из таблиц 1 и 2 представляют собой функциональную чувствительность анализа для каждого из анализируемых веществ. Для того чтобы определить являются ли полученные значения функциональной чувствительности подходящими для использования при скрининге новорождённых, представленные значения были сравнены с средними эндогенными уровнями веществ определенными при обследовании 5000 нормальных новорожденных (Таблицы 3 и 4). Все уровни функциональной чувствительности находятся ниже нормальных эндогенных концентраций исследуемых веществ, что означает что эти пределы адекватны для использования при скрининге уровня аминокислот и ацилкарнитинов в крови новорожденных. Таблица 3 Сравнение функциональной чувствительности и нормальной эндогенной концентрации (мкмоль/литр) Ацилкарнитины Пределы C0 C2 C3 C4 C5DC C6 C8 C10 C12 C14 C16 C18 Функциональная чувствительность 2.13 0.13 0.09 0.02 0.16 0.01 0.02 0.01 0.04 0.01 0.04 0.01 Эндогенная концентрация 38.66 21.0 2.46 0.50 0.10 0.19 0.19 0.14 0.31 0.32 3.59 0.97
--- стр. 115 ---
Глюкоза-6 фосфатдегидрогеназа (Г6ФД) -Неонатал Neonatal G6PD Флюорометрический анализ с разрешением по времени для количественного определения Глюкозо-6 фосфодиэстераза в сухом пятне крови Производитель - WALLAC Oy, Финляндия Для диагностического применения in vitro. ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В IN VITRO ДИАГНОСТИКЕ 960 ОПРЕДЕЛЕНИЙ НАЗНАЧЕНИЕ: Набор диагностических реактивов для скрининга новорожденных на наследственные болезни обмена. Используется для количественного измерения концентрации Г6ФД в сухих пятнах крови на фильтровальной бумаге. . СОСТАВ НАБОРА: 1.Калибраторы: 1 карточка фильтровальной бумаги с пятнами высушенной крови . 2.Контроли: 1 карточка фильтровальной бумаги с пятнами высушенной крови 3.Субстрат: 10 фл., лиофил. 4.Восстанавливающий буфер: 1 бут., 118 мл 5.Медный реагент: 1 бут., 240 мл 6.Микропланшеты непокрытые, 96-ти луночные: 10 шт. ПРИНЦИП МЕТОДА: Глюкоза-6 фосфатдегидрогеназа (Г6ФД) –Неонатал определение основано на твердофазном, дву-сайтовом флюороиммунометрическом определении с разрешением по времени на основе прямого сэндвич методе при котором два антитела (кроличьи и мышиные) направлены против двух различных антигенных детерминантах на молекуле Г6ФД . Стандарты, контроли и тестируемые образцы содержащие Г6ФД одноврменно реагируют и с иммобилизированными моноклональными антителами, направленными против специфических антигенных сайтов на молекуле Г6ФД и меченными европием вторыми моноклональными антителами (направленными против разных антигенных детерминантов) в инкубационном Г6ФД буфере. Буфер элюирует Г6ФД из высушенных пятен крови. Для выполнения определения требуется только одна инкубационная ступень. Усиливающий раствор диссоциирует ионы европия из меченого антигена в раствор, где они формируют высокофлюоресцентные хелатные комплексы с компонентами усиливающего раствора. Флюоресценция каждой лунки в последующем измеряется. Флюоресцентный сигнал каждого образца прямо пропорционален количеству Г6ФД в образце. Каждый Глюкоза-6 фосфатдегидрогеназа (Г6ФД) –Неонатал набор содержит реагентов необходимых для 960 определений. Срок годности набора указан на внешней стороне коробки. Хранение при +2+8 С. МАТЕРИАЛЫ НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ С НАБОРОМ: Данный набор является частью комплексной системы иммунодиагностических реагентов и оборудования. ДЕЛФИЯ система требует следующие компоненты, которые могут быть поставлены или от WALLAC OY или от его дистрибьютеров:
--- стр. 116 ---
1. Флюорометр с временным разрешением плюс принтер и внешний компьютер. 2. Автоматический вошер - ДЕЛФИЯ плейтвошер (Кат.№1296-024 или1296-026) 3. Автоматический шейкер-ДЕЛФИЯ плейтшейкер(Кат.№1296-001или1296-003) 4. Пипетка для разливки ДЕЛФИЯ буфера и метки - ЭППЕНДОРФ МУЛЬТИПИПЕТКА (1296-014) с 5 мл Комби наконечниками (1296-016) или в качестве альтернативы ДЕЛФИЯ плейт диспенсер с ДЕЛФИЯ диспенсер юнит (1296-041 или 1296-043). 5. Пипетка для разливки Усиливающего раствора - ЭППЕНДОРФ мультипипетка (1296-014) с 5 мл Комби наконечниками (1296-016) или альтернативно ДЕЛФИЯ плейт диспенсер (1296-041). 6. ДЕЛФИЯ растворитель I (Кат.№ В127-100, В128-100). В дополнении к ДЕЛФИЯ системе необходимо следующее: - дозирующая пипетка для разливки микролитровых объемов - пипетки для разливки миллитровых объемов НЭ буфера требуемого для приготовления раствора метки и антител - дистиллированная вода СБОР ОБРАЗЦОВ И ХРАНЕНИЕ: Получение крови посредством венопункции, образование сгустка и выделение сыворотки посредством центрифугирования. Плазма, получена с использованием ЭДТА и цитрата натрия не может быть использована, вследствие воздействия на хелатирующий европий. Однако может применяться плазма крови полученная с гепарином. Гемолитическая (гемоглобин>2г/Л), липемическая (>2 г/Л) и иктерическая (билирубин>30 мкмоль/Л) сыворотки использовать не рекомендуется. Если концентрация превышает 50 нмоль/Л следует развести сыворотки или нормальной женской сывороткой или ДЕЛФИЯ дилюентом I. Образцы могут быть сохранены 12 часов при комнатной температуре или 3 дня при +2+8С. Для более длительного периода неразведенные образцы могут храниться при -20 С. Избегайте повторного замораживания размораживания. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ: Для диагностики ин витро. Следует соблюдать правила предосторожности США №CDC 88-8395 или местные правила. Можно считать все образцы крови пациентов как потенциально инфицированные. Реагенты содержат азид натрия в качестве консерванта. Азид натрия может взаимодействовать с металлическими поверхностями с образованием азидов металлов. Для предотвращения образования азидов металлов необходимо промыть большим количеством воды. Для дезинфекции всех сливных реагентов пользуйтесь правилами местных контролирующих организаций. Флюоресценция измеряется на флюорометре с временным разрешением. Выберите номер программы 50 для автоматического измерения и подсчета результатов. Сверьте параметры группы для программы №50 и если необходимо произведите коррекцию в соответствии со следующим (см. описание к флюрометру для проведения редакции параметров считывания): ASSAY TYPE FIA тип определения ФИА FITTING METHOD SPLINE SMOOTHED метод обработки метод “сглаживания” X-AXIS LOGARITHMIC х-ось логарифмическая Y-AXIS B/Bмакс у-ось B/Bмакс BLANKS 0
--- стр. 117 ---
бланки 0 STANDARDS 6 стандарты 6 STANDARD REPLICATES 2 Убедитесь, чтобы концентрация стандарты в дупликате 2 стандартов, указанная на флаконах STANDARD CONC А совпадала с задаваемой. Если не стандарты конц. А совпадает, введите новые. STANDARD CONC В стандарты конц. В STANDARD CONC С стандарты конц. С STANDARD CONC D стандарты конц. Д STANDARD CONC Е стандарты конц. Е STANDARD CONC F стандарты конц. Ф UNKNOWN REPLICATES 2 неизвестные образцы в дубле 2 ОСОБЕННОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ: 1. Отношение к этому набору как к целому необходимо для успешного использования ДЕЛФИЯ наборов. Реагенты в этом наборе являются комплексными компонентами. Не смешивайте идентичные реагенты из различных лотов. Не используйте реагенты после срока годности, указанной на флаконе. 2. Реагенты должны быть доведены до комнатной температуры (+20+25С) до приготовления различных растворов. Замороженные образцы должны быть нагреты до комнатной температуры при медленном и осторожном перемешивании. Не используйте вортекс или смешанные образцы пациентов. 3. При промывке стрипов следите, чтобы все стрипы были заполнены полностью и одинаково до верхнего уровня как показано на картинке. После промывки стрипов, проверьте, что стрипы сухие. Если что-либо осталось в лунках, то необходимо перевернуть планшету и встряхнуть на фильтровальную бумагу. Аспирирующее/промывочное оборудование не должно находиться заполненным с промывочным раствором длительный период времени, поскольку промывочные иглы могут быть закупорены и трудно проходимы для жидкости. В конце рабочего дня аспирировать дистиллированную воду в аспирирующую/промывочную систему. Промывочное устройство должно быть регулярно промываться раствором NaCL (30г/Л), а затем дистиллированной водой и 50% этанолом и в конце промыто дистиллированной водой. 4. Для избежания примеси европия и как результат высокого флюресцентного фона высокие требования предъявляются к процедуре раскапывания и промывки. Поэтому необычайно важно использовать рекомендуемые и поставляемые вместе с ДЕЛФИЯ пипетки. Усиливающий раствор должен быть раскапан только с использованием рекомендуемой ЭППЕНДОРФ мультипипеткой, и при этом первый объем сбрасывается для полного заполнения. Тот же тип Комбинаконечника не может быть использован для раскапывания любого другого реагента. После работы ЭППЕНДОРФ мультипипетка помещается на штатив с наконечником. При использовании ДЕЛФИЯ плейт диспенсера и ДЕЛФИЯ диспенсера юнита ознакомьтесь с описанием. ПОДСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ: ДЕЛФИЯ система включает программу для обработки результатов и получения данных в виде стандартной кривой, концентрации неизвестных пациентов и т.д. (для детали см. описание к флюорометру или к программе Мультикалк). КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА: Использование контрольной сыворотки позволяет оценивать качество ежедневных определений. Рекомендуется, чтобы каждая лаборатория имела свой сывороточный пул на
--- стр. 121 ---
