Набор реагентов для выявления и количественного определения РНК SARS-CoV-2 методом ОТ-ПЦР АмплиСенс® COVID-19-FL по ТУ 21.20.23-409-01897593-2020 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 --- «УТВЕРЖДАЮ» Директор Федерального бюджетного учреждения науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и/благополучия В.Г. Акимкин 20Лгг. ИНСТРУКЦИЯ по ПРИМЕНЕНИЮ набора реагентов для выявления и количественного определения РНК 8АР8-Со\/-2 методом ОТ-ПЦР АмплиСенс® СОУЮ-19-РЬ по ТУ 21.20.23-409-01897593-2020 АмплиСенс tJ ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Российская Федерация, 111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, д. ЗА г. Москва, ул. Новогиреевская, д. ЗА, стр. 6 тел. (495) 974 9642, e-mail: amplisens@pcr.ru IVD --- стр. 2 --- ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.......................................................... 3 НАЗНАЧЕНИЕ......................................................................... 3 ПРИНЦИП МЕТОДА..........................................................................................4 ФОРМЫ КОМПЛЕКТАЦИИ.................................................................................5 АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ...................................... 6 ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ .................................. 10 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ.........................................................................13 СВЕДЕНИЯ ОБ УТИЛИЗАЦИИ ..........................................................................14 ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ......................................15 ВЗЯТИЕ. ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА.. 19 ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАКЦИИ РНК.....................26 ИНТЕРФЕРИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА И ОГРАНИЧЕНИЯ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ПРОБ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА .................................................................. 27 СОСТАВ.........................................................................................................30 ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ ..............................................................33 ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ...........................................33 ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ И АМПЛИФИКАЦИЯ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» ................................................................................34 A. Подготовка проб для ОТ-ПЦР .................... 34 Б. Проведение ОТ-ПЦР с детекцией в режиме «реального времени»................35 B. Анализ и интерпретация результатов............................................................36 СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ и ХРАНЕНИЯ .................42 ГАРАНТИЙНЫЕ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА ИЗГОТОВИТЕЛЯ..........................................43 ПЕРЕЧЕНЬ ПРИМЕНЯЕМЫХ НАЦИОНАЛЬНЫХ СТАНДАРТОВ ...........................44 БИБЛИОГРАФИЯ............................................................................................45 СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ .................................46 ПРИЛОЖЕНИЕ 1.............................................................................................47 ПРИЛОЖЕНИЕ 2.............................................................................................50 ПРИЛОЖЕНИЕ 3.............................................................................................53 стр. 2 из 53 --- стр. 3 --- список СОКРАЩЕНИИ В настоящей инструкции применяются следующие BKO-FL - экзогенный внутренний контрольный образец ГЭ - геномные эквиваленты