Набор реагентов для анализа мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ассоциированных с риском онкологических заболеваний, методом ПЦР КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТИКА BRCA по ТУ 21.20.23-1004-17253567-2022 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 ---
АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
«LiahtCvcIer 96» (Roche)
1. По окончании амплификации откройте файл завершенного анализируемого эксперимента в
рабочей программе LightCycler 96.
2. Откройте вкладку Analysis. На панели инструментов кликнете по значку Add Analysis, чтобы
добавить новый анализ. Откроется диалоговое окно Create New Analysis.
3. Выберите Endpoint Genotyping. Нажмите OK.
4. Во вкладке Analysis в соответствии с исходными настройками находятся четыре окна с
результатами эксперимента.
5. Указать специфичные настройки в диалоговом окне Endpoint Genotyping Settings во вкладке
Parameters:
- Pos/Neg Threshold: 0,3
-Angle FAM:30-35
-Angle HEX: 60-65
6. Программа автоматически интерпретирует результаты.
«СРХ96» (BioRad)
1. Для каналов FAM и HEX выставить следующие настройки:
Cycles to Analyze 5-40
2. На вкладке Allelic discrimination в поле Selected Fluorophores назначить для аллели 1 канал
HEX, для аллели 2 - канал FAM.
3. Программа автоматически интерпретирует результаты.
«ДТ96» ШНК-технология)
1. Критерии положительного результата ПЦР 60%
2. Для каналов FAM и HEX выставить следующие настройки:
Канал HEX Threshold 20; Канал FAM Threshold 200
3. Программа автоматически интерпретирует результаты.
Проверить соответствие генотипов контрольных образцов заявленным:
Положительный контрольный образец 11 - Allele 1
Положительный контрольный образец 22 - Allele 2
ПАМЯТКА ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА МУТАЦИЙ В
ГЕНАХ BRCA1, BRCA2, АССОЦИИРОВАННЫХ С РИСКОМ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ, МЕТОДОМ ПЦР
КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТИКА BRCA
SNP-SHOT TwoStep-PB-96
ПРИНЦИП МЕТОДА
Система «SNP-SHOT» представляет собой комплект реагентов для выявления мутаций
(полиморфизмов) в геноме человека.
В реакционной смеси содержатся праймеры, необходимые для амплификации участка,
содержащего искомую последовательность, и два аллель-специфичных гидролизных зонда,
содержащих полиморфный сайт. Зонд, содержащий сайт Аллель 1, мечен флуорофором HEX,
аллель 2 - флуорофором FAM. Дискриминация аллелей осуществляется за счёт различной
эффективности разрушения Taq-полимеразой полностью и неполностью комплементарного зонда.
Результаты анализа позволяют дать три типа заключений:
гомозигота по аллелю 1; гетерозигота: гомозигота по аллелю 2;
СОСТАВ НАБОРА
Набор состоит из 96 пробирок с реакционной смесью под слоем парафина, по 12 пробирок на
реакционную смесь одного генетического маркера. Один вертикальный ряд пробирок
предназначен для исследования одного клинического образца на 8 маркеров. Пробирки с
реакционной смесью на определенный маркер расположены согласно приведенной ниже схеме:
1 А. BRCA1185delAG
1 В. BRCA1 4153delA
С. BRCA1 5382insC
D. BRCA1 3819delGTAAA
Е. BRCA1 3875delGTCT
i F. BRCA1 Cys61Gly
G. BRCA1 2080delA
! Н. BRCA2 6174delT
По всем вопросам обращайтесь в офис компании ООО НПФ «Литех»:
телефон (495) 258-39-47, e-mail: info@lytech.ru
ОтдельйГГвлПЯйны пробирка с раствором Taq-полимеразы, пробирка с разбавителем, который
используется в качестве единого отрицательного контроля, и пробирки с положительными
контрольными образцами для всех реакционных смесей в отдельном пакете.
--- стр. 2 ---
ОБОЗНАЧЕНИЕ АЛЛЕЛЕЙ
ВНИМАНИЕ! При работе с прибором «LiqhtCvcIer 96» fRoche) следует проверить, что
амплификационная смесь расфасована в низкопрофильный пластик.
Кат№ Ген
Аминокис
потная
замена
Нуклеоти
дная
замена
SNPID Аллель Каналы
to il 37 BRCA1 185delAG rs80357713 AG Аллель 1 HEX
del AG Аллель 2 FAM
Ю1168 BRCA1 4153 delA ГВ80357711 A Аллель 1 HEX
del A Аллель 2 FAM
Ю1138 BRCA1 5382 insC rs80357906 deIC Аллель 1 HEX
insC Аллель 2 FAM
Ю1385 BRCA1 p.Val1234
GInfs
3819 del
GTAAA fs80357609 GTAAA Аллель 1 HEX
del GTAAA Аллель 2 FAM
Ю1386 BRCA1 3875
deIGTCT rs80357868 GTCT Аллель 1 HEX
del GTCT Аллель 2 FAM
Ю1146 BRCA1 Cys61Gly T181G rs28897672 Cys(T) Аллель 1 HEX
Gly(G) Аллель 2 FAM
Ю1387 BRCA1 2080 delA rs80357522 A Аллель 1 HEX
delA Аллель 2 FAM
101139 BRCA2 -6174 delT rs80359550 T Аллель 1 HEX
delT Аллель 2 FAM
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ
1. Достать из коробки необходимое число пробирок (стрипов) и расставить в соответствии с
заранее подготовленным протоколом. Маркировка пробирок не допустима.
2. Тщательно перемешать раствор Taq-полимеразы.
3. Добавить во все пробирки индивидуальными наконечниками с аэрозольными фильтрами по
5 мкл раствора Taq-полимеразы.
4. Добавить во все пробирки индивидуальными наконечниками с аэрозольными фильтрами по
5 мкл:
- в пробирки исследуемых образцов - исследуемые образцы ДНК;
- в пробирку отрицательного контрольного образца - разбавитель из комплекта набора;
1) При работе на приборе «CFX96» (BioRad) положительные контрольные образцы и
исследуемые образцы обозначить как Unknown, отрицательный контроль обозначить как
NTC.
2) При работе с прибором 1сДТ96» (ДНК-технология) создать следующий тест:
Тип: анализ полиморфизмов, 2 краски.
При необходимости назначить каналам FAM и HEX соответствующие аллели
Указать параметры анализа полиморфизмов:
- гетерозигота dCp <3,0
-гомозигота dCp >6,0
Для работы с наборами «SNP-SHOT» используются следующие каналы:
канал НЕХ-АЛЛЕЛЫ
канал РАМ- АЛЛЕЛЬ 2
Детекция продуктов амплификации осуществляется прибором автоматически в каждом цикле
амплификации. На основании этих данных улравляющая программа строит кривые накопления
флуоресцентоного сигнала по заданному для образцов каналу.
7. Перенести пробирки в прибор и провести амплификацию по следующей программе:
«СРХ96» (BioRad)
«ДТ96» (ДНК-технология)
+80 °C 2 мин
+94 «С 3 мин
+94 «С 15 сек 40 циклов+64 oC 40 сек (считывание)
+80 °C 2 мин
+94 °C 3 мин
+94 °C 15 сек 5
циклов+64 °C 40 сек
+94 °C 15 сек 35 циклов+64 °C 40 сек (считывание)
- в пробирки положительных контрольных образцов - положительные контрольные
образцы ДНК из комплекта используемого набора.
