Genome-X max SMA/TREC/KREC. Набор реагентов для определения гомо- и гетерозиготных делеций в гене SMN1, отвечающих за развитие спинальной мышечной атрофии, и количественного определения внехромосомных кольцевых ДНК как биомаркеров первичных иммунодефицитов — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
=== файл: unknown__Инструкция_Genome-X_max_22032024_редакция 2.pdf ===
--- стр. 1 ---
1
ИНСТРУКЦИЯ ПО РАБОТЕ С НАБОРОМ РЕАГЕНТОВ
«Genome-X max SMA/TREC/KREC. Набор реагентов для определения гомо- и
гетерозиготных делеций в гене SMN1, отвечающих за развитие спинальной
мышечной атрофии, и количественного определения внехромосомных кольцевых
ДНК как биомаркеров первичных иммунодефицитов»
VER 18.03.2024
1 НАЗНАЧЕНИЕ ................................................................................................................................................. 3
2 ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗДЕЛИЯ ......................................................................................................................... 5
2.1 СОСТАВ НАБОРА РЕАГЕНТОВ И КОМПЛЕКТ ПОСТАВКИ: ............................................................................................... 5
ВАРИАНТ ИСПОЛНЕНИЯ «GENOME-X MAX SMA/TREC/KREC 100» ..................................................................................... 5
ВАРИАНТ ИСПОЛНЕНИЯ «GENOME-X MAX SMA/TREC/KREC 200» ..................................................................................... 6
2.2 ПРИНЦИП МЕТОДА ............................................................................................................................................... 6
2.3 ОПИСАНИЕ И ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РЕАГЕНТОВ В СОСТАВЕ «GENOME-X MAX SMA/TREC/KREC » ................ 7
2.4 ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КОМПОНЕНТОВ «GENOME-X MAX SMA/TREC/KREC GM-01. НАБОР РАСХОДНЫХ
МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ АВТОМАТИЧЕСКОГО ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК И ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР» ................................................................................ 9
2.5 СТАБИЛЬНОСТЬ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ....................................................................................................................... 9
3 ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ....................................................................................................... 9
3.1 КАЛИБРАТОРЫ ..................................................................................................................................................... 9
3.2 СПЕЦИФИЧНОСТЬ ............................................................................................................................................... 10
3.3 ПРЕЦИЗИОННОСТЬ (ПРАВИЛЬНОСТЬ) .................................................................................................................... 10
3.4 ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ ....................................................................................................................................... 10
3.5 КОЭФФИЦИЕНТ ВАРИАЦИИ .................................................................................................................................. 10
3.6 ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ ....................................................................................................................................... 10
3.7 ДИАПАЗОН ИЗМЕРЕНИЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ..................................................................................... 11
3.8 ВЛИЯНИЕ ПОТЕНЦИАЛЬНО ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ ....................................................................................... 11
3.9 ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ .................................................................................................................. 11
4 ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕЗУЛЬТАТ ..................................................................................................... 11
5 ОГРАНИЧЕНИЯ ............................................................................................................................................. 12
6 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ..................................................................................................................... 12
7 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА ................................... 13
8 ИНФОРМАЦИЯ ОБ УСЛОВИЯХ, НЕОБХОДИМЫХ ДЛЯ СБОРА, ОБРАБОТКИ И ПОДГОТОВКИ ОБРАЗЦОВ 14
9 ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА .............................................................................................................................. 15
9.1 ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ СУХИХ ПЯТЕН КРОВИ НА ФИЛЬТР-КАРТЕ, ИЗ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ, ИЗ ВОРСИН ХОРИОНА, ИЗ
АМНИОЦИТОВ. 16
9.1.1 Предварительная обработка .......................................................................................................... 16
9.1.2 Автоматическое выделение ДНК ................................................................................................... 17
УТВЕРЖДАЮ
Генеральный директор
ООО «Геном-Микс»
_____________ Д.Н. Дейниченко
«22» марта 2024 г.
--- стр. 2 ---
2
9.1.3 Ручное выделение ДНК с использованием магнитного штатива ............................................ 19
9.2 ПОДГОТОВКА К ПОСТАНОВКЕ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ...................................................................................... 20
9.3 ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ НА ПРИБОРАХ APPLIED BIOSYSTEMS QUANTSTUDIO 5 ................................. 21
9.3.1 Параметры определения .................................................................................................................. 21
9.3.2 Интерпретация результатов исследования 7 экзона гена SMN1: ........................................... 22
9.3.3 Интерпретация результатов исследования TREC и KREC: ......................................................... 23
9.4 ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ НА ПРИБОРЕ ДТПРАЙМ .......................................................................... 25
9.4.1 Параметры определения .................................................................................................................. 25
9.4.2 Интерпретация результатов исследования 7 экзона гена SMN1: ........................................... 25
9.4.3 Интерпретация результатов исследования TREC и KREC: ......................................................... 27
9.5 ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ НА ПРИБОРЕ СЕРИИ ROTOR-GENE............................................................. 27
9.5.1 Параметры определения .................................................................................................................. 27
9.5.2 Интерпретация результатов исследования 7 экзона гена SMN1: ........................................... 28
9.5.3 Интерпретация результатов исследования TREC и KREC: ......................................................... 29
9.6 ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ НА ПРИБОРЕ ТИПА CFX. .......................................................................... 30
9.6.1 Параметры определения .................................................................................................................. 30
9.6.2 Интерпретация результатов исследования 7 экзона гена SMN1: ........................................... 30
9.6.3 Интерпретация результатов исследования TREC и KREC: ......................................................... 31
9.7 ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ НА ПРИБОРЕ ТИПА LOCUS® INTERO . ....................................................... 32
9.7.1 Параметры определения .................................................................................................................. 32
9.7.2 Интерпретация результатов исследования 7 экзона гена SMN1: ........................................... 33
9.7.3 Интерпретация результатов исследования TREC и KREC: ......................................................... 34
10 КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ................................................................................................................................. 34
11 УПАКОВКА ................................................................................................................................................... 35
12 УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ ......................................................................................... 36
13 УТИЛИЗАЦИЯ .............................................................................................................................................. 36
14 ПЕРЕЧЕНЬ ПРИМЕНЯЕМЫХ НАЦИОНАЛЬНЫХ СТАНДАРТОВ .................................................................... 37
15 ЛИТЕРАТУРНЫЕ ССЫЛКИ ............................................................................................................................ 37
16 СИМВОЛЫ, НАНОСИМЫЕ НА УПАКОВКУ МЕДИЦИНСКОГО ИЗДЕЛИЯ ..................................................... 38
17 СВЕДЕНИЯ О ПРОИЗВОДИТЕЛЕ .................................................................................................................. 39
18 ГАРАНТИЙНЫЕ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА ................................................................................................................ 39
19 КОНТАКТЫ ДЛЯ НАПРАВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ......................................................................................... 39
Настоящая инструкция по работе распространяется на медицинское изделие для
диагностики in vitro (МИ ИВД) – «Genome-X max SMA/TREC/KREC . Набор реагентов для
определения гомо- и гетерозиготных делеций в гене SMN1, отвечающих за развитие спинальной
мышечной атрофии, и количественного определения внехромосомных кольцевых ДНК как
биомаркеров первичных иммунодефицитов»
Набор реагентов изготовлен в соответствии с ТУ 20.59.52-002-71944992-2024.
Набор реагентов выпускается в двух вариантах исполнения (моделях):
«Genome-X max SMA/TREC/KREC 100»,
«Genome-X max SMA/TREC/KREC 200»,
отличающихся количеством образцов ДНК, которые могут быть протестированы с
использованием одного набора реагентов.
Сокращенное наименование набора реагентов : «Genome-X max SMA/TREC/KREC»,
«Genome-X max SMA/TREC/KREC 100», «Genome-X max SMA/TREC/KREC 200».
ВНИМАНИЕ: перед применением «Genome-X max SMA/TREC/KREC» внимательно
прочитайте настоящую инструкцию!
--- стр. 3 ---
3
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПЦР-РВ полимеразная цепная реакция в реальном времени
НК нуклеиновая кислота
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
СМА спинальная мышечная атрофия
ПИД первичные иммунодефициты
МИ ИВД медицинское изделие для диагностики in vitro
МР методические рекомендации
СПК Сухие пятна крови
1 НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов предназначен для диагностики спинальной мышечной атрофии,
проведения неонатального, селективного и преконцепционного скрининга на спинальную
мышечную атрофию (СМА) путем определения делеций 7 экзона гена SMN1 в гомо - и
гетерозиготном состоянии, и количественного определения внехромосомных кольцевых ДНК -
молекул TREC и KREC в рамках неонатального и селективного скрининга на первичные
иммунодефициты (ПИД). Определение проводится методом полимеразной цепной реакции в
режиме реального времени, тестируются образцы ДНК, выделенные из биологического материала
человека: сухие пятна крови (СМА, ПИД), цельная кровь (СМА, ПИД), ворсины хориона (СМА),
амниотическая жидкость (СМА), а также ДНК из биоптата трофэктодермы после проведения
полногеномной амплификации (WGA) (только СМА).
Целевой аналит: делеции 7 экзона в гене SMN1 в гомо - и гетерозиготном состоянии и
внехромосомные кольцевые ДНК-молекулы TREC и KREC.
Типы анализируемого образца:
- Сухие пятна крови с фильтр-карт
- Цельная кровь с ЭДТА
- Ворсины хориона (только для определения делеций 7 экзона в гене SMN1)
- Амниотическая жидкость (только для определения делеций 7 экзона в гене SMN1)
- Полногеномный амплификат из биоптата трофэктодермы (только для определения
делеций 7 экзона в гене SMN1)
Функциональное назначение: диагностика спинальной мышечной атрофии,
неонатальный, селективный и преконцепционный скрининг спинальной мышечной атрофии и
скрининг первичных иммунодефицитных состояний.
Потенциальный пользователь: персонал, с высшим и средним медицинским
образованием, обученный методам молекулярной диагностики и правилам работы в клинико -
диагностической лаборатории.
Область применения: клиническая лабораторная диагностика, лабораторная генетика.
Показания к применению:
- молекулярно-генетическая диагностика спинальной мышечной атрофии - определение
количества копий гена SMN1 у плода (когда оба родителя имеют гетерозиготные делеции 7 экзона
в гене SMN1), новорожденных, лиц с симптомами СМА и лиц репродуктивного возраста (пр и
планировании беременности)
- молекулярно-генетический скрининг спинальной мышечной атрофии - определение
количества копий гена SMN1 у новорожденных, лиц с симптомами СМА и лиц репродуктивного
возраста (при планировании беременности).
- прямой молекулярн о-генетический скрининг первичных иммунодефицитов , связанных с
изменением уровня содержания эксцизионных колец Т -клеточного рецептора (TREC) и (или)
рекомбинационных колец каппа -делеционного элемента (KREC) у новорожденных при
--- стр. 4 ---
4
проведении неонатального скрининга и селективного скрининга.
Противопоказания к применению: набор реагентов «Genome-X max SMA/TREC/KREC»,
в рамках установленного производителем назначения, противопоказаний не имеет.
Набор реагентов не подлежит использованию в случаях:
- нарушенной внутренней упаковки и/или не соответствующего описанию внешнего вида;
- несоблюдения условий транспортирования и/или хранения согласно инструкции;
- истекшего срока годности.
Количество определений : «Genome-X max SMA/TREC/KREC 100» - Набор реагентов
рассчитан на проведение 100 тестов (амплификаций), включая образцы ДНК, входящие в набор.
Количество калибраторов, входящих в набор реагентов, рассчитано на проведение анализа в 5
постановках (при необходимости).
«Genome-X max SMA/TREC/KREC 200» - Набор реагентов рассчитан на проведение 200
тестов (амплификаций), включая образцы ДНК, входящие в набор. Количество калибраторов,
входящих в набор реагентов, рассчитано на проведение анализа в 5 постановках (при
необходимости).
Сведения об определяемой патологии:
Спинальная мышечная атрофия (СМА) – это аутосомно-рецессивное нервно-мышечное
заболевание, характеризующееся дегенерацией, альфа-моторных нейронов в передних рогах
спинного мозга. СМА является одной из самых тяжелых наследственны х болезней, приводящих в
большинстве случаев к летальному исходу. Частота встречаемости заболевания 1 на 6500 -8000
новорожденных, частота носительства 1 на 40 -50 человек (Markowitz et al., 2012 ). СМА
подразделяется на I, II, III и IV тип на основе возраста начала развития симптомов и тяжести
заболевания (Zerres et al., 1997). Развитие всех форм СМА вызвано мутациями в гене выживания
моторных нейронов SMN1. 95% пациентов имеют гомозиготную делецию 7 экзона гена SMN1, в
то время как у остальных индивидуумов, страдающих заболеванием и сохранивших хотя бы одну
копию гена SMN1, были обнаружены внутригенные мутации (Lefebvre et al., 1995; Wirth et al.,
2000).
Ген SMN1 имеет центромерно ориентированную копию – ген SMN2, количество которого,
как было показано, може т варьировать от 0 до 8, и коррелирует с тяжестью СМА (Mailman et al.,
2002). Ген SMN2 не способен полностью компенсировать отсутствие гена SMN1 из -за
однонуклеотидной замены в 7 -м экзоне, что приводит в процессе альтернативного сплайсинга к
формированию мРНК гена SMN2, лишенной 7 экзона, снижению количества полноразмерной
мРНК гена SMN2 и, соответственно, образованию нестабильного, неполноразмерного белка SMN
(Monanietal., 1999).
В России действует федеральная программа по выявлению спинальной мышечной атрофии
у новорожденных в рамках проведения расширенного неонатального скрининга с последующей
возможностью лечения заболевания . Однако лечение СМА не может повернуть течение
заболевания вспять, а только препятствует дальнейшему прогрессированию при условии
своевременного получения препарата однократного воздействия или применения на постоянной
основе препаратов поддерживающего действия.
Тестирование по образцам цельной крови, СПК, и ДНК из биоптата трофэктодермы после
проведения полногеномной амплификации для определения носительства гетерозиготной делеции
гена SMN1, позволяет будущим родителям на преконцепционном уровне просчитывать риски.
Применение вспомогательных репродуктивных технологий позволяет снизить риск рождения
ребенка с наследственным заболева нием, а также, при необходимости, увеличивает возможность
начать лечение СМА на максимально ранней стадии.
Диагностика плода по образцам ворсин хориона или амниотической жидкости позволяет
диагностировать СМА на максимально ранней (дородовой) стадии и дат ь запас времени на
подготовку к своевременному началу лечения. Информация о гетерозиготном носительстве
делеций на данном этапе не имеет клинического значения – данные дети относятся к группе
«условно здоровые».