Е 1720 мкмоль/л крови (31 мг/дл) указаны в контрольном сертификате прилагаемом к F 2220 мкмоль/л крови (40 мг/дл) набору. ОГ контроли Фильтровальный Хранить в морозильнике. (приблизит. значения) лист (Шляйхер&Шуль 903) Защищать от влаги и света. с 5 пятнами высушенной крови Убедиться, что пластиковый конверт закрыт и содержит осушитель. При +2+8С стабилен в пределах указанного срока годности. Норма 190 мкмоль/л (3.5 мг/дл) Точные концентрации ОГ зависят от номера лота и Патология указаны в контрольном сертификате прилагаемом к 690 мкмоль/л (12.5 мг/дл) набору. Коэффициент пересчета: 1 мг/дл = 55.5 мкмоль/л. Калибраторы и контроли приготовлены из человеческой крови с добавлением ProClin 300 в качестве консервантов. Концентрация гемоглобина составляет около 170 г/л до нанесения на бумагу Шляйхер&Шуль №903. Гематокрит в пределах 50-55%, что эквивалентно таковому у новорожденного. Цинк сульфатный реагент 1 флакон, 30 мл +2+8С до окончания срока годности указанной на флаконе Избегать нагревания и прямых солнечных лучей Готовый для использования реагент содержащий < 25% сульфата цинка. Внимание: Реагент токсичен к водным организмам и может вызывать длительные обратимые эффекты на водное окружение. Не высушивать до конца емкость с реагентом. Галактозо оксидазный 10 флаконов, лиофиллизированные +2+8С до окончания срока реагент годности указанной на флаконе Защищать от света и тепла. Реагент содержит < 0.05 сульфата меди, сахарозу, фосфат натрия, 47 Ед/мл галактозо оксидазу от Dactylium dendroides, 375 Ед/мл пероксидазу хрена, 6.2 Ед/мл щелочной фосфатазы от быка и 213 Ед/мл супероксид дисмутазы из эритроцитов быка. Galactose Substrate Reagent 10 флаконов, лиофилизированные +2 +8°C до даты, (Подложка для галактозы) указанной на этикетке флакона Беречь от воздействия тепла и света. Реагент содержит 3-(р-гидроксифенил)пропионовую кислоту (НРРА). ОГ буфер для разведения 1 флакон, 240 мл +2+8С до окончания срока годности указанной на флаконе Готовый для использования ТРИС (гидроксиметил) аминометан, 3-(р-гидроксифенил) пропионовая кислота буфер и ProClin 300 в качестве консерванта. Стоп смесь 1 флакон, 240 мл +2+8С до окончания срока годности указанной на флаконе Готовая для использования смесь содержит глицин и <0.01% Oxaban A.
--- стр. 122 ---
_____________________________________________________________________________________ Микропланшеты белые (открытые, 96 лунок) 10 планшет +2+25 С Штрихкодовые метки для планшет 30 шт Штрих коды одинаковые в пределах одного и того же лота __________________________________________________________________________________ Специфические для каждого лота сертификаты контроля качества 1 лист _________________________________________________________________________________ МАТЕРИАЛЫ НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ С НАБОРОМ: Неонатальный ОГ набор является частью комплексной системы иммунодиагностических реагентов и оборудования для неонатального скрининга. ДЕЛФИЯ система требует следующие компоненты, которые могут быть поставлены или от Wallac Oy или от его дистрибьютеров: 1. Флюорометр с временным разрешением плюс (ДЕЛФИЯ/ВИКТОР), принтер и внешний компьютер. 2.. Автоматический шейкер-ДЕЛЬФИЯ плейтшейкер(Кат.№1296-003/004) 3. Автоматический панчер ВАЛЛАК ДБС ПАНЧЕР (1296-071) или ручной панчер для выбивки бумажных дисков с диаметром около 3 мм. В дополнении к ДЕЛФИЯ системе необходимо следующее: - 50 мл из прозрачного стекла или полиэтилена бутыль с завинчивающейся крышкой - 50 мл коричневая бутыль - пипетка или градуированный цилиндр для измерения объемов реагентов в мл - 8 канальная прециссионная пипетка для разливки 30-300 мкл жидкостей или Apricot Sample Processor модель MS-550XD. - наконечники к пипетке - миксер для перемешивания субстратного реагента - резервуары для реагентов - тестируемые образцы крови на фильтровальных бланках - абсолютный спирт - деионизированная вода - одноразовые, чистые, с формой дна лунок U микропланшеты типа NC-2400 или подобное. СБОР ОБРАЗЦОВ И их ХРАНЕНИЕ: Кровь может быть получена от новорожденного при прямом проколе пятки. Уровень гемоглобина < 200 г/л не оказывает влияние на результат. Статистически значимое влияние оказывалось, если уровень гемоглобина превышал 250 г/л. Скрининговые программы в различных странах различаются в зависимости от того какой тип образца используется. Кровь при проколе пятки в идеале необходимо забирать не ранее 24 часов после рождения после первого кормления ребенка, если роды в срок. Мы рекомендуем использовать фильтровальную бумагу производимую компанией Шляйхер/Шуль (№903) для сбора образцов крови и бумага должна быть та же самая как и для пятен стандартов. Метод основанный на образцах представленных на бланках предъявляет определенные требования к сбору образцов крови, хранению и транспортировке. Сбор образцов описан детально( NCCLS) в документе комитета по взятию крови LA4-A3: - протрите кожу спиртом и высушите
--- стр. 123 ---
