Реагенты in vitro для исследования гемостаза в наборах и отдельных упаковках — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
=== файл: Инструкция_руководство__o41899_I.pdf ===
--- стр. 1 ---
^ЭЕРЖДАЮ
деректор
Уед-с М»
_ _ илов Н.А.
«01» февраля 2010 г
ИНСТРУКЦИЯ
по ПРИМЕНЕНИЮ
Наборы in-vitro для исследования гемостаза
1. НАЗНАЧЕНИЕ
2. ОСНОВНЫЕ ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
3. ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ
4. ПОДГОТОВКА К РАБОТЕ ИЗДЕЛИЯ
5. ПОРЯДОК РАБОТЫ ИЗДЕЛИЯ
6 ПРАВИЛА ХРАНЕНИЯ И ИСПОЛБЗОВАНИЯ
2010
--- стр. 2 ---
SIEMENS
Аейд Кластер для исследования агрегации
тромбоцитов
|ряисследований агрегометрии тромбоцитов
кнслект и пояснения
ршетрия тромбоцитов - сравнительно новое поле исследования, которое начало
[тъсилу с момента разработки соответствующего оборудования Борном (Вогп)^ ^.
оборудование включает прежде всего турбидиметрические приборы (Рис. 1),
е рег>1стрируют изменения при пропускании света перемешанной обогащенной
нЬцитами плазмы, вызванные агрегацией тромбоцитов после добавления различных
реактивов. В результате экспериметов с данной методикой был очерчен
КТ оромденных и приобретенных дисфункциональных состояний тромбоцитов,
могут частично характеризоваться агрегометрией, Агрегометрия тромбоцитов
средством диагностики, предоставляющим информацию, которую сложно или
■■окно получить при помощи других методик, а также помогает при диагностике,
выборе лечения или терапии.
Основа методики
tam o. О тромбоциты могут агрегировать при большом количестве условий и в
рцтствии целого ряда различных реактивов. Для традиционной агрегометрии на АДФ
мпшьзуются адреналин и коллаген в целях скрининга, они обеспечивают самое
lepoe получение информации для начальной диагностики.
|мм выбора этих реактивов находится теоретическая база. Как АДФ, так и адреналин
в пределах тромбоцита в органеллах, обеспечивающих хранение, и
ется из тромбоцита во время нормального формирования сгустков и может тем
вызывать дальнейшую агрегацию тромбоцитов. Следовательно, было доказано.
■ г иЬо ответная реакция тромбоцитов на эти реактивы полезна для определения
|втера нарушения свертываемости у пациента.
не расположен внутри тромбоцита, а обнаруживается в опорной
■нпельной ткани сосудистой системы, считается, что он является первым
■фпрующим и прокоагулянтным фактором, с которым сталкивается тромбоцит
■ктвие травмы сосудов. Следовательно, изучение ответной реакции тромбоцитов на
л vilrD приобрело важное значение.
^ реактивы, такие как тромбин^, кальций-ионофор А 23187^, полилизин^,
|Монобая кислота^, ристоцетин^, бычий фактор Vlt!^ и серотонин* были использованы
р «следования ответной реакции тромбоцитов, однако для более специфических
чем предоставляемые здесь реактивы для скрининга.
Кешивы
юмые материалы
1Ьбтааналша, код № В4236
1 Cuter* Реактив АДФ
I cuter* Реагстив адреналин
ICUir* Реактив коллаген
Ь г а
Ома* Реактив АДФ (аденозиндифосфат): лиофилизированный препарат АДФ со
рором Хранить при температуре от +2 до +8 * С.
еьте в 1,0 мл дистиллированной или деионизированной воды, закройте пробирку
встряхните, чтобы перемешать. Разбавленный реактив имеет рабочую
l■Nraвц№C. равную 2 х 10~* М (200 мкМ).
Реактив адреналин; лиофилизированный препарат (■<■) адреналина битартрата
рорами. Хранить при температуре от +2 до +8 * С.
■те в 1,0 мл дистиллированной или деионизированной воды, закройте пробирку
JM и встряхните, чтобы перемешать. Разбавленный реактив имеет рабочую
■ргга^ю, равную 1 X 10'^ М (100 мкМ).
Мв* Реактив коллаген: лиофилизированный препарат растворимого коллагена со
р1яввтором Хранить при температуре от +2 до -г-б ^ С.
дения и меры предосторожности
кидля in vitro диагностики.
hvoToexa реактивов
lltebTe в 1,0 мл дистиллированной или деионизированной воды, закройте пробирку
■м и сразу же встряхните быстрым движением запястья подобно стряхиванию
ув№ термометра до получения однородной суспензии. Поскольку коллаген является
Е
ц|слензией. нежели молекулярным раствором, необходимо строго следовать
, гроцедуре разбавления, в противном случае во время срока службы изделия
возникнуть мутность. Перед использованием оставьте разбавленный материал на
|мут при комнатной температуре. Перед каждым использованием встряхивайте
ку. чтобы снова перемешать содержимое. Разбавленный реактив имеет рабочую
). равную 2,0 г/л.
к; Считается, что указанные концентрации реактивов находятся в применимом
9 для скрининга. Тем не менее, рекомендуется, чтобы исследование агрегации
ррсшлялось с использованием растворов разбавленных реактивов для выявления
В»(тов с гюграничными состояниями или тех. у которых генетическое выражение той
й болезни неполное. При проведении данных исследований используйте 0,85%
■ раствор, чтобы разбавить реактивы сверх тех концентраций, что были получены
о при разбавлении водой.
» и устойчивость
|М1Гк при температуре от +2 до ч-б * С. Сроки годности указаны на этикетках,
lewe на ухудшение качества всех трех реактивов: нет признаков вакуума после
ИГ|« пробирки
• рвбавления реактивы следует хранить при температуре от +2 до +8 "С для
'<ет<аия двухнедельной устойчивости разбавленного реактива Реактивы можно
гь при иомнатной температуре только в течение тестирования.
Миоимые дополнительные материалы, не входящие в комплект поставки
I <>гграт натрия (3.8%)
I Цибсрдля контроля агрегации, такой как Агрегометр* с регистрирующим устройством
вРисунок1)
к то ч н ! VkVk _ Детектор
И
Регистрирующее
Фильтр Кювета
Зк]мм1:Ькж*диаграмма традиционного прибора для контроля агрегации
тромбоцитов. Температура кюветы регулируется (+37 ** С), кювета
перемешивается (700-1200 об/мин)
i Квмтадля агрегации
1105 itfi гмпетка с одноразовыми пластиковыми наконечниками для распределения
Сбор и подготовка образцов
Примечание: Избегайте соприкосновения со стеклом или поликарбонатным пластиком i
сборе образцов крови; не используйте гемолизированные образцы.
Возьмите у пациента кровь с помощью пластикового шприца. Удалите из шприца И 1
Тщательно распределяя, смешайте 9 частей свежей крови с 1 частью следуюш
антикоагулирующего раствора цитрата:
Цитрат натрия. 3.8%: 3,8 г цитрата натрия (ЫазСвНбОт • 2Н2О)
растворенного в дистиллированной или деионизированной воде и разбавленного до
мл.
Для подготовки обогащенной тромбоцитами плазмы центрифугиру
антикоагулированный образец при 180 х г в течение 10 минут.
Осторожно соберите обогащенную тромбоцитами плазму при помощи пластиковой пипе
Поместите ее в пластиковую пробирку с этикеткой PRP. Закройте пробирку и оставьте
при комнатной температуре. Для подготовки обедненной тромбоцитами плазмы повто
центрифугируйте оставшийся образец крови при 1 500 х г в течение 20 минут. Помест
обедненную тромбоцитами плазму а пластиковую пробирку с этикеткой РРР. Закрс
пробирку и оставьте ее при комнатной температуре.
Тест необходимо провести не менее, чем через 30 минут и не более, чем через тр
половиной часа после забора образца у пациента. Вся подготовка образцов дол
проводиться при комнатной температуре.
Примечание: Известно, что пониженная температура может вызывать агрега
тромбоцитов: следовательно, не рекомендуется центрифугирование при ни;
температурах.
Чтобы скорректировать количество тромбоцитов, рекомендуется, чтобы все тесты
определение агрегации тромбоцитов проводились с использованием одинако!
количества тромбоцитов в PRP Ввиду этого необходимо скорректировать количе(
тромбоцитов в PRP до 250 000 ± 25 000 тромбоцитов/мкл, используя для этого обеднен
тромбоцитами плазму.
Процедура
Тест необходимо провести не менее, чем через 30 минут и не более, чем через Tf
половиной часа после забора образца у пациента.
1. Количество тромбоцитов PRP приводится к 250 000 ± 25 000/мкл, используя РРР.
2. Добавьте 0,45 мл PRP (скорректированное количество) в одну кювету для агрегации.
3. Добавьте 0,45 мл РРР во вторую кювету для агрегации.