5. Пробирки закрыть и центрифугировать в течение 3-5 секунд при 1500-3000 об/мин на
плашечной центрифуге или на микроцентрифуге-вортексе.
6. Создать протокол расположения образцов.
! Iг *
/
«LightCycler96» (Roche)
+80 °С 120 сек
+94 °С 180 сек
+94 °С 10 сек
40 циклов+62 °С 40 сек (считывание)
(ramp rate 2,2 °С/сек)
пор
--- стр. 3 ---
АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
«UqhtCvcler96i* (Roche}
1. По окончании амплификации откройте файл завершенного анализируемого эксперимента в
рабочей программе LightCycler96.
2. Откройте вкладку Analysis. На панели инструментов кликнете по значку Add Analysis, чтобы
добавить новый анализ. Откроется диалоговое окно Create New Analysis.
3. Выберите Endpoint Genotyping. Нажмите OK.
4. Во вкладке Analysis в соответствии с исходными настройками находятся четыре окна с
результатами эксперимента.
5. Указать специфичные настройки в диалоговом окне Endpoint Genotyping Settings во
вкладке Parameters:
- Pos/Neg Threshold: 0,3
- Angle FAM: 30 - 35
-Angle HEX; 60-65
6. Программа автоматически интерпретирует результаты.
«CFX96» (BioRad)
1. Для каналов FAM и HEX выставить следующие настройки:
Cycles to Analyze 5-40
2. На вкладке Allelic discrimination в поле Selected Fluorophores назначить для аллели 1 канал
HEX, для аллели 2 - канал FAM.
3. Программа автоматически интерпретирует результаты.
«ДТ96» ШНК-технология}
1. Критерии положительного результата ПЦР 60%
2. Для каналов FAM и HEX выставить следующие настройки:
Канал HEX Threshold 20; Канал FAM Threshold 200
3. Программа автоматически интерпретирует результаты.
Проверить соответствие генотипов контрольных образцов заявленным:
g(»P.SH0T’
ПАМЯТКА ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА МУТАЦИИ В
ГЕНАХ BRCA1, BRCA2, АССОЦИИРОВАННЫХ С РИСКОМ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ, МЕТОДОМ ПЦР
Положительный контрольный образец 11 - Allele 1
Положительный контрольный образец 22 - Allele 2 '7 т в е р ж д
Подпись
По всем вопросам обращайтесь в офис компании ООО НПФ «Литех»:
телефон (495) 258-39-47, e-mail: info(5)lvtech.ru
КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТИКА BRCA
SNP-SHOT OneStep-PB-96
ВСЕ КОМПОНЕНТЫ УЖЕ ВНЕСЕНЫ. ДОБАВЬТЕ ТОЛЬКО ОБРАЗЦЫ И КОНТРОЛИ.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Система «SNP-SHOT» представляет собой комплект реагентов для выявления мутаций
(полиморфизмов) в геноме человека.
В реакционной смеси содержатся праймеры, необходимые для амплификации участка,
содержащего искомую последовательность, и два аллель-специфичных гидролизных зонда,
содержащих полиморфный сайт. Зонд, содержащий сайт Аллель 1, мечен флуорофором HEX,
аллель 2 - флуорофором FAM. Дискриминация аллелей осуществляется за счёт различной
эффективности разрушения Taq-полимеразой полностью и неполностью комплементарного
зонда.
Результаты анализа позволяют дать три типа заключений:
гомозигота по аллелю 1: гетерозигота: гомозигота по аллелю 2:
СОСТАВ НАБОРА
Набор состоит из 96 пробирок с амплификационной смесью под слоем масла, по 12 пробирок
на амплификационную смесь одного генетического маркера. Один вертикальный ряд пробирок
предназначен для исследования одного клинического образца на 8 маркеров. Пробирки с
амплификационной смесью на определенный маркер расположень! согласно приведенной ниже
схеме:
BRCA1185delAG
BRCA14153delA
BRCA1 5382insC
BRCA1 3819delGTAAA
BRCA1 3875delGTCT
BRCA1 Cys61Gly
BRCA1 2080delA
BRCA2 6174delT
Отд а|цм1Г ^ ожены пробирка с разбавителем, который используется в качестве единого
отрицательного контроля, и пробирки с положительными контрольными образцами для
всех амплификационных смесей в отдельном пакете.
--- стр. 4 ---
ОБОЗНАЧЕНИЕ АЛЛЕЛЕЙ
ВНИМАНИЕ! При работе с прибором «LiqhtCvcIer 96i> fRoche) следует проверить, что
амплификационная смесь расфасована в низкопрофильный пластик.
Кат № Гвн
Аминокис
потная
замена
Нуклвоти
дная
замена
SNPID Аллель Каналы
to il 37 BRCA1 185 delAG rs80357713 AG Аллель 1 HEX
del AG Аллель 2 FAM
Ю1168 BRCA1 4153delA rs80357711 A Аллель 1 HEX
del A Аллель 2 FAM
to il 38 BRCA1 5382 insC rs80357906 delC Аллель 1 HEX
insC Аллель 2 FAM
Ю1385 BRCA1 p.Val1234
GInfs
3819 del
GTAAA re80357609 GTAAA Аллель 1 HEX
del GTAAA Аллель 2 FAM
Ю1386 BRCA1 * 3875
deIGTCT rs80357868 GTCT Аллель 1 HEX
del GTCT Аллель 2 FAM
t01146 BRCA1 CyseiGly T181G rs28897672 Cys(T) Аллель 1 HEX
Gly(G) Аллель 2 FAM
Ю1387 BRCA1 2080 delA rs80357522 A Аллель 1 HEX
del A Аллель 2 FAM
to il 39 BRCA2 -6174 delT rs80359550 T Аллель 1 HEX
delT Аллель 2 FAM
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ
1. Достать из коробки необходимое число пробирок (стрипов) и расставить в соответствии с
заранее подготовленным протоколом. Маркировка пробирок не допустима.
2. Полностью разморозить содержимое пробирок.
При необходимости, если часть раствора находится на внутренней стороне крышки
пробирки, отцентрифугировать пробирки 3-5 сек на плашечной центрифуге или на
микроцентрифуге-вортексе.
3. Добавить во все пробирки индивидуальными наконечниками с аэрозольными фильтрами
по 5 мкл:
- в пробирки исследуемых образцов - исследуемые образцы ДНК;
- в пробирку отрицательного контрольного образца - разбавитель из комплекта набора;
- в пробирки положительных контрольных образцов - положительные контрольные
образцы ДНК из комплекта используемого набора.
4. Пробирки закрыть и центрифугировать в течение 3-5 секунд при 1500-3000 об/мин на
плашечной центрифуге или на микроцентрифуге-вортексе.
5. Создать протокол расположения образцов.
1) При работе на приборе «CFX96» (BioRadj положительные контрольные образцы и
исследуемью образщ»! обозначить как Unknown, отрицательный контроль обозначить как
NTC.
2) При работе с прибором кДТ96» (ДНК-технология) создать следующий тест:
Тип: анализ полиморфизмов, 2 краски.