Первичные иммунодефициты (ПИД) , в том числе, тяжелый комбинированный
иммунодефицит и Х -сцепленная агаммаглобулинемия, характеризуются отсутствием
--- стр. 5 ---
5
функциональных Т и В -лимфоцитов соответственно. Без своевременной ранней диагностики и
лечения дети с ПИД страдают от инфекционных заболеваний с тяжелым т ечением, что приводит к
их инвалидизации или смерти. Диагностика ПИД проводится путем определения уровня
внехромосомных кольцевых молекул ДНК, являющихся универсальными маркерами Т -клеточных
иммунодефицитов - TREC (Т -cell receptor excision circle) и В -клеточных иммунодефицитов -
KREC (kappa-deleting recombination excision circle) (Serana et al., 2013). Количество TREC и KREC
может быть оценено с помощью количественной ПЦР с детекцией в режиме реального времени
(ПЦР-РВ) и, ввиду прямого маркирования зрелых наивных Т и В -лимфоцитов, имеет высокий
диагностический потенциал (Borte et al., 2012) . Количественный анализ TREC активно
применяется для оценки функции тимуса и неогенеза Т -клеток. Он был использован для
диагностики иммунодефицитов, для неонатального скрининга ПИД у новорожденных, и как
предиктор восстановления Т-клеточной функции после пересадки костного мозга. В целом, низкие
уровни TREC и KREC в крови новорожденных указывают на Т - и/или В-клеточную лимфопению,
что позволяет применять определение уровней TREC и KREC для ранней диагностики ПИД (King
and Hammarström, 2018).
Классификация медицинского изделия для диагностики in vitro
Класс потенциального риска применения медицинского изделия для диагностики in vitro в
соответствии с номенклатурной классификацией медицинских изделий, утвержденной приказом
Министерства здравоохранения Российской Федерации от 06 июня 2012 г. № 4н – 2б.
2 ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗДЕЛИЯ
2.1 Состав набора реагентов и комплект поставки:
Вариант исполнения «Genome-X max SMA/TREC/KREC 100»
I. Инструкция по работе с набором реагентов – 1 шт.;
II. «Genome-X max SMA/TREC/KREC 100 ПЦР » - 1 шт, в составе:
1) Паспорт качества;
2) MasterMix – 1700 мкл 1 пробирка;
3) Полимераза – 108 мкл, 1 пробирка;
III. . «Genome-X max SMA/TREC/KREC СС» - 1 шт, в составе:
1) Паспорт качества;
2) Калибратор SMN1 +/+ - 105 мкл, 1 пробирка.
3) Калибратор К1 - 105 мкл, 1 пробирка.
4) Калибратор К2 - 105 мкл, 1 пробирка.
5) Калибратор К3 - 105 мкл, 1 пробирка.
6) Калибратор К4 - 105 мкл, 1 пробирка
7) Калибратор К5 - 105 мкл, 1 пробирка.
8) Отрицательный контрольный образец, ОКО, 105 мкл, 1 пробирка
IV«Genome-X ДНК», производства ООО «Геном -Микс», ТУ 20.59.52 -003-71944992-2024 –
1 шт. (при необходимости), в составе:
1) Паспорт качества;
2) Магнитный сорбент М – 1050 мкл, 1 пробирка;
3) 100X буфер для предлизиса 100X PLB – 850 мкл, 1 пробирка;
4) Буфер для лизиса LB – 52,5 мл, 1 флакон;
5) Буфер для первой отмывки W1 – 75 мл, 1 флакон;
6) Буфер для второй отмывки W2 – 75 мл, 1 флакон;
7) Буфер для третьей отмывки W3 – 75 мл, 1 флакон;
8) Буфер для элюции EB – 10,5 мл, 1 флакон;
V «Genome-X max SMA/TREC/KREC GM -01. Набор расходных материалов для
автоматического выделения ДНК и проведения ПЦР» -1 шт. (при необходимости), в составе:
1) Планшет глубоколуночный 2,2 мл на 96 лунок -7 шт.
2) Насадка на магнитные стержни 96 - 2 шт.
--- стр. 6 ---
6
3) Ванночка для реагентов вместимостью 100 мл - 6 шт.
4) Планшет для ПЦР на 96 лунок; - 1 шт.
5) Пленка для ПЦР планшетов термостойкая – 2 шт.
Вариант исполнения «Genome-X max SMA/TREC/KREC 200»
I. Инструкция по работе с набором реагентов – 1 шт.;
II. «Genome-X max SMA/TREC/KREC 200 ПЦР» - 1 шт. в составе:
1) Паспорт качества;
2) MasterMix – 3400 мкл (2 пробирки по 1700 мкл);
3) Полимераза – 215 мкл, 1 пробирка;
III. «Genome-X max SMA/TREC/KREC СС» в составе:
1) Паспорт качества;
2) Калибратор SMN1 +/+ - 105 мкл, 1 пробирка.
3) Калибратор К1 - 105 мкл, 1 пробирка.
4) Калибратор К2 - 105 мкл, 1 пробирка.
5) Калибратор К3 - 105 мкл, 1 пробирка.
6) Калибратор К4 - 105 мкл, 1 пробирка
7) Калибратор К5 - 105 мкл, 1 пробирка.
8) Отрицательный контрольный образец, ОКО - 105 мкл, 1 пробирка
IV. «Genome-X ДНК», производства ООО «Геном -Микс», ТУ 20.59.52 -003-71944992-2024 –
2 шт. (при необходимости), в составе:
1) Паспорт качества;
2) Магнитный сорбент М – 1050 мкл ,1 пробирка;
3) 100X буфер для предлизиса 100X PLB – 850 мкл, 1 пробирка;
4) Буфер для лизиса LB – 52,5 мл, 1 флакон;
5) Буфер для первой отмывки W1 –75 мл, 1 флакон;
6) Буфер для второй отмывки W2 – 75 мл, 1 флакон;
7) Буфер для третьей отмывки W3 – 75 мл, 1 флакон;
8) Буфер для элюции EB – 10,5 мл, 1 флакон;
V. «Genome-X max SMA/TREC/KREC GM -01. Набор расходных материалов для
автоматического выделения ДНК и проведения ПЦР» -2 шт. (при необходимости), в составе:
1) Планшет глубоколуночный 2,2 мл на 96 лунок -7 шт.
2) Насадка на магнитные стержни 96 - 2 шт.
3) Ванночка для реагентов вместимостью 100 мл - 6 шт.
4) Планшет для ПЦР на 96 лунок; - 1 шт.
5) Пленка для ПЦР планшетов термостойкая – 2 шт.
2.2 Принцип метода
Определение проводится методом полимеразной цепной реакции в режиме реального
времени, тестируются образцы ДНК, выделенные из биологического материала человека: сухие
пятна крови (СМА, ПИД), цельная кровь (СМА, ПИД), ворсины хориона (СМА), амниотическая
жидкость (СМА), а также ДНК из биоптата трофэктодермы после проведения полногеномной
амплификации (WGA) (только СМА).
Для получения образцов ДНК используются выбитые панче ром кружки фильтр карты с
СПК или образцы крови, отобранные в пробирки с антикоагулянтом К 3ЭДТА или К 2ЭДТА,
ворсины хориона, амнио тическая жидкость . Образцы СПК , цельной крови , ворсин хориона или
амниоциты лизируются, а затем ДНК очищается путем последовательных промывок
специальными буферами и отделением целевого продукта при помощи магнитного сорбента. ДНК
из биоптата трофэктодермы после проведения полногеномной амплификации использу ется без
дополнительной обработки.
ПЦР-амплификация в режиме р еального времени – количественный метод ПЦР. Процесс
ПЦР-амплификации заключается в серии повторяющихся циклов температурной денатурации
--- стр. 8 ---
8
Реагенты, входящие в
состав набора реагентов
Функция Внешний вид Состав
Калибратор К1
Калибратор К2
Калибратор К3
Калибратор К4
Калибратор К5
Калибраторы для
количественного
определения
TREC(KREC) по
калибровочной
кривой;
Калибратор К3
также является
контрольным
материалом для
SMN1
Прозрачная бесцветная
жидкость без осадка
ДНК здорового человека,
буфер
Отрицательный
контрольный образец,
ОКО
Контроль
контаминации,
Прозрачная бесцветная
жидкость без осадка
буфер
Магнитный сорбент М Сорбент для очистки
ДНК
Суспензия коричневого цвета,
при хранении допускается
расслоение, исчезающие при
встряхивании
Cуперпарамагнитные
частицы, буфер
100X буфе р для
предлизиса 100XPLB
Буфер для
предлизиса клеток
Прозрачная бесцветная
жидкость
Вода, регулятор кислотности
Буфер для лизиса LB Буфер для лизиса
клеток
Прозрачная жидкость от
бесцветного до слабо-желтого
цвета. При хранении
возможно образование
кристаллов, растворяющихся
при нагревании при 65° С
Изопропиловый спирт,
гуанидина гидрохлорид,
тиоглицерол, буфер
Буфер для первой
отмывки W1
Буфер для очистки
ДНК на первом
этапе
Прозрачная бесцветная
жидкость. При хранении
возможно выпадение
инертного осадка.
Изопропиловый спирт,
гуанидина гидрохлорид,
тиоглицерол, буфер
Буфер для второй
отмывки W2
Буфер для очистки
ДНК на втором
этапе
Прозрачная бесцветная
жидкость
Изпропиловый спирт, буфер
Буфер для третьей
отмывки W3
Буфер для очистки
ДНК
Прозрачная бесцветная
жидкость
Изпропиловый спирт, буфер
Буфер для элюции EB
Буфер для перевода
ДНК в раствор
Прозрачная бесцветная
жидкость
Вода, консервант
Состав набора реагентов указан с учетом п.6.1.3 ГОСТ Р 51088-2013 (без раскрытия коммерческой тайны)
В составе Буфера для Лизиса и реагентов для отмывки входят токсичные вещества,
указания по безопасному применению см. в разделе «Меры предосторожности»
При изготовлении набора реагентов используется материал человеческого происхождения,
а именно: ДНК. Материал не токсичен, не ядовит и не входит в непосредственный контакт с
организмом человека. Не являются фармакологической субстанцией или лекарственным
препаратом. Процессы переработки, консервации, тестирования и обработки тканей, клеток и
веществ человеческого происхождения выполнены таким образом, чтобы обеспечить
максимальный уровень биологической безопасности для пользователей, пациентов и других
людей. Материалы человеческого происхождения , применяемы е при изготовлении набора
реагентов, получены от людей, прошедших медицинский осмотр и находившихся под
наблюдением, с учетом предполагаемого использования этого материала.
--- стр. 9 ---
9
2.4 Технические характеристики компонентов «Genome -X max SMA/TREC/KREC GM -01.
Набор расходных материалов для автоматического выделения ДНК и проведения
ПЦР»
Компонент Характеристики и нормы
Планшет глубоколуночный 2,2 мл на 96 лунок Материал: полипропилен (PP)
Количество лунок – 96 шт.
Длина- (118 – 132) мм
Ширина – (78-88) мм
Высота – (42-50) мм
Форма дна - V-образная
Насадка на магнитные стержни 96 Материал: полипропилен (PP)
Количество стержней - 96 шт.
Длина- 125 мм ± 5%
Ширина – 80 мм ± 5%
Высота – 45 мм ± 5%
Ванночка для реагентов вместимостью 100 мл Вместимость 100-130 мл
Длина 140-157 мм
Цвет: белая или прозрачная/ неокрашенная
Планшет для ПЦР на 96 лунок Материал: полипропилен (PP)
Количество лунок- 96 шт.
Длина – (124 -127) мм
Ширина – (84-87) мм
Высота – (20,5 - 22) мм
Наличие юбки: без юбки или с полуюбкой
Пленка для ПЦР планшетов Длина- (140 ±1) мм
Ширина – (78 ± 1) мм
Цвет: прозрачная
2.5 Стабильность набора реагентов
Стабильность реагентов при хранении: 12 месяцев.
Стабильность реагентов после вскрытия: 12 месяцев (до окончания срока годности)
3 ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
3.1 Калибраторы
В набор реагентов «Genome-X max SMA/TREC/KREC » входит 6 калибраторов:
- Калибратор SMN1 +/+ - Калибратор для количественного определения гена SMN1.
Приписывание значения калибратору реализовано в соответствии с требованиями ГОСТ ISO
17511 к метрологической прослеживаемости.
- Пять калибраторов : Калибратор К1, Калибратор К2, Калибратор К3, Калибратор К4,
Калибратор К5 - для построения калибровочной кривой для количественного определения
кольцевых молекул TREC и KREC. Калибратор К3 также выполняет функцию контрольного
материала для определения количества копий SMN1 +/+. Приписывание значения
калибраторам реализовано в соответствии с требованиями ГОСТ ISO 17511 к метрологической
прослеживаемости. Концентрация калибраторов лотоспецифич на и указана в паспорте
качества.
Диапазон калибровочной кривой 950 – 30 000 копий TREC на мл
коэффициент корреляции калибровочного графика 99%
Эффективность в диапазоне 90-110 %
--- стр. 10 ---
10
Диапазон калибровочной кривой 950 – 36 000 копий KREC на мл
коэффициент корреляции калибровочного графика 99%
Эффективность в диапазоне 90-110 %
3.2 Специфичность
В исследуемых образцах биологического материала человека, содержащих ДНК 7
экзона гена SMN1, референсного гена, кольцевых молекул TREC и KREC, в результате
проведения ПЦР -РВ детектируется экспоненциальный рост уровня флуоресценции по
заявленным каналам флуоресценции FAM / SybrGreen, ROX / TexasRed, JOE/HEX, Cy5.
В исследуемых образцах биологического материала человека, не содержащих ДНК 7
экзона г ена SMN1, кольцевых молекул TREC и KREC, в результате проведения ПЦР -РВ
экспоненциальный рост флуоресценции по заявленным каналам флуоресценции отсутствует
или ниже фонового значения. Возможна детекция экспоненциального роста уровня
флуоресценции по каналу FAM в случае гомозиготной делеции 7 экзона гена SMN1 при
условии ΔCt = Ct(FAM) – Ct (ROX) > 6. Специфичность выявления делеций 7 экзона гена
SMN1 в гомо - и гетерозиготном состоянии, а также снижения уровня кольцевых молекул
TREC и KREC подтверждена на клиническом материале.
Отсутствие перекрестной неспецифической реакции на целевые олигонуклеотиды
набора реагентов подтверждается проведенным компьютерным анализом последовательностей
ДНК с помощью программы BLAST+ 2.13.0.
3.3 Прецизионность (правильность)
СМА (гомозиготная делеция
гена SMN1)
Пороговый цикл (Ct) по каналу детекции FAM не
определяется либо Ct(FAM) – Ct(ROX) > 6 при условии
Ct по каналу детекции ROX < 33
СМА (гетерозиготное
носительство, норма)
Значение RQ для образца равно целевому значению
±0,2*
Относительная погрешность
определения TREC/ KREC 5%
Примечание * значение 0,5 соответствует гетерозиготной делеции 7 экзона гена SMN1; значение 1
соответствует дву м копиям гена SMN1, значение 1,5 соответствует тре м копиям гена SMN1, значение 2 – четырем
копиям гена SMN1.
3.4 Воспроизводимость
Воспроизводимость определения гомозиготной делеции гена SMN1 (ДИ 95%) - 100%
испытанных проб с гомозиготной делецией гена SMN1 показывают ожидаемое значение
Воспроизводимость результатов по отсутствию 7 экзона гена SMN1 подтверждена на 25 образцах
биологического материала человека в результате проведения ПЦР -РВ на 2х моделях
амплификаторов с использованием набора реагентов как одинаковых, так и разных серий.
3.5 Коэффициент вариации
CV определения количества копий 7 экзона гена SMN1 копий/мл ≤ 8%
CV определения количества референсного гена копий/мл ≤ 10 %
CV количества копий TREC на 100 000 лейкоцитов в СПК ≤ 10 %
CV количества копий KREC на 100 000 лейкоцитов в СПК ≤ 10 %
CV количества копий TREC на 100 000 лейкоцитов в цельной крови ≤ 20%
CV количества копий KREC на 100 000 лейкоцитов в цельной крови ≤ 20%
3.6 Предел обнаружения
Предел обнаружения гена SMN1: 0,5-1 нг геномной ДНК на исследуемую пробу.