- проколоть иглой для прокола кожи ребенка ланцетом или автоматическим ланцетом на глубину примерно 2.0 мм. Прокол глубже чем на 2.0 мм у маленьких плодов может вызвать повреждение кости - удалите первую каплю крови. Нежно промокнуть на фильтровальную бумагу большую каплю крови, позволяя ей промокнуть насквозь, полностью заполняя отмеченный кружок на фильтровальном бланке. Проверьте с другой стороны бланка, что кровь пропиталась насквозь. Не накрывайте полученное пятно крови. - Высушите пятна крови на воздухе в горизонтальной позиции по меньшей мере 3 часа при комнатной температуре, избегайте попадания прямых солнечных лучей. - Проверьте заполненность всех граф нужной информацией, включая имя, адрес, номер пациента, пол; название и адрес госпиталя; имя, адрес, телефон врача производящий заполнение граф. Укажите время и дату родов, а также дату и время забора крови. Укажите был ли ребенок доношенным и если да – то степень недоношенности. Укажите вес новорожденного, многоплодный или нет. - Поместите каждый образец в свой отдельный бумажный конверт и транспортируйте или перешлите его в лабораторию в течение 24 часов после взятия. Галактоза стабильна в течение 1 недели при хранении при +20+25С. Галактозо-1фосфат стабилен при +20-25С в течение 4 недель. Если образцы крови будут протестированы через 7 дней и более после взятия, то рекомендуется хранить их в морозильнике до тестирования. Хранится таким образом бланки должны в герметичных пакетах с откаченным воздухом. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ: Для диагностики ин витро. Используется в работе персоналом после предварительного обучения. Набор содержит реагенты произведенные из компонентов человеческой крови. Источник протестирован на наличие поверхностного антигена к гепатиту В, анти-гепатиту С, и анти-ВИЧ I и II. Тем не менее все рекомендации по мерам предосторожности при работе с производными крови должны быть соблюдены. Можно считать все образцы крови пациентов как потенциально инфицированные. Реагенты содержат азид натрия в качестве консерванта. Азид натрия может взаимодействовать с металлическими поверхностями с образованием азидов металлов. Для предотвращения образования азидов металлов необходимо промыть большим количеством воды. Для дезинфекции всех сливных реагентов пользуйтесь правилами местных контролирующих организаций. ПРОТОКОЛ ОПРЕДЕЛЕНИЯ: Выполните каждое определение в дубле для стандартов и контролей. Стандартная кривая должна быть использована для каждой плашки. Тестируемые образцы определяются по одному. Образцы и реагенты должны быть доведены до комнатной температуры (+20+25С) перед использованием. 1. Приготовление реагентов Стабильность после разведения _________________________________________________________________________________ ГО буфер для разведения 7 дней при +2+8С (в коричневом флаконе) Смешать 1 часть деионизированной воды и одну часть ГО буфера для разведения. На 1 планшет требуется около 10 мл этой смеси. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Раствор для экстракции 7 дней при +20+25С Держать плотно закрытым
--- стр. 124 ---
Приготовить Раствор для экстракции смешивая три части Цинк сульфатного реагента с двумя частями абсолютного этанола , например 24 мл Цинк сульфатного реагента смешать с 16 мл абсолютного этанола. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Галактозо оксидазный реагент 60 минут при +20+25С Растворить Галактозо оксидазный реагент добавляя 9 мл ГО буфера для разведения в 1 флакон с лиофиллизированным галактозо оксидазным реагентом и смешать. Галактозо оксидазный реагент следует растворять не менее чем за 5 минут до начала использования и использовать в течение 60 минут. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 2. Выбить фильтровальные диски, используя автоматические или ручные панчеры в лунки белых микротитровальных плашек в соответствии с таблицей. Диаметр выбиваемого диска должен быть около 3.2 мм. Калибраторы и контроли выбиваются в дубле на каждую плашку. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Кал Кал Кал Кал Кал Кал Кал Кал Кал Кал Кал Кал А А В В С С Д Д Е Е Ф Ф ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 1-й К. 1-й К. 2-й К. 2-й К. 1-й 2-й Обр. Обр. и т.д. 3. Добавить по 15 мкл раствора для экстракции в каждую лунку с фильтровальным диском. Убедитесь, что диски погружены в раствор для экстракции, с этой целью можно легко перемешать плашку. 4. Инкубировать при комнатной температуре 30 минут без шейкирования. Не накрывать планшет. 5. Добавить по 80 мкл ГО буфера для разведения в каждую лунку, содержащую фильтровальный диск. Нежно потрясти плашку. Перенос следует выполнять в течение 5 минут после смешивания. 6. Перенести 60 мкл содержимого каждой лунки в соответствующую лунку белой плашки. Следует заменять наконечники для каждой лунки с целью избежания контаминации. 7. Добавить по 75 мкл разведенного Галактозного оксидазного реагента в каждую лунку белой плашки. Избегайте контакта наконечником поверхности плашки. Нежно перемешать содержимое лунок. 8. Инкубировать при комнатной температуре в течение 60+15 минут без шейкирования. Не накрывать планшет.