При необходимости назначить каналам FAM и HEX соответствую1цие аллели
Указать параметры анализа полиморфизмов:
- гетерозигота dCp <3,0
-гомозигота dCp >6,0
Для работы с наборами «SNP-SHOT» используются следующие каналы:
канал НЕХ-АЛЛЕЛЫ
канал РАМ- АЛЛЕЛЬ 2
Детекция продуктов амплификации осуществляется прибором автоматически в каждом цикле
амплификации. На основании этих данных управляющая программа строит кривые накопления
флуоресцентоного сигнала по заданному для образцов каналу.
6. Перенести пробирки в прибор и провести амплификацию по следующей программе:
«CFX96» (BioRad) +94 3 мин
+94 °C 15 сек 40 циклов+64 °C 40 сек (считывание)
«ДТ96» (ДНК-технология)
+94 °С 3 мин
+94 °С 15 сек 5
циклов+64 °С 40 сек
+94 °С 15 сек 35 циклов+64 °С 40 сек (считывание)
«LIghtCycler 96» (Roche)
+94 °С 180 сек
+94 °С 10 сек
40ЦИКЛОВ
+62 «С 40 сек (считывание)
(ramp rate 2,2°С/сек}
--- стр. 5 ---
ПАСПОРТ КАЧЕСТВА Лв 0!Л-1004 р/22
Набор реагентов для анализа мутаций в генах BRCA1, BRCA2,
ассоциированных с риском онкологических заболеваний, методом ПЦР
КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТИКА BRCA
SNP-SHOT OneStep-PB-96
Предприятие-изготовитель ООО НПФ «Литех», Москва 119435, ул. Малая Пироговская 1стр.З, тел. (495) 258-39-47
11омер серии 01/t-l0Q4p/22 Дата изготовления 03.10.2022 I [аборов в серии 170
С о ст а в К о м п л ек тац и я В н е ш н и й в и д
1.1. А мплификациониая смесь BRCA1 185dclAG 12 пробирок по 20 мкл П розрачная бесцветная жзш кость под слоем вязкой
прозрачной ж идкости
1.2. А мплнфнкпционипя смесь BRCA1 4 153dclA 12 пробирок по 20 мкл П розрачная бесцветная ж идкость под слоем вязкой
прозрачной ж идкости
1.3. Л мп.'ш фикациотш я смесь DRCA1 5382insC 12 П 1ю бирок по 20 мкл П розрачная б саш етн ая ж идкость подслоем вязкой
прозрачной Ж31ДКОСТИ
1.4. А.м 11Л1|фикаш<ошшя см есь 0R C A 1 3819delG TA A A 12 гфобирок по 20 мкл П розрачная бесцветная ж идкость под слоем вязкой
прозрачной ЖИДКОСТИ
1.5. Лмгиш фикацно 1ш ая смесь B R C A I 3875delG TC T 12 пробирок по 20 мкл П розрачная бесцветная ж идкость под слоем вязкой
прозрачной ж идкости
1.6. А мплификаинонная смесь BRCA1 Cys61G Iy 12 пробирок по 20 мкл П розрачная бесцветная ж идкость под слоем вязкой
прозрачной ж ндкосш
1.7. Л м 1ь'ш ф||каш 1 0ш шя смесь B R C A ! 208UdclA 12 пробирок по 20 МК 1 П розрачная бесцветная ж идкость под слоем вязкой
прозрачной ж илкости
1.8. А мплифнкаииоипая смесь BRCA 2 6174dclT I2 пробирок по 20 мкл П розрачная бссш зетиая ж идкость под слоем вязкой
прозрачной ж идкости
1.9. Разбавитель I п 1ю б11р к а- 2 0 0 мкл П розрачная бесцветная ж идкость
1.10. П КО «О нкогенетмка B R C A »11 1 пробирка - 200 МК 1 П розрачная бесцветная ж идкость
1.11. ПКО «О нкогенетика B RCA »22 1 пробирка- 2 0 0 мкл П розрачная бесцветная ж идкость
11я11.ме11овяине пок'язмте.1н Характеристика и нормв по ТУ Результаты контроля
I. Комплектность Согласно п.1.4. ТУ Соответствует
В комплект поставки входят:
-набор реагентов;
-памятка по применению набора.
2. Упаковка Согласно п. 1.6. ТУ Соотвсгствует
3. Маркировка Согласно II. 1.5. ТУ. Соответствует
На каждый блок компонентов,
наклеена этикетка.
На потребительскую упаковку
каждого набора наклеена
этикетка.
4. Технические характеристики
4.1. Лналнтическая чувствительность,
гсном-эквивш1ентов*/мл
ДНК человека WOOO Соответствует
4.2. Аналитическая специфичность:
4.2.1. ПКО «Онкогепетнка BRCA» 11 Экспоненциальный рост флуоресцентного
сигнала должен регистрироваться для всех
смесей по каналу 11ЕХ не позднее 25 цикла; по
каналу FAM позднее 37 цикла или не
регистрироваться совсем.
Соответствует
4.2.2. ПКО «Онкогспегика BRCA» 22 Экспоненциальный рост флуоресцентного
сигнала должен регисгрироваться для всех
смесей по каналу КАМ не позднее 25 цикла; по
кана;|у HEX позднее 37 цикла или не
регистрироваться совсем.
Соответствует
4.3. ОКО Экс1юненциа;1ьный рост флуоресцентного
сигнала нс должен регисгрироваться по каналам
FAM, HEX для всех смесей.
Соответствует
ПРИМНЧАИИЕ.
* геном-эквивалент (гэ)- суммарное количесгво i енеэнчсско! о .магериала в одной клетке.
--- стр. 6 ---
Условия хранения:
Набор реагентов КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТПКА BRCA варианта исполнения SNP-SHOT OneStep-PB-96 должен храниться при
температуре -18...-20'*С в течение всего срока годности.
Условия транспортировки:
Набор реагентов КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТИКА BRCA варианта исполнения SNP-SHOT OneSiep-PB-96 рекомендуется
транспортировать при температуре его хранения. Допустима транспортировка при температуре +2...+8 °С в течение ! суток (нс более),
либо в пенопластовых контейнерах с сухим льдом в течение 3 с)'ток.
Заключение отдела к о н т р о л я производства медицинских нмедий:
ГОДЕН ДО
Набор реагентов КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТИКА BRCA SNP-SHOTOneStep-PB-96 серии 01/t-l004n/22 соответствует
требованннм ТУ 21.20.23-1004-17253567-2022.