4. Установите исходные значения PRP и РРР согласно указаниям производителя прибо
5. Оставьте кювету с РРР для ввода дополнительных исходных значений.
6. Инкубируйте PRP при температуре +37 *С в течение 3 минут в контрольном приборе.
7. Добавьте 50 мкл одного из агрегирующих реактивов.
Примечание: Сейчас 9 частей PRP и 1 часть агрегирующего реактива.
8. Пронаблюдайте за реакцией агрегации тромбоцитов (2-5 минут).
9. Повторите шаги 2-8 для каждого из оставшихся реактивов.
Контроль качества
В настоящее время промышленный контроль не доступен; тем не менее, Абер
(Abernathy) с группой ученых ссылается на общий контроль доноров для агрегоме
тромбоцитов
Результаты
Типичная схема агрегации показана на Рисунке 2. Многие исследователи предпочи'
устанавливать исходное значение PRP на 90 на регистрирующем устройстее и РРР - н.
Процент агрегации на Рисунке 2 будет равен (А/90-10) х 100 ~ (А/80) х 100
Другим важным параметром является Vmax. который определяется на Рисунках 3 и 4. V
рассчитывается как соотношение расстояния В в мм ко времени С в минутах.
При агрегации с коллагеном важно время задержки, определяемое на Рисунке 5
Необходимо обратить внимание на форму кривой агрегации с АДФ и адренали
Некоторые типичные кривые показаны на Рисунке 6. где М=однофазная, В1=двухфа:
1®=только первичная агрегация и 1® + D/A= первичная агрегация с дезагрегацией.
Следует обратить внимание на то, что во многих случаях у здорового человека, у коте
нет ярко выраженного нарушения свертываемости, обнаруживается отсутствие втори
волны с адреналином ".
В статье Росси (Rossi) есть дополнительная информация о количестве
агрегометрии.
Ограничения процедуры
Многие лекарства, отпускаемые по рецепту, и лекарства безрецептурного отпуска ^
помешать агрегации поэтому перед тестом пациенты не должны прини
лекарственные препараты.
Тест необходимо провести не менее, чем через 30 минут и не более, чем через 1
половиной часа после забора образца у пациента.
Референсные значения
Предполагается, что каждая лаборатория сама устанавливает референсные значен 1.я
Таблица I
Исследование А Исследование В
Среднее
значение
% агрегации
Время
задержки
(сек)
Станд.
отклон.
SD
Среднее
значение
% агрегации
Время
задержки
(сек)
Стан;
отклс
SD
АДФ 85,5 8,2% 74,9 5,5%
Адреналин 86,5 - 8,5% 76,0 - 8,6%
Коллаген 83,4 - 13,6% 76,0 - 8,7%
38,6 сек 8,5 сек ■ 31,4 сек 7,2 с(
11 нп гмпетка с одноразовыми пластиковыми наконечниками для распределения плазмы
t Н|гмггы с пластмассовым покрытием или одноразовые магниты с проволокой
* Chrono-log Corporation. Хавертаун, РА 19083
Таблица I: Представленные параметры, определенные в двух различных исследован!
Реактивами Cluster* для анализа агрегации тромбоцитов.
Исследование А: Включает среднее значение и стандартное отклонение (SD)
здоровых пациентов, не принимающих медикаменты и не имеющих известных наруш
функции тромбоцитов; скорость перемешивания 700 об/мин; прибор контроля агрег
произведен Payton**; одна лаборатория, несколько лаборантов, несколько дней,
образца 3,2% цитрата натрия.
Исследование В: Включает среднее значение и стандартное отклонение (SC
различных образцов нормального контроля скорость перемешивания 1 200 об
Агрегометр тромбоцитов произведен Chrono-log*; одна лаборатория, нескс
лаборантов, несколько дней, сбор образца 3,8% натрия цитрата.
• Chrono-log Corporation, Хавертаун, РА 19083
•• Payton Associates. Inc., Буффало NY 14202
--- стр. 3 ---
А (разделы) / А Границы х 100
Рисунок 6
Определение формы кривой
Таблица II. Унаследованные нарушения функции тромбоцитов ”
Унаследованное нарушение Реакция агрегации
АДФ Адреналин Коллаген тромбин Ристоцет
ИН
Тил передачи Характер
кровотечения
1. Нарушение адгезии к
субэндотелиальному
слою
Синдром Бернара-Сулье
N N N N - 1 -
аутосомная
рецессивная сильное
болезнь Виллебранда •
Юргенса N N N N i - . . аутосомная
доминантная
различное, мо
быть сильнь
II. Нарушение
ретракции сгустка
Тромбастения i i i 1 ±
аутосомная
рецессивная
различное, мо
быть сильнь
III. Нарушение
выделения
Дефицит пула
тромбоцитов
i i i ± ± переменная обычно легк'
Угнетение функции
тромбоцитов, похожее на
аспирин*
i J. ± ± переменная обычно легк
N = Нормальный.
± = Не диагностический.
•**= Корректируется криопреципитатом,
концентратом фактора VIII или
_ нормальной плазмой.
= Сниженный.
Особые рабочие
характеристики
Реактивы Cluster® для анализа агрегации
тромбоцитов были тщательно подготовлены
для обеспечения функционирования в
соответствии с результатами и в пределах,
описанных для применения в in vitro
исследованиях агрегации тромбоцитов.
Воспроизводимость, полученная в ходе
испытаний, в условиях практической работы,
показала, что повторное определение,
осуществленное на нормальных и
патологических образцах пациентов привело
к средней разнице в проценте агрегации
приблизительно ±7% для АДФ, адреналина и
коллагена. Время задержки с коллагеном
колеблется в среднем на ±10 секунд у
дубликатов, анализируемых аналогичным
образом. Стандартные значения агрегации
приведены в Таблице I, а референсные
патологические пробы для некоторых
наследственных болезней - в Таблице II.
Тем не менее, рекомендуется, чтобы каждая
отдельная лаборатория сама устанавливала
значения и методики для идентификации
пробы и количественного определения для
более тщательной оценки их эффективности
Список литературы
1. Born, G.V.R. Nature 194: 927; 1962.
2. Born, G.V.R.; Cross, М. J. Physiol. (Lond.)
168: 178; 1963.
3. Chao, F.C., Tullis, J.L.; Conneely, G.S.;
Lawler, J.W. Thrombos. Haemostas. 35: 717,
1976.
4. MCirer, E.H.; Stewart, G.J.; Rausch, M.A.;
Day, H.J. Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 72;
1975.
5. Jenkins, C.S.P; Packham, M.A.; Kinlough-
Rathbone, R.L.; Mustard, J.F. Blood 37(4):
395; 1971.
6. Kinlough-Rathbone, R.L.; Reimers, H.J.;
Mustard, J.F.; Packham, M.A. Science 192:
1011, 1976.
7. Howard, M.A.; Firkin, B.G. Thromb. Diath
Haemorrh. 26: 362; 1971.
8. Caen, J.P.; Nurden, A.T.; Jeanneau, C;
Michel, H; Tobelem, G.; Levy-Toledano, S.;
Sultan, Y; Valensi, F; Bernard, J. J. Lab Clin.
Med. 87: 586; 1976.
9. Michal, F; Motamed, M. Br. J. Pharmacol. 54:
221: 1975.
10. Abernathy, L.; Hill, J.;
Hutchison, D. Thrombos.
Haemostas. 39: 246;
1978.
11. Arkel, Y.S.; Haft, J.I.;
Kreutner, W.;
Sherwood. J.; Williams,
R. Thrombosis and
Haemostasis 38: 552;
1977.
12. Rossi, E.C.; Louis, G.
Thrombos. Haemostas.
37: 283; 1977.
13. Homisen, H. Series
Haemoatological 8(3): 50;
1975
14. Day, H.J.; Hoimsen,
H. Annals of Clin. Lab.
Sci. 2(1): 63; 1972.
15. Lusher, J.M.;
Barnhart, M l. Thrombosis
and Haemostasis 4(2):
123; 1977
16. Caen J.P.; et al.
Thrombos. Haemos. 38:
586; 1978.
--- стр. 4 ---
SIEMENS
Набор для хромогенного исследования
фактора VIII
Предполагаемое использование
Для фотометрического выявления активности фактора VIII (антигемофильный
фактор) в ллазме человека.
Конспект и основа метода
Гемофилия - ЭТО геморрагическое заболевание, сцепленное с полом и
вызываемое дефицитом циркуляционного фактора VIII (O.VIII) или фактора IX
(Ф,1Х). Гемофилия А - термин используемый для дефицита O.Vtll, она встречается
от пяти до семи раз чаще, чем Гемофилия В (дефицит фактора IX) Оба
заболевания переносятся Х-свяэанным рецессивным геном и проявляются
практически только у мужчин, получивших дефектный ген от Х-хромосомы матери.
При гемофилии А степень дефицита O.VIIl определяет тяжесть геморрагических
нарушений. Для нормального гемостаза требуется приблизительно от 10 до 40%
от нормальной активности O.VIII: при значениях ниже данного диапазона,
кровотечения проявляются достаточно явно.