Предел обнаружения TREC, KREC : 5 копий целевого аналита на амплификационную
пробирку
--- стр. 11 ---
11
Предел обнаружения TREC: 5 копий TREC на 100 000 лейкоцитов
Предел обнаружения KREC: 5 копий TREC на 100 000 лейкоцитов
3.7 Диапазон измерения количественного определения
Диапазон измерения кольцевых молекул TREC: 0 - 175 000… копий на 105 лейкоцитов.
Диапазон измерения кольцевых молекул KREC: 0-200 000 копий на 105 лейкоцитов.
Диапазон измерения 7 экзона гена SMN1*: 0 ..0,5..1..2
Примечание * значение 0 соответствует гомозиготной делеции 7 экзона гена SMN1; значение 0,5 соответсвует
гетерозиготной делеции 7 экзона гена SMN1; значение 1 соответствует двухкопийному гену SMN1, то есть
норме.
3.8 Влияние потенциально интерферирующих веществ
Подтверждено отсутствие влияния потенциально интерферирующих веществ до
указанного количества включительно в образцах:
- сухих пятен крови и цельной крови: Гемоглобин до 250 г/л в кров и; Билирубин до 500
мкМоль/л в крови; ЭДТА в цельной крови до 3,60 мг/мл.
- ворсин хориона и амниотической жидкости: Гемоглобин до 250 мг/мл;
Изопропиловый спирт до 100 мкл/мл; - Цефазолин (цефазолина натриевая соль) до 50 мкг/мл.
Наличие интерферирующих веществ в образце биологического материала выше
указанного количества может быть причиной сомнительных и недостоверных результатов.
Показателем ингибирования ПЦР явля ется отсутствие или снижение эффективности
амплификации референсного гена , а также искажение формы кривой амплификации
референсного гена.
При подтверждении наличия в образце биологического материала для анализа
ингибирующих примесей рекомендуется повторное взятие биологического материала.
Материалы фильтр-карт: основа, пропитки и размет ки не оказывают ингибирующего
влияния.
3.9 Диагностические характеристики
По результатам клинических испытаний установлены характеристики диагностической
чувствительности и специфичности:
Делеция в 7 экзоне SMN1: диагностическая чувствительность (ДИ 95%) – 100,00%
(92,89% - 100,00%); диагностическая специфичность – 100,00% (96,38-100,00%).
TREC: диагностическая чувствительность (ДИ 95%) – 100% (86,28-100,00%);;
диагностическая специфичность – 100,00% (91,59-100,00%).
KREC: диагностическая чувствительность (ДИ 95%) – 100,00% (86,28 -100,00%);
диагностическая специфичность – 100,00% (91,59-100,00%).
По результатам клинических испытаний подтверждена внутрисерийная и межсерийная
воспроизводимость результатов при и спользовании набора реагентов «Genome -X max
SMA/TREC/KREC ». Воспроизводимость составила 100% с 95% доверительным интервалом
(97,84-100,00%).
4 ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕЗУЛЬТАТ
Нарушение настоящей инструкции при подготовке и хранении набора реагентов, взятии,
подготовке образцов и выполнении процедуры анализа;
Наличие интерферирующих веществ в образце;
Переливание крови;
Проведение терапии, оказывающей влияние на лейкопоэз новорожденного после
рождения;
Прохождение во время беременности матерью нов орожденного терапии, оказывающей
влияние на формирование иммунной системы плода.
--- стр. 12 ---
12
5 ОГРАНИЧЕНИЯ
- Для корректной оценки генотипирования по 7 экзону гена SMN1 и уровню кольцевых
молекул TREC и KREC количество геномной ДНК на пробирку должно составлять не мене е
0,5-1нг геномной ДНК - Допустимое значение Сt по каналу детекции референсного гена <33 В
образцах со значением С t по каналу детекции референсного гена (канал детекции ROX /
TexasRed)> 33 результат определяется как недостоверный результат (нд). Недостоверный или
сомнительный результат может быть обусловлен недостаточным количеством или качеством
исходного биологического материала (в том числе лейкопения, лимфопения и т.п. различного
генеза), нарушением протокола пробоподготовки или вызван присутс твием ингибиторов в
препарате ДНК, полученном из биологического материала; неверным выполнением протокола
анализа, несоблюдением температурного режима амплификации и др.
В этом случае требуется либо повторная постановка амплификации образца ДНК, либо
повторное выделение образца ДНК, либо повторное взятие биологического материала
(выполняется последовательно).
- У пациентов на парентеральном питании и /или получающих инъекции гепарина
внутривенно кровь для анализа отбирают не ранее чем через 6 часов после внутривенного
вливания.
- Не детектируются точечные мутации в гене SMN1, которые присутствуют примерно у
3% больных СМА
- Набор реагентов не выявляет скрытое носительство гетерозиготной делеции гена
SMN1 (случаи, когда одна аллель хромосомы несет две или б ольше копий гена SMN1, в то
время как на второй аллели хромосомы отсутствует целый ген SMN1) – в данном случае
результат тестирования на носительство будет ложнооотрицательным.
6 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
- Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно -
биологические (ПЦР) исследования биологического материала с соблюдением методических
указаний МУ 1.3.2569-09.
- При выделении ДНК работать в вытяжном шкафу, боксе биологической безопасности
II класса или в помещении с приточной вентиляцией.
При работе использовать средства индивидуальной защиты для предотвращения
контакта с организмом человека: перчатки медицинские, прилегающие очки или лицевой
щиток, использовать лабораторный халат и закрыту ю обувь. После окончания работы сн ять
перчатки, не касаясь внешней поверхности , и тщательно вымыть руки. Избегать контакта с
кожей, глазами и слизистыми оболочками, не глотать.
При аварийной ситуации с реагентами Буфер для лизиса, Буфер для первой
отмывки W1, Буфер для второй отмывки W2, Буфер для третьей отмывки W3
При вдыхании:
Вывести пострадавшего на свежий воздух. Вызвать врача. При остановке дыхания:
немедленно применять механическую вентиляцию, а также кислород, если необходимо.
При попадании на кожу
При попадании на кожу: Немедленно снять всю загрязненную одежду. Промыть кожу
водой/ принять душ. Немедленно вызвать врача.
При попадании в глаза
Промыть большим количеством воды не менее 15 мину т. Удалить контактные линзы.
Оперативно получить консультацию врача.
При попадании в желудок
При попадании внутрь: дать выпить воды (по меньшей мере два стакана). Немедленно
вызвать медицинскую помощь. Только в особых случаях, когда медицинская помощь
невозможна в течение одного часа, вызвать рвоту (только если пострадавший бодрствует и
--- стр. 13 ---
13
находится в полном сознании), дать активированный уголь (20 - 40 г в суспензии) и как можно
скорее проконсультироваться с врачом.
При возникновении пожара
Тушить при помо щи огнетушителя; использовать респиратор или противогаз -
возможно выделение оксидов углерода, оксидов серы.
- Раскапывание реактивов и образцов биологического материала для проведения ПЦР в
реальном времени должно осуществляться в боксе первого класса
- Все работы следует проводить только с использованием одноразовых наконечников с
аэрозольным барьером для полуавтоматических пипеток. Для каждого образца, содержащего
нуклеиновые кислоты, использовать отдельный наконечник.
- При работе с набором реагентов следует соблюдать ГОСТ Р ИСО 15190-2023.
- Перед началом работы необходимо ознакомится с пользовательскими инструкциями
на используемое оборудование и комплекты реагентов. Для получения надежных результатов
необходимо строгое соблюдение инструкций.
- При работе следует соблюдать особую осторожность, так как разбрызгивание
растворов может привести к контаминации и, как следствие, к ложноположительным
результатам.
- При удалении отходов не допускать открывания пробирок с продуктами ПЦР и их
разбрызгивания, так как это может привести к контаминации рабочих поверхностей и
оборудования.
Общие рекомендации и меры предосторожности при проведении амплификации:
Р103: Прочитайте этикетку перед использованием.
Р201: Перед использованием ознакомьтесь со специальными инструкциями.
Р301+Р330+Р331: При проглатывании: прополоскать рот. Не вызывать рвоту.
P305+P351+P338: При попадании в глаза: промыть глаза водой в течение нескольких
минут. Снимите контактные линзы, если они есть и это легко сделать. Продолжайте промывку.
P401: Хранить в соответствии с указанным на упаковке температурным режимом.
P410: Защищать от солнечного света.
7 ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕР ИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ДЛ Я ПРОВЕДЕНИЯ
АНАЛИЗА
Дополнительные материалы и оборудование, которые не входят в комплект поставки,
приобретаются отдельно.
1) ПЦР-бокс 1 класса , оснащенный бактерицидным проточным УФ -рециркулятором
воздуха, например, «Бокс для чистых работ» (например, РУ № РЗН 2023/19369).
2) Термостат твердотельный, например, ТТ-1 «Гном» (программируемый) (РУ № ФСР
2011/11806)
3) Магнитный штатив (1,5 / 2,0 мл)
или автоматическая станция для выделения нуклеиновых кислот. Набор
валидирован со следующими станциями:
Auto-Pure 96 ( ООО "Ханчжоуская компания инструментов Аошэн" , КНР (Hangzhou
Allsheng Instruments Co., Ltd.) РУ № РЗН 2022/16430)
Nexor32M (Яньтай Эддкеа Био-Тек Ко., Лтд., КНР, (Yantai Addcare Bio-Tech Co.,
Ltd.) РУ № РЗН 2022/18775)
4) Прибор для ПЦР в реальном времени, оснащенный каналами детекции FAM /
SybrGreen, ROX / TexasRed, JOE / HEX, Cy5 . Набор валидирован со следующими
приборами:
- Амплификатор детектирующий «ДТпрайм» по ТУ 9443 -004-96301278-2010 5М1,
5М3, 5М6, 5Х1 (РУ № ФСР 2011/10229),
- Амплификатор нуклеиновых кислот Applied Biosystems QuantStudio 5 с
--- стр. 14 ---
14
гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме реального
времени (РУ № РЗН 2019/8446)
- Прибор для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального
времени Rotor-Gen Q с принадлежностями (РУ № ФСЗ 2010/07595)
- Амплификатор нуклеиновых кислот CFX Opus 96 Dx с детекцией продуктов ПЦР в
режиме реального времени (РУ № РЗН 2022/18397)
- Амплификатор с детекцией в режиме реального времени LOCUS® Intero (РУ №
РЗН 2024/22132)
5) центрифуга для микропробирок / планшетов Центрифуга-вортекс для ПЦР
планшетов, пригодная д ля 96 -луночных ПЦР планшетов или настольная
миницентрифуга для микропробирок microspin, например , «Ц ентрифуга/вортекс
Комбиспин FVL-2400N» (Biosan) (РУ № ФС №2005/514)
6) Дозатор пипеточный варьируемый одноканальный, ГОСТ 10223-97 класс 0,2 Объем
дозирования 0,1 ... 1 мкл,
7) Дозатор пипеточный варьируемый одноканальный или многоканальный , ГОСТ
28311-89 Объем дозирования 0,5 ... 10 мкл,
8) Дозатор пипеточный варьируемый одноканальный или многоканальный , ГОСТ
28311-89 Объем дозирования 20 ... 200 мкл,
9) Дозатор пипеточный варьируемый одноканальный или многоканальный , ГОСТ
28311-89 Объем дозирования 100 ... 1000 мкл,
10) Наконечники к пипеткам Полуавтоматические с аэрозольным барьером,
сертифицированные на отсутствие ДНКаз, например, «Наконечники для дозаторов в
штативе и без штатива» 0,5-10 мкл ФСЗ 2012/12495 (Guangzhou Jet Bio-Filtration Co),
«Наконечник для дозатора» 100 мкл, 300 мкл, 1000 мкл ( Yancheng Huida Medical
Instruments Co) (РУ № ФСЗ 2011/10017)
11) Микропробирки не контаминированные ДНК, ДНКазами и РНКазами, объемом 1,5
мл или 2 мл, пригодные для центрифугирования, например Микропробирка, в том
числе для криохранения (РУ № ФСЗ 2011/09223), для проведения предлизиса сухих
пятен крови и приготовления мастер-миксов для ПЦР
12) Штативы для микропробирок для объема 1,5 мл
13) Компьютер, оснащенный кабелем, пригодным для соединения с ПЦР -
амплификатором, и совместимый с программным обеспечением
14) Устройство для пробивки образцов пятен высушенной крови, ручное или
автоматическое (панчер), с возможность выби вания кружка диаметром 3,2 мм ,
например, Валлак DBS панчер МЗ (РУ № РФ № 2000/776)
15) Холодильник, от 2 до 8 °С
16) Морозильная камера, от минус 22 до минус 18 °С
17) Вода очищенная (без нуклеаз, деионизированная, многократно дистилированная и
стерилизованная с помощью фильтрации 0,1 мкм) или Вода для инъекций
8 ИНФОРМАЦИЯ ОБ УСЛОВИ ЯХ, НЕОБХОДИМЫХ ДЛЯ СБОРА, ОБРАБОТКИ И
ПОДГОТОВКИ ОБРАЗЦОВ
Для анализа используются сухие пятна крови на фильтр -карте, цельная кровь, ворсины
хориона, амниоциты, полногеномный амплификат клеток эмбриона (WGA) .
Сухие пятна крови
Взятие крови новорожденных для получения сухого пятна крови осуществляют в
соответствии с рекомендациями по забору крови при проведении массового обследования
новорожденных детей на наследственные заболевания (Приложение № 2 к Приказу
Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 22 марта 2006 года, № 185 «О
массовом обследовании новорожденных детей на наследственные болезни») и инструкциями
производителей к бумажным фильтр-картам.
--- стр. 15 ---
15
Рекомендуется наносить кровь на фильтр -карту в соответствие с ограничивающей
разметкой, при этом кровь должна пропитать бумагу насквозь. После нанесения крови фильтр -
карта высушивается в горизонтальном положении на чистой сухой поверхности не мен ее 2
часов без применения дополнительной тепловой обработки.
Для получения сухого пятна допускается использование о бразца цельной кров и, см .
описание ниже.
Транспортировка и хранение образцов на фильтр -картах после высушивания
проводится в соответствии с инструкциями производителей. Срок хранения тест -бланков
регламентируется методическими рекомендациями «Метод получения сухого пятна крови на
тест-бланк для проведения клинико -лабораторных исследований»/Ассоциа ция медицинских
генетиков. Российское общество неонатологов. 2022 г. https://amg-
genetics.ru/pdf/2023/met_rekomendacii_pyatna_krovi_29_12_2022.pdf
Для анализа образца из области фильтр -карты, пропитанной кровью с двух сторон, с
помощью ручного или автомати ческого панчера выбивается 3 диска диаметром 3,2 мм в
пробирку для дальнейшего выделения ДНК.
Цельная кровь
Цельная кровь должна быть забрана в пробирку с антикоагулянтом
этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) . После забора крови необходимо перевернуть пробирку
2-3 раза для перемешивания крови с антикоагулянтом. Допускается транспортирование и
хранение образцов цельной крови в пробирках при температуре от +2 оС до +8 оС до 3-х суток.
Допускается однократное замораживание и хранение крови в пробирках при температуре от
минус 10°С до минус 30°С.