Начальник отдела контроля производства медицинских изделий
Дата выдачи паспорта: 03.10.2022
--- стр. 7 ---
ПАСПОРТ КАЧЕСТВА JV f 01/M004TS/22
|{абор реагентов для анализа мутаций в генах BRCA1, BRCA2,
ассоциированных с риском онкологических заболеваний, методом ПЦР
КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТИКА BRCA
SNP-SHOT TwoStep-PB~96
Предприятие-изготовитель ООО 11ПФ «Лнтех», Москва 119433, ул. Малая Пиро1'овская 1стр.З, тел. (495) 258-39-47
Номер серии 01A-1QQ4TS/22 Лата изготовления 03.10.2022 Наборов в серии 12Q
С о став К о.м п лекта 1ш я В н е ш н и й ви л
1.1. Реакционная смесь [3RCAI 185delAG 12 пробирок по 15 мкл П розрачная бесцветная ж ш ж ость нол пробкой белого цвета
1.2. Реакц| 1 0Ш1ая смесь 0R C A I 41S3deiA 12 пробирок по 15 мкл П розрачная бесцветная ж идкость под пробкой белого цвета
1.3. Реакционная смесь B RC A ) 5382insC 12 пробирок по 15 МК .1 П розрачная бесцветная ж идкость пол пробкой белого lu c ra
1,4. Реакционная смесь B RC A I 3819dclG TA A A 12 пробирок по 15 мкл П ризрачная бесцветная ж идкость под пробкой белого цвета
1,5. Реакционная смесь B RC A I 3875dclCj ГСТ 12 лроби|)ок по 15 мкл П ризрачная бес 1ш етиоя ж идкость пол пробкой белого цвета
1.6. Реакционная смесь BRCA1 Cvs61G lv 12 пробирок но 15 мкл П розрачная бесцветная ж идкость иол пробкой белого цвета
1,7. Реакционная смесь BRCA1 2080dclA 12 пробирок по 15 мкл П розрачная бесцветная ж идкость пол пробкой белого цвета
1.8. Реакционная смесь BRCA 2 6174dclT 12 пробирок по 15 МК .1 П розрачная бесцветная ж идкость пол пробкой белого цвета
1.9. Раствор Taq-полимсразы I пробирка - 550 мкл П розрачная бесцветная вязкая ж идкость
1.10. Разбавитель I пробирка- 2 0 0 мкл П розрачная бес 1ш стная ж и; 1кость
I .I I. П КО «О нкогенетнка B R C A »11 I п р о б и р к а -200 мкл П розрачная бсиш етная ж идкость
1.12. П КО «О нкогенетнка B RCA »22 I пробирка- 2 0 0 мкл П розрачная бесцветная ж >акость
Иаи.меноианис показатс.ти Характеристика и норма по ТУ Результаты контроля
I. Комплектность Согласно п.1.1. ТУ Соответствует
В комплект поставки входят;
•набор реагентов;
•памятка но применению набора;
2. Упаковка Согласно 11.1.6. ТУ Соответствует
3. Маркировка Согласно п. 1.5. ТУ. Соответствует
На каждый блок компонентов,
наклеена этикетка.
11а потребительскую упаковку
каждого набора наклеена
этикетка.
4. Техинчсскис хаоает-еоисзнки
4.1. Аишттнческая чувсгвшслыюс'гь.
гсном-’>квивалентов*/мл
ЛПК человека 10000 Соответствует
4.2. Лиатитическая специфичность:
4.2.1. ПКО «Оикогенетика BRCA» 11 Экс1юпешшалы1ый рост флуоресцентного сигнала
должен регистрироваться для всех смесей по
каналу HEX пе позднее 25 цикла; по каналу РАМ
позднее 37 цикла или не регистрироваться совсе.м.
Соответствует
4.2.2. ПКО «Оикогенетика ИКСА» 22 ОкспонсициальиыП рост флуоресцентного сигнала
должен регистрироваться для всех смесей по
кани,’1у 1-АМ нс позднее 25 цикла; по каналу ПЕХ
позднее 37 цикла или пе регистрироваться совсем.
Соответствует
4.3. ОКО Оксиоиеициа^тьиый рост флуоресцентного сигнала
не должен регистрироваться по каналам РАМ,
МЕХ для всех смесей.
Соотве^гствует
ПРИМЕЧАНИЕ.
* гепом-эквивалеит (п ь суммарное количесгво сеие'гнческого материала в одиоП клетке.
Условия хранения:
Набор реагентов КОМПЛЕКС ОНКОГЕПЕТПКЛ BRCA варианта исполнения SNP-SIIOT T\voStef>~PB-96 должен храниться при
тс.мпсратурс т2...+8°С втеченне всего срока годпосги.
Условия трапспоргировки:
Набор реагентов КОМПЛЕКС ОИКОГЕПЕТИКЛ BRCA варианта исполнения SNP-SffOT TwoSlep-PB-96 рекомендуется
транспортировать при температл ре его хранения. Допусгиматранспортировка при температуре + 18...+25 ®С в течение 3 суток (не более).
--- стр. 8 ---
--- стр. 9 ---
Копия на листах верн;
«Литех»
Наумов А.Ю.
--- стр. 10 ---
u
ИНСТРУк
« у т в га ^ д а ю »
Ф «Литех»
А.Ю.Наумов
2022 г.
ПО применению медицинского изделия для диагностики in vitro
«Набор реагентов для анализа мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ассоциированных с риском
онкологических заболеваний, методом ПЦР
КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТИКА BRCA»
1. НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТИКА BRCA предназначен для одновременного
качественного выявления мутаций в генах BRCA1, BRCA2 генома человека, ассоциированных с
риском возникновения наследственных онкологических заболеваний, методом полимеразной цепной
реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в пробах ДНК человека, выделенных
из клинических образцов (цельная кровь).
Функциональное назначение - Набор реагентов КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТИКА BRCA
предназначен для диагностики наследственной онкологии, обусловленной мутациями 185delAG.
4153delA, 5382insC, 3819delGTAAA, 3875delGTCT, Cys61GIy, 2080deiA в гене BRCAl, 6174delT в
гене BRCA2.
Набор предназначен для обследования всех групп населения любого возраста без градации по
демографическому или популяционному признаку.
Полученные результаты не являются основанием для постановки диагноза, а используются
только в сочетании с другими лабораторными показателями и диагностической информацией.
2. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ НАБОРА - клиническая лабораторная диагностика.
Показания к применению. Набор реагентов КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТИКА BRCA может
быть использован в клинической лабораторной диагностике генетической предрасположенности к
онкологии.
3. ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ПОЛЬЗОВАТЕЛЬ НАБОРА сотрудники клинико-
диагностических лабораторий, прошедшие соответствующую профессиональную подготовку в
области ДНК-диагностики.
4. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА
4.1. Состав набора
Набор КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТИКА BRCA выпускается в 2 вариантах исполнения.
Варианты исполнения набора различаются степенью готовности реагентов к проведению
анализа (OneStep-PB-96, TwoStep-PB-96) (табл. 1).
Набор рассчитан на проведение анализа 12 образцов на 8 генетических маркеров, включая
контрольные образцы, и последующей флуоресцентной детекции амплифицированного фрагмента
ДНК методом гибридизации с зондами «в реальном времени» на адаптированных для этого приборах.
Таблица 1
№ Вариант исполнения Состав Варианты фасовки
1 SNP-SHOT
OneStep-PB-96
1. Амплификационные смеси:
BRCA1 185deiAG 12 пробирок по 20 мкл
BRCAl 4153delA 12 пробирок по 20 мкл
BRCAl 5382insC 12 пробирок по 20 мкл
BRCAl 3819delGTAAA 12 пробирок по 20 мкл
--- стр. 11 ---
i J
BRCAl 3875delGTCT 12 пробирок по 20 мкл
BRCAl Cys6IGly 12 пробирок по 20 мкл
BRCAl 2080delA 12 пробирок по 20 мкл
BRCA2 6174delT 12 пробирок по 20 мкл
2. Разбавитель 1 пробирка -200 мкл
3. ПКО «Онкогенетика BRCA» 11 1 пробирка - 200 мкл
4. ПКО «Онкогенетика BRCA» 22 1 пробирка - 200 мкл
2 SNP-SHOT 1. Реакционные смеси:
TwoStep-PB-96 BRCAl 185delAG 12 пробирок по 15 мкл
BRCAl 4153delA 12 пробирок по 15 мкл
BRCAl 5382insC 12 пробирок по 15 мкл
BRCAl 3819dclGTAAA 12 пробирок по 15 мкл
BRCAl 3875delGTCT 12 пробирок по 15 мкл
BRCAl Cys61Gly 12 пробирок по 15 мкл
BRCAl 2080delA 12 пробирок по 15 мкл
BRCA2 6174delT 12 пробирок по 15 мкл
2. Раствор Taq-полимеразы 1 пробирка - 550 мкл
3. Разбавитель 1 пробирка - 200 мкл
4. ПКО «Онкогенетика BRCA» 11 1 пробирка - 200 мкл
5. ПКО «Онкогенетика BRCA» 22 1 пробирка - 200 мкл
в состав комплектаций набора входят готовые к применению реагенты.