--- стр. 125 ---
9. Перенести около 11 мл Стоп Смеси из расчета на 1 планшет в резервуар. Переносимый объем следует обязательно предварительно замерить во избежании нехватки. Добавить по 100 мкл этой Смеси в каждую лунку. Нежно перемешать содержимое лунок. 10. Измерять флюоресценцию на анализаторе ВИКТОР модели Д. Начало измерения с помощью нажатия клавиши START WIZARD, затем выбирается «87 GАО» из протоколов на панели «Neonatal» и задается количество плашек и образцов. Планшеты должны быть просчитаны в течение 1 часа после добавления Стоп Смеси. Проверяете протокол в программе Multicalc «87 GAO» или корректируете если необходимо (см. описание к программе Multicalc раздел редакция параметров): ASSAY TYPE IS IFMA 01 DUAL ASSAY = NO 03 MEASURING PARAMETERS = Eu 20 X-AXIS (CONCENTRATION) = Lin 21 Y-AXIS (RESPONSE) = MEAS 22 FITTING ALGORITHM = REGR UNWEIGHT LINEAR 25 STANDARD CURVE = NEW 26 STANDARDS ON 2.PLATES = NEW CODING/стандарты 2 STD = A (Убедитесь, что концентрация 2 STD = B стандартов галактозы соответствует 2 STD = C указанной в сертификате качества 2 STD = D к набору. Если нет – введите новые 2 STD = E значения концентраций) 2 STD = F 1 UNKN/образцы END ОСОБЕННОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ: 1. Следует понимать что состав набора ГО полностью достаточен для проведения неонатального скрининга. Все компоненты набора являются составными частями набора. Не смешивайте идентичные реагенты от наборов различных лотов. Не используйте реагенты после истечения их срока годности, которая указана на этикетке. 2. Величина флюоресцентного сигнала меняется в течение времени; однако при использовании калибраторов в каждой плашке, рассчитываемая концентрация остается постоянной. 3. Все реагенты и образцы должны быть доведены до комнатной температуры до использования. 4. Используйте по возможности реверсированное пипетирование на всех стадиях постановки. Реверсированное пипетирование в общем более точное, когда раскапываются малые объемы. 5. Проверьте, чтобы все лунки имели диски после процедуры выбивки панчером дисков.