ДИ 95 % - 95 % доверительный интервал ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ЖКТ - желудочно-кишечный тракт к+ - положительный контроль ОТ-ПЦР к- - отрицательный контроль ОТ-ПЦР кДНК - комплементарная ДНК, получаемая в реакции обратной транскрипции на матрице РНК ок - отрицательный контроль экстракции око - отрицательный контрольный образец ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией ПК - положительный контроль экстракции пко - положительный контрольный образец ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота РУ - регистрационное удостоверение ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора - Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека COVID-19 - Coronavirus disease 2019 FL - ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией FRT - флуоресцентная детекция в режиме «реального времени» SARS-CoV-2 - Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 НАЗНАЧЕНИЕ Набор реагентов АмплиСенс® COVID-19-FL лредназначен для выявления и количественного определения РНК SARS-CoV-2 в биологическом материале (мазки со слизистой оболочки носо- и ротоглотки, мокрота / аспират из зева, бронхоальвеолярный лаваж / промывные воды бронхов, плазма крови, фекальный / ректальный мазок, аутопсийный материал) и в объектах окружающей среды (концентраты образцов воды, смывы с объектов окружающей среды) методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации. Материалом для проведения ОТ-ПЦР служат пробы РНК, экстрагированные из исследуемого материала. стр. 3 из 53 --- стр. 5 --- Обратная транскрипция РНК проводится с помощью фермента ревертазы. Амплификация участка кДНК проводится при помощи специфичных к этому участку праймеров и фермента Тац-полимеразы. В составе реакционной смеси присутствуют флуоресцентно-меченые олигонуклеотиды, комплементарные участкам амплифицируемых кДНК-мишеней, что позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала с помощью амплификатора с системой детекции в режиме «реального времени». Количественное олределение РНК основывается на существовании линейной зависимости между логарифмом исходной концентрации РНК-мишени в исследуемом образце и экслоненциальным увеличением флуоресцентного сигнала. ПЦР-исследование анализируемых образцов проводят одновременно с образцом с известной концентрацией РНК- мишени - ПКО, который аттестован по методике Изготовителя. По результатам амплификации ПКО проводится расчет концентрации РНК-мишени в исследуемых образцах. На этапе ОТ-ПЦР одновременно в одной пробирке проводится амплификация двух кДНК-мишеней. Результаты амплификации регистрируются по каналам флуоресцентной детекции, указанным в табл. 1. Таблица 1 Канал для флуорофора РАМ JOE кДНК-мишень кДНКВКО-Р1 кДНК SARS-CoV-2 Область амплификации искусственная нуклеотидная последовательность ген RdRp (RNA-dependent RNA polymerase) ФОРМЫ КОМПЛЕКТАЦИИ Форма 1: «РИБО-преп» вариант 100, «ПЦР-комплект» вариант РРТ-ЮО Р Форма 2: «МАГНО-сорб» вариант 100, «ПЦР-комплект» вариант РРТ-ЮО Р Форма 3: «МАГНО-сорб» вариант 100М, «ПЦР-комплект» вариант РРТ-ЮОМ Р Форма 4: «ПЦР-комплект» вариант РРТ-100 Р Формы 1, 2 и 3 предназначены для проведения полного ПЦР- исследования, включающего экстракцию РНК, обратную стр. 5 из 53 --- стр. 6 --- транскрипцию РНК и амплификацию кДНК с гибридизационно- флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Форма 4 предназначена для проведения обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК с гибридизационно- флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции РНК. Формы 1,2 и 3 рассчитаны на проведение 100 тестов, включая контроли. Форма 4 рассчитана на проведение 110 реакций обратной транскрипции и амплификации, включая контроли. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Для данного набора реагентов применимы следующие характеристики: Диапазон измерения и предел обнаружения Таблица 2 Вид исследуемого материала Комплект для экстракции РНК Комплект для амплификации Предел обнаружения, ГЭ (копий) / мл Диапазон измерения, ГЭ (копий) / мл Мазки со слизистой . оболочки HOCO- и ротоглотки «РИБО-преп» вариант 100, «МАГНО- сорб» вариант 100 и вариант100М «ПЦР- комплект» вариант FRT- 100 F и вариант FRT-100M F 5x102 5x102-3x10® Мокрота / аспират из зева 1x102 5x102-3x10® Бронхоальвео лярный лаваж / промывные воды бронхов 5x102 5x102-3x10® Плазма крови 1x103 1x10“-3x10® Фекальный / ректальный мазок 1X102 1x10“-3x10® Аутопсийный материал 1x103 5x102-3x10® Примечание - Одна копия мишени кДНК соответствует одному геномному эквиваленту (геному) микроорганизма. Данный предел обнаружения достигается при соблюдении правил, указанных в разделах «Взятие, транспортирование и хранение исследуемого материала» и «Подготовка исследуемого материала к экстракции РНК». Аналитическая специфичность СТр. 6 ИЗ 53 --- стр. 7 --- Набор реагентов обнаруживает участок РНК коронавируса SARS-CoV-2 (клинические образцы, содержащие РНК SARS- CoV-2 в концентрации от 5x10^ до 5x10® ГЭ (копий) / мл, специфичность подтверждена методом прямого секвенирования нуклеотидных последовательностей). Аналитическая специфичность набора реагентов доказана при исследовании РНК/ДНК следующих микроорганизмов/штаммов: - штаммы из коллекции АТСС (American Туре Culture Collection, США): Streptococcus pneumoniae (АТСС® 49619’'“), Staphylococcus aureus subsp. aureus, Strain Seattle 1945 (ATCC® 25923’’“), Pseudomonas aeruginosa (ATCC® 9027™), Moraxella catarrhalis (ATCC® 8193’“), Neisseria mucosa (ATCC® 19693™), Enterococcus faecalis (ATCC® 19433™), Mycoplasma pneumoniae, Strain PI 1428 (ATCC® 29085™), Chlamydophila pneumoniae. Strain CM-1 (ATCC® VR-1360™), Legionella pneumophila subsp. pneumophila. Strain Philadelphia 1 (ATCC® 33152™), Staphylococcus epidermidis, FDA Strain PCI 1200 (ATCC® 12228™), Bacillus cereus. Strain FDA 5 (ATCC® 10702™), Human Respiratory Syncytial Virus, Strain 9320 (ATCC® VR-OSS'’“), Human Respiratory Syncytial Virus, Strain A- 2 (ATCC® VR-1540™), Human Parainfluenza Virus 1, Strain C35 (ATCC® VR-94™), Human Parainfluenza Virus 2, Strain Greer (ATCC® VR-92™), Human Parainfluenza Virus 3, Strain C243 (ATCC® VR-93™), Human Rhinovirus 17, Strain 33342 (ATCC® VR-1663™), Human Adenovirus 1, Strain Adenoid 71 (ATCC® VR-1 ™), Human Coronavirus, Strain OC43 (ATCC® VR-1558™), Human Coronavirus, Strain 229E (ATCC® VR-740™), Human Coxsackievirus B1, Strain Conn-5 (ATCC® VR-28™), Human Echovirus 4, Strain Pesascek (ATCC® VR-1734™), Human Herpesvirus 1, Strain HF (ATCC® VR-260™), в концентрации не более 1x10® ГЭ/мл и не менее 1x10® ГЭ/мл; - штаммы из коллекции ГКПМ (Государственная коллекция патогенных микроорганизмов) Haemophilus influenzae 423, Streptococcus pyogenes Dick - I, Corynebacterium pseudodiphtheriticum №25, Proteus mirabilis 3177, Klebsiella pneumoniae 418, Escherichia coliM 17, Salmonella typhimurium 79, Yersinia enterocolitica 134, Bordetella pertussis 703 L 6, Mycobacterium Bovis Ravenel N^700204 в концентрации не более 1x10® ГЭ/мл и не менее 1x10® ГЭ/мл; стр. 7 из 53 --- стр. 9 --- Повторяемость Таблица 3 АмплиСенс® COVID-19-FL Тип образцов Коли чество повторов Совпаде ние результа* тов, % Ожидаемое значение концентра ции, 1д Среднее значение измерения концентра ции, 1д Стандарт •ное отклоне ние (SD) Коэффи циент вариации (CV), % Форма 1 Положительные 10 100 3,70 3,88 0,18 4,75 Отрицательные 10 100 - - - - Форма 2 Положительные 10 100 3,70 3,61 0,13 3,58 Отрицательные 10 100 - - - - Воспроизводимость Таблица 4 АмплиСенс® COVID-19-FL Тип образцов Коли чество повторов Совпаде ние результа тов, % Ожидаемое значение концентра ции, 1д Среднее значение измерения концентра ции. 1д Стандарт -ное отклоне ние (SD) Коэффи циент вариации (CV), % Форма 1 Положительные 40 100 3,70 3,89 0,17 4,46 Отрицательные 40 