Пациентов обычно классифицируют в три категории по активности O.VIII: легкая
тякесть, 25%-5% от нормы: средняя, 5% - 1% от нормы; тяжелая, менее 1% от
нормы. В данном хромогенном анализа фактор Vill в образце активируется
тромбином
Активированный фактор VIII (0.Vllla) затем ускоряет превращение фактора X (Ф.Х)
в фактор Ха (Ф.Ха) при наличии активированного фактора IX (1Ха), фосфолипидов
(ФЛ) и ионов кальция. Активность Ф.Ха оценивается при помощи гидролиза
субстрата р-нитроаналида специфичного для Ф.Ха. Начальный уровень выделения
рчситроаналина (pNA) измеряется при 405 нм. Он пропорционален активности
Ф.Ха, а, соответственно, и активности Ф.VIIt в образце. Химические процессы
хромогенного анализа фактора VIII приведены в формулах
нюке;
Ф,У1|}+Тромбин -----------► Ф. Villa
Ф.Х R Villa
Ф 1Ха, PL. Са2‘
'. Ха
Ф Ха . CHjOCO'D-CHG'Qly-Aig-OH + рМА(люлтый)СНЗОСО-D-CHG-Gly-Arg-pNA
Реактивы
Предоставляемые материалы
Нббор для хромогенного выявления фактора VIII, код В4238, включая 2 по 2 мл
реактивом фактора X, 2 по 2 мл реагента фактора 1Ха, 2 по 1 мл реагента
дубстрата, 2 по 10 мл стопорного буфера.
Состав
Реагент фактора X: лиофилиэированный препарат, содержащий около 2 нмоль
бычьего Ф.Х. буфер трис-(гидроксиметил)-аминометана (Трис) с pH 8 и
стабилизаторы.
Реагент фактора 1Ха: лиофилизированный препарат, содержащий около 0.6
яюль бычьего Ф.1Ха, около 0.6 нмоль бычьего тромбина, около 0,06 ммоль
хлорида кальция, около 0,12 мкмоль фосфолипидов, буфер Трис с pH 8 и
стабилизаторы.
Реагент субстрата: лиофилиэированный препарат, содержащий около 3,4 мкмоль
CHjOCO-D-CHG-Gly-Arg-pNA.AcOH, субстрат Ф.Ха, L амидино-фенилаланин
■перидид (a-NAPAP), Ма-(2-нафтилсуль(}галилглицил)-0®. ингибитор тромбина и
стабилизаторы.
Стопорный буфер: раствор, содержащий Трис, этилендиаминтетрауксусную
•слоту и 0,02% азид натрия.
Предупреждения и меры предосторожности
1 Только для in vitro диагностики.
2. Содержит азид натрия. Рекомендуется работать с веществом аккуратно;
Не вдыхать и избегать контакта с кожей и слизистыми оболочками! 8 случае
утилизации через канализацию, в целях предотвращения образования азидов,
необходимо смывать большим количеством воды. Азид натрия вступая в
контакт с тяжелыми металлами, такими как медь и свинец, может
образовывать взрывоопасные соединения.
Подготовка реактивов
Реактивы факторов 1Ха и X: разведите содержимое пробирки 2,0 мл
^(рстиллированной или деионизированной воды.
Рмгент субстрата: разведите содержимое пробирки 1,0 мл дистиллированной
или деионизированной воды. Стопорный буфер: перед использованием
вмшайте 1,0 мл реагента субстрата с 10,0 мл стопорного буфера в коричневом
Лмтейнере реагента субстрата. Аккуратно смешайте реактивы еще раз
щтаосредственно перед использованием.
Хранение и устойчивость
При температуре от +2 до +8 *С реактив стабилен вплоть до даты, указанной на
«мкетке.
‘Стабильность после восстановления (реагентов факторов 1Ха и X, субстрата/смеси
^таопорного буфера):
|фи +37 *С 2 часов
ц +15 до +25 ®С 8 часов
»+2до+8®С Здня
)пя различных анализаторов коагуляции данные по стабильности могут
|впичаться.
1^наки порчи препарата: при открывании пробирки отсутствует вакуум.
|вгент с трудом восстанавливается; высокая мутность или наличие частиц в
•опорном буфере.
Пробы
Ь|вшайте 9 частей свежей крови пациента с 1 частью 0,11 или 0,13 моль/л
|Кгвора цитрата натрия. После чего как можно скорее поместите в центрифугу на
К)1в4нут при 1 500 г. После чего сразу поместите плазму в пластиковую пробирку и
«тааьте в холодильник до тех пор пока не будете готовы к тесту.
(казну пациентов следует исследовать в течение 1 часа после сбора крови и
•анить до 30 дней при температуре -20 *С. В связи с нестабильностью фактора
W, плазму допускается размораживать только один раз и исследовать в течение
(часа
1ю6ходимые дополнительные материалы, не входящие в комплект
«ставки
Ikmpam натрия (0,11 или 0,13 моль/л для сбора крови.
свежей плазмы (ПСП) или Стандартная плазма человека (код ORKL) для
■«бровки.
Птаэма с дефицитом коагуляционного фактора VIII (челов ), код OTXW
|пиллированная или деионизированная вода.
Спектрофотометр со следующими характеристиками:
— Длина волны; 405 нм
— Длина пути: 1 см
— Температура измерения: +25 °С, +30 “или ог +37 *С.
Хлорид натрия, 0,9%.
Для конечного выявления: 20% уксусная кислота или 1 моль/л моногидрат
лимонной кислоты. Смешайте 200 мл ледяной уксусной кислоты с 800 мл
дистиллированной или деионизированной воды или растворите 210 г моногидрата
лимонной кислоты в дистиллированной или деионизированной воде и разведите
до 1 литра.)
Секундомер
Пипетки на 0,1 мл, 0,5 мл и 3,0 мл.
Пластиковые пробирки и небольшие кюветы глубиной 1 см
Контрольная плазма N, код ORKE
Контрольная плазма Р, код OUPZ
Буферный раствор имидазола, код OQAA или
Верональный буфер Оурена (Owren) от Dade®, код В4234 или
СА системный буфер от Dad^, код В4265 или
Анализатор коагуляции (см. раздел «Ограничения анализа»)
Оборудование
Хромогенный анализ фактора VII! подходит для многих анализаторов коагуляции
Следуйте инструкциям производителя выбранного анализатора.
Процедура
Ручной режим:
Процедура кинетического анализа/конечной точки
Анализ следует проводить при температуре +25 ®С, +30 *С или +37 ‘’С. Задайте
длину волны фотометра в 405 нм и ноль относительно хлорида натрия 0,9%.
Разбавление образца/калибровочной плазмы
Анализ следует выполнять с разбавлением образца 1 ; 31 или калибровочной
плазмы. Данное разбавление следует выполнять следующим образом: смешайте
0,1 мл образца или калибровочной плазмы с 3,0 мл хлорида натрия 0,9% в
пластиковой пробирке.
Расчет калибровочной кривой:
Допускается выполнять анализ по однократной разведенной калибровочной
плазме, однако, в этом случае, калибровочную кривую следует строить очень
точно. Для подобных целей подойдет калибровочная плазмы с известным уровнем
Ф.VIII, ее необходимо разбавить хлоридом натрия по следующей схеме; например
к 100%
Разбавление калибр плазмы 1:21 1:31 1:62 1:124 I Нулев. станд.
0.9% NaCI мл 2,0 3,0 1,0 1,0 1.0
Калибр, плазма мл 0.1 0,1
1 4 -
Смешать и передать мл
1
1.0
II
1,0
I
25 0
Ф. VIII* % 148 100 50
* При исследовании референсной плазмы, предлагаемой на рынке,
присутствующее процентное соотношение фактора в разбавлении 1:31 и будет
конечным значением. Присутствующее процентное соотношение для других
разбавлений следует задавать соответствующим образом. Концентрация Ф VIII
в разбавлении 1 : 21 высчитывается следующим образом: концентрация Ф.VИi
в разбавлении 1 : 31 х 1,48 = концентрация Ф.VIII в разбавлении 1 : 21, т е.,
100% X 1,48 = 148%.
Описание процедуры
Все реактивы и пластиковые пробирки следует прогреть в инкубаторе до
требуемой температуры. Оптимальная воспроизводимость достигается в случае,
если температура измерения в среднем не отклоняется более чем на 0.2 “С от
Этап Кинетич.
анализ
Конечн.
анализ
Разбавление образца/калиб. плазмы 1 ; 31** 0,1 мл 0.1 мл
Реагент фактора X 0,1 мл 0,1 мл
Реагент фактора 1Ха 0,1 мл 0,1 мл
Хорошо смешать и поместить в инкубатор 90 секунд при +37 ®С***
Доб. реагент субстрата и стопорный буфер 0,5 мл 0,5 мл
Смешать и измерить увеличение абсорбции
немедленно (лА/мин).