В состав каждой амплификационной (реакционной) смеси входят:
- раствор дНТФ;
- раствор специфичных праймеров, необходимых для амплификации участка, содержащего искомую
последовательность;
- ПЦР-буфер;
- аллель-специфичные гидролизные зонды, содержащие полиморфные сайты: зонд, содержащий
сайт аллель 1, мечен флуорофором HEX; зонд, содержащий сайт аллель 2 мечен флуорофором РАМ.
Амплификационная смесь комплектации SNP-SHOT OneStep-PB-96 полностью готова к
амплификации, содержит Taq-полимеразу;
Реакционная смесь комплектации SNP-SHOT TwoStep-PB-96 требует внесения Taq-
полимеразы, входящей в состав набора.
ПКО «Онкогенетика BRCA» 11 представляет собой смесь ДНК-мишеней, соответствующих
аллелям 1 маркеров в генах BRCA1, BRCA2.
ПКО «Онкогенетика BRCA» 22 представляет собой смесь ДНК-мишеней, соответствующих
аллелям 2 маркеров в генах BRCA1, BRCA2.
4.2. Комплектность
В комплект поставки входят:
- набор реагентов;
- памятка по применению набора.
Паспорт предоставляется по запросу пользователя.
Полная инструкция по применению представлена на сайте производителя www.Iytech.ru (ГОСТ
51088). На бумажном носителе инструкция предоставляется по запросу пользователя.
4.3. Принцип метода
Набор реагентов КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТИКА BRCA основан на использовании метода
полимеразной цепной реакции (ПЦР) для определения маркеров в генах ДНК человека путем
накопления (амплификации) фрагментов ДНК, ограниченных специфически подобранными
праймерами.
В результате многократно повторяющихся циклов синтеза новых цепей ДНК, гомологичных
специфической области ДНК-мишени, происходит накопление фрагментов ДНК в количестве,
достаточном для детекции.
Гибридизационно-флуоресцентная детекция позволяет проводить регистрацию продуктов
амплификации в процессе реакции («в реальном времени»). Детекция продуктов амплификации
проводится в реакционном растворе.
2
--- стр. 12 ---
Амплификационная/реакционная смесь содержит два аллель-специфичных зонда, меченных
различными флуорофорами. В процессе амплификации зонды конкурируют за связывание с
матрицей в участке с определяемым генетическим маркером. Преимущество получает тот зонд,
который соответствует представленному в образце аллелю. Если в исследуемом образце
присутствует два одинаковых аллеля, то с ДНК-мишенью связывается только один из сигнальных
зондов, и данный образец интерпретируется как гомозигота по определенному аллелю. В случае
присутствия в образце двух разных аллелей, оба зонда будут гибридизоваться с одинаковой
вероятностью, и образец будет интерпретироваться как гетерозигота.
В ходе последующей элонгации происходит разрушение полностью комплементарного
матрице зонда и высвобождение флуоресцентной метки в раствор, что делает возможным её
регистрацию на флуоресцентном детекторе. Детекция продуктов амплификации осуществляется
прибором автоматически в каждом цикле амплификации. На основании этих данных управляющая
программа строит кривые накопления флуоресцентного сигнала по каждому из заданных для
образцов каналов, что даёт возможность визуализировать результат и осуществлять дискриминацию
аллелей.
Результаты анализа позволяют дать три типа заключений: гомозигота по аллелю 1,
гетерозигота, гомозигота по аллелю 2 для каждого определяемого генетического маркера. В случае
гомозиготы по аллелю 1 кривая накопления флуоресцентного сигнала будет представлена только по
каналу Флуорофора 1; в случае гомозиготы по аллелю 2 - по каналу Флуорофора 2; в случае
гетерозиготы будут представлены равнозначные кривые накопления по каналам обоих Флуорофоров
(Рисунок 1).
Примечание: кривая накопления флуоресцентного сигнала по каналу Флуорофора 1 обозначена жирной линией: по каналу
Флуорофора 2 - тонкой линия.
4.4. Коммутабельность контрольных образцов предприятия подтверждена результатами
измерения концентрации и генотипирования ДНК референтной и рутинной методиками,
предназначенными для измерения показателей концентрации или аллель-специфичного анализа
генетической последовательности, соответственно, при исследовании ДНК, выделенной из
соответствующих клинических образцов.
4.5. Ограничения метода
При наличии мутаций в анализируемой области генома, вследствие ухудшения гибридизации
праймеров или зондов с ДНК, могут наблюдаться ложноотрицательные реакции, а также занижение
реального содержания исследуемой ДНК в клиническом образце.
5. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА
5.1. Аналитическая специфичность
Специфичность анализа 100%. Специфичность определяется олигонуклеотидными затравками
(праймерами) и зондами, подобранными к определенным аллелям генов человека и условиями
реакции амплификации.
В образцах биологического материала человека после завершения реакции амплификации
должен определяться генотип исследуемого образца.
5.2. Аналитическая чувствительность
Аналитическая чувствительность составляет 10“ ^ геном-эквивалентов/мл ДНК человека в прошедшей
обработку (выделение ДНК) пробе.
--- стр. 13 ---
6. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА*
6.1. Диагностическая чувствительность выявления мутации 185delAG в гене BRCA1~:
100 % (интервал 74,1 % - 100 %, с доверительной вероятностью 95 %).
Диагностическая чувствительность выявления мутации 4153delA в гене BRCA1: 100 %
(интервал 91,3 % - 100 %, с доверительной вероятностью 95 %).
Диагностическая чувствительность выявления мутации 5382insC в гене BRCA1: 100 %
(интервал 91,6 % - 100 %, с доверительной вероятностью 95 %).
Диагностическая чувствительность выявления мутации 3819delGTAAA в гене BRCA1": 100
% (интервал 54,9 % - 100 %, с доверительной вероятностью 95 %).
Диагностическая чувствительность выявления мутации 3875delGTCT в гене BRCA1': 100 %
(интервал 47,3 % - 100 %, с доверительной вероятностью 95 %).
Диагностическая чувствительность выявления мутации Cys61Gly в гене BRCAP:
(интервал 65,2 % - 100 %, с доверительной вероятностью 95 %).
Диагностическая чувствительность выявления мутации 2080delA в гене BRCA1":
(интервал 54,9 % - 100 %, с доверительной вероятностью 95 %).
Диагностическая чувствительность выявления мутации 6174deIT в гене BRCA2^: 100 %
(интервал 54,9 % - 100 %, с доверительной вероятностью 95 %).