100 - - - - Форма 2 Положительные 40 100 3,70 3,68 0,13 3,49 Отрицательные 40 100 - - - - Правильность количественного определения РНК 8АР5-СоУ-2 Правильность количественного определения РНК 5АР5-Со\/-2 была установлена путем тестирования биологического материала, в котором предварительно не была выявлена РНК ЗАРЗ-Со\/-2, а затем был добавлен стандартный образец предприятия, содержащий РНК ЗАРЗ-Со\/-2 в концентрациях 5x102, 7x102, 5x103, 1x10^ 1x10^, 1x10^, 3x108 ГЭ/мл. Вид исследуемого материала Количество повторов Ожидаемое значение концентрации, 1д Среднее значение измерения концентрации, 1д Систематическая погрешность (В), % Мазки со слизистой оболочки HOCO-и ротоглотки 12 8,48 8,97 5,79 12 7,00 7,23 3,28 12 5,00 5,26 5,18 12 4,00 4,03 0,75 10 2,70 2,91 7,69 Мокрота / аспират из зева 12 8,48 8,94 5,50 12 7,00 7,12 1.77 12 5,00 5,23 4,55 12 3,70 3,91 5,69 Бронхоальвеолярны й лаваж / промывные воды бронхов 9 8,48 8,88 4,70 9 7,00 6,97 0,44 9 5,00 4,99 0,22 11 3,70 3,78 2,10 11 2,70 2,93 8,51 стр. 9 из 53 --- стр. 10 --- Вид исследуемого материала Количество повторов Ожидаемое значение концентрации, Ip Среднее значение измерения концентрации, 1р Систематическая погрешность (В), % Плазма крови 12 8,48 9,07 6,97 12 7,00 7.11 1,60 12 5,00 5,18 3,62 12 4,00 3,99 0,14 Фекальный / ректальный мазок 12 8,48 9,13 7,70 12 7,00 7,23 3,20 12 5,00 5,30 6,01 12 4,00 4,06 1,56 Аутопсийный материал 9 8,48 8,96 5.72 9 7,00 7,10 1,40 8 5,00 5,12 2,34 9 3,70 3,89 5,23 Систематическая погрешность (В) измерения логарифма концентрации РНК ЗАРЗ-Со\/-2 не превышает 20 %. ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Таблица 6 Результаты тестирования набора реагентов АмплиСенс® СО\/Ю-19-РЬ в сравнении с референтным методом Вид исследуемого материала Результаты применения АмплиСенс® COVID-19-FL Результаты применения референтного метода^ положительныхотрицательных Мазки со слизистой оболочки HOCO- и ротоглотки Всего исследован О 160 образцов положительных 80 0 отрицательных 0 80 Мокрота / аслират из зева Всего исследован О 70 образцов положительных 35 0 отрицательных 0 35 Бронхоальвеолярный лаваж / промывные воды бронхов Всего исследован О 70 образцов положительных 35 0 отрицательных 0 35 Плазма крови Всего исследован 0 70 образцов положительных 35 0 отрицательных 0 35 Фекальный / ректальный мазок Всего исследован О 70 образцов положительных 35 0 отрицательных 0 35 Аутопсийный материал положительных 35 0 ^ В качестве референтного метода использовался набор реагентов «АмплиСенс® Cov-Bat-FL» (РУ № РЗН 2014/1987) в сочетании с Системой капельной цифровой ПЦР QX100 droplet digital PCR (РУ № ФСЗ 2012/13278). стр. 10 из 53 --- стр. 11 --- Вид исследуемого материала Результаты применения А.. _______ЛЛ 1-1 Результаты применения референтного метода^ м м п л и ч ^ е н и 1 Э - Г 1 _ положительныхотрицательных Всего исследован О 70 образцов отрицательных 0 35 Концентраты образцов воды, смывы с объектов окружающей среды Всего исследовано 120 образцов положительных 20 0 отрицательных 0 100 Таблица 7 Диагностические характеристики набора реагентов АмплиСенс® C0VID-19-FL Вид исследуемого материала Диагностическая чувствительность^ (с доверительной вероятностью 95 %) Диагностическая специфичность^ (с доверительной вероятностью 95 %) Мазки со слизистой оболочки носо- и ротоглотки 100 (95-100)% 100 (95-100) % Мокрота / аспират из зева 100 (90-100) % 100 (90-100) % Бронхоальвеолярный лаваж/ промывные воды бронхов 100 (90-100)% 100 (90-100)% Плазма крови 100 (90-100)% 100 (90-100)% Фекальный / ректальный мазок 100 (90-100)% 100 (90-100) % Аутопсийный материал 100 (90-100) % 100 (90-100)% Концентраты образцов воды, смывы с объектов окружающей среды 100 (83-100)% 100 (96-100)% Были использованы: 227 образцов биологического материала (мазки со слизистой оболочки HOCO- и ротоглотки, мокрота / аспират из зева, бронхоальвеолярный лаваж / промывные воды бронхов, плазма крови, фекальный / ректальный мазок, аутопсийный материал) от пациентов с подтвержденным клиническим диагнозом COVID-19; 28 образцов биологического материала (мазки со слизистой оболочки HOCO- и ротоглотки, мокрота / аспират из зева, бронхоальвеолярный лаваж / промывные воды бронхов, плазма крови, фекальный / ректальный мазок, аутопсийный материал), содержащих вирус SARS-CoV-2 в разных концентрациях; ^ Относительная чувствительность в сравнении с использованным референтным методом. ^ Относительная специфичность в сравнении с использованным референтным методом. стр. 11 из 53 --- стр. 12 --- - 14 образцов объектов окружающей среды (концентраты образцов воды, смывы с объектов окружающей среды), в которых с помощью референтного метода обнаружено и определено количество РНК SARS-CoV-2; - 6 образцов объектов окружающей среды (концентраты образцов воды, смывы с объектов окружающей среды), содержащих вирус SARS-CoV-2 в разных концентрациях; - 80 образцов мазков со слизистой оболочки носо- и ротоглотки от пациентов с иной этиологией заболевания (грипп А и В, парагрипп, аденовирусная инфекция, респираторно синцитиальная инфекция, метапневмовирусная инфекция, риновирусная инфекция и коронавирусная инфекция человека, вызванная HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-HK\J\y, - 35 образцов мокроты / аспиратов из трахеи от пациентов с иной этиологией заболевания (грипп А и В, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes. Staphylococcus aureus)', - 35 образцов бронхоальвеолярного лаважа / промывных вод бронхов от пациентов с иной этиологией заболевания (грипп А и В, легионеллезная инфекция); - 35 образцов плазмы крови от больных аденовирусной инфекцией; - 35 образцов фекалий от больных ротавирусной инфекцией; - 35 образцов аутопсийного материала от пациентов с иной этиологией заболевания (грипп А); - 100 образцов объектов окружающей среды (концентраты образцов воды, смывы с объектов окружающей среды). Образцы биологического материала получены из ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора в рамках деятельности лаборатории молекулярных методов ОМДиЭ, референс-центра по мониторингу за возбудителями инфекций верхних и нижних дыхательных путей Роспотребнадзора и лаборатории молекулярной диагностики и эпидемиологии кишечных инфекций. Образцы объектов окружающей среды получены из референс-центра по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций Роспотребнадзора. стр. 12 из 53 --- стр. 22 --- удаляют вдоль наружной стенки носа. Общая глубина введения зонда должна составлять примерно половину расстояния от ноздри до ушного отверстия (3-4 см для детей и 5-6 см для взрослых). После забора материала конец зонда с тампоном опускают до места слома в стерильную одноразовую пробирку с 0,5 мл транспортной среды для хранения и транспортировки респираторных мазков, при этом гибкая часть зонда складывается в 3 раза, далее, прикрывая сверху пробирку крышкой, рукоятку зонда опускают вниз, добиваясь полного отламывания верхней части зонда. Пробирку герметично закрывают и маркируют. Для взятия мазков у взрослых допустимо использовать сухие стерильные зонды из полистирола с вискозными тампонами. Зонд вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2-3 см до нижней раковины, слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину до носоглотки и удаляют вдоль наружной стенки носа. Общая глубина введения зонда должна составлять примерно половину расстояния от ноздри до ушного отверстия (5-6 см). После взятия материала тампон (рабочую часть зонда с вискозным тампоном) помещают в пробирку с 0,5 мл транспортной среды для хранения и транспортировки респираторных мазков. Конец зонда отламывают, придерживая крышкой пробирки с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть пробирку. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают и маркируют. Мазки со слизистой оболочки ротоглотки Образцы берут сухими стерильными зондами с вискозными тампонами вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки. После взятия материала тампон (рабочую часть зонда с вискозным тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с 0,5 мл транспортной среды и зондом с мазком из носоглотки. Конец зонда отламывают, придерживая крышкой пробирки с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть пробирку. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают, маркируют. Допускается хранение мазков со слизистой оболочки носо- и ротоглотки до проведения предобработки: - при температуре от 2 до 8 °С - не более 3 суток; стр. 22 из 53 --- стр. 23 --- - при температуре от минус 24 до минус 16 °С - в течение года. Допускается однократное замораживание-оттаивание материала. Мокрота / аспират из зева Образцы собирают согласно МУК 4.2.3115-13 «Лабораторная диагностика внебольничных пневмоний» и помещают в одноразовые герметичные емкости из полипропилена. Если нет возможности получить мокроту или аспират из зева, собирают слюну, образующуюся утром после глубокого откашливания сразу после пробуждения. Допускается хранение мокроты / аспирата из зева до проведения предобработки: - при температуре от 2 до 8 °С - не более 1 суток; - при температуре от минус 24 до минус 16 °С - в течение года. Допускается однократное замораживание-оттаивание материала. Бронхоальвеолярный лаваж / промывные воды бронхов Образцы объемом не менее 5 мл собирают согласно МУК 4.2.3115-13 «Лабораторная диагностика внебольничных пневмоний» и помещают в одноразовый плотно завинчивающийся пластиковый контейнер. Допускается хранение бронхоальвеолярного лаважа / промывных вод бронхов до проведения предобработки: - при температуре от 2 до 8 °С - не более 1 суток; - при температуре от минус 24 до минус 16 °С - в течение года. Допускается однократное замораживание-оттаивание материала. Плазма крови Для получения плазмы взятие крови производят натощак из локтевой вены одноразовой иглой диаметром 0,8-1,1 мм в пробирку (специальную вакуумную систему) с ЭДТА в качестве антикоагулянта. Закрытую пробирку аккуратно переворачивают несколько раз для перемешивания с антикоагулянтом и хранят при температуре от 2 до 8 °С. Не позднее 6 ч с момента взятия крови пробирку с цельной кровью центрифугируют при 0,8-1,6 тыс д в течение 20 мин при комнатной температуре. Полученную плазму отбирают (не захватывая лейкоцитарное кольцо) в количестве не менее 0,5 мл отдельными наконечниками с фильтром в стерильные стр. 23 из 53 --- стр. 24 --- пробирки объемом 1,5-2 мл. Для экстракции РНК используют 50 мкл плазмы крови. Допускается хранение образцов плазмы крови до проведения ПЦР-исследования: - при температуре от 2 до 8 °С - в течение 3 суток; - при температуре от минус 24 до минус 16 °С - в течение года; - при температуре не выше минус 68 °С - длительно. Допускается однократное замораживание-оттаивание материала. Фекальный / ректальный мазок Фекальный мазок собирается из подгузника или с поверхности одноразового пакета, положенного в горшок или судно. Зонд из полипропилена с вискозным тампоном погружают до конца вискозного тампона в пробу фекалий, выдерживают до пропитывания, после чего вискозный тампон отламывают в пробирку с 0,5 мл транспортной среды (физиологического раствора или фосфатного буфера), придерживая его крышкой пробирки, и герметично закрывают пробирку. Ректальный мазок Для взятия ректального мазка зонд из полипропилена с вискозным тампоном вводят в прямую кишку на глубину 2 см, производят вращательное движение и извлекают. Вискозный тампон отламывают в пробирку с 0,5 мл транспортной среды (физиологического раствора или фосфатного буфера), придерживая его крышкой пробирки, и герметично закрывают пробирку. Допускается хранение фекальных / ректальных мазков до проведения предобработки: - при температуре от 2 до 8 °С - не более 1 суток; - при температуре от минус 24 до минус 16 °С - в течение года. Допускается однократное замораживание-оттаивание материала. Аутопсийный материал Образцы помещают в стерильные одноразовые контейнеры и исследуют в течение 1 ч, либо замораживают сразу после взятия. Для проведения ПЦР-исследования проводят предобработку образцов. Допускается хранение аутопсийного материала до стр. 24 из 53 --- стр. 32 --- СОСТАВ набору реагентов, краткое руководство к набору реагентов - на бумажном носителе или на сайте Изготовителя (www.amplisens.ru). стр. 32 из 53 --- стр. 33 --- ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ ПЦР-исследование состоит из следующих этапов: - экстракция РНК из исследуемых образцов, - обратная транскрипция РНК и амплификация кДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени», - анализ и интерпретация результатов. ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ ВНИМАНИЕ! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку RNase-free, DNase-free. Для экстракции РНК используют комплекты реагентов: - «РИБО-преп» вариант 100, в соответствии с Приложением 1; - «МАГНО-сорб» вариант 100 и вариант 100М, в соответствии с Приложением 2. ВНИМАНИЕ! В случае использования формы 4 экстракцию необходимо проводить в соответствии с Приложением 1 или Приложением 2. При использовании комплекта реагентов «МАГНО-сорб» (РУ № ФСР 2010/07265) раствор для отмывки 5 не используется. Каждая индивидуальная постановка должна сопровождаться постановкой двух контролей: отрицательного контроля экстракции (ОК) и положительного контроля экстракции (ПК). В качестве ОК используют 100 мкл ОКО, в качестве ПК - 10 мкл ПКО SARS-CoV-2, добавленные к 90 мкл ОКО. Экстракция РНК/ДНК из каждого исследуемого образца и контролей проводится в присутствии внутреннего контрольного образца - BKO-FL. ВНИМАНИЕ! ОТ-ПЦР рекомендуется проводить сразу после получения проб РНК. Допускается хранение проб РНК при температуре от 2 до 8 °С не более 30 мин, при температуре от минус 24 до минус 16 °С - не более недели и при температуре не выше минус 68 °С - до года. Допускается однократное замораживание-оттаивание проб РНК. стр. 33 из 53 --- стр. 34 --- ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ И АМПЛИФИКАЦИЯ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» ВНИМАНИЕ! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку RNase-free, DNase-free. Выбор пробирок для проведения ОТ-ПЦР зависит от используемого амплификатора с системой детекции в режиме «реального времени». Для внесения в пробирки реагентов, проб РНК и контрольных образцов используются одноразовые наконечники с фильтрами. А. Подготовка проб для ОТ-ПЦР Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, включая объем пробы РНК - 10 мкл. 1. Рассчитать количество каждого реагента, требующееся для приготовления реакционной смеси. На одну реакцию требуется 10 мкл ПЦР-смеси-FL SARS-CoV-2, 5 мкл ПЦР- буфера-С, 0,5 мкл полимеразы (TaqF), 0,25 мкл ревертазы-Н и 0,25 мкл RT-G-mix-2. Смесь готовить на общее число исследуемых и контрольных образцов (количество контрольных образцов см. в п. 7) плюс запас на одну реакцию. ВНИМАНИЕ! Компоненты реакционной смеси следует смешивать непосредственно перед проведением ПЦР-исследования. 2. Разморозить пробирку с ПЦР-смесью-FL SARS-CoV-2. Перемешать содержимое всех реагентов ПЦР-комплекта, осадить капли на вортексе. 3. В отдельной пробирке подготовить реакционную смесь. Смешать необходимое количество ПЦР-смеси-FL SARS- CoV-2, ПЦР-буфера-С, полимеразы (TaqF), ревертазы-Н и RT-G-mix-2, осадить капли на вортексе. 4. Отобрать необходимое количество пробирок или стрипов для ОТ-ПЦР исследуемых и контрольных проб. 5. Внести в каждую пробирку по 15 мкл приготовленной реакционной смеси. Неиспользованные остатки реакционной смеси выбросить. 