ВНИМАНИЕ! Не допускается использование крови, забранной в пробирку с
антикоагулянтом гепарином, ни в цельном виде, ни в виде сухих пятен крови.
Ворсины хориона
10-20 мг, в стерильных пробирках с 0,9% раствором NaCl.
Допускается транспортирование и хранение при температуре от +2 °С до +8 °С.
Амниотическая жидкость
Взятие амниотической жидкости производят в ходе процедуры амниоцентеза согласно
утвержденному алгоритму проведения. Отбор аликвоты материала проводят в сухо й стерильный
контейнер, снабженный герметично завинчивающейся крышкой, в количестве не менее 1,0-2,0 мл.
После сбора контейнер плотно закрывают и маркируют.
Образцы амниотической жидкости допускается транспортировать и хранить:
- при температуре от 2 °С до 8 °С - не более одних суток;
- при температуре от минус 18 °С до минус 20 °С - не более одной недели;
- при температуре минус 70 °С - длительно.
ВНИМАНИЕ! Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.
ДНК из биоптата трофэктодермы после проведения полногеномной
амплификации
ДНК из биоптата трофэктодермы после проведения полногеномной амплификации
используются без дополнительной обработки.
Образцы хранить при температуре минус 18°C не более одного месяца; при температуре
минус 70 °С – длительно или в соответствии с указаниями эксплуатационной документации на
реагенты для получения полногеномного амлификата ДНК из биоптата трофэктодермы.
9 ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Для проведения анализа возможно использование 5 типов образцов биоматериала – цельная кровь,
сухие пятна крови на фильтр -карте, ворсины хориона , амниоциты , полногеномный амплификат
клеток эмбриона (WGA).
--- стр. 16 ---
16
ДНК выделяется 1) автоматически с использованием автоматической станции с магнитной
гребенкой/головкой или 2) вручную с магнитным штативом,
ПЦРамплификация была валидирована на пяти типах приборов. Ниже даны указания на действия
со всеми перечисленными материалами и приборами.
Тестирование для скрининга и для диагностики СМА проводится по одним и тем же шагам.
Однако если и скрининг и диагностика проводится набором « Genome-X max SMA/TREC/KREC»,
то для диагностики СМА и скрининга должны использоваться биоматериалы, взятые у пациента в
разное время.
Рекомендуется для диагностики СМА проводить анализ ДНК в 2х повторах.
ВНИМАНИЕ! Для диагностики нельзя использовать биопробы, которые применялись для
скринингового тестирования, обязательно повторное взятие биоматериала.
ВНИМАНИЕ! Диагностику данным набором реагентом проводят только на СМА (болезнь –
гомозиготная делеция ; носительство – гетерозиготная делеция); Результаты исследования
на иммунодефицитные состояния могут быть интерпретированы только в комплексе с
другими исследованиями, возрастом новорожденного и клинической картиной.
9.1 Выделение ДНК из сухих пятен крови на фильтр -карте, из цельной крови , из ворсин
хориона, из амниоцитов.
9.1.1 Предварительная обработка
9.1.1.1 Предлизис сухих пятен крови
1) Промаркировать 1,5 мл пробирки. Промаркировать 1 пробирку « ОКО» для
отрицательного контрольного образца.
ВНИМАНИЕ! Соблюдайте аккуратность соответствия маркировки пробирок,
образцов и сведений в системе регистрации образцов.
2) Приготовить свежий 1 Х буфер для предлизиса из 100X PLB с помощью
ампулированной или бидистиллированной воды 1:99 из расчета 200 мкл 1 Х буфера
на пробу.
Рассчитать количество 1Х буфера, необходимого для предлизиса, по формуле:
2*(n+1) мкл 100Х PLB + 198*(n+1) мкл воды,
где n – количество образцов.
3) Выбить из сухого пятна крови панчером 3 диска диаметром 3,2 мм в отдельные
промаркированные пробирки на 1,5 мл. В пробирку «ОКО» внести 10 мкл
контрольного материала ОКО
ВНИМАНИЕ! При выбивании пятен ручным панчером перед выбиванием образца
сухого пятна крови рекомендуется сделать несколько высечек на чистом месте листа
фильтровальной бумаги для снижения риска перекрестной контаминации образцов.
4) В пробирки с фильтрами внести (включая пробирку « ОКО») по 200 мкл
свежеприготовленного 1Х буфера для предлизиса.
5) Вортексировать в течение 1 минуты. Следить за тем, чтобы фильтры находились в
объеме жидкости.
6) Поместить пробирки в холодный твердотельный термостат ( например, «Гном») и
установить температуру 75°С. Нагревать с момента установления температуры 75°С
в течение 15 минут. В случае установки пробирок в уже разогретый термостат,
увеличить время инкубации на 10 минут. Если ваша автоматическая станция для
выделения ДН К позволяет осуществлять термостатирование образцов – этот шаг
можно сделать в ней.
--- стр. 17 ---
17
7) Вортексировать в течение 1 минуты. Следить за тем, чтобы фильтры находились в
объеме жидкости.
8) Центрифугировать в течение 3 минут при 13 000 об./мин.
9) Перенести весь жидкий объем исследуемых предлизированных образцов в лунки
столбца «LB»/планшета « LB» (см. Автоматическое выделение ДНК ) или в чистую
подписанную пробирку с лизирующим буфером (см. Ручное выделение ДНК с
использованием магнитного штатива)
9.1.1.2 Предлизис образцов цельной крови
1) Промаркировать 1,5 мл пробирки.
2) Приготовить свежий 0,5 Х буфер для предлизиса из 100X PLB с помощью
ампулированной или бидистиллированной воды 1:199 из расчета 200 мкл 0,5Х буфера на пробу.
Рассчитать количество 0,5Х буфера, необходимого для предлизиса, по формуле:
(n+1) мкл 100Х PLB + 199*(n+1) мкл воды,
где n – количество образцов.
3) Перемешать цельную кровь, несколько раз переворачивая пробирку с кровью в руках .
Отобрать аликвоту 100 мкл цельной крови и перенести в промаркированные пробирки на 1,5 мл. В
пробирку «ОКО» внести 10 мкл образца ОКО или 100 мкл физраствора.
4) В пробирки с кровью (включая пробирку «ОКО») внести по 200 мкл
свежеприготовленного 0,5Х буфера для предлизиса.
5) Вортексировать в течение 5 секунд.
6) Центрифугировать в течение 5 минут при 5 000 об./ мин. Слить супернатант, оставив ~10
мкл жидкости на дне пробирки.
7) Перемешать осадок пипетированием в оставшемся объеме жидкости и полностью
перенести этот объем в лунки столбца «LB» /планшета «LB» (см. Автоматическое выделение
ДНК) или в чистую подписанную пробирку с лизирующим буфером (см. Ручное выделение ДНК с
использованием магнитного штатива)
При ручном выделении ДНК с использованием магнитного штатива можно продолжить
процесс в пробирках, где выполнялся предлизис.
9.1.1.3 Подготовка амниоцитов.
1) Промаркировать 1,5 или 2 мл пробирки.
2) Перемешать образец амниотической жидкости, несколько раз переворачивая
пробирку/шприц в руках либо пипетированием. Отобрать аликвоту 300 мкл (допустимый объем
0,1-2 мл) и перенести в промаркирован ные пробирки. В пробирку «ОКО» внести 10 мкл образца
ОКО или 300 мкл физраствора.
3) Центрифугировать в течение 2 минут при 13400 об./мин. Слить супернатант, оставив ~10
мкл жидкости на дне пробирки.
4) Перемешать осадок пипетированием в оставшемся объеме жидкости и полностью
перенести этот объем в лунки столбца «LB» /планшета «LB» (см. Автоматическое выделение
ДНК) или в чистую подписанную пробирку с лизирующим буфером (см. Ручное выделение ДНК с
использованием магнитного штатива).
При ручном выделении ДНК с использованием магнитного штатива можно продолжить
процесс в пробирках, где выполнялся предлизис.
9.1.2 Автоматическое выделение ДНК
Запрограммировать автоматическую станцию для выделения ДНК в соответстви и с
шагами, указанными ниже, согласно инструкции по эксплуатации.
Перед началом работы рекомендуется провести УФ обработку станции в течение 30 минут.
ВНИМАНИЕ! В случае образования кристаллов в Буфере для лизиса LB нагреть в
термостате при температуре 65°С до растворения кристаллов.
--- стр. 18 ---
18
9.1.2.1 Подготовка глубоколуночных планшетов
1) Промаркировать столбцы планшета:
Станции для единовременного выделения 32 образцов: Последовательно
промаркировать 6 столбцов планшета: 1 – «LB», 2 – «W1», 3 – «W2», 4 – «W3», 5 –
«×» (пропуск столбца), 6 – «EB».
Станции для единовременного выделения 96 образцов: Последовательно
промаркировать 5 планшетов: 1 – «LB», 2 – «W1», 3 – «W2», 4 – «W3», 5 – «EB».
2) В лунки столбца/планшета «LB» внести по 500 мкл Буфера для лизиса LB.
3) В лунки столбца/планшета «W1» внести по 700 мкл Буфера для первой отмывки W1.
4) В лунки столбца/планшета «W2» внести по 700 мкл Буфера для второй отмывки W2.
5) В лунки столбца/планшета «W3» внести по 700 мкл Буфера для третьей отмывки
W3.
6) Лунки столбца × оставить пустыми. При работе со станциями для единовременн ого
выделения 96 образцов данный пункт пропустить.
7) В лунки столбца/планшета «EB» внести по 100 мкл Буфера для элюции EB.
8) Вортексировать Магнитный сорбент М в течение 30 секунд и внести по 10 мкл
Магнитного сорбента М в лунки столбца «LB».
9) В случае выделения ДНК из цельной крови, ворсин хориона или амниоцитов внести
7 мкл 100X PLB в лунки столбца «LB». При выделении ДНК из сухих пятен крови
этот пункт пропускается!
9.1.2.2 Выделение и очистка ДНК
1) В случае сухих пятен крови лунки столбца «LB» /планшета «LB» внести весь
жидкий объем исследуемых предлизированных образцов, подготовленных по п . 9.1.1.1,
включая контроль «ОКО».
ВНИМАНИЕ! Если ваша автоматическая станция позволяет перемешивать и
термостатировать образцы, Вы можете автоматизиров ать п. 9.1.1.1 «Предлизис
сухих пятен крови». Для стадии предлизиса используйте отдельную насадку на
магнитные стержни. Настройте перемешивание так, чтобы диски всегда были
в растворе, а интенсивность перемешивания не приводила к разрушению
бумажной основы диска. По окончании предлизиса отберите жидкость, не
затрагивая бумажную основу диска.
В случае выделения из цельной крови или амниоцитов, в лунки столбца/планшета
«LB» внести суспензию, полученную после слива супернатанта см п . 9.1.1.2, 9.1.1.3,
включая контроль «ОКО».
В случае выделения ДНК из ворсин хориона внести фрагмент ворсины напрямую
в лунки столбца «LB». Ворсины хориона не требуют отдельной стадии предлизиса. В
отдельную лунку столбца/планшета «LB» внести 10 мкл контроля «ОКО».
ВНИМАНИЕ! Соблюдайте аккуратность соответствия образцов и сведений в
системе регистрации образцов.
2) Установить гребенки в соответствующие разъемы станции.
3) Установить планшеты с образцами в станцию.
4) Запустить протокол экстракции*.
№
эта-
па
№
столбца
(планше
та)
Этап
Ожи-
дание
(сек)
Переме-
шивание
(сек)
При-
тяжение
(сек)
Ско-
рость
пере-
меши-
вания
Объем
(мкл)
Темпе-
ратура
(°C)
1 1 LB 0 600 120 Средняя 800 60
2 2 W1 0 120 120 Средняя 700 Выкл
--- стр. 19 ---
19
№
эта-
па
№
столбца
(планше
та)
Этап
Ожи-
дание
(сек)
Переме-
шивание
(сек)
При-
тяжение
(сек)
Ско-
рость
пере-
меши-
вания
Объем
(мкл)
Темпе-
ратура
(°C)
3 3 W2 0 120 120 Средняя 700 Выкл
4 4 W3 0 0 15 Низкая 700 Выкл
5 6 EB 0 300 120 Высокая 100 80
6 2 Waste** 0 15 0 Высокая 700 Выкл
*Представлен протокол экстракции для станции для единовременного выделения 32 -х
образцов Nexor 32M (Яньтай Эддкеа Био -Тек Ко., Лтд., КНР, РЗН 2022/18775). Если вы
используете другие модели станций, настройте прибор согласно инструкции, которая идет в
комплекте с вашим оборудованием.
Протокол экстракции для Auto-Pure 96 можно скачать с сайта или получить по запросу (см.
сведения о производителе)
** «Waste» – Сброс отработанных магнитных частиц.
5) По окончании программы собрать из лунок столбца/планшета EB готовый раствор
очищенной ДНК в чистые промаркированные пробирки . В случае хранения
образцов непосредственно в планшете необходимо заклеить планшет пленкой.
Образцы выделенных нуклеиновых кислот могут храниться при температуре +2… +8 °C в
течение 72 часов.
9.1.3 Ручное выделение ДНК с использованием магнитного штатива
1) Предварительную обработку образцов биоматериала провести как описано в п.
9.1.1.1-9.1.1.3. В случ ае выделения ДНК из ворсин хориона отдельная стадия
предобработки не требуется.
2) Промаркировать пробирки на 1,5 мл в количестве исследуемых образцов , вклю чая
пробирку для «ОКО».
ВНИМАНИЕ! Соблюдайте аккуратность соответствия образцов, маркировки
пробирок, применяемых в анализе, и сведений в системе регистрации образцов.
3) Внести по 500 мкл буфера для лизиса (LB) в о все промаркированные пробирки ,
включая образец «ОКО».
4) Вортексировать магнитные частицы (М) на вортексе в течение 30 секунд . Внести по
10 мкл магнитных частиц в пробирки с LB.
5) В случае выделения ДНК из цельной крови, ворсин хориона или амниоцитов внести
7 мкл 100X PLB в пробирки с «LB». При выделении ДНК из сухих пятен крови этот
пункт пропускается!
6) Внести объем исследуемых предобработанных образцов в соответствие с п. 9.1.1 -
9.1.3 в пробирки с LB. Закрыть крышки пробирок . Перемешать содержимое
пробирок на вортексе и осадить капли. В случае выделения ДНК из ворсин
хориона внести фрагмент ворсины напрямую в пробирки с LB.
7) Выдержать пробирки в разогретом твердотельном термостате («Гном») (60 °С) 10
мин. Забрать пробирки.
8) Разогреть термостат до 80 °С для последующего элюирования (п. 9.1.3 пп. 25).
--- стр. 20 ---
20
9) Перемешать содержимое пробирок на вортексе и осадить капли. Открыть крышки
пробирок.
10) Перенести пробирки в магнитный штатив на 2 мин.
11) По истечени и указанного времени, не снимая со штатива и не задевая магнитные
частицы, аккуратно удалить весь жидкий объем пробирок.
12) Внести по 700 мкл буфера для первой отмывки (W1) в пробирки. Закрыть крышки
пробирок.
13) Перемешать содержимое пробирок на вортексе и осадить капли. Открыть крышки
пробирок.
14) Перенести пробирки в магнитный штатив на 2 мин.