6.2. Диагностическая специфичность выявления мутации 185delAG в гене BRCA
(интервал 98,5 % - 100 %, с доверительной вероятностью 95 %).
Диагностическая специфичность выявления мутации
(интервал 98,3 % - 100 %, с доверительной вероятностью 95 %).
Диагностическая специфичность выявления мутации
(интервал 98,3 % - 100 %, с доверительной вероятностью 95 %).
Диагностическая специфичность выявления мутации 3819delGTAAA в гене BRCA1: 100 %
(интервал 98,5 % - 100 %, с доверительной вероятностью 95 %).
Диагностическая специфичность выявления мутации 3875delGTCT в гене BRCA1: 100 %
(интервал 98,5 % - 100 %, с доверительной вероятностью 95 %).
Диагностическая специфичность выявления мутации Cys61Gly в гене BRCA1: 100 %
(интервал 98,5 % - 100 %, с доверительной вероятностью 95 %).
Диагностическая специфичность выявления мутации
(интервал 98,5 % - 100 %, с доверительной вероятностью 95 %).
Диагностическая специфичность выявления мутации
(интервал 98,5 % - 100 %, с доверительной вероятностью 95 %).
00 %
00 %
00 %
4153delA в гене BRCA1: 100 %
5382insC в гене BRCA1: 100 %
2080deIA в гене BRCA1: 100 %
6174delT в гене BRCA2: 100 %
6.3. Воспроизводимость результатов исследования с использованием набора КОМПЛЕКС
ОНКОГЕНЕТИКА BRCA составляет 100% и подтверждена в ходе проведения клинических
испытаний на разных сериях набора (внутрисерийная, межсерийная и внутрипостановочная
воспроизводимость). Коэффициент вариации измерения Ct по соответствующим каналам
флуоресценции для одного и того же образца не превышает 4%.
Таблицао Э
К ли н и ч ес
кий
м атери ал
К олич ество
образцов
от п ац и
ентов
М у тац и я Г енотип
Р езу л ь таты и сп ы тан и й
Д и агн о сти ч еск ая
чу в ств и тел ьн о сть
Д и агн о сти ч еск ая
сп ец и ф и чн ость
Ц ельная
кровь
207
185delA G
в гене BRCA1
Гомозигота по
Аллелю 1
100%
(95% Д И : 98.5-100% )
100%
(95% ДИ : 74.1-100% )
Гетерозигота* 100%
(95% Д И : 74.1-100% )
100%
(95% ДИ : 98.5-100% )
4 I53delA
в гене BRCA1
Гомозигота по
Аллелю 1
100%
(95% ДИ : 98.3-100% )
100%
(95% Д И : 91.3-100% )
Гетерозигота
100%
(95% ДИ : 91.3-100% )
100%
(95% Д И : 98.3-100% )
1 диагностические характеристики представлены для гетерозиготных носителей мутации.
представленная выборка образцов недостаточна для подтверждения высокой диагностической
чувствительности исследуемого набора реагентов, однако, ввиду редкой встречаемости мутаций исследование
более широкой выборки на данном этапе не представляется возможным.
4
--- стр. 14 ---
5382insC
в гене BRCA1
Гомозигота по
Аллелю I
100%
(95% Д И : 98.3-100% )
100%
(95% ДИ : 9 1 .6 -1 0 0 « о)
Гетерозигота
100%
(95% Д И : 91.6-100% )
100%
(95% Д И : 98.3-100% )
38l9deIG T A A A
в гене BRCA1
Гомозигота по
Аллелю 1
100%
(95% ДИ : 98.5-100% )
100%
(95% Д И : 54.9-lOO'J-o)
Гетерозигота * 100%
(95% ДИ : 54,9-100% )
100%
(95% ДИ : 98.5-100«о)
3875delG T C T
в гене BRCA1
Гомозигота по
Аллелю I
100%
(95% ДИ : 98,5-100% )
100%
(95% ДИ : 47.3-100% )
Гетерозигота * 100%
(95% ДИ : 47.3-100% )
100%
(95% ДИ : 98.5-100% )
C ys61G ly
в гене B R C A I
Гомозигота по
Аллелю 1
100%
(95% Д И : 98.5-100% )
100%
(95% ДИ : 65.2-100% )
Гетерозигота * 100%
(95% Д И : 65.2-100% )
100%
(95% Д И : 98.5-100% )
2080delA
в гене BRCA1
Гомозигота по
Аллелю 1
100%
(95% Д И : 98.5-100% )
100%
(95% Д И : 54.9-100% )
Гетерозигота* 100%
(95% ДИ : 54.9-100% )
100%
(95% ДИ : 98.5-100% )
6 l7 4 d elT
в гене B R C A 2
Гомозигота по
Аллелю 1
100%
(95% ДИ : 98.5-100% )
100%
(95% ДИ : 54.9-100% )
Гетерозигота* 100%
(95% ДИ : 54.9-100% )
100%
(95% ДИ : 98.5-100% )
• Представленная выборка образцов недостаточна для подтверждения высокой диагностической
чувствительности исследуемого набора реагентов, однако, ввиду редкой встречаемости образцов цельной
крови от пациентов с генотипами Гетерозигота по представленным мутациям исследование более широкой
выборки на данном этапе не представляется возможным.
7. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Потенциальный риск применения набора - класс 26
7.1. Требования безопасности при работе с набором
Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно-биологические (ПЦР)
исследования клинического материала на наличие возбудителей инфекционных болезней, с
соблюдением санитарных правил и норм СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические
требования по профилактике инфекционных болезней» и методических указаний МУ 1.3.2569-09
«Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при
работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».
При работе всегда следует выполнять следующие требования:
• Следует рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные, организовывать
работу и хранение в соответствии с СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования
по профилактике инфекционных болезней».
• Убирать и дезинфицировать разлитые образцы или реактивы, используя
дезинфицирующие средства в соответствии с СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические
требования по профилактике инфекционных болезней».
ВНИМАНИЕ! При удалении пробирок, содержащих продукты ПЦР, недопустимо их
открывание и разбрызгивание содержимого, поскольку это может привести к контаминации
продуктами ПЦР лабораторной зоны, оборудования и реагентов.
• Применять набор строго по назначению, согласно данной инструкции.
• Допускать к работе с набором только специально обученный персонал с высшим или
средним медицинским или бгГологическим (ветеринарным) образованием, прошедшим подготовку на
лицензированных курсах первичной специализации по работе с микроорганизмами 1I1-1V групп
патогенности и получившим дополнительное специальное образование на курсах повышения
квалификации по молекулярно-биологическим методам диагностики.
• Не использовать набор по истечении срока годности.
--- стр. 16 ---
I
9.3. Предварительная обработка клинического материала
Обработка клинического материала для выделения ДНК, а также его хранение производи гся
согласно инструкции производителя набора для выделения ДНК из клинического материала.
Для подготовки образцов ДНК могут быть использованы любые зарегистрированные на
территории РФ наборы реагентов для пробоподготовки с сорбентной очисткой, предназначенные для
выделения нуклеиновых кислот (ДНК) из клинического материала (цельная кровь) для ПЦР-
диагностики и позволяющие максимально удалить ингибиторы ПЦР из образца. Производигель
рекомендует использовать зарегистрированный в установленном порядке набор «НК-сорбент» ((XX)
НПФ «Литех», РЗН 2019/9331) совместно с набором КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТИКА BRCA для
полного цикла исследования образцов.