60 сек
405 нм
60 сек
Доб. 20% уксус, или 1 моль/л лемон, кислоты - 0,1 мл
Смешать и измерить абсорбцию по 0,9% NaCI - 405 нм
См. раздел «Примечания по процедуре анализа»
90 сек. при +37 *С, 120 сек. при +30 “С или 180 сек. при +25 *С.
Для конечного анализа плазму следует подготовить для образцов и каждого
разбавления калибровочной плазмы.
20% уксусная кислота 0.1 мл
Доб Реагент фактора X. Смешать. 0,1 мл
Доб. Реагент фактора 1Ха. Смешать. 0,1 мл
Доб. разбавленный образец. Смешать. 0,1 мл
Доб. реагент субстрата и стопорный буфер. Смешать. 0.5 мл
Смешать и измерить абсорбцию по 0.9% NaCI. 405 нм
Автоматический вариант:
По запросу Dade Behring может направить инструкции для конкретного
анализатора коагуляции.
Внутренний контроль качества
Нормальный диапазон: Контрольная плазма N
Патологический диапазон: Контрольная плазма Р
Оба контроля следует анализировать при каждой калибровке, и не реже чем через
3-4 часа в течение дня тестирования (один для нормального и один для
патологического диапазона). Контрольные пробы должны обрабатываться
аналогично тестируемым образцам. Для каждой лаборатории следует олределить
свой собственный диапазон контроля качества, либо при помощи целевых
значений и диапазонов производителя контрольных препаратов, либо задав свой
собственный интервал доверия лаборатории. Как правило подобный диапазон
составляет от ± 2,0 до ± 2,5 стандартных отклонений (SD) от контрольного
среднего значения. Если полученное контрольное значение лежит вне заданного
интервала доверия, необходимо установить причину, осмотрев анализатор
коагуляции, реактивы и калибровку.
--- стр. 5 ---
Вычисление результатов анализа
а) при помощи одного калибровочного коэффициента (F)
Так как калибровочная кривая линейна от О до 100%, а 1Стивность ФЛ/Ш в образце
можно вычислить при помощи известного значения для калибровочной плазмы
(FPP, стандартной человеческой сыворотки). I. Для кинетических анализов
Процент активности фактора VIII в калибровочной плазме = А
дА/мин. калибровочной плазмы = С
дА/мин. нулевого стандарта - В
дА/минуты образца = S
Коэффициент калибровки = F
Активность фактора VIII в неизвестном образце в процентах вычисляется по
следующему отношению: ; (S - В) х F = активность фактора VIII в образце в %. II.
Для конечных анализов
Процент активности фактора VIII в калибровочной плазме = А
Поглощение калибровочной плазмой = С
Слепое поглощение калибровочной плазмой = Сь
Поглощение образцом = S
Слепое поглощение образцом =
Поглощение нулевым стандартом = В
Слепое поглощение нулевым стандартом = Вь
Коэффициент калибровки = F
-----------1 ----------- - F
Активность фактора Vlll в неизвестном образце в процентах вычисляется по
следующему отношению: : [(S - $&} - (В - Вь)) х F = активность фактора VIII в
образце в %.
Ь) При помощи калибровочной кривой
I. Для кинетических анализов
Отложите активность O.VIH в процентах на оси абсцисс, а поглощение/мин.,
полученное при 405 нм, на оси ординат. Считайте активность O.VIII в
процентах для неизвестного образца с калибровочной кривой найдя точку где
дА/мин. пересекает кривую.
II. Для конечных анализов
1. Вычтите слепое поглощение калибровочной плазмы (Сь) из поглощения
калибровочной плазмой (С).
2. Вычтите слепое поглощение плазмы образца (8ь) из поглощения образцом
(S).
3. Вычтите слелое поглощение нулевого стандарта (Вь) из поглощения
нулевого стандарта (В). Постройте активность O.VIII в процента на оси
абсцисс и разность (С*Сь) на оси ординат на миллиметровой бумаге.
Считайте активность O.VIII в процентах для неизвестного образца с
калибровочной кривой найдя точку где (S-Sb) пересекает кривую.
Ограничения анализа
Дпя определенных анализаторов коагуляции Dade Behring поставляет инструкции.
Необходимость использования хромогенного анализа О. VIII на других
анализаторах коагуляции должно оцениваться тестирующей лабораторией. При
JT0M возможно получение рабочих характеристик отличных от представленных
здесь Полученные результаты анализов всегда должны интерпретироваться
совместно с историей болезни, клинической картиной пациента, а так же с
результатами других медицинских обследований.
Эталонный интервал
При noMou^ Хромогенного анализа фактора VIII у 40 предположительно здоровых
людей были получены ожидаемые уровни O.VIII - от 50 до 175%.
Систематические отклонения от данных значений могут быть определены при
помощи специального прибора. Возможно, что для лаборатории будет
необходимо рассчитать собственный референсный диапазон.
[^мечания по процедуре анализа
• Чувствительность анализа в нижней части диапазона O.VIII (0-10%) можно
повысить если в качестве стандартов использовать дефицитную плазму с
коагулянтным фактором VIII и FPP или стандартную человеческую сыворотку.
Подготовьте 4 стандарта смешав обе плазмы так, чтобы получить 100, 50, 25
и 0% (только дефицитная плазма с коагулянтным фактором VIII (челов.)) В
данном случае оба стандарта и образцы следует обрабатывать в
разбавлении 1 : 31.
Все реактивы и пластиковые пробирки следует прогреть в инкубаторе до
требуемой температуры. Оптимальная воспроизводимость достигается в
случае, если температура измерения в среднем не отклоняется более чем на
0.2 *С от выбранной температуры реакции.
6 конечном методе вместо 20% уксусной кислоты можно использовать 1
мопь/л лимонной кислоты.
Для образцов и измерений рекомендуется применять одноразовые
пластиковые предметы.
Референсную кривую необходимо задавать для каждой смены прибора или
новой партии хромогенного анализа фактора VIII.
Особые рабочие характеристики
При Сравнительном исследовании рабочих характеристик, было исследовано 98
образцов пациентов как при помощи хромогенного анализа фактора, так и
коагулометрическим анализом при помощи дефицитной плазмы и реагента
Актин® активированного цефалопластином. Полученный коэффициент
корреляции составил 0,96, а уравнение регрессии: у =*1,0 х + 1,0%.
Точность анализа зависит в некотором роде от качества оборудования и навыка
оператора, выполняющего данный анализ. 8 таблице ниже приведены оценки
точности, полученные при помощи кинетического метода при +37 ®С.
Образец 1 N Среднее % SD CV%
Точность между анализами 11 118 5 4
Точность внутри анализа 11 124 5 4
Образец 2 N Среднее % SD CV%
Точность между анализами 11 25 2,5 10
Точность внутри анализа 11 28 2,6 9
Концентрации гепарина до 10 ед./мл не оказывают влияния на хромогенный
анализ фактора VIII. Линейность хромогенного анализа фактора VIII составляет от
0-100% О VIII
Список литературы
1. Jackson, С.М.: Nemerson, Y. Ann. Rev. Biochem.; 49: 765-811; 1980.
2. Bloom, A.L.; Thomas. D. P., eds. Hemostasis and thrombosis. New York: Churchill
Livingstone Inc; 1981.
3. Colman, R.W.; Hirsh, J.; Marder, V.J., Saizmann, E.W. Hemostasis and thrombosis,
basic principles and clinical practice. Philadelphia: J.B. Lippincott Company; 1982.
4. Thompson, A.R.; Harker, LA. Manual of hemostasis and thrombosis, Edition 3.
Philadelphia: F A. Davis Company; 1983.
5. van Dieijen G, et ai. J. Biol. Chem.; 256; 3433-42; 1981.
6. Svendsen. L., et al Thromb, Res.: 34; 457-462; 1984.
7. Tran, T.H., et al. Thromb. Haemost; 58: 341; 1987.
--- стр. 6 ---
SIEMENS
Набор реагентов для иммуннотурбидиметрического
антигена фактора фон Виллебранда (vWF Ag)
определения
Предназначение
Набор vWF Ag предназначен для лабораторного
определения массы vWF Ag в плазме человека.
иммунно-турбидиметрического
Краткие данные
Фактор фон Виллебранда (vWF) представляет из себя гликопротеин мультимерной
формы, вьщеляемый в плазму эндотелиальными клетками и мегакариоцитами'.
Молекулярная масса может достигать 15000 кДа. Находясь вне а-гранул тромбоцитов,
после вьщеления он подвергается расщеплению плазмином.
vWF играет важную роль как при первичном гемостазисе, формируя гемостатическую
пробку вследствие своей функциональной роли при адгезии и агрегации тромбоцитов, так
и при коагуляционном процессе^, стабилизируя фактор VIII.