15) По истечени и указанного времени, не снимая со штатива и не задевая магнитные
частицы, аккуратно удалить весь жидкий объем содержимого пробирок.
16) Внести по 700 мкл буфера для второй отмывки (W2) в пробирки. Закрыть крышки
пробирок.
17) Перемешать содержимое пробирок на вортексе и осадить капли. Открыть крышки
пробирок.
18) Перенести пробирки в магнитный штатив на 2 мин.
19) По ист ечении указанного времени, не снимая со штатива и не задевая магнитные
частицы, аккуратно удалить весь жидкий объем пробирок.
20) Внести по 700 мкл буфера для третьей отмывки (W3) в пробирки.
ВНИМАНИЕ! ПРОБИРКИ НЕ ЗАКРЫВАТЬ! НЕ ПЕРЕМЕШИВАТЬ
СОДЕРЖИМОЕ!
21) Выдержать пробирки на магнитном штативе в течение 2 мин.
22) По истечени и указанного времени, не снимая со штатива и не задевая магнитные
частицы, аккуратно удалить весь объем содержимого пробирок.
23) Внести по 100 мкл буфера для элюции (EB) в пробирки. Закрыть крышки пробирок.
24) Перемешать содержимое пробирок и осадить капли на вортексе.
25) Выдержать пробирки в разогретом термостате (80 °С) 5 мин. Перемешивать каждые
2 мин.
26) Осадить капли на вортексе. Открыть крышки пробирок.
27) Перенести пробирки в магнитный штатив на 2 мин.
28) По истечени и указанного времени, не снимая со штатива и не задевая магнитные
частицы, аккуратно собрать из лунок столбца/планшета EB готовый раствор
очищенной ДНК в чистые промаркированные пробирки.
Образцы выделенных нуклеиновых кислот могут хранитьс я при температуре +2… +8 °C в
течение 72 часов.
9.2 Подготовка к постановке ПЦР в реальном времени
1. Разморозить MasterMix. После размораживания перемешать, несколько раз
переворачивая пробирку , мягким вортексом или пипетированием, сбросить капли на
центрифуге.
2. Отобрать в отдельную пробирку (А) необходимое количество MasterMix из расчета 16
мкл на образец, с запасом равным аликвоте на 2 -4 дополнительных образца. Остатки
MasterMix хранить при минус 20°C.
3. К MasterMix в пробирке А добавить Полимеразу из расчета 1 мкл на каждые 16 мкл
MasterMix. Тщательно перемешать готовую смесь на мягком вортексе и
пипетированием. Остатки Полимеразы хранить при минус 20°C.
--- стр. 21 ---
21
ВНИМАНИЕ! Полимеразу следует доставать из морозильной камеры
непосредственно перед использованием
4. Для ПЦР-РВ раскапать:
- Во все пробирки (лунки планшета) по 17 мкл готовой смеси.
- По 10 мкл образцов контрольных и калибровочных ДНК*:
Калибратор SMN1 +/+
Калибратор К1,
Калибратор К2,
Калибратор К3,
Калибратор К4
Калибратор К5
- Выделенные ДНК, включая «ОКО» по 10 мкл
или
ДНК из биоптата трофэктодермы после проведения полногеномной амплификации
(WGA) – добавить от 2 до 10 мкл образца на пробирку . При использовании меньшего
объема (рекомендуется) смешать с водой для иньекций или водой очищенной (без
нуклеаз, деионизированная, многократно дистилированная и стерилизованная с
помощью фильтрации 0,1 мкм) до суммарного объема раствора ДНК и воды 10 мкл!
Примечание* При тестировании образцов биоматериалов только для оценки
наличия делеций 7 экзона ге на SMN1 допускается применение сокращенного списка
контрольных и калибровочных ДНК: Калибратор SMN1 +/+, Калибратор К3 и ОКО.
ВНИМАНИЕ! Соблюдайте аккуратность соответствия маркировки
пробирок/лунок планшета, применяемых в анализе, и сведений в системе регистрации
образцов.
5. Удалите капли со стенок пробирок/планшета центрифугированием.
6. Поместите пробирки/планшет в прибор для ПЦР в реальном времени.
7. Детекция флуоресцентного сигнала должна проводится по каналам для флуорофоров
FAM / SybrGreen, ROX / TexasRed, JOE/HEX, Cy5
9.3 Проведение ПЦР в реальном времени на приборах Applied Biosystems QuantStudio 5
9.3.1 Параметры определения
Задать следующие настройки прибора:
1) Тип анализа – Comparative Ct (ΔΔCt)
2) Условия реакции (вкладка «метод» (Method):
предварительная
денатурация
1 цикл 95 °С - 5 мин
--- стр. 22 ---
22
амплификация
46 циклов
94°С - 15 сек
62° - 1 мин – считывание сигнала
3) Во вкладке мишени и образцы (подпись образцов и мишеней возможно также
проводить на компьютере после окончания эксперимента):
̵ Задать мишени, перейдя на страницу расширенных настроек: SMN1 – FAM, TREC –
VIC, KREC – Cy5, референс – ROX.
̵ Подписать образцы.
̵ Убрать задаваемый по умолчани ю референс ( ROX), и выбрать в качестве
эндогенного контроля референсный ген, а также указать образец с 2 копиями гена
SMN1 в качестве референсного образца.
4) Запустить протокол на приборе, нажав кнопку «Cтарт» (Run)
5) По окончанию амплификации на вкладке «Ре зультаты» нажать кнопку «Анализ»
(Analyze) и во всплывающем окне « Amplification plot» проверить пороговые уровни
для каждой мишени. При необходимости убрать галочку с автоматического выбора
порогового уровня и задать для пороговых уровней следующие значения:
̵ SMN1 ~ 25000-50000
̵ референс ~ 50000-110000
̵ TREC ~ 10000-17000
̵ KREC ~ 8000-12000
ВНИМАНИЕ! Эффективность реакции может немного варьировать в зависимости
от партии, поэтому выставлять пороговый уровень флуоресценции следует, опираясь на
следующие утверждения:
1.Пороговый уровень должен превышать фоновую флуоресценцию, т.е. флуоресценцию
на ранних циклах до экспоненциального роста кривых амплификации (для SMN1 и
референсного гена пороговый уровень должен превышать флуоресценцию, которая
наблюдается до 12 цикла, для TREC и KREC - до 22 цикла).
2. Средние значения Ct должны составлять:
~27,5 для ROX,
~26,5 для FAM,
~31,5 для VIC,
~32 для Cy5.
6) После выставления пороговых уровней нажать кнопку «Анализ» (Analyze) для
перерасчета значений с учетом введенных параметров.
9.3.2 Интерпретация результатов исследования 7 экзона гена SMN1:
Для получения результатов амплификации открываем во вкладке «Результаты» окно
«Экспрессия генов».
В таблице результатов смотрим показатель RQ.
Для цельной крови, СПК, ДНК из биоптата трофэктодермы после проведения
полногеномной амплификации (WGA):
- Результат анализа положительный (обнаружена СМА) , если пороговый цикл (Ct) по
каналу детекции FAM не определяется или RQ= 0 при условии Ct по каналу д етекции ROX
<33.
--- стр. 23 ---
23
- Результат анализа положительный (обнаружено гетерозиготное носительство СМА) ,
если RQ равно 0,5±0,2*.
- Результат анализа отрицательный (СМА не обнаружена) , если RQ для образца будет
равным 1±0,25 (для 2 копий), 1,5±0,25 (для 3 копий), 2±0,25 (для 4 копий)*.
*данное значение RQ достигается при условии, что в качестве референсного
(калибровочного) образца задан образец с 2 копиями гена SMN1, выделенный тем же способом,
что и остальные образцы, либо ДНК SMN1 +/+. В случае применения калиб ратора ДНК SMN1 +/+
для расчета RQ используйте коэффициент S, указанный в паспорте:
RQ×S = 0,5±0,2 (для 1 копии)
RQ×S = 1±0,25 (для 2 копий)
RQ×S= 1,5±0,25 (для 3 копий)
RQ×S= 2±0,25 (для 4 копий)
Для Амниотической жидкости, Ворсин хориона:
- Результат анализа положительный (обнаружена СМА) , если пороговый цикл (Ct) по
каналу детекции FAM не определяется или RQ= 0 при условии Ct по каналу детекции ROX
<33.
- Результат анализа отрицательный (СМА не обнаружена) , если RQ для
образца ≥ 0,3
Для всех типов биоматериала:
- Результат анализа невалидный:
1) если для данной пробы Ct(ROX)> 33.
2) Если при постановке в двух повторностях для данной пробы аликвот ы показали
результаты, относящиеся к разным диагностическим интервалам («положительный» и
«отрицательный» или «положительный СМА» и «положительный носительство»).
В этом случае требуется повторная постановка ПЦР с данным образцом , повторное
выделение образца или тестирование повторного забора биоматериала;
- Результат анализа сомнительный:
1) Если в результате проведения относительного количественного анализа или метода ΔΔCt
значение RQ для образца будет лежать в диапазоне от 0 до 0,3, а также иметь
промежуточные значения (от 0,7 до 0,75).
2) Если кривые амплификации имеют нестандартную форму.
В этих случаях требуется повторная постановка ПЦР с данным образцом или повторное
выделение образца.
Результат ПЦР -исследования считается достоверным, если получены правильные
результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации . В положительном
контрольном образце SMN1 (калибратор К3) должен наблюдаться экспоненциальный рост кривых
амплификации по каналу FAM и ROX. Для ОКО не должно наблюдаться экспоненциального
роста кривых амплифиакции ни по одному каналу. Для отрицательного контроля допускается
появление кривых флуоресценции на поздних циклах амплификации ниже пороговых уровней.
9.3.3 Интерпретация результатов исследования TREC и KREC:
Интерпретация результатов проводится с использованием калибровочных образцов. На
основе значений концентраций каждого калибратора (копий/мл), предоставленных
производителем (данные значения являются лотоспецифичными и представлены в паспорте) и на
--- стр. 24 ---
24
основе з начений Ct(VIC), Ct( Cy5) и Ct( ROX) происходит построение калибровочных кривых.
Далее по калибровочным кривым и значению Ct( VIC) и Ct( ROX) тестовых образцов находят
значение количества TREC в копиях/мл и референсного гена в копиях/мл*;
по калибровочным кри вым и значению Ct( Cy5) и Ct( ROX) тестовых образцов находят
значение количества KREC в копиях/мл и референсного гена в копиях/мл,
Расчет количества копий TREC и KREC на 10 5 лейкоцитов с учетом референсного гена
(ROX) производится по формуле:
N(TREC (KREC) (копий на 105 лейкоцитов) = (TREC (KREC) (копий/мл) / рефренсный ген
(копий/мл)) × 400000
* Примечание если значение Ct( VIC) и/ или Ct( Cy5) больше чем значения Ct( VIC) и/ или
Ct(Cy5) калибратора 1 (самого разбавленного) соответственно и при этом Ct(ROX) < 3 3
используйте для нахождения количества копий TREC и KREC на 10 5 лейкоцитов формулы
расчета по методу ΔΔCt:
Количество копий TREC =10((Сt(ROX)-Ct(VIC))/3,32)×F (1),
где Количество копий TREC - число копий TREC на 105 лейкоцитов
Сt(ROX) – пороговый цикл референсного гена,
Ct(VIC) – пороговый цикл TREC,
Коэффициент F – эмпирический коэффициент, указан в паспорте качества набора
реагентов.
Количество копий KREC =10((Сt(ROX)-Ct(Cy5))/3,32)×G (2),
где Количество копий KREC - число копий KREC на 105 лейкоцитов
Сt(ROX) – пороговый цикл референсного гена,
Ct(Cy5) – пороговый цикл KREC,
Коэффициент G – эмпирический коэффициент, указан в паспорте качества набора
реагентов.
Результат анализа «норма» при значении числа копий:
TREC копий на 105 лейкоцитов> 450
KREC копий на 105 лейкоцитов> 250;
Результат анализа «высокий риск иммунодефицитных состояний» при значении числа
копий TREC и/или KREC на 105 лейкоцитов меньше 100
Группа пограничного риска**: при значении числа копий TREC на 105 лейкоцитов от 100
до 450
при значении числа копий KREC на 105 лейкоцитов от 100 до 250
** Примечание Группа пограничного риска – согласно методическим рекомендациям по
маршрутизации, разработанным в РФ, дети из данной группы требуют амбулаторного
наблюдения для своевременной помощи при проявлении признаков иммунодефицитных
состояний11.
Результат анализа невалидный, если для данной пробы Ct(ROX) > 33.
В этом случае требуется повторная постановка ПЦР с данным образцом или повторное
выделение образца.
--- стр. 25 ---
25
ВНИМАНИЕ! Результаты исследования на первичные иммунодефициты могут
быть интерпретированы только в комплексе с другими исследованиями, возрастом
новорожденного и клинической картиной.
9.4 Проведение ПЦР в реальном времени на приборе ДТпрайм
9.4.1 Параметры определения
Задать следующие настройки прибора:
1) Тип анализа – Мультиплекс, метод – Пороговый.
2) Пробирки – образец.
3) Объем рабочей смеси – 27 мкл.
4) Флуорофоры – Fam, Hex, Cy5, Rox (ВК).
5) Программа амплификации:
предварительная
денатурация
1 цикл 95 °С - 5 мин
амплификация
46 циклов
94°С - 15 сек
62° - 1 мин – считывание сигнала
6) Добавить тест: указать количество образцов.
7) Нажать кнопку «Старт»
8) По окончании амплификации проверить пороговые уровни флуоресценции.
Рекомендуется задать для порогового уровня амплификации мишеней следующие
значения:
̵ Fam ~ 35
̵ Rox ~ 70
̵ Hex ~ 10
̵ Cy5 ~ 10
ВНИМАНИЕ! Эффективность реакции может немного варьировать в зависимости
от партии, поэтому выставлять пороговый уровень флуоресценции следует чтобы
средние значения Ct составляли:
~27,5 для ROX,
~26,5 для FAM,
~31,5 для VIC,
~32 для Cy5.
При отличии средних значений Ct эмпирическим путем скорректируйте задаваемые
значения порогового уровня мишеней.
9.4.2 Интерпретация результатов исследования 7 экзона гена SMN1:
Для интерпретации результатов рекомендуется использовать программу Exсel или
другое программное обеспечение, предназначенное для математического обсчета данных. Для
--- стр. 26 ---
26
интерпретации результатов исследования 7 экзона гена SMN1 учитываются сигналы по каналу
FAM и ROX
Экспортируйте данные и примените к каждой пробе расчет по формуле (3) или (4):
1) если эффективность амплификации по FAM и ROX совпадает:
RQ=2−ΔΔCt (3)
Где:
ΔΔCt=ΔCt(образца)−ΔCt(контроля SMN1 +/+)
ΔCt(образца)=Ct(FAM)−Ct(ROX)
ΔCt(контроля SMN1 +/+)=Ct(FAM)−Ct(ROX)
2) если эффективности амплификации различаются более, чем на 5%
RQ=(EROX)ΔCt(ROX)/(EFAM)ΔCt(FAM) (4)
Где Е – эффективность амплификации:
ΔCt(FAM)=CtFAM (контроля SMN1 +/+)−ΔCtFAM (образца)
ΔCt(ROX)=CtROX (контроля SMN1 +/+)−ΔCt ROX (образца)
Для цельной крови, СПК, ДНК из биоптата трофэктодермы после проведения
полногеномной амплификации (WGA):
- Результат анализа положительный (обнаружена СМА) , если пороговый цикл (Ct) по
каналу детекции FAM не определяется или RQ= 0 при условии Ct по каналу детекции ROX
<33.