9.4, Интерферирующие вещества и ограничения, связанные с пробой
Материалом для исследования набором реагентов КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТИКА BRCA
являются образцы ДНК человека, выделенные из клинических проб.
Анализ рисков показал, что возможными ошибками применения набора реагентов КОМПЛЕКС
ОНКОГЕНЕТИКА BRCA могут являться:
использование непредусмотренных для данного изделия видов анализируемого
биологического материала или наборов для пробоподготовки (выделение ДНК);
- эндогенные интерферирующие вещества, входящие в состав клинического материала
(например, метаболиты, образующиеся при патологических состояниях, таких как сахарный диабег;
множественная миелома; холестатический гепатит; гемолиз, т.е. разрушение эритроцитов с выходом
в жидкую часть крови ряда внутриклеточных компонентов), приводящие к получению недостаточно
очищенного препарата ДНК в результате неэффективной экстракции наборами для Г1робоподготовки;
такие образцы должны быть отбракованы на преаналитическом этапе анализа и не подвергаться
дальнейшему исследованию;
- экзогенные интерферирующие вещества (например, лекарственные средства и их метаболи гы.
парентеральное питание, плазма расширители, антикоагулянты; вещества, принимаемые пациентом,
такие как алкоголь, наркотики, пищевые добавки и т.п.; вещества, добавленные во время
приготовления образца, такие как антикоагулянты, консерванты, стабилизаторы).
Все это может приводить к ингибированию реакции амплификации, снижению
чувствительности анализа и получению недостоверных результатов.
При использовании зарегистрированного в установленном порядке набора реагентов для
выделения НК «НК-сорбент» (РУ № РЗН 2019/9331) интерференции не ожидается.
Производителем Набора реагентов НК-сорбент было показано сохранение эффективности
выделения НК из цельной крови в случае присутствия в клинических образцах потенциально
интерферирующих веществ в концентрациях, соответствующих верхней границе физиологической
нормы, и превышающих их в несколько раз (Таблица 3).
Таблица 3
Клинический образец Интерферент Допустимое содержание в образце
цельная кровь
жиры 50%
К2-ЭДТА 1,8 мг/мл
цитрат натрия 0,129 моль/л
Контроль качества тестируемой ДНК (недостаточное количество, присутствие возможных
ингибиторов) осуществляется автоматически с помощью программного обеспечения
детектирующего амплификатора. Образец ненадлежащего качества будет интерпретироваться как
невалидный.
10. ПРОВЕДЕНИЕ А'НАЛИЗА
Все компоненты необходимо добавлять отдельными наконечниками с аэрозольными
барьерами (фтьтрами). Такие же наконечники необходимо использовать и для внесения в пробирки
препарата ДНК.
После внесения o6pasiia, пробирки с реакционными смесями должны быть как можно скорее
помещены в амплификатор.
--- стр. 17 ---
у
/
10.1. Подготовка к проведению амплификации, вариант исполнения SNP-SHOT OneStep-
РВ-96
10.1.1. Приготовить и расставить-в указанном в протоколе измерений порядке необходимое
количество стрипов с раскапанными амплификационными смесями, включая стрипы для
положительных контрольных образцов (ПКО) и отрицательного контрольного образца. Маркировка
пробирок не допускается!
Для исследования одного образца ДНК требуется один стрип (по восемь пробирок А-Н). В
каждой пробирке представлена амплификационная смесь для определения соответствующего
маркера в гене.
Расположение амплификационных смесей представлено на Рис. 2.
Рисунок 2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
А BRCA1 185delAG
В BRCA1 4153delA
С BRCA1 5382insC
D BRCA1 3819delGTAAA
Е BRCA1 3875delGTCT
Г BRCA1 Cys61Gly
G BRCA1 2080delA
Н BRCA2 6174delT
10.1.2. Полностью разморозить компоненты из набора. Растворы разбавителя и ПКО тщательно
встряхнуть для перемешивания содержимого.
10.1.3. В 8 пробирок Стрипа с различными амплификационными смесями добавить
индивидуальными наконечниками с аэрозольными фильтрами образцы в объеме 5 мкл:
а) в 8 пробирок Стрипа для отрицательного контрольного образца (ОКО) - разбавитель;
б) в 8 пробирок Стрипа для исследуемого образца - исследуемый образец ДНК;
в) в 8 пробирок стрипов для положительных контрольных образцов - ПКО «Онкогенетика
BRCA» 11 и ПКО «Онкогенетика BRCA» 22, соответственно.
10.1.4. Стрипованные пробирки закрыть и центрифугировать в течение 3-5 сек при комнатной
температуре на предназначенной для этого центрифуге.
Перейти к п.10.3.
10,2. Подготовка к проведению амплификации, вариант исполнения SNP-SHOT TwoStep-
РВ-96
10.2.1. Приготовить и расставить в указанном в протоколе измерений порядке необходимое
количество стрипов с раскапанными реакционными смесями, включая стрипы для положительных
контрольных образцов (ПКО) и отрицательного контрольного образца. Маркировка пробирок не
допускается!
Для исследования одного образца ДНК требуется один стрип (по восемь пробирок А-Н). В
каждой пробирке представлена реакционная емесь для определения соответствующего маркера в
гене.
Расположение реакционных смесей представлено на Рис. 3.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 12
A BRCA1 185delAG
В BRCA1 4153delA
C BRCA1 5382insC
D BRCA1 3819delGTAAA
E BRCA1 3875delGTCT
F BRCA1 Cys61Gly
--- стр. 18 ---
BRCA1 2080delA
Н BRCA2 6174delT
10.2.2. Пробирку с раствором Taq-полимеразы перемешать пипетированием или импульсным
вортексированием в течение 10 секунд.
10.2.3. Внести в раставленные пробирки по 5 мкл раствора Taq-полимеразы для приготовления
амплификационных смесей.
10.2.4. Растворы разбавителя и ПКО тщательно встряхнуть для перемешивания содержимого.
10.2.5. В 8 пробирок стрипа с различными амплификационными смесями добавить
индивидуальными наконечниками с аэрозольными фильтрами образцы в объеме 5 мкл:
а) в 8 пробирок стрипа для отрицательного контрольного образца (ОКО) - разбавитель;
б) в 8 пробирок стрипа для исследуемого образца - исследуемый образец ДНК:
в) в 8 пробирок Стрипов для положительных контрольных образцов - ПКО «Онкогенетика
BRCA» 11 и ПКО «Онкогенетика BRCA» 22, соответственно.
10.2.6. Стрипованные пробирки закрыть и центрифугировать в течение 3-5 сек при комнатной
температуре на предназначенной для этого центрифуге. Перейти к п.10.3.