Качественный и/или количественный дефицит vWF может вызвать болезнь Виллебранда
(vWD) - наиболее распространенное наследственное нарушения кровоизвлечения (один
больной на каждые сто человек^). У фактора фон Виллебранда преобладает аутосомная
форма наследования. Определено три основных вида болезни Виллербранда''.
Тогда как гемокультура реагента фон Виллебранда может быть использована для
определения уровня активности кофермента ристоцетина (ristocetin) фон Виллебранда
(vWF:RCo), анализ антиген фактора фон Виллебранда определяет уровень конкретного
антигена. Оба анализа необходимы для дифференциального анализа типа болезни
Виллебранда.
70-80% всех типов болезни Виллебранда составляет первый тип. При нем у больного
отмечается понижение активности фактора фон Виллебранда и его антигена. Второй тип
этой болезни характеризуется качественным дефицитом активности фактора фон
Виллебранда. При этом уровень антигена может не выходить за нормальные рамки. У
пациентов с третьей разновидностью болезни отмечается полное отсутствие фактора фон
Виллебранда как в плазме, так и в клеточных компартентах.
Тест Тип 1 Тип 2А Тип 2В Тип 2N Тип 3
vWF Ag*
vWF:RCo
Фактор VIII
i
Норма или ± 1
i
i i
Норма или ± 1
± 1
i или Ц
Норма или ± 1
Норма
Норма
i i
Отсутствует
Отсутствует
i i
Следует отметить, что недостаток фактора фон Виллебранда может также отмечаться при
различных болезнях - таких, как системная красная волчанка, миелома, лимфома и др. В
подобных случаях следует вести речь о приобретенной болезни Виллебранда. Активность
фактора фон Виллебранда и его антигена может повышаться при любых видах
воспалительных процессов как результат повреждения сосудистого эндотелия''. Помимо
этого, повышенные уровни фактора фон Виллебранда могут отмечаться у пациентов с
инфарктом миокарда^.
--- стр. 7 ---
Принцип действия
Небольшие частицы полистирола с ковалентно подсоединенными определенными
антителами скапливаются при перемешивании с образцами, содержащими антиген фон
Виллебранда, что определяется турбидиметрически как помутнение, пропорциональное
уровню антигена в тестовом образце.
Реагенты
Предоставленные материалы
Код № ОРАВ: 4х6мл (2мл латексного реагента + 4мл разбавителя) реагента антигена
фактора фон Виллебранда.
Состав
Набор антигена фактора фон Виллебранда содержит следующие реагенты:
4х5мл буфера (глициновый буфер)
4х2мл латексного реагента (зеленый колпачек, раствор, содержащий глицин для
разбавления латексного реагента)
Меры предосторожности
1. Предназначено для использования исключительно в лабораторных условиях.
2. При обращении с реагентами, содержащими азид натрия, следует соблюдать
соответствующие меры предосторожности.
Избегайте попадания внутрь, контакта с кожей и слизистой! При выливании в
водосток следует пропустить достаточное количество воды для предотвращения
накапливания азида. Азид натрия может вызывать образование взрывоопасных
азидов при контакте с такими тяжелыми металлами, как медь или свинец.
Подготовка реагентов
Буфер:
Перед открытием сосуд с буфером следует подержать при комнатной (+15-25°С)
температуре в течение 15 минут.Слегка взболтайте сосуд.
Латексный реагент:
Вылейте все содержимое сосуда с разбавителем для латексного реагента (зеленый
колпачек) в сосуд с латексным реагентом (с таким же зеленым колпачком) из одного и
того же набора. Убедитесь, что разбавляющая жидкость полностью перелита в сосуд с
латексным разбавителем. Затем взболтайте сосуд с этой смесью, не допуская образования
пузырьков. Оставьте полученный раствор постоять при комнатной (+15-25°С)
температуре на 15 минут, после чего слегка взболтайте его еще раз.
Разбавитель для латексного реагента:
Данный разбавитель готов для использования.
Хранение и стабильность
При температуре хранения от +2 до +8°С в неповрежденных сосудах реагенты стабильны
до истечения срока годности, указанного на упаковке.
Стабильность после восстановления/при открытых (закрытых) сосудах
--- стр. 8 ---
15 дней при температуре от +2 до +8°С
7 дней при температуре от +15 до +25°С
Каждый анализатор имеет индивидуальные свойства стабильности.
Образцы
Чтобы отделить плазму, аккуратно перемешайте одну часть раствора цитрата натрия
(0,109 моль/л, т.е. 3,2%) с 9-ю частями венозной крови так, чтобы не образовалась пена.
Центрифугируйте при 2500 не менее 10 минут, уберите всплывшую на поверхность
плазму и держите при температуре от +15 до +25°С, пока того требует анализ, но не
дольше 8 часов.Образцы плазмы можно хранить при температуре от +2 до +8°С в
течение суток, либо в глубокой заморозке при температуре -20 до -30°С сроком до 1
месяца. Перед анализом и смешиванием замороженные образцы плазмы следует
размораживать при температуре +37°С в течение как минимум 15-ти минут.
Процедура
При необходимости следует обращаться к соответствующим разделам Руководства по
использованию. Это особенно важно, когда речь идет о калибровке, загрузке и контроле
качества.
Необходимые материалы (в наборе не поставляются)
Буфер: Dade® Owren веронал буфер (код № В 4234-25)
Для калибровки: Стандартная человеческая плазма (код № ORXL)
Для контроля качества: Контрольная плазма N (код № ORKE) и плазма Р (код №
OUPZ)
Коагуляционный анализатор Dade Behring для vWF Ag*.
Коагуляционный анализатор
Антиген фактора фон Виллебранда может использоваться с различными
коагуляционными анализаторами. Пожалуйста, следуйте указаниям Руководства по
использованию.
Калибровка
Калибровочная проба производится с помощью стандартной человеческой плазмы
(откалиброваной согласно Стандарту ВОЗ 97/586). Стандартные разбавители получаются
автоматически при смешивании коагуляцционных анализаторов и веронального буфера
Dade Owren в соответствии с параметрами, заданными в анализаторы для проведения
теста. Сам по себе буфер представляет 0% отметку. Кривую калибровки можно увидеть на
экране, зайдя в соответствующий пункт меню Калибровки (см. Соответсвующий раздел
Инструкции по использованию).
Образцы пациента
Образцы плазмы пациентов используются неразбавленными. Растворы с верональным
буфером Dade Owren получаются автоматически при использовании коагуляционных
анализаторов. Образцы плазмы пациентов идентифицируются коагуляционными
анализаторами посредством сканирования их щтрих-кода сканером штрих-кода, либо
ввода их данных с клавиатуры.
--- стр. 9 ---
Внутренний контроль качества
Чтобы удостовериться в точности и воспроизводимости полученных результатов,
необходимо провести процедуру контроля. Для этого следует взять два разных уровня
контроля за одну смену. Используйте Контрольные Плазмы N и Р.
Подготовьте контрольные материалы и занесите в коагуляционные анализаторы
информацию, содержащуюся в наборах контрольных плазм. Эти контрольные препараты
используются неразведенными. Необходимые растворы получаются автоматически при
помощи коагуляционных анализаторов.
Если результат контрольного замера находится за рамками правдоподобных
результатов, замер следует произвести повторно. Если повторный результат подтверждает
отклонение, следует создать новую кривую для анализа. Не выдавайте результаты анализа
пациента до тех пор, пока не будет определена и устранена причина отклонения в
результатах.
Результаты
vWF Ag тестирование производится анализаторами автоматически, как только образцы
загружены. После этого результаты выводятся на экран.
Ограничения параметров процедуры и эффект «сползания»
Следует использовать те коагуляционные анализаторы, для которых имеются тестовые
протоколы. Использование антиген фактора фон Виллебранда в совокупности с иными
коагуляционными анализаторами должно быть согласовано с тестовой лабораторией. В
таких случаях показатели могут отличаться от приводимых здесь. Пожалуйста,
обращайтесь к Инструкции по использованию, прилагаемой к вашим Коагуляционным
Анализаторам или к Инструкции по применению антиген фактора фон Виллебранда
относительно потенциального влияния эффекта «сползания», гемоглобина, билирубина,
липемии или гепарина.
Крайне малое присутствие антибычьего альбумина и/или антикроличьих антител по
определенным причинам может вызывать переоценку антиген фактора фон Виллебранда
(vWF Ag). Тот же результат может быть вызван присутствием ревматоидного фактора^.
Ожидаемые значения
Значения, полученные в разных лабораториях, могут различаться в зависимости от
используемой техники, поэтому каждой лаборатории следует установить свои
собственные контрольные интервалы. (Для более подробной информации об установке
контрольных интервалов обращайтесь к документу Национального комитета клинических
лабораторных стандартов с28-А, Как определять и устанавливать контрольные интервалы
в клинических лабораториях. Одобренные рекомендации.)
На уровень плазмы vWF Ag могут влиять возраст пациента, постклимактерический
период, физические упражнения, стресс’.