- Результат анализа положительный (обнаружено гетерозиготное носительство СМА) ,
если RQ равно 0,5±0,2*.
- Результат анализа отрицательный (СМА не обнаружена) , если RQ для образца будет
равным 1±0,25 (для 2 копий), 1,5±0,25 (для 3 копий), 2±0,25 (для 4 копий)*.
*данное значение RQ достигае тся при условии, что в качестве референсного
(калибровочного) образца задан образец с 2 копиями гена SMN1, выделенный тем же способом,
что и остальные образцы, либо ДНК SMN1 +/+. В случае применения калибратора ДНК SMN1 +/+
для расчета RQ используйте коэффициент S, указанный в паспорте:
RQ×S = 0,5±0,2 (для 1 копии)
RQ×S = 1±0,25 (для 2 копий)
RQ×S= 1,5±0,25 (для 3 копий)
RQ×S= 2±0,25 (для 4 копий)
Для Амниотической жидкости, Ворсин хориона:
- Результат анализа положительный (обнаружена СМА) , если пороговы й цикл (Ct) по
каналу детекции FAM не определяется или RQ= 0 при условии Ct по каналу детекции ROX
<33.
--- стр. 27 ---
27
- Результат анализа отрицательный (СМА не обнаружена) , если RQ для
образца ≥ 0,3
Для всех типов биоматериала:
- Результат анализа невалидный:
1) если для данной пробы Ct(ROX) > 33.
2) если при постановке в двух повторностях для данной пробы аликвот ы показали
результаты, относящиеся к разным диагностическим интервалам («положительный» и
«отрицательный» или «положительный СМА» и «положительный носительство»).
В этом случае требуется повторная постановка ПЦР с данным образцом или повторное
выделение образца;
- Результат анализа сомнительный:
1) Если значение RQ для образца будет лежать в диапазоне от 0 до 0,3, а также иметь
промежуточные значения (от 0,7 до 0,75)
2) Если кривые амплификации имеют нестандартную форму.
В этих случаях требуется повторная постановка ПЦР с данным образцом или повторное
выделение образца.
Результат ПЦР -исследования считается достоверным, если получены правильные
результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации. В
положительном контрольном образце SMN1 (калибратор К3) должен наблюдаться
экспоненциальный рост кривых амплификации по каналу FAM и ROX. Для ОКО не должно
наблюдаться экспоненциального роста кривых амплифик ации ни по одному каналу. Для
отрицательного контроля допускается появление кривых флуоресценции на поздних циклах
амплификации ниже пороговых уровней.
9.4.3 Интерпретация результатов исследования TREC и KREC:
Для интерпретации результатов исследования TREC и KREC учитываются сигналы по
каналам флуоресценции HEX (TREC), Cy5 (KREC) и ROX, см п. 9.3.3.
9.5 Проведение ПЦР в реальном времени на приборе серии Rotor-Gene.
9.5.1 Параметры определения
Поместить пробирки в ротор амплификатора в соответствие с нумерацией образцов.
Задать следующие настройки прибора:
1) Создать новый протокол, нажав кнопку «Новый» в основном меню программы.
2) В открывшемся окне перейти во вкладку «Детальный мастер» и выбрать из перечня
«Флуоресцентные зонды (TaqMan)/Двухшаговый цикл».
3) В окне «Мастера Нового Теста» выбрать тип заранее размещенного ротора и
отметить галочкой, что «Кольцо закреплено».
4) Заполнить поле «Объем реакции (μL): 7
5) Установить температурный профиль реакции, нажав на кнопку «Редактор профиля»
и задав условия реакции.
Удержание
температуры
1 цикл 95 °С на 5 мин
Циклирование
46 циклов
94 °С на 15 сек
62 °С на1 мин
6) Кликнуть левой кнопкой мыши на участок графика «62 °С на1 мин».
--- стр. 28 ---
28
7) Нажать на кнопку «Детек на Cycling A». В открывшемся окне задать детектируемые
каналы: «Green», «Yellow», «Red», «Orange».
8) Запустить протокол на приборе, нажав кнопку «Cтарт».
9) После запуска амплификации подписать образцы.
10) По оконч ании амплификации в меню нажать кнопку «Анализ», и во вкладке
«Количественный» выделить надпись Cycling A. FAM/Green и нажать кнопку
«Показать».
11) Установить уровень пороговой линией «Порог» в середине участка прироста
флуоресценции контрольных образцов. Рек омендованы следующие пороговые
уровни:
Green (Fam – SMN1) – 0,06
Orange (Rox - референс) – 0,08
Red (Cy5 - KREC) – 0,04
Yellow (Hex/Vic - TREC) – 0,14
12) В меню основного окна должны быть активированы кнопки «Нормализация»,
«Динамич. фон» (по умолчанию).
13) Рекомендовано исключить первые 7 циклов, нажав соответствующую кнопку
«Игнорировать» - выбрать «7». При наличии высокого уровня фоновой
флуоресценции на первых циклах амплификации это действие необходимо.
14) Выгрузить отчеты со значениями Ct по каждому каналу в табличном формате.
9.5.2 Интерпретация результатов исследования 7 экзона гена SMN1:
Для интерпретации результатов рекомендуется использовать программу Exсel или
другое программное обеспечение, предназначенное для математического обсчета данных. Для
интерпретации результатов исследования 7 экзона гена SMN1 учитываются сигналы по каналу
«Green» и «Orange».
Экспортируйте данные и примените к каждой пробе расчет по формуле (3) или (4):
1) если эффективность амплификации по «Green» и «Orange»совпадает:
RQ=2−ΔΔCt (3)
Где:
ΔΔCt=ΔCt(образца)−ΔCt(контроля SMN1 +/+)
ΔCt(образца)=Ct(Green)−Ct(Orange)
ΔCt(контроля SMN1 +/+)=Ct(Green)−Ct(Orange)
2) если эффективности амплификации различаются более, чем на 5%
RQ=(EOrange)ΔCt(Orange)/(EGreen)ΔCt(Green) (4)
Где Е – эффективность амплификации:
ΔCt(Green)=CtGreen (контроля SMN1 +/+)−ΔCtGreen (образца)
ΔCt(Orange)=CtOrange (контроля SMN1 +/+)−ΔCt Orange (образца)
RQ=1 - норма
RQ=0,5 – носитель
Для цельной крови, СПК, ДНК из биоптата трофэктодермы после проведения
полногеномной амплификации (WGA):
--- стр. 29 ---
29
- Результат анализа положительный (обнаружена СМА) , если пороговый цикл (Ct) по
каналу детекции FAM не определяется или RQ= 0 при условии Ct по каналу детекции ROX
<33.
- Результат анализа положительный (обнаружено гетерозиготное носительство СМА) ,
если RQ равно 0,5±0,2*.
- Результат анализа отрицательный (СМА не обнаружена) , если RQ для образца будет
равным 1±0,25 (для 2 копий), 1,5±0,25 (для 3 копий), 2±0,25 (для 4 копий)*.
*данное значение RQ достигается при условии, что в качестве референсного
(калибровочного) образца задан образец с 2 копиями гена SMN1, выделенный тем же способом,
что и остальные образцы, либо ДНК SMN1 +/+. В случае применения калибратора ДНК SMN1 +/+
для расчета RQ используйте коэффициент S, указанный в паспорте:
RQ×S = 0,5±0,2 (для 1 копии)
RQ×S = 1±0,25 (для 2 копий)
RQ×S= 1,5±0,25 (для 3 копий)
RQ×S= 2±0,25 (для 4 копий)
Для Амниотической жидкости, Ворсин хориона:
- Результат анализа положительный (обнаружена СМА) , если пороговый цикл (Ct) по
каналу детекции FAM не определяется или RQ= 0 при условии Ct по каналу детекции ROX
<33.
- Результат анализа отрицательный (СМА не обнаружена) , если RQ для
образца ≥ 0,3
Для всех типов биоматериала:
- Результат анализа невалидный:
1) если для данной пробы Ct(Orange) > 33.
2) если при постановке в двух повторностях для данной пробы аликвот ы показали
результаты, относящиеся к разным диагностическим интервалам («положительный» и
«отрицательный» или «положительный СМА» и «положительный носительство»).
В этом случае требуется повторная постановка ПЦ Р с данным образцом или повторное
выделение образца;
- Результат анализа сомнительный:
1) Если значение RQ для образца будет лежать в диапазоне от 0 до 0,3, а также иметь
промежуточные значения (от 0,7 до 0,75)
2) Если кривые амплификации имеют нестандартную форму.
В этих случаях требуется повторная постановка ПЦР с данным образцом или повторное
выделение образца.
Результат ПЦР -исследования считается достоверным, если получены правильные
результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации . В
положительном контрольном образце SMN1 (калибратор К3) должен наблюдаться
экспоненциальный рост кривых амплификации по каналу FAM и ROX. Для ОКО не должно
наблюдаться экспоненциального роста кривых амплифик ации ни по одному каналу. Для
отрицательного контроля допускается появление кривых флуоресценции на поздних циклах
амплификации ниже пороговых уровней.
9.5.3 Интерпретация результатов исследования TREC и KREC:
Для интерпретации результатов рекомендуется использовать программу Exсel или
другое программное обеспечение, предназначенное для математического обсчета данных. Для
интерпретации результатов исследования TREC и KREC учитываются сигналы по каналам
флуоресценции Yellow (TREC), Red (KREC) и Orange (референс), см п. 9.3.3.
--- стр. 30 ---
30
9.6 Проведение ПЦР в реальном времени на приборе типа CFX.
9.6.1 Параметры определения
1) Во вкладке «Файл» создаем новый протокол:
предварительная
денатурация
1 цикл 95 °С - 5 мин
амплификация
46 циклов
94°С - 15 сек
62° - 1 мин – считывание сигнала
2) Переходим во вкладку «Плашка» и создаем новую плашку:
̵ Выделяем нужное количество лунок, задаем мишени (кнопка “ select fluorophores”):
FAM, HEX, Cy5, ROX.
̵ выбираем тип образца ( sample type) – можно для всех образцов задать тип
«unknown», т.к. пересчет экспе риментальных данных в количество TREC, KREC
отличается от стандартных программ амплификатора.
̵ выбираем параметры эксперимента (кнопка “ experiment settings”), добавляем
мишени во вкладке “ targets”. “new” – пишем название мишени – SMN1 – нажимаем
кнопку “ add”. Таким же образом добавляем TREC, KREC и референсный ген. В
окошке мишеней ставим галочку “reference” напротив референсного гена. Нажимаем
“Ok” и возвращаемся к окну настройки плашки.
̵ В раздел “ target names” добавляем мишени напротив каналов детекции: FAM-
SMN1, HEX –TREC, ROX– референс, Cy5– KREC. Ставим галочки “load”.
̵ Подписываем образцы: выделяем нужную ячейку плашки, добавляем название,
нажимаем “load”.
̵ Подписав плашку, нажимаем «Ок».
3) Запускаем пробег, нажав кнопку «Start run».
4) По окончани ю амплификации проверяем пороговые уровни для каждого канала
детекции. Пороговые уровни для каждого канала должны располагаться выше уровня
фоновой флуоресценции, примерно в середине экспоненциального роста кривых
амплификации.
- Переходим во вкладку «Gene expression», задаем «mode» - «Normalized expression
(ΔΔCq)», Graph data – «Relative to control».
- «Control» - задаем контрольный образец для анализа числа копий гена SMN1 –
оптимальным является образец с 2 копиями гена SMN1, выделенный тем же способом,
что и анализируемые образцы.
9.6.2 Интерпретация результатов исследования 7 экзона гена SMN1:
Для быстрого анализа результатов исследования числа копий гена SMN1 в программе
прибора CFX96 во вкладке « Gene expression» смотрим окно “ Gene expression data table”,
столбец значений «expression».
При условии, что в качестве контрольного образца задан образец с 2 копиями гена
SMN1, а в качестве рефер енеса задан референсный ген по каналу детекции ROX, как описано
выше, то:
Для цельной крови, СПК, ДНК из биоптата трофэктодермы после проведения
полногеномной амплификации (WGA):
- Результат анализа положительный (обнаружена СМА) , если пороговый цикл (Ct) по
каналу детекции FAM не определяется или RQ= 0 при условии Ct по каналу детекции ROX
<33.
--- стр. 31 ---
31
- Результат анализа положительный (обнаружено гетерозиготное носительство СМА) ,
если RQ равно 0,5±0,2*.
- Результат анализа отрицательный (СМА не обнаружена) , если RQ для образца будет
равным 1±0,25 (для 2 копий), 1,5±0,25 (для 3 копий), 2±0,25 (для 4 копий)*.
*данное значен ие RQ достигается при условии, что в качестве референсного
(калибровочного) образца задан образец с 2 копиями гена SMN1, выделенный тем же способом,
что и остальные образцы, либо ДНК SMN1 +/+. В случае применения калибратора ДНК SMN1 +/+
для расчета RQ используйте коэффициент S, указанный в паспорте:
RQ×S = 0,5±0,2 (для 1 копии)
RQ×S = 1±0,25 (для 2 копий)
RQ×S= 1,5±0,25 (для 3 копий)
RQ×S= 2±0,25 (для 4 копий)
Для Амниотической жидкости, Ворсин хориона:
- Результат анализа положительный (обнаружена СМА) , если пороговый цикл (Ct) по
каналу детекции FAM не определяется или RQ= 0 при условии Ct по каналу детекции ROX
<33.
- Результат анализа отрицательный (СМА не обнаружена) , если RQ для
образца ≥ 0,3
Для всех типов биоматериала:
- Результат анализа невалидный:
1) если для данной пробы Ct(ROX)> 33.
2) Если при постановке в двух повторностях для данной пробы аликвот ы показали
результаты, относящиеся к разным диагностическим интервалам («положительный» и
«отрицательный» или «положительный СМА» и «положительный носительство»).
В этом случае требуется повторная постановка ПЦР с данным образцом или повторное
выделение образца;
- Результат анализа сомнительный:
1) Если в результате проведения относительного количественного анализа или метода ΔΔCt
значение RQ для образца будет лежать в диапазоне от 0 до 0,3, а также иметь
промежуточные значения (от 0,7 до 0,75).
2) Если кривые амплификации имеют нестандартную форму.
В этих случаях требуется повторная постановка ПЦР с данным образцом или повторное
выделение образца.
Результат ПЦР -исследования считается достоверным, если получены правильные
результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации. В положительном
контрольном образце SMN1 (Калибратор К3) должен наблюдаться экспоненциальный рост
кривых ампли фикации по каналу FAM и ROX. Для отрицательного контроля не должно
наблюдаться экспоненциального роста кривых амплифик ации ни по одному каналу. Для
отрицательного контроля допускается появление кривых флуоресценции на поздних циклах
амплификации ниже пороговых уровней.
9.6.3 Интерпретация результатов исследования TREC и KREC:
Для интерпретации результатов рекомендуется использовать программу Exсel или
другое программное обеспечение, предназначенное для математического обсчета данных.
Экспортируйте результаты пр обега (вкладка “export”), например в файл формата excel. В
экспортированных файлах выберите файл «Gene Expression Results – Summary». Далее
используйте указания п. 9.3.3.