--- стр. 126 ---
ПОДСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ: Компьютерная система включает программу для обработки результатов и получения данных в виде стандартной кривой, концентрации неизвестных пациентов и т.д. (для подробной информации см. описание к анализатору ВИКТОР или к программе Мультикалк). Концентрация галактозо-1-фосфата определяется в величинах галактозных эквивалентов: 1 ммоль/л галактозо-1-фосфата = 1 ммоль/л галактозы = 18.0 мг/дл общей галактозы. КАЛИБРОВКА: Полная стандартная кривая для каждого определения ставится для каждой плашки. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА: Контрольные образцы следует использовать для подтверждения стабильности ежедневных определений. Контроли определяются также как и неизвестные образцы. Контроли двух различных уровней используются и включены в наборы. Эти контроли следует ставить в каждом определении, если количество определений более чем одна планшета, то и в каждой плашке. Каждой лаборатории следует установить свой собственный концентрационный диапазон. Полученная средняя величина определяемого контроля должна укладываться в диапазон +2 SD от величин указанных в сертификате контроля качества. Рекомендуется также использовать свои собственные контроли для каждой лаборатории в добавлении к контролям включенным в набор. Тестируемые образцы дают истинную концентрацию, если контрольные значения в пределах установленных норм. Мы также рекомендуем участие лабораторий во внешнем контроле качества. ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ: Как и для любых других скрининговых тестов ин витро, результаты получаемые с помощью НЕОНАТАЛ ГАЛАКТОЗА могут быть использованы только для медицинских процедур и данные интерпретируются только совместно с клиническими исследованиями. Диагностические процедуры следует проводить только в качестве подтверждения подозреваемого диагноза высокого уровня НЕОНАТАЛ ГАЛАКТОЗА. Случаи при которых возможно получение аномальных результатов: - пятна не полностью пропитаны кровью - пятна выбиты панчером в месте, где имеет место плохая пропитка - плохо собраны и высушены пятна - нет элюции образца в буферный раствор, что вызвано либо нагреванием, либо свертыванием. - примеси в пятне крови фекалий и др. Образцы крови новорожденных, которые не получают достаточного количества грудного молока или питательных элементов с лактозой могут дать низкие уровни галактозы. Уровень гемоглобина < 200 г/л не оказывает влияние на результат. Имело место только влияние при повышении уровня гемоглобина выше 250 г/л. Эндогенная флюоресценция не должна оказывать сильное влияние на основной источник флюоресценции, потому что в этом случае лунки без бланков могут быть с либо нормальными либо выше нормы уровнем ГАЛАКТОЗЫ. ОЖИДАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ :
--- стр. 127 ---
Определение положительных по уровню ГАЛАКТОЗЫ проб проводится на основании сравнения получаемых результатов с пороговым уровнем. Результаты могут зависеть от возраста новорожденного, времени взятия образца крови и от др. условий. Следует иметь в виду, что значения уровня ГАЛАКТОЗЫ данные в этом разделе носят рекомендательный характер и каждая лаборатория должна установить свой собственный рабочий диапазон и пороговый уровень. Положительные результаты В качестве примера, уровень в 540 мкмоль/л (9.7 мг/дл) ГАЛАКТОЗЫ или выше следует считать как положительный для диагностики галактоземии. Этот образец требует проведения подтверждающей диагностической процедуры. Если в лаборатории возможно определить уровень галактозо-1-фосфат-уридил-трансферазы, то это следует провести. И в этом случае, если выявляется положительный результат (т.е. дефицит галактозо-1-фосфат-уридил-трансферазы), то образец считается положительным на галактоземию. Все последующие процедуры проводятся в соответствии с местными правилами. ВНИМАНИЕ: Величина порогового уровня была оценена исходя из тестирования 1040 образцов новорожденных в США и 909 – вне США. Величина порогового уровня рассчитывалась на основании расчета для каждой из групп обследуемых величин 99 и 95 персентилей. Был установлен пороговый уровень в 470 мкмоль/л (8.4 мг/дл) и это был наименьший из пороговых значений для каждой из групп. Величина порога определялась в данном случае на основании расчета 99 персентилей при использовании непараметрических статистических методов. Сомнительная зона Для снижения количества ложно отрицательных или ложно положительных значений устанавливается (рассчитывается) сомнительная зона в диапазоне 400-500 мкколь/л или 7.2-9.7 мг/дл. Этот диапазон рассчитывался как на основании среднего значения в 470 мкмоль/л (8.4 мг/дл) плюс/минус величина разброса для набора NG-1000 НЕОНАТАЛ ГАЛАКТОЗА, он составляет от 9 до 14.5%. Образцы со значением галактозы в диапазоне от 400 до 540 мкмоль/л считаются сомнительными, т.е. не отрицательными и не положительными. Они должны быть повторены как можно быстрее с помощью ретеста этим же методом либо другим методом например оценки активности галактозо-1-фосфат-уридил-трансферазы. При этом, если активность галактозо-1-фосфат-уридил-трансферазы дает положительный результат, то этот образец считается положительным на галактоземию. Однако если результат активности фермента отрицательный и нет проблем с качеством забора образца, то он считается как отрицательным на галактоземию. Определение сомнительной зоны Для расчета границ сомнительной зоны были взяты образцы с увеличивающимся уровнем галактозы от 280 до 560 мкмоль/л. Средняя концентрация была определена при измерении каждого из 17 образцов (из этого концентрационного диапазона) в дубле, дважды в день в течение 5 дней. Затем результаты были представлены в виде диаграммы распределения в зависимости от уровня галактозы.(представлено на диаграмме). Сомнительная зона определялась как концентрационный диапазон вблизи порогового значения в 470 мкмоль/л. Сомнительная зона позволяла снизить количество ложно-отрицательных или ложно-положительных результатов. Отрицательные результаты Любой образец до начала скрининга с уровнем галактозы ниже, чем 400 мкмоль/л (7.2 мг/дл) следует считать как отрицательный. Результаты ниже или выше калибровочного диапазона концентрации Уровни ниже, чем первый калибратор компьютер обозначит как <STD (меньше стандарта). Такой образец рекомендуется переставить и если и при этом он остается таким же низким, то содержание галактозы в этом образце следует обозначить как < 70 мкмоль/л(<1.3 мг/дл) и он считается отрицательным.