Нормальная плазма фактора фон Виллебранда у взрослого пациента обычно находится в
диапазоне 50-160%*’ ^.
Особые характеристики процедуры
Область измерения
Пожалуйста, обращайтесь к Руководству по использованию вашего Коагуляционного
Анализатора или Инструкции по применению антиген фактора фон Виллебранда.
Особенности
Антиген фактора фон Виллебранда (vWF Ag) определяет уровень антигена фактора фон
Виллебранда в тестовом образце плазмы.
--- стр. 10 ---
Точность
Изучение точности проводилось при помощи коагуляционных анализаторов посредством
определения Контрольной плазмы Р и Контрольной плазмы N.
Коэффициент вариации (внутритестовая точность) при этом находился в пределах 1,4-
4,2%, тогда как коэффициент вариации изо дня в день (межтестовая точность) находился в
диапазоне от 0,9% до 4,2%.
Библиография
1. Фервай К.Л.: Биосинтез человеческого фактора фон Виллебранда. Гемостазис 1988;
18: 224-245.
2. Руггери З.М., Варе Дж.: Структура и назначение фактора фон Виллебранда. Тромб.
Гемостазис 1992; 67: 594-599.
3. Вернер Е.Дж., Броксон Е.Х., Такер Е.Л. и другие: Распространенность болезни
Виллебранда среди детей: межнациональное исследование. Дж.Педиатр. 1993; 123:
893-898.
4. Бланн А.: Фактор фон Виллебранда и эндотелий при васкулярных заболеваниях.
Бр.Дж. Биомед. Наук. 1993; 50: 125-134.
5. Лип Дж.Уай.Х., Бланн А.Д.: Фактор фон Виллебранда и его влияние на
кардиоваскулярные заболевания. Бр.Харт Дж. 1995; 74: 580-583
6. Фавалоро Э.Дж., Эбауд М., Артур К.: Потенциальая возможность ошибочного
диагностирования или классификации болезни Виллербранда при применении
иммунолюминесцентного анализа и наличии ревматоидного фактора.
Эм.Дж.Гематол. 2001; 66: 53-56.
7. Вамала С., Мюррей М.А., Хорстен М. и другие: Социально-экономический статус
и определяющие факторы гемостатической функции у здоровой женщины.
Аартериосклероз. Тромб. Васкул.Биол. 1999; 19: 485-492.
8. Холмберг Л., Бернторп Э., Доннер М., Нильсон И.М.: Болезнь Виллебранда,
характеризуемая увеличением ристоцетиновой чувствительности и присутствием в
плазме всех мультимерфакторов фон Виллебранда. Кровь 1986; 68 (3): 668-672.
9. Нишино М., Гирма Дж.П., Ротщильд К., Фрессино Э., Майер Д.,: Новый тип
болезни Виллебранда с нарушением скрепления фактора VIII. Кровь 1989; 74 (5):
1591-1599.
--- стр. 12 ---
Растительные фосфолипиды (< 10г/л), кальций (0,1 М) и гепариновый ингибитор (<
0,5г/л).
Консерватор: азид натрия (< 0,01%)
Меры предосторожности
1. Для использования исключительно в лабораторных условиях.
2. При обращении с реагентами, содержащими азид натрия, следует соблюдать
соответствующие меры предосторожности.
Избегайте попадания внутрь, контакта с кожей и слизистой! Азид натрия может
вызывать образование взрывоопасных азидов при контакте с такими тяжелыми
металлами, как медь или свинец.
Подготовка реагентов
• Восстановите активатор в 2,0мл дистиллированной или деионизированной воды
без консервантов, как показано на этикетке бутылочки. В результате должен
получиться чистый бледно-зеленый раствор без различимых частиц.
• Восстановите PR3V реагент в 4,0мл дистиллированной или деионизированной
воды без консервантов, как показано на этикетке бутылочки. В результате должен
получиться полупрозрачный бледный раствор без различимых частиц.
• Аккуратно переверните, чтобы перемешать. Не встряхивайте!
• Выдерживайте 10 минут при комнатной температуре (от +15 до +25°С) перед
использованием.
• Снова аккуратно перемешайте реагенты перед использованием.
Хранение и стабильность
При температуре хранения от +2 до +8°С в неповрежденных сосудах замороженные сухие
реагенты стабильны до истечения срока годности, указанного на упаковке.
Стабильность после восстановления (закрытый сосуд)
Температура: РгоС® Ас R активатор
+2 до +8°С 2 недели
+20до+25°С 12 дней
+37°С 6 часов
-20°С 2 недели
РгоС® Ас R PR3V реагент
2 недели
12 дней
6 часов
2 недели
Признаки выхода реагента из строя: Если при откупоривании бутылочки есть
подозрения в нарушении вакуумности упаковки и/или реагент влажный, данный реагент
следует вернуть. Если в восстановленных препаратах явно различимы частицы, признаки
загрязнения или же если они не растворяются в течение 15 минут после добавления
дистиллированной или деионизированной воды, пожалуйста, обратитесь к вашему
дистрибьютеру. Не замораживайте и не размораживайте более одного раза после
восстановления!
Необходимые материалы (в наборе не поставляются)
Цитрат натрия (0,11 М или 3,2%) для забора крови
Контрольная Плазма N, Код № ORKE
РгоС Контрольная Плазма, Код № OQKE
Дистиллированная или деионизированная вода без консервантов
Пластиковые тубы для теста
Пипетки для отмеривания 1 ООмкл, 2,0мл и 4,0мл
Водная ванночка для манипуляций +37°С
Таймер или секундомер
Физиологический солевой раствор (0,15М хлорида натрия) для использования с
коагулометром BCS®
--- стр. 13 ---
Системный буфер Dade® СА для использования с коагулометрами Systemex®, Код №
В4265 ши
Верональный буфер Dade® Owren, Код № В4234
Коагулометр (Смотрите «Ограничения параметров процедуры»)
Оборудование
Тест РгоС® Ас R можно проводить в ручном режиме или в автоматическом с
применением различных коагулометров. Обращайтесь к Руководству по использованию
от производителей!
Сбор и подготовка образца
Важно: любые образцы плазмы потенциально несут угрозу инфицирования!
Для получения плазмы смешайте девять частей свежезабранной венозной крови пациента
с одной частью цитрата натрия (0,11М) таким образом, чтобы не образовываясь пена.
Центрифугируйте образец крови в течении хотя бы 10 минут при 1500 х г
незамедлительно после забора крови у пациента и заберите всплывающую плазму
пипеткой. При отделении плазмы удостоверьтесь также, что пипеткой не были извлечены
тромбоциты. Если предполагается заморозить образец, центрифугируйте отделенную
плазму снова, после чего немедленно замораживайте.
Стабильность образца
при температуре от +15 до +25°С 4 часа (свежая плазма)
при температуре -30°С 6 месяцев (если тромбоциты удалены путем
двойного центрифугирования непосредствено перед замораживанием).
Процедура теста
Ручной режим:
Тест с активатором:
1. Предварительно разогрейте достаточное количество PR3V реагента (0,1мл для
одного теста) до +37 + 1°С в реагентном резервуаре.
2. Диспензируйте 0,1мл тестирумой плазмы в тестовую тубу.
3. Добавьте 0,1мл активатора к тестируемой лазме и инкубируйте ровно 5 минут при
+37 ± 1°С.
4. Добавьте 0,1мл предварительно разогретого до +37 ± 1°С PR3V реагента, сразу же
запустите еекундомер и определите время загущения.
5. Повторите процедуру теста для двойного определения, чтобы получить
усредненный результат.
Тест без активатора:
1. Предварительно разогрейте достаточное количество PR3V реагента (0,1мл для
одного теста) до +37 ± 1°С в реагентном резервуаре.
2. Диспензируйте 0,1мл тестирумой плазмы в тестовую тубу.
3. Добавьте 0,1мл солевого раствора к тестируемой лазме и инкубируйте ровно 5
минут при +37 ± 1°С.
4. Добавьте 0,1мл предварительно разогретого до +37 ± 1°С PR3V реагента, сразу же
запустите секундомер и определите время загущения.
5. Повторите процедуру теста для двойного определения, чтобы получить
усредненный результат.
Автоматический режим:
Тестовые протоколы для коагулометров могут быть получены по запросу.
Проверено поведение вышеупомянутых реагентов в сочетании с различными
анализаторами на предмет оптимального функционирования системы и соответствия
характеристикам соответствующих препаратов.
--- стр. 14 ---
Препараты могут работать некорректно при использовании модифицированных
продуктов, результаты таких тестов могут быть ошибочными. Ответственность за
использование наших препаратов в сочетании с анализаторами, не указанными в этом
документе как проверенные на совместимость, возлагается на пользователя в полной
мере.
Внутренний контроль качества
Нормальный диапазон: Контрольная Плазма N
Патологический диапазон: РгоС® Контрольная Плазма
Следует применять два контрольных препарата (один - по нормальному диапазону и один
- с наличием фактора V Лейдена). Нормальная контрольная плазма может быть
определена из ряда свежезабранных нормальных плазм, каждая из которых была
протестирована на отсутствие признаков мутации фактора V Лейдена. Набор плазм
следует собрать в день забора, а затем заморозить для последующего использования.