- При использовании для расчета макроса производителя в файле «Gene Expression
Results – Summary» проверьте что анализируемые мишени идут последовательно для всех
образцов. Скопируйте названия образцов в макрос и значения Cq для каждого канала детекции
--- стр. 32 ---
32
в соответствующие столбцы макроса. Значения Cq, соответствующие калибраторам,
скопируйте в соответствующие окна макроса.
9.7 Проведение ПЦР в реальном времени на приборе типа LOCUS® Intero .
9.7.1 Параметры определения
1) Создаем новый эксперимент:
в «Настройках запуска» вносим параметры определения:
Объем реакции 27 мкл.
Добавляем стадии предварительная денатурация и дву хступенчатая амплификация.
Редактируем температуру и время каждого этапа в соответствие с указаниями ниже.
предварительная
денатурация
1 цикл 95 °С - 5 мин
амплификация
46 циклов
94 °С - 15 сек
62 °С - 1 мин – считывание
сигнала
Скорость изменения температуры 2.0 °С/s.
В «Настройках флуоресценции» отмечаем каналы, по которым будет происходить
считывание сигнала: FAM, HEX, ROX, Cy5.
Запускаем эксперимент.
2) После окончания эксперимента, переносим его на USB-накопитель и на компьютере
подписываем образцы и мишени.
Во вкладке «Sample setting» - выделяем на плашке все ячейки с образцами и добавляем
мишени напротив каналов детекции: FAM- SMN1, HEX –TREC, ROX– референс, Cy5–
KREC.
̵ выбираем тип каждого образца (sample type) – можно для всех образцов задать тип
«unknown», т.к. пересчет экспериментальных данных в количество TREC, KREC
отличается от стандартных программ амплификатора.
̵ Подписываем образцы: выделяем нужную ячейку плашки, добавляем название
напротив окошка « sample» (также названия образцов можно внести списком, нажав
«sample editor»).
3) Переходим во вкладку «Анализ». Вверху страницы щелкаем по иконке « New
analysis» - выбираем Relative Quantification. В появившемся окне ставим галочку в
графе «Ref Gene» напротив рефернесного гена по ROX. В этом же окне ниже в разделе
«sample» в столбце « Ref sample» ставим галочку напротив образца, относительно
которого будем проводить расчет числа копий гена SMN1. В качестве референсного
образца рекомендуется брать образец с 2 копиями гена SMN1, выделенного из того же
биоматериала тем же способом, что и анализируемые образцы. Также в качестве
референсного образца можно брать контроль SMN1++, в этом случае для расчета стоит
применить коэффициент, рекомендованный производителем набора.
В окошке « Amplification curve» п роверяем кривые амплификации и пороговые
уровни для каждого канала детекции. Для удобства рекомендовано выставлять
пороговые уровни на логарифмической шкале, нажав иконку log. В «Настройках
анализа» выбираем вариант «manual threshold», чтобы менять пороговые уровни. Далее
в окошке « Amplification curve» оставляем галочку только напротив того канала
флуоресценции, по которому мы будем менять пороговый уровень. Пороговые уровни
для каждого канала должны располагаться выше уровня фоновой флуоресценции,
примерно в середине экспоненциального роста кривых амплификации.
--- стр. 33 ---
33
В окошке «Bar chat» настраиваем «Display setting»: линейная шкала Y, Display: Gene
Expression. Представленые гистограммы соответствуют числу к опий гена SMN1,
деленных на 2, при условии, что в качестве Ref sample задан образец с 2 копиями гена
SMN1 (для этого образца значение будет равно 1). 0,5, соответственно, будет
соответствовать 1 копии гена SMN1.
9.7.2 Интерпретация результатов исследования 7 экзона гена SMN1:
Для быстрого анализа результатов исследования числа копий гена SMN1 в программе
прибора во вкладке «Bar chat» смотрим гистограммы значений.
Также можно экспортировать « Result table» в excel и провести анализ числа копий гена
SMN1 в макросе производителя на основе значений Ct.
При условии, что в качестве контрольного образца задан образец с 2 копиями гена
SMN1, а в качестве рефер енеса задан референсный ген по каналу детекции ROX, как описано
выше, то:
Для цельной крови, СПК, ДНК из биоптат а трофэктодермы после проведения
полногеномной амплификации (WGA):
- Результат анализа положительный (обнаружена СМА) , если пороговый цикл (Ct) по
каналу детекции FAM не определяется или RQ= 0 при условии Ct по каналу детекции ROX
<33.
- Результат анализа положительный (обнаружено гетерозиготное носительство СМА) ,
если RQ равно 0,5±0,2*.
- Результат анализа отрицательный (СМА не обнаружена) , если RQ для образца будет
равным 1±0,25 (для 2 копий), 1,5±0,25 (для 3 копий), 2±0,25 (для 4 копий)*.
*данное значен ие RQ достигается при условии, что в качестве референсного
(калибровочного) образца задан образец с 2 копиями гена SMN1, выделенный тем же способом,
что и остальные образцы, либо ДНК SMN1 +/+. В случае применения калибратора ДНК SMN1 +/+
для расчета RQ используйте коэффициент S, указанный в паспорте:
RQ×S = 0,5±0,2 (для 1 копии)
RQ×S = 1±0,25 (для 2 копий)
RQ×S= 1,5±0,25 (для 3 копий)
RQ×S= 2±0,25 (для 4 копий)
Для Амниотической жидкости, Ворсин хориона:
- Результат анализа положительный (обнаружена СМА) , если пороговый цикл (Ct) по
каналу детекции FAM не определяется или RQ= 0 при условии Ct по каналу детекции ROX
<33.
- Результат анализа отрицательный (СМА не обнаружена) , если RQ для
образца ≥ 0,3
Для всех типов биоматериала:
- Результат анализа невалидный:
1) если для данной пробы Ct(ROX)> 33.
2) если при постановке в двух повторностях для данной пробы аликвот ы показали
--- стр. 34 ---
34
результаты, относящиеся к разным диагностическим интервалам («положительный» и
«отрицательный» или «положительный СМА» и «положительный носительство»)
В этом случае требуется повторная постановка ПЦР с данным образцом или повторное
выделение образца;
- Результат анализа сомнительный:
1) Если в результате проведения относительного количественного анализа или метода ΔΔCt
значение RQ для образца будет лежать в диапазоне от 0 до 0,3, а также иметь
промежуточные значения (от 0,7 до 0,75).
2) Если кривые амплификации имеют нестандартную форму.
В этих случаях требуется повторная постановка ПЦР с данным образцом или повторное
выделение образца.
Результат ПЦР -исследования считается достоверным, если получены правильные
результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации. В положительном
контрольном образце SMN1 (калибратор К3) должен наблюдаться экспоненциальный рост кривых
амплификации по каналу FAM и ROX. Для отрицательного контроля (ОКО) не должно
наблюдаться экспоненциального роста кривых амплифиакции ни по одному каналу. Для
отрицательного контроля допускается появление кривых флуоресценции на поздних циклах
амплификации ниже пороговых уровней.
9.7.3 Интерпретация результатов исследования TREC и KREC:
Для интерпретации результатов рекомендуется использовать программу Exсel или
другое программное обеспечение, предназначенное для математического обсчета данных.
Экспортируйте «Result table» в excel и проведите анализ на основе значений Ct, как указано в
п. 9.3.3.
- При использовании для расчета макроса производителя в файле «Gene Expression
Results – Summary» отсортируйте данные трехуровневой сортировкой: на 1 уровне по столбцу
«Fluor», на втором уровне по столбцу «Sample» (если вносили идентификаторы образцов в ПО
амплификатора) и на третьем уровне по столбцу «Well». Проверьте что анализируемые
мишени идут последовательно для всех образцов. Скопируйте названия образцов в макрос и
значения Ct для каждого канала детекции в соответствующие столбцы макроса. Значения C t,
соответствующие калибраторам, скопируйте в соответствующие окна макроса.
10 КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Для оценки правильности определения проводится контроль качества в соответствии с
таблицей:
Параметр контроля Контрольный
материал/параметр
Критерий соответствия
Контроль контаминации: Отрицательный
контрольный образец,
ОКО
Флуоресценция по целевым
каналам не выше фонового
уровня
Правильность оценки делеций
гена SMN1
Значение Ct(FAM)
Калибратора К3.
Численное значение RQ
попадает в интервал значений,
указанный в паспорте качества
--- стр. 35 ---
35
Оценка количества или качества
исходного биологического
материала, соответствие
протокола пробоподготовки или
наличия ингибиторов в препарате
ДНК
Значения Ct(ROX) для
тестируемых образцов
Значения Ct(ROX) < 33
означает пригодность пробы для
проведения тестирования по
параметрам контроля.
Лаборатории рекомендуется использовать собственный положительный контрольный
образец (ПКО) для контроля прохождения реакции, используя типичный для лаборатории
биоматериал здорового человека. Критерии отбора материала для ПКО – остаточный
биоматериал здорового человека, ДНК из которого соответс твует 2 копиям гена SMN1 и (по
применимости) содержит количество молекул TREC, KREC в интервале от 1000 до 4000 копий
на 100 000 лейкоцитов.
При изготов лении ПКО следуйте указаниям раздела «Информация об условиях,
необходимых для сбора, обработки и подготовки образцов»
Образцы цельной крови (собранной в пробирки с ЭДТА) аликвотируйте в пробирки
объемом 1,5 – 2 мл, в количестве для одного анализа и заморо зьте. Внимание, допускается
только однократное замораживание–оттаивание образца. Для создания ПКО на основе цельной
крови нельзя использовать размороженную кровь.
По запросу производитель может предоставить образец ПКО в виде СПК.
11 УПАКОВКА
Индивидуальная упаковка компонентов набора реагентов
Все жидкие компоненты набора реагентов упакованы в индивидуальную упаковку :
полипропиленовые пробирки объемом 0,5 мл или 2 мл или флаконы 15, 60, 125 мл с винтовой
горловиной и завинчивающимися крышками:
На каждую индивидуальную упаковку наклеена этикетка самоклеящаяся, или этикетка
из бумаги писчей по ГОСТ 18510-87 с маркировкой.
Компоненты «Genome-X max SMA/TREC/KREC GM -01». Набор расходных материалов
для автоматического выделения ДНК и проведения ПЦР» упакованы в пакет ы с зип -лок
замком или запаянные пакеты из полиэтилена.
Потребительская упаковка набора реагентов
Компоненты «Genome -X max SMA/TREC/KREC 100 ПЦР», «Genome -X max
SMA/TREC/KREC 200 ПЦР» упакованы в коробку, выполненную из картона для
потребительской тары по ГОСТ 7933 -89, размером 65х75х25 мм (±3 мм), с ложементом из
полипропилена, или в коробку размером 84х58х30 мм (± 3 мм), оснащенную ложементом из
картона.
Компоненты «Genome -X max SMA/TREC/KREC СС» упакованы в коробку размером
136х75х25 мм (± 5 мм), выполненную из картона для потребительской тары по ГОСТ 7933 -89,
с ложементом из полипропилена.
Коробки с реагентами должны быть оклеены или запаяны в пленку так, чтобы они не
могли быть вскрыты без нарушения целостности упаковки.
«Genome-X ДНК» упакован в полиэтиленовый пакет с зип лок. И контролем вскрытия –
этикеткой с амоклеящейся. Упаковка содержит: Магнитный сорбент М, 100X буфер для
предлизиса 100X PLB, Буфер для лизиса LB, Буфер для первой отмывки W1, Буфер для второй
отмывки W2, Буфер для третьей отмывки W3, Буфер для элюции EB в индивидуальных
упаковках и паспорт качества.
«Genome-X max SMA/TREC/KREC GM -01». Набор расходных материалов для
автоматического выделения ДНК и проведения ПЦР» упакован в пакет с зип -лок замком или
запаянный пакет из полиэтилена.
Инструкция по применению входит в комплект поставки набора реагентов.
--- стр. 36 ---
36
12 УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ
Транспортирование Набора реагентов должно осуществляться крытыми
транспортными средствами всеми видами транспорт а, части набора реагентов
транспортировать при температурном режиме, согласно условиям хранения, в
термоконтейнерах с хладоэлементами или в авторефрижераторах . Время транспортирования
не ограничено при условии соблюдения температурного режима. Наборы реагентов ,
транспортированные с нарушением температурного режима, применению не подлежат.
Хранение
Компоненты набора реагентов в оригинальной упаковке изготовителя «Genome-X max
SMA/TREC/KREC 100 ПЦР», «Genome-X max SMA/TREC/KREC 200 ПЦР» следует хранить
на складе в морозильных камерах при температуре от минус 30 °С до минус 10 °С в течение
всего срока годности – 12 месяцев.
Компоненты набора реагентов в оригинальной упаковке изготовителя «Genome -X max
SMA/TREC/KREC СС» и «Genome-X ДНК» следует хранить на складе в холодильных камерах
при температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С в течение всего срока годности – 12 месяцев.
«Genome-X max SMA/TREC/KREC GM -01». Набор расходных материалов для
автоматического выделения ДНК и проведения ПЦР» следует хранить на складе с контролем
температуры при температуре от плюс 1 °С до плюс 40 °С в течение срока годности ,
указанного на маркировке на расстоянии не менее 1 м от отопительных приборов. При
повреждении индивидуальной упаковки подлежит утилизации.
Набор реагентов после вскрытия необходимо хранить:
MasterMix и полимеразу в морозильных камерах при температуре от минус 18 °С до
минус 22 °С. В ходе работы допускается не более 6 циклов заморозки / разморозки.
Калибратор SMN1 +/+, Калибратор К1, Калибратор К2, Калибратор К3, Калибратор К4,
Калибратор К5 и все компоненты потребительской упаковки « Genome-X ДНК» - в
холодильнике с контролем установленной температуры при температуре от плюс 2 °С до плюс
8 °С.
Срок годности вскрытых реагентов соответствует сроку годности, указанному на
этикетках для невскрытых реагентов.
Наборы реагентов , хранившиеся с нарушением температурного режима, в
поврежденной индивидуальной упаковке, не соответствующие описанию по внешнему виду, с
истекшим сроком годности применению не подлежат.
Эксплуатация.
- температура окружающего воздуха плюс (25±10) °С;
- относительная влажность воздуха от 45 до 80%;
- атмосферное давление от 630 до 800 мм.рт.ст.
13 УТИЛИЗАЦИЯ
Утилизации подлежат все наборы реагентов, пришедшие в непригодность, в том числе в
связи с истечением срока годности.
Утилизация должна проводиться в соответствии с действующими на момент
утилизации правилами и требованиями, включая требования местных организаций и правила
утилизации в данном регионе.
В Российс кой федерации утилизация изделия осуществляется в соответствии с
требованиями СанПиН 2.1.3684-21 и МУ 287-113:
Компоненты «Genome-X ДНК» относятся к классу Г - токсикологически опасные
отходы - и должны быть утилизированы в соответствии с действующим законодательством
Российской Федерации
Компоненты «Genome-X max SMA/TREC/KREC ПЦР 100», «Genome-X max
SMA/TREC/KREC ПЦР 200», «Genome-X max SMA/TREC/KREC СС» относятся к классу Б -
--- стр. 37 ---
37
эпидемиологически опасные отходы – и должны быть утилизированы в соответствии с
действующим законодательством Российской Федерации.
Утилизация должна проводиться специализированными организациями.