10.3, Проведение амплификации, все варианты исполнения
10.3.1. Перенести пробирки в амплификатор с детекцией результатов «в режиме реальною
времени» и провести амплификацию по следующим программам (ниже представлена Таблица 4 с
программами амплификации для комплектаций SNP-SHOT OneStep~PB-96 и SNP-SHOT TwoSiep-PB-
96 для различных видов амплификаторов);
Таблица 4
«CFX96» (BioRad)
+80 °С 2 мин*
+94 °С 3 мин
+94 °С 15 сек 40
циклов+64 °С 40 сек (считывание по
каналам РАМ. HEX)
+80 °С 2 мин*
+94 °С 3 мин
+94 °С 15 сек 5
циклов+64 °С 40 сек
+94 °С 15 сек 35
циклов+64 °С 40 сек (считывание по
каналам РАМ, HEX)
+80 "С 120 сек*
+94 °С 180 сек
+94 "С 10 сек
40
циклов+62 °С
40 сек (считывание по
каналам РАМ, HEX)
(ramp rate 2,2°С/сек)
«ДТ96» (ДНК-Технология)
«LightCycler 96» (Roche)
* - для комплектаций OneStepраздел программы +80 °С -2 мин необязателен.
Примечание. Подробное руководство для работы на амплификаторах с детекцией
результата «в режиме реачьного времени» представлено в специачьно разработанных
ПРИЛОЖЕНИЯХ д.1Я конкретного вида прибора (www.lytech.ru).
--- стр. 20 ---
«
i
11.2. Интерпретация результатов
При использовании амплификатора CFX96 интерпретация результатов проводится во вкладке
Allelic Discrimination.
Аллельный дискриминантный анализ требует следующего минимального содержания лу(юк:
- наличие двух флуорофоров в каждой лунке;
- наличие не менее одного образца без ДНК-мишени (ОКО) с обозначением NTC для
оптимизации анализа данных.
Необходимо убедиться, что результаты генотипирования ПКО соответствуют заявленным
генотипам: ПКО «Онкогенетика BRCA» 11 - Allele 1; ПКО «Онкогенетика BRCA» 22 - Allele 2.
Генотипирование образцов происходит автоматически с отображением заключения по
каждому маркеру: гомозигота по аллелю 1, гетерозигота или гомозигота по аллелю 2.
Невалидные образцы (недостаточное количество анализируемой ДНК, наличие ингибиторов
реакции в образце) будут интерпретироваться как Undetermined. В этом случае можно говоригь о
ненадлежащем качестве образца для исследования и необходимости повторной пробоподготовки.
Образцы, не прошедшие ПЦР с интерпретацией No Call, могут содержать мутации в
анализируемой области генома, вследствие ухудшения гибридизации праймеров или зондов с ДИК.
Аллельные варианты, детектируемые по использованным каналам флуоресценции,
представлены в таблице 6. Аллель 1 соответствует генотипу с популяционным риском заболевания.
Аллель 2 - генотипу с высоким риском заболевания.
Таблица 6
Амплификационная/реакционная
смесь
Канал флуоресценции и
детектируемая мишень
HEX
Аллель 1
FAM
Аллель 2
BRCA1 185delAG A G delAG
BRCA1 4153delA А delA
BRCA 1 5382insC deIC insC
BRCA1 3819delGTAAA GTAAA deIGTAAA
BRCA1 3875delGTCT GTCT deIGTCT
BRCA 1 Cys61Gty (Cys)T (Gly)G
BRCA1 2080delA A delA
BRCA2 6174delT T delT
Интерпретация результатов анализа с целью выявления и идентификации аллелей генов ДНК
человека проводится в соответствии с таблицей 7.
11
--- стр. 21 ---
Таблица 7
i
HEX EAM Заключение
ОКО No Call No Call Отсутствие амплификации
пко и Allele 1 - Гомозигота по аллелю 1
ПКО 22 - Allele 2 Гомозигота по аллелю 2
Allele 1 - Гомозигота по аллелю 1
гч
яQ.
УО
о
Heterozygote Heterozygote Гетерозигота
3S
м
20)
- Allele 2 Гомозигота по аллелю 2
ч4.» Неопределённый.
U Undetermined Undetermined Образец ненадлежащего качества.
ТРЕБУЕТСЯ повтор анализа с этапа
пробоподготовки
12. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
12.1. Условия хранения
Набор КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТИКА BRCA варианта исполнения SNP-SHOT OneStep-PB-
96 должен храниться при температуре -18...-20 °С в течение всего срока годности. Срок годноспи
набора - 6 месяцев.
Набор КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТИКА BRCA варианта исполнения SNP-SHOTTwoStep-PB-
96 должен храниться при температуре +2...+8 °С в течение всего срока годности. Срок годности
набора - 9 месяцев.
Набор реагентов с истекшим сроком годности применению не подлежит. Срок годности и
условия хранения вскрытых реагентов соответствуют сроку годности и условиям хранения,
указанным на этикетках для невскрытых реагентов.
12.2. Транспортирование
Набор реагентов КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТИКА BRCA транспортируют всеми видами
транспорта (в закрытых железнодорожных вагонах, в отапливаемых герметичных отсеках самолетов
и автомобильным транспортом) по правилам перевозок грузов соответствующих транспортных
ведомств. Условия транспортирования набора должны соответствовать условиям хранения!
Для наборов реагентов КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТИКА BRCA варианта исполнения SMP-
SHOT OneStep-PB-96 допустима транспортировка при температуре +2. ..+8 °С в течение 1 суток (не
более), либо в пенопластовых контейнерах с сухим льдом в течение 3 суток.
Для наборов реагентов КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТИКА BRCA варианта исполнения SNP-
SHOT ТмоВ1ер-РВ-96 допустима транспортировка при температуре +18...+25 °С в течение 3 дней (не
более).
Изделия, транспортированные с нарушением температурного режима, применению не
подлежат.
13. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА НАБОРА
Предприятие-изготовитель проводит приемочные испытания для каждой производственной
серии, осуществляя верификационный контроль основных аналитических характеристик
(технические характеристики), внешний вид, комплектность, упаковку, маркировку, а также
контроль качества сырья и компонентов.
12
--- стр. 22 ---
i
14. БЕЗОПАСНАЯ УТИЛИЗАЦИЯ
Уничтожение отходов, использованных и неиспользованных компонентов набора, наборов
реагентов с истекшим сроком годности Проводить в соответствии с СанПиН 1.2.3684-21.
Жидкие компоненты (реагенты, реактивы) уничтожают разведением водой 1:100, сливом
раствора в канализацию и вывозом остатка упаковок как производственный или бытовой мусор.
Отходы биоматериала (инфицированные и потенциально инфицированные отходы) из клинико-
диагностических лабораторий, работающих с микроорганизмами 3-4 групп патогенности, образцы
материала после пробоподготовки (выделение ДНК) и отходы после проведения амплификации
относятся к классу Б (эпидемически опасные отходы).
Отходы класса Б подлежат обязательному обеззараживанию (дезинфекции)/обезвреживанию.
Выбор метода обеззараживания/обезвреживания определяется возможностями организации,
осуществляющей медицинскую деятельность, и выполняется при разработке схемы обращения с
медицинскими отходами.
15. ИНФОРМАЦИЯ О ПРОИЗВОДИТЕЛЕ
По вопросам, касающимся качества набора КОМПЛЕКС ОНКОГЕНЕТИКА BRCA, следует
обращаться в ООО НПФ «Литех» по адресу: 119435, г. Москва, ул. Малая Пироговская 1, стр.З,
телефон/факс: (495)258-39-47, или e-mail: info@lytech.ru
«СОГЛАСОВАНО»
Генеральный директор
ООО «ВБ1МПЕЛ-МЕДЦЕНТР» ^ П.К. Варнавичус
13