Позитивный контрольный препарат можно взять у пациента с наличием фактора V
Лейдена.
Замораживать плазму следует при -70°С.
Обходиться с контрольными препаратами следует точно также, как и с образцами.
Допустимые ограничения следует установить для каждой контрольной плазмы путем
проведения анализа на точность в соответствии с руководствами Национального комитета
клинических лабораторных стандартов. Эти документы рекомендуют анализировать
контрольные препараты в самом начале серии тестов, по крайней мере один раз за
восьмичасовую смену, и при каждой смене реагентов. Каждой лаборатории следует
установить свои собственные интервалы контроля качества для обоих контрольных
препаратов путем применения целевых значений и диапазонов производителя
контрольных препаратов или же контрольных значений, определенных непосредствнно в
лаборатории для каждого набора РгоС Ас R теста. Обычно этот интервал составляет менее
± 2,5 стандартного отклонения от контрольного значения.
Если контрольные значения находятся вне доверительного интервала, не следует выдавать
окончательные результаты анализа пациента, пока не будет установлен, исправлен и
задокументирован источник погрешности. Определите, какая именно часть
инструмента/реагента/контрольного препарата функционировала некорректно и устраните
неполадку. После того, как ошибка устранена и задокументирована в соответствии с
качественной лабораторной практикой, повторите тестирование контрольных препаратов.
Если результаты находятся в доверительных пределах, можно тестировать образцы
пациента и передавать полученные результаты.
Ограничения параметров процедуры
Тесты РгоС Ас R проводились на образцах пациентов, проходящих курс оральной
антикоагуляционной терапии, гепариновой и низкомолекулярной гепариновой терапии, а
также пациентов с волчаночными антикоагулянтами.
Образцы таких пациентов могут демонстрировать значительно более долгое время
загущения, чем образцы здоровых людей.
При использовании солевого раствора или системного буфера СА время загущения также
пролонгируется. Как следствие, частное от «время загущения с активатором/ время
загущения без активатора» не поддается сомнению и сохраняет свою диагностическую
ценность.
Терапевтические дозировки гирудина или других прямых тромбиновых ингибиторов
вызывают увеличение времени загущения.
Результаты этого тестирования всегда следует интерпретировать в сочетании с данными
медицинской истории пациента, клинической информацией и другими доступными
параметрами.
--- стр. 15 ---
Влияющие факторы
Желтушные, липемические и гемолитические образцы, а также образцы с низким
гематокритом нельзя использовать с этим тестом, так как наличие перечисленных
заболеваний может привести к недостоверности результатов (для более детальных
объяснений смотрите документ Национального комитета клинических лабораторных
стандартов Н21-АЗ). Низкая^ активность факторов VII, VIII, IX и XII не является помехой
для теста РгоС Ас R. Активность факторов II и V более 10% и более 20% для фактора X
также не влияют на результаты теста. В начальной стадии лечения оральными
антикоагулянтами, т.е. перед стабилизаций, тест РгоС Ас R может показывать слишком
низкое соотношение. Тот же результат отмечается при концентрации протеина С менее
50%.
Ожидаемые значения
Значения (соотношения) для здоровых людей могут отличаться в разных лабораториях в
зависимости от параметров используемой процедуры. По этой причине каждой
лаборатории следует установить свои собственные справочные интервалы, основываясь
на методике процедуры теста и модели используемого коагулометра.
В целом, соотношения, меньшие или равные 1,5, сигнализируют о наличии фактора V
(Лейдена).
Соотношения между 1,5 и 2,1 могут свидетельствовать о низкой концентрации протеина С
и говорят о необходимости проведения дальнейших исследований (например,
специальных анализов на протеин С и ДНК). Образцы, дающие позитивные или
неопределенные результаты, должны подвергаться генетическому исследованию.
I
Особые характеристики процедуры
Чувствительность теста и его особенности
Тест РгоСАс R был оценен на аппарате методом генетического анализа, при этом было
установлено ROC влияние на уровне 1,57.
После этого в трех независимых тестовых центрах было проведено клиническое
оценочное исследование с целью оценки возможности выявлять мутацию фактора V
(Q506) тестом РгоС Ас R. Результаты теста РгоС Ас R были сравнены с результатами
теста Coatest** на сопротивление АРС 5 и ДНК-анализа, с использованием 164-х образцов
(82-х нормальных и 82-х образцов с наличием фактора V Лейдена) пациентов в возрасте
от 2 до 87 лет. В исследуемую группу вошли пациенты со следующими клиническими
состояниями: не начинавшие лечение (49 человек), имеющие тромбоз глубоких вен и др.
протромбические заболевания (58), принимающие оральные антикоагулянты (36),
принимающие гепарин/низкомолекулярный гепарин (49), имеющие волчаночные
антикоагулянты (12), семейные исследования (39).
На всех участках было использовано отсечение 1,57; демонстрировалась чувствительность
в 100% (доверительные пределы: 95,6-100%) и определенность относительно ДНК метода
(доверительные рамки 93,4-99,8%). При этом 163 из 164 пациентов были верно
идентифицированы.
Примечание: Анализ чувствительности и определенности теста РгоС Ас R на
сопротивляемость АРС без фактора V Лейдена не проводился. Учитывая различия в
контингенте пациентов, технике забора образца и наличного инструментария, каждая
лаборатория должна определить свою собственнную отсечку (cut-off).
Точность
Максимальная внутритестовая точность (внутритестовый коэфициент вариации)
установлен в 1,9%. Общая максимальная точность была определена как 8,9% при
--- стр. 16 ---
использовании двух участков, аппаратов и операторов. Анализировалось три образца
плазмы, методом двойного определения на протяжении 20 дней.
Библиография
1. Бертина Р.М., Коулмэн Б.П., Костер Т. И другие «Мутация коагуляционного
фактора V в крови, связываемая с сопротивлением активированному протеину С».
Природа 369;64;1994.
2. Дальбэк Б. «Физиологическая антикоагуляция. Сопротивление активированному
протеину С и венозная тромбоэмболия» Ж.Клин.Иссл: 94;923;1994.
3. Национальный комитет клинических лабораторных стандартов. Забор,
транспортировка и обработка образцов крови для проведения тестирования
сворачиваемости крови и общее описание процедуры теста на сворачиваемость
крови. Одобренное руководство по использованию. Н21-АЗ, Вэйн, Пенсильвания.
1998.
--- стр. 19 ---
■ определения точности пипетирования и фотометрики системы ВСТ*.
И: Точность пипетирования образцов (Prec.Samp)
Процедура определения точности пипетирования и фотометрики системы ВСТ*.
Тест N9 989: Точность пипетирования реагентов (Prec.Reag)
1
2
3
4
5
6
I 7i
8
I ®
10
11
I "
I 13
14
15
16
| 1начение [mOD]
1^ отклонение
[mOD]
CV (%]
Карусель с кюветами
1 2
Целевой: CV < 5%
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Среднее значение [mOO]
Стандартное отклонение
[mOD]
C V f
Относительное
отклонение для двух
средних значений[%)
Целевое; Отклон, < 5%
Карусель с кюветами
1 2
Целевой: CV < 5%
Целевое: Отклон. < 5%
N
0 1
V)
относительного отклонения для двух средних Вычисление относительного отклонения для двух средних
значений (MV)
MV, - MV2
Отклон. =------------------- X 100%
MV,
VM, - VM2
Отклонение =------------------- х 100%
VM,
Дата Подпись Дата Подпись
--- стр. 20 ---
ilEMENS
'еагенты комплемента
COMPLEMENT
нинетического определения активности общего комплемента
редполагаемое использование
1шты комплемента позволяют провести исследование функциональной способности
1^системы комплемента. Данные реагенты подходят как для классического, так и для
Ярнативного пути активации. Но не предназначены для ингибиторных компонентов
ямы комплемента.
юнты позволяют получить количественную оценку активности индивидуальных
внентов системы комплемента, в случае использования совместно с
^ствующей дефицитной плазмой или сывороткой.
№спект и пояснения
сгема комплемента является эндогенной плазменной защитной системой. Она
■ируется либо комплексами антитело-антиген (классический путь), либо
1родными веществами (альтернативный путь). Патологические состояния могут
щдить к реактивному повышению концентрации отдельных компонентов (реакция
1рои фазы). Пониженная активность наблюдается в результате поглощения или
■ценного дефицита.
I и тест СН50, данный метод позволяет измерить функциональную активность
■цемента. Поэтому тест может применяться для выявления как наследственных
i^eifTOB, так и приобретенного дефицита (например, из-за болезней иммунных
■пассов таких как гломерулонефрит, системная красная волчанка, генерализованный
вулит или криоглобулинемия).