Материалы потребительской упаковки, неиспользованные компоненты «Genome-X max
SMA/TREC/KREC GM -01», пришедшие в негодность , и эксплуатационная документация
должны утилизироваться как отходы класса А –эпидемиологически безопасные отходы,
приближенные к твердым коммунальным отходам.
Сливы набора реагентов, образующиеся при проведении анализа , должны
утилизироваться как отходы класса Б – эпидемиологически опасные отходы.
14 ПЕРЕЧЕНЬ ПРИМЕНЯЕМЫХ НАЦИОНАЛЬНЫХ СТАНДАРТОВ
ГОСТ Р 51088 –2013 – Медицинские изделия для диагностики ин витро. Реагенты,
наборы реагентов, тест -системы, контрольные материалы, питательные среды.
Требования к изделиям и поддерживающей документации;
ГОСТ Р ИСО 18113 -1-2024 Медицинские изделия для диагностики in vitro.
Информация, предоставленная изготовителем (маркировка). Часть 1. Термины,
определения и общие требования;
ГОСТ Р ИСО 18113 -2-2024 Медицинские изделия для диагностики in vitro.
Информация, предоставленная изготовителем (маркировка). Часть 2. Реагенты для
диагностики in vitro для профессионального использования;
ГОСТ Р ИСО 23640 –2015 – Изделия мед ицинские для диагностики in vitro. Оценка
стабильности реагентов для диагностики in vitro;
ГОСТ Р 51352 –2013 – Медицинские изделия для диагностики ин витро. Методы
испытаний;
ГОСТ Р ИСО 15223 -1-2023 Изделия медицинские. Символы, применяемые для
передачи информации, предоставляемой изготовителем. Часть 1. Основные требования
ГОСТ Р ИСО 17511 -2022 Изделия медицинские для диагностики in vitro. Требования к
установлению метрологической прослеживаемости значений, приписанных
калибраторам, контрольным материалам правильности и образцам биологического
материала человека
ГОСТ Р ИСО 20395-2023 Биотехнология. Требования к оценке эффективности методов
количественного определения последовательностей нуклеиновых кислот -мишеней.
Количественная ПЦР и цифровая ПЦР
ГОСТ Р 72026—2025 «КЛИНИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. Метод
полимеразной цепной реакции в реальном времени для выявления первичных
иммунодефицитных состояний и спинальной мышечной атрофии в образцах сухих
пятен крови»
15 ЛИТЕРАТУРНЫЕ ССЫЛКИ
1. Markowitz JA, Priyamvada S, Darras BT. Spinal muscular atrophy: a clinical and research update.
PediatNeurol. 2012;46(1):1–12.
2. Zerres K, Rudnik -Schöneborn S, Forrest E, et al. A collaborative study on the natural history of
childhood and juvenile onset proximal spinal muscular a trophy (type II and III SMA): 569
patients. J NeurolSci. 1997;146(1):67–72.
3. Lefebvre, S.; Bürglen, L.; Reboullet, S.; Clermont, O.; Burlet, P.; Viollet, L.; Benichou, B.;
Cruaud, C.; Millasseau, P.; Zeviani, M.; Le Paslier, D.; Frézal, J.; Cohen, D.; Weiss enbach, J.;
Munnich, A.; Melki, J. Identification and Characterization of a Spinal Muscular Atrophy -
Determining Gene. Cell, 1995, 80 (1), 155–165.
4. Wirth B. An update of the mutation spectrum of the survival motor neuron gene (SMN1) in
autosomal recessive spinal muscular atrophy (SMA). HumMutat. 2000;15(3):228–237.
--- стр. 38 ---
38
5. Monani, U.R.; Lorson, C.L.; Parsons, D.W.; Prior, T.W.; Androphy, E.J.; Burghes, A.H.M.;
McPherson, J.D. A Single Nucleotide Difference That Alters Splicing Patterns Distinguishes the
SMA Gene SMN1 from the Copy Gene SMN2. Hum. Mol. Genet., 1999, 8 (7), 1177–1183.
6. Serana, F., Chiarini, M., Zanotti, C., Sottini, A., Bertoli, D., Bosio, A., . . . Imberti, L. (2013). Use
of V(D)J recombination excision circles to identify T - and B -cell defects and to monitor the
treatment in primary and acquired immunodeficiencies. JournalofTranslationalMedicine, 11(1)
7. Borte, S., Von Döbeln, U., Fasth, A., Wang, N., Janzi, M., Winiarski, J., . . . Hammarström, L.
(2012). Neonatal screening for severe primary immunodef iciency diseases using high -throughput
triplex real-time PCR. Blood, 119(11), 2552-2555
8. King, J. R., &Hammarström, L. (2018). Newborn screening for primary immunodeficiency
diseases: History, current and future practice. Journal of Clinical Immunology, 38(1), 56-66
9. Kwok, J. S., Cheung, S. K., Ho, J. C., Tang, I. W., Chu, P. W., Leung, E. Y., ... & Lau, Y. L.
(2020). Establishing simultaneous T cell receptor excision circles (TREC) and K -deleting
recombination excision circles (KREC) quantification assays and laboratory reference intervals in
healthy individuals of different age groups in Hong Kong. Frontiers in immunology, 11, 1411.
10. Medova, V., Hulinkova, I., Laiferova, N., Urdova, V., Ciznar, P., Dolnikova, D., Krasnanova, V.,
Fabri, O., Ficek, A., Soltysova, A. (2022) The importance of defining the age -specific
TREC/KREC levels for detection of various inborn errors of immunity in pediatric and adult
patients. Clinical Immunology, Volume 245, 109155, ISSN 1521-6616
11. A.P. Prodeus, N.D. Odinayeva, S.V. Voro nin, I.N. Zakharova, I.A. Tuzankina, N.N. Volodin,
K.V. Zhdanov, A.N. Pampura, D.I. Sadykova, E.I. Kondratyeva, A.A. Korsunskiy, E.A.
Degtyareva, K.V. Savostyanov, S.A. Trusova, A.Yu. Lobenskaya, Ye.S. Nikonova, A.S.
Lebedeva, E.V. Loshkova, V.D. Denisova, A.G. Rumyantsev Методические рекомендации по
маршрутизации, мониторингу и тактике ведения иммунокомпрометированных детей групп
риска и пациентов с врожденными ошибками иммунитета. Педиатрия им. Г.Н.
Сперанского. 2024; 103 (6): 218–245. DOI: 10.24110/0031-403X-2024-103-6-218-245.
16 СИМВОЛЫ, НАНОСИМЫЕ НА УПАКОВКУ МЕДИЦИНСКОГО ИЗДЕЛИЯ
Медицинское изделие для
диагностики in vitro
Предел температуры
Осторожно!
Не допускать воздействия
солнечного света
Обратитесь к инструкции по
применению
Беречь от влаги
Содержимого достаточно для
проведения n-тестов
Хрупкое. Обращаться осторожно
Дата утверждения или последнего
пересмотра инструкции по
применению
Верх
Воспламеняющиеся газы (класс 1),
жидкости (классы 1, 2, 3)
Вещества, которые оказывают
острое или долгосрочное
отрицательное действие на
водные организмы.
Химическая продукция,
вызывающая серьёзные
повреждения/раздражение глаз,
класс 2A
Раздражение дыхательных путей
Содержит биологический
материал человеческого
организма
=== файл: unknown__Маркировка Genome-X max_22.03.2024.pdf ===
--- стр. 1 ---
Сведения о маркировке
Медицинского изделия
Genome-X max SMA/TREC/KREC.
Набор реагентов для определения гомо- и гетерозиготных
делеций в гене SMN1, отвечающих за развитие спинальной
мышечной атрофии, и количественного определения
внехромосомных кольцевых ДНК как биомаркеров первичных
иммунодефицитов
УТВЕРЖДАЮ
Генеральный директор
ООО «Геном-Микс»
_____________ Д.Н. Дейниченко
«22» марта 2024 г.
--- стр. 2 ---
Стр. 2 из 13
1 Маркировка индивидуальной упаковки реагентов.
1.1.1 «Genome-X max SMA/TREC/KREC 100 ПЦР»
Маркировка индивидуальной упаковки выполняется в виде
наклеиваемых этикеток:
1.1.2 «Genome-X max SMA/TREC/KREC 200 ПЦР»
Маркировка индивидуальной упаковки выполняется в виде
наклеиваемых этикеток:
1.2 «Genome-X max SMA/TREC/KREC СС»
Маркировка индивидуальной упаковки выполняется в виде
наклеиваемых этикеток:
--- стр. 3 ---
Стр. 3 из 13
1.3 «Genome-X ДНК» (соответствует ТУ 20.59.52-003-71944992-2024)
Маркировка индивидуальной упаковки выполняется в виде наклеиваемых
этикеток:
--- стр. 4 ---
Стр. 4 из 13
2 Маркировка потребительской упаковки
2.1.1 «Genome-X max SMA/TREC/KREC 100 ПЦР»
Маркировка потребительской упаковки (с ложементом из
полипропилена) выполняется посредством печати на коробке, в которую
упакованы компоненты части изделия «Genome-X max SMA/TREC/KREC
100 ПЦР»
--- стр. 5 ---
Стр. 5 из 13
--- стр. 6 ---
Стр. 6 из 13
Маркировка потребительской упаковки- коробки с ложементом из
картона выполняется методом печати на коробке или в комбинированном
виде прямая печать и наклеиваемые этикетки:
--- стр. 7 ---
Стр. 7 из 13
2.1.2 «Genome-X max SMA/TREC/KREC 200 ПЦР»
Маркировка потребительской упаковки выполняется посредством
печати на коробке, в которую упакованы компоненты части изделия
«Genome-X max SMA/TREC/KREC 200 ПЦР»
--- стр. 8 ---
Стр. 8 из 13
--- стр. 9 ---
Стр. 9 из 13
Маркировка потребительской упаковки- коробки с ложементом из
картона выполняется методом пе чати на коробке или в комбинированном
виде прямая печать и наклеиваемые этикетки:
--- стр. 10 ---
Стр. 10 из 13
2.2 «Genome-X max SMA/TREC/KREC СС»
Маркировка потребительской упаковки выполняется посредством
печати на коробке, в которую упакованы компоненты части изделия
«Genome-X max SMA/TREC/KREC СС»
--- стр. 11 ---
Стр. 11 из 13
2.3 «Genome-X ДНК» (соответствует ТУ 20.59.52-003-71944992-2024)
Маркировка потребительской упаковки (пакета из полиэтилена с зип -
лок) выполняется в виде наклеиваемой этикетки:
--- стр. 12 ---
Стр. 12 из 13
2.4 «Genome-X max SMA/TREC/KREC GM-01. Набор расходных материалов
для автоматического выделения ДНК и проведения ПЦР»
Маркировка потребительской упаковки (пакета из полиэтилена с зип -
лок или запаянного пакета) выполняется в виде наклеиваемой этикетки:
3 Маркировка транспортной упаковки
Маркировка транспортной упаковки выполняется в виде наклеиваемой
этикетки и ориентирована на маркировку тары для изделий с учетом
температуры транспортирования/хранения:
--- стр. 13 ---
Стр. 13 из 13
=== файл: unknown__Фотофайл_Genome-X max SMA_TREC_KREC_03.10.2025.pdf ===
--- стр. 1 ---
1
Фотографические изображения
Медицинского изделия
Genome-X max SMA/TREC/KREC. Набор реагентов для определения
гомо- и гетерозиготных делеций в гене SMN1, отвечающих за развитие
спинальной мышечной атрофии, и количественного определения
внехромосомных кольцевых ДНК как биомаркеров первичных
иммунодефицитов
УТВЕРЖДАЮ
Генеральный директор
ООО «Геном-Микс»
_____________ Д.Н. Дейниченко
«03» октября 2025 г.
--- стр. 2 ---
2
Genome-X max SMA/TREC/KREC 200, в составе:
1)Genome-X max SMA/TREC/KREC 200 ПЦР ,
2)Genome-X max SMA/TREC/KREC СС,
3)Genome-X ДНК, 2 шт
4) Genome-X max SMA/TREC/KREC GM-01, 2 шт
*Примечание цвет флаконов и крышек не является функциональным параметром и может
быть изменен.
--- стр. 3 ---
3
Genome-X max SMA/TREC/KREC 100, в составе:
1)Genome-X max SMA/TREC/KREC 100 ПЦР ,
2)Genome-X max SMA/TREC/KREC СС,
3)Genome-X ДНК,
4) Genome-X max SMA/TREC/KREC GM-01
*Примечание цвет флаконов и крышек не является функциональным параметром и может
быть изменен.
--- стр. 4 ---
4
Genome-X max SMA/TREC/KREC 100 ПЦР*(потребительская упаковка
вариант с ложементом из полипропилена).
*Примечание цвет флаконов и крышек не является функциональным параметром и может
быть изменен.
--- стр. 5 ---
5
Genome-X max SMA/TREC/KREC 100 ПЦР*(потребительская упаковка
вариант с ложементом из картона).
*Примечание цвет флаконов и крышек не является функциональным параметром и может
быть изменен.
--- стр. 6 ---
6
Genome-X max SMA/TREC/KREC 100 ПЦР. Потребительская упаковка
(потребительская упаковка вариант с ложементом из полипропилена).
--- стр. 7 ---
7
Genome-X max SMA/TREC/KREC 100 ПЦР. Потребительская упаковка
(потребительская упаковка вариант с ложементом из картона).
--- стр. 8 ---
8
Genome-X max SMA/TREC/KREC 200 ПЦР*(потребительская упаковка
вариант с ложементом из полипропилена).
*Примечание цвет флаконов и крышек не является функциональным параметром и может
быть изменен.
--- стр. 9 ---
9
Genome-X max SMA/TREC/KREC 200 ПЦР*(потребительская упаковка
вариант с ложементом из картона).
*Примечание цвет флаконов и крышек не является функциональным параметром и может
быть изменен.
--- стр. 10 ---
10
Genome-X max SMA/TREC/KREC 200 ПЦР. Потребительская упаковка
(потребительская упаковка вариант с ложементом из полипропилена)
--- стр. 11 ---
11
Genome-X max SMA/TREC/KREC 200 ПЦР. Потребительская
упаковка(потребительская упаковка вариант с ложементом из картона)
--- стр. 12 ---
12
Genome-X max SMA/TREC/KREC СС
Genome-X max SMA/TREC/KREC СС. Набор калибраторов в
потребительской упаковке*
*Примечание цвет крышек не является функциональным параметром и может быть
изменен.
--- стр. 13 ---
13
Genome-X max SMA/TREC/KREC СС. Потребительская упаковка Вид1
Genome-X max SMA/TREC/KREC СС. Потребительская упаковка Вид2
--- стр. 15 ---
15
Genome-X ДНК. Набор реагентов для экстракции ДНК из сухих пятен крови, цельной крови, ворсин хориона
(секционного материала), амниоцитов. Реагенты в индивидуальной упаковке*.
--- стр. 16 ---
16
*Примечание цвет крышек не является функциональным параметром и может быть изменен.
Genome-X ДНК. Набор реагентов для экстракции ДНК из сухих пятен крови, цельной крови, ворсин хориона
(секционного материала), амниоцитов. Реагенты в потребительской упаковке. Вид1
--- стр. 17 ---
17
Genome-X ДНК. Набор реагентов для экстракции ДНК из сухих пятен крови, цельной крови, ворсин хориона
(секционного материала), амниоцитов. Реагенты в потребительской упаковке. Вид2