--- стр. 128 ---
Уровни выше верхнего значения калибровки компьютер напечатает как >STD. При этом истинная концентрация в этих образцах не может быть определена точно, но совершенно определенно можно сказать, что эти результаты положительны. Точное количественное определение уровня галактозы в таких образцах следует определить другим методом. УПОЛНОМОЧЕННЫЙ ПРЕДСТАВИТЕЛЬ: АО «ПРИБОРЫ» 109028, город Москва, Певческий пер., д. 4 стр. 1, помещ. I, комната 10 Тел./факс: +7 (495) 937-45-94/ +7 (495)937-45-92 Адрес электронной почты: info@pribori.com
--- стр. 129 ---
Галактозная трансфераза (ГАЛТ) GAL-Transferase (GALT) Флюорометрический анализ с разрешением по времени для количественного измерения ГАЛТ в сухом пятне крови Производитель - WALLAC Oy, Финляндия Для диагностического применения in vitro. ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В IN VITRO ДИАГНОСТИКЕ 960 ОПРЕДЕЛЕНИЙ НАЗНАЧЕНИЕ: Набор диагностических реактивов для скрининга новорожденных на наследственные болезни обмена. Используется для количественного измерения концентрации Галактоза-1-фосфат трансферазы (ГАЛТ) в сухих пятнах крови на фильтровальной бумаге. СОСТАВ НАБОРА: 1. Калибраторы: 1 карточка фильтровальной бумаги с пятнами высушенной крови 2.Контроли: 1 карточка фильтровальной бумаги с пятнами высушенной крови 3. Субстрат: 10 фл., лиофил. 4.Восстанавливающий буфер: 1 бут., 240 мл 5.Микропланшеты непокрытые, 96-ти луночные: 10 шт. ПРИНЦИП МЕТОДА: Галактозная трансфераза (ГАЛТ) определение основано на твердофазном, дву-сайтовом флюороиммунометрическом определении с разрешением по времени на основе прямого сэндвич методе при котором два антитела (кроличьи и мышиные) направлены против двух различных антигенных детерминантах на молекуле ГАЛТ . Стандарты, контроли и тестируемые образцы содержащие ГАЛТ одноврменно реагируют и с иммобилизированными моноклональными антителами, направленными против специфических антигенных сайтов на молекуле ГАЛТ и меченными европием вторыми моноклональными антителами (направленными против разных антигенных детерминантов) в инкубационном ГАЛТ буфере. Буфер элюирует ГАЛТ из высушенных пятен крови. Для выполнения определения требуется только одна инкубационная ступень. Усиливающий раствор диссоциирует ионы европия из меченого антигена в раствор, где они формируют высокофлюоресцентные хелатные комплексы с компонентами усиливающего раствора. Флюоресценция каждой лунки в последующем измеряется. Флюоресцентный сигнал каждого образца прямо пропорционален количеству ГАЛТ в образце. Каждый Галактозная трансфераза (ГАЛТ) набор содержит реагентов необходимых для 960 определений. Срок годности набора указан на внешней стороне коробки. Хранение при +2+8 С. МАТЕРИАЛЫ НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ С НАБОРОМ: Данный набор является частью комплексной системы иммунодиагностических реагентов и оборудования. ДЕЛФИЯ система требует следующие компоненты, которые могут быть поставлены или от WALLAC OY или от его дистрибьютеров: 1. Флюорометр с временным разрешением плюс принтер и внешний компьютер. 2. Автоматический вошер - ДЕЛФИЯ плейтвошер (Кат.№1296-024 или1296-026)
--- стр. 130 ---
3. Автоматический шейкер-ДЕЛФИЯ плейтшейкер(Кат.№1296-001или1296-003) 4. Пипетка для разливки ДЕЛФИЯ буфера и метки - ЭППЕНДОРФ МУЛЬТИПИПЕТКА (1296-014) с 5 мл Комби наконечниками (1296-016) или в качестве альтернативы ДЕЛФИЯ плейт диспенсер с ДЕЛФИЯ диспенсер юнит (1296-041 или 1296-043). 5. Пипетка для разливки Усиливающего раствора - ЭППЕНДОРФ мультипипетка (1296-014) с 5 мл Комби наконечниками (1296-016) или альтернативно ДЕЛФИЯ плейт диспенсер (1296-041). 6. ДЕЛФИЯ растворитель I (Кат.№ В127-100, В128-100). В дополнении к ДЕЛФИЯ системе необходимо следующее: - дозирующая пипетка для разливки микролитровых объемов - пипетки для разливки миллитровых объемов НЭ буфера требуемого для приготовления раствора метки и антител - дистиллированная вода СБОР ОБРАЗЦОВ И ХРАНЕНИЕ: Получение крови посредством венопункции, образование сгустка и выделение сыворотки посредством центрифугирования. Плазма, полученна с использованием ЭДТА и цитрата натрия не может быть использована, вследствие воздействия на хелатирующий европий. Однако может применяться плазма крови полученная с гепарином. Гемолитическая (гемоглобин>2г/Л), липемическая (>2 г/Л) и иктерическая (билирубин>30 мкмоль/Л) сыворотки использовать не рекомендуется. Если концентрация превышает 50 нмоль/Л следует развести сыворотки или нормальной женской сывороткой или ДЕЛФИЯ дилюентом I. Образцы могут быть сохранены 12 часов при комнатной температуре или 3 дня при +2+8С. Для более длительного периода неразведенные образцы могут храниться при -20 С. Избегайте повторного замораживания размораживания. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ: Для диагностики ин витро. Следует соблюдать правила предосторожности США №CDC 88-8395 или местные правила. Можно считать все образцы крови пациентов как потенциально инфицированные. Реагенты содержат азид натрия в качестве консерванта. Азид натрия может взаимодействовать с металлическими поверхностями с образованием азидов металлов. Для предотвращения образования азидов металлов необходимо промыть большим количеством воды. Для дезинфекции всех сливных реагентов пользуйтесь правилами местных контролирующих организаций. Флюоресценция измеряется на флюорометре с временным разрешением. Выберите номер программы 50 для автоматического измерения и подсчета результатов. Сверьте параметры группы для программы №50 и если необходимо произведите коррекцию в соответствии со следующим (см. описание к флюрометру для проведения редакции параметров считывания): ASSAY TYPE FIA тип определения ФИА FITTING METHOD SPLINE SMOOTHED метод обработки метод “сглаживания” X-AXIS LOGARITHMIC х-ось логарифмическая Y-AXIS B/Bмакс у-ось B/Bмакс BLANKS 0 бланки 0 STANDARDS 6 стандарты 6
--- стр. 131 ---
STANDARD REPLICATES 2 Убедитесь, чтобы концентрация стандарты в дупликате 2 стандартов, указанная на флаконах STANDARD CONC А совпадала с задаваемой. Если не стандарты конц. А совпадает, введите новые. STANDARD CONC В стандарты конц. В STANDARD CONC С стандарты конц. С STANDARD CONC D стандарты конц. Д STANDARD CONC Е стандарты конц. Е STANDARD CONC F стандарты конц. Ф UNKNOWN REPLICATES 2 неизвестные образцы в дубле 2 ОСОБЕННОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ: 1. Отношение к этому набору как к целому необходимо для успешного использования ДЕЛФИЯ наборов. Реагенты в этом наборе являются комплексными компонентами. Не смешивайте идентичные реагенты из различных лотов. Не используйте реагенты после срока годности, указанной на флаконе. 2. Реагенты должны быть доведены до комнатной температуры (+20+25С) до приготовления различных растворов. Замороженные образцы должны быть нагреты до комнатной температуры при медленном и осторожном перемешивании. Не используйте вортекс или смешанные образцы пациентов. 3. При промывке стрипов следите, чтобы все стрипы были заполнены полностью и одинаково до верхнего уровня как показано на картинке. После промывки стрипов, проверьте, что стрипы сухие. Если что-либо осталось в лунках, то необходимо перевернуть планшету и встряхнуть на фильтровальную бумагу. Аспирирующее/промывочное оборудование не должно находиться заполненным с промывочным раствором длительный период времени, поскольку промывочные иглы могут быть закупорены и трудно проходимы для жидкости. В конце рабочего дня аспирировать дистиллированную воду в аспирирующую/промывочную систему. Промывочное устройство должно быть регулярно промываться раствором NaCL (30г/Л), а затем дистиллированной водой и 50% этанолом и в конце промыто дистиллированной водой. 4. Для избежания примеси европия и как результат высокого флюресцентного фона высокие требования предъявляются к процедуре раскапывания и промывки. Поэтому необычайно важно использовать рекомендуемые и поставляемые вместе с ДЕЛФИЯ пипетки. Усиливающий раствор должен быть раскапан только с использованием рекомендуемой ЭППЕНДОРФ мультипипеткой, и при этом первый объем сбрасывается для полного заполнения. Тот же тип Комбинаконечника не может быть использован для раскапывания любого другого реагента. После работы ЭППЕНДОРФ мультипипетка помещается на штатив с наконечником. При использовании ДЕЛФИЯ плейт диспенсера и ДЕЛФИЯ диспенсера юнита ознакомьтесь с описанием. ПОДСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ: ДЕЛФИЯ система включает программу для обработки результатов и получения данных в виде стандартной кривой, концентрации неизвестных пациентов и т.д. (для детали см. описание к флюорометру или к программе Мультикалк). КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА: Использование контрольной сыворотки позволяет оценивать качество ежедневных определений. Рекомендуется, чтобы каждая лаборатория имела свой сывороточный пул на различных уровнях концентраций, или альтернативно использовала коммерческие контроли., например, ЛИПОЧЕК. Высокие и низкие контроли должны быть использованы в каждом определении;