1снова методики
образца с активированными эритроцитами приводит к классическому пути
■В8ЦИИ комплемента посредством C1q. СЗЬ, сформированный СЗ-конвертазой,
■овится компонентом С5-конвертазы, а так же инициатором каскада усиления с
Р
ием факторов В и D. Данный процесс также приводит к формированию
гивной С5-конвертазы. С5Ь, высвобождаемый С5, инициирует лизис с
печением оставшихся факторов С6 и С9. Лизис эритроцитов приводит к снижению
■пеской плотности. Время необходимое для лизиса определенного количества
р^оцитов используется в качестве основы для определения активности
■иемента’'^. Дефицит или пониженная концентрация отдельных компонентов
■цимер, из-за предшествующей активации системы комплемента) приводит к
ранению времени лизиса. Время сокращается если концентрация белков
■пвмента повышается из-за реакции на соответствующие заболевания.
Реагенты
■рцоставляемые материалы
1W1MENT, код OWZD включая
;iSun REAGENT реагент для эритроцитов
>25мл DILUENT реагент для амбоцепторов
Шт для эритроцитов: эритроциты овцы в стабилизированном растворе (хлорид
|«р«, HEPES).
«■рванты: 5-хлоро-2-метил-изотиазол-3-один (0,37 г/л),
2-метил-4-изотиазол-3-один (0,13 г/л)
щшп для амбоцепторов: антитела кролика к эритроцитам овцы, хлорид натрия,
(■мд кальция и хлорид магния. HEPES
■арвант: азид натрия (0,5 г/л).
|l■l^peждeния и меры предосторожности
I Только для in vitro диагностики.
|l Содержит азид натрия (< 0,1 %) в качестве консерванта Азид натрия может вступать
I {реакцию с медными или свинцовыми трубами сливной системы и образовывать
I ifbeoonacHbie соединения. Утилизация должна проводиться в соответствии с
I рпюнальными нормами и стандартами,
мотовка реагентов
■■первым использованием необходимо аккуратно восстановить реагент REAGENT
■втно вращая емкость.
^imre внимание на прилипание эритроцитов к пробке! Затем смешайте REAGENT с
шным количеством разбавителя DILUENT и оставьте приблизительно на 45 минут
1*37 *С.
(■использованием быстро потрясите и подогрейте до +37 “С.
■вние и стабильность
JfcjotOBMH хранения закрытого набора при температуре +2.+8 ®С, его допускается
■ьэоватьдо даты, указанной на этикетке.
linbhOCTb свежей смеси реагентов:
4 часа
4*в*С 24 часа
№№ораживайте реагент! REAGENT должен быть ярко-красного цвета. Если же
N£N7 стал коричневого цвета, его не следует использовать в анализе.
I■вличныx анализаторов коагуляции данные по стабильности могут различаться.
Ммдимые дополнительные материалы, не входящие в комплект поставки
lippman плазма человека, код ORKL
|i■Dflьнaя плазма N, код ORKE
|рльная плазма Р, код OUPZ
Мйтор коагуляции (см. раздел «Ограничения анализа»)
|р)Пование
кшгы комплемента подходят для многих анализаторов коагуляции. Следуйте
|Ц||циям производителя выбранного анализатора
Кртзцы
||рная плазма или сыворотка.
liinbHocTb образцов:
1 месяц
С *25 *С 4 часа
1мцы замороженные до - 20 необходимо разморозить в течение 10 минут при +37
Ьфоизвести измерение в течение 2 часов.
Уоцедура
1)врй режим:
а 1 см
непны: 578 нм (500 - 600 нм)
haper^ анализа: +37
квмающее устр-во: 1 - 5 см в минуту
|р| 1ительно подогрейте пластиковые кюветы до температуры +37^С. Образцы
■риспользовать в неразбавленном состоянии.
Образец 50 мкл
Реагент 1 0 0 0 мкл
Эпределение времени лизиса; измерьте время уменьшения поглощения на 0,100 пр
чм.
Процедура тестирования для хромотаймера; объемы образца и реагентов нeoбxoд^
взять в половинном объеме. Хромотаймер автоматически измеряет время лизис:
вычисляет конечный результат.
Автоматический режим:
По запросу Siemens Healthcare Diagnostics может направить инструкции для конкретн
анализатора коагуляции.
Оценка
Результаты оцениваются при помощи референсной кривой, которая строится по се]
разбавлений свежего пула плазмы или стандартной плазмы (например, Стандарт!
плазмы человека (Standard Human Plasma)) изотоническим солевым раствором.
Активность комплемента Стандартная плазма (мкл) Изотонический растве
1 0 0% 1 0 0 0
75% 75 25
50% 50 50
25% 25 75
1 0% 1 0 90
Для калибровки в 150, 200 и 300%, объем стандарта допускается уменьшить до 75, 1C
150 мкл соответственно. На логарифмической бумаге необходимо по одной из О'
отложить время лизиса в стандартной серии, определяемое в ходе анализа, а по дру
активность в % от нормы. Активность комплемента в образце считывается
референсной кривой. Если указанное приписанное значение для Стандартной плаз
человека составляет не 100% от нормы, а, например, 95%. то результат след
умножить на 0,95.
Чтобы повысить точность в диапазоне активности ниже 50%, используемый обг
образца можно удвоить. В этом случае образец следует оценивать при поме
калибровочной кривой, построенной с учетом того же отношения образца к реагенту.
Образцы сыворотки также можно оценить по калибровочной кривой при помощи плаз 1
Калибровочную кривую необходимо задавать для каждой смены прибора или hoi
партии реагентов комплемента. Внутренний контроль качества
Необходимо производить измерение контроля с каждой калибровкой и в каждой се|
измерений. Подойдут контрольные растворы Control Plasma N и Control Plasma
Контроли должны обрабатываться аналогично тестируемым образцам. Для каж^
лаборатории следует определить свой собственный диапазон контроля качества, Л 1
при помощи целевых значений и диапазонов производителя контрольных препарат
либо задав свой собственный интервал доверия лаборатории. Если получен!
контрольное значение лежит вне заданного интервала доверия, необходимо установ
причину, осмотрев анализатор коагуляции, реактивы и калибровочную кривую.
Ограничения анализа
Для определенных анализаторов коагуляции Siemens поставляет инструкции
В анализе не следует использовать образщ»!, содержащие EDTA.
Компания Siemens провела тестирование на использование данных реагентоЕ
различными анализаторами в целях оптимизации производительности и соответст!
требованиям, предъявляемым к продукции. Компания Siemens не поддержив
пользовательские изменения, так как они могут повлиять на производительно
системы и результаты анализа. За использование рекомендаций, отличающихся
приведенных, или реагентов, не входящих в список заявки Siemens Application She'
вместо оригинальных, ответственность ложится на пользователя. Получен!-
результаты анализов всегда должны интерпретироваться совместно с истор!
болезни, клинической картиной пациента, а так же с результатами других медицине
обследований.
Референсный интервал
70-140 % от нормы
Систематические отклонения от данных значений могут быть следствием примене!
конкретного прибора. Поэтому, для каждой лаборатории необходимо задать а
собственный референсный интервал.
Особые рабочие характеристики
Диапазон измерений
Диапазон измерений составляет от 10 до 300% от нормы.
Специфичность
Тест подходит как для классического, так и для альтернативного пути актива!
комплемента, но не подходит для ингибиторных компонентов.
Точность
Коэффициент вариации внутри анализа для образцов нормальной плазмы, составил
2,7 до 6.5% для ручного пипетирования и от 0,8 до 2,5% для автоматическ
пипетирования. Коэффициент вариации CV между анализами составил 4,6% (pynf
метод) и 1,7% (автоматический метод). Значения между анализами для патологичеа
плазмы составили от 4,3 до 14% или от 0,8 до 5,3%. Коэффициент вариации CV ме>
анализами составил 5,5% (ручной метод) и 2,4% (автоматический метод).
Список литературы
1. Kolde HJ. Deubel R. Development of a rapid kinetic assay for the function of the class
pathway of the complement system and for C2 and C4. J Clin Lab Immunol. 1986; 21: 2
7.
2. Siedentopf HG, Lauenstein K, Fischer H. Uber die automatische Registrierung der I
molyse durch Serumkomplement und Lysolecithin. Z. Naturforsch. 1965; 20b: 569-74
Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Emil-von-Behring-Str. 76 35041
Марбург, Германия
WWW, siemens, com/diaqnostics C €
Ред{
Ик
2008
--- стр. 21 ---
« об о зн а ч е н и й
Не использовать повторно.
Использовать до
Партия
Код номер
Внимание, см. соответствующие документы
Производитель
Уполномоченный представитель в европейском сообществе
Содержимого достаточно для <п> тестов
Медицинский прибор для In Wfro диагностики
Температурный режим
См. Инструкции по эксплуатации
Не стерильно
Знак СЕ
Содержимое
Объем восстановления
Концентрация^ ^_____________
|Р Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH.
■П(ява защищены