6. В подготовленные пробирки внести по 10 мкл проб РНК, стр. 34 из 53 --- стр. 35 --- ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ полученных в результате экстракции из исследуемых образцов. ВНИМАНИЕ! При добавлении проб РНК, экстрагированных с помощью комплектов реагентов для проведения экстракции методом магнитной сепарации, необходимо избегать попадания сорбента в реакционную смесь. 7. Поставить контрольные реакции: а) положительный контроль экстракции (ПК) - в пробирку с реакционной смесью внести 10 мкл пробы, экстрагированной из ПКО. б) отрицательный контроль экстракции (ОК) - в пробирку с реакционной смесью внести 10 мкл пробы, экстрагированной из ОКО. ВНИМАНИЕ! При получении новой серии набора реагентов необходима постановка положительного и отрицательного контролей ОТ-ПЦР (К+, К-). Постановка К+ рекомендуется для проверки работы амплификаторов и в других случаях внутрилабораторного контроля. Для этого в пробирку с реакционной смесью внести 10 мкл К+ 8АР5-СоУ-2. При подозрении на возможную контаминацию в лаборатории необходима постановка К-. Для этого в пробирку с реакционной смесью внести 10 мкл К-. ВНИМАНИЕ! Содержимое пробирок необходимо тщательно перемешать пипетированием, не допуская появления пузырьков воздуха. ВНИМАНИЕ! Провести ОТ-ПЦР сразу после соединения реакционной смеси с РНК-пробами и контролями. Б. Проведение ОТ-ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» 1. Запрограммировать амплификатор с системой детекции в режиме «реального времени» для выполнения соответствующей программы амплификации и детекции флуоресцентного сигнала (см. табл. 9). стр. 35 из 53 --- стр. 40 --- ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ который обозначают как контроль качества количественного исследования (ККИ). Концентрация, полученная для образца ККИ, должна укладываться в диапазон, указанный во вкладыше к набору реагентов. Контроль качества количественного исследования может быть также проведен с использованием панели контрольных образцов «SARS-CoV-2», содержащих РНК SARS-CoV-2 и охарактеризованных количественно, производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (предоставляется по запросу). Возможные ошибки: 1. Для положительного контроля ОТ-ПЦР (К+) значение порогового цикла (Ct) по любому из указанных каналов для флуорофоров (см. табл. 13) отсутствует или превышает граничное значение. Необходимо повторить амплификацию и детекцию для всех образцов, в которых не обнаружена специфическая РНК. 2. Для положительного контроля экстракции (ПК) значение порогового цикла (Ct) по каналам для флуорофоров РАМ и/или JOE отсутствует или превышает граничное значение. Необходимо повторить ПЦР-исследование, начиная с этапа экстракции РНК, для всех образцов. 3. Для отрицательного контроля экстракции (ОК) по каналу для флуорофора JOE определено значение порогового цикла (Ct). Вероятна контаминация лаборатории продуктами амплификации или контаминация реагентов или исследуемых образцов на каком-либо этапе ПЦР- исследования. Необходимо предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации и повторить ПЦР- исследование для всех образцов, в которых обнаружена специфическая РНК, начиная с этапа экстракции РНК. 4. Для отрицательного контроля ОТ-ПЦР (К-) по каналам для флуорофоров РАМ и/или JOE определено значение порогового цикла (Ct). Вероятна контаминация лаборатории продуктами амплификации или контаминация реагентов, исследуемых образцов на каком-либо этапе ПЦР- исследования. Необходимо предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации и повторить амплификацию и детекцию для всех образцов, в которых стр. 40 из 53 --- стр. 41 --- ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ обнаружена специфическая РНК. 5. Для исследуемого образца определено значение порогового цикла, при этом на графике флуоресценции отсутствует участок характерного экспоненциального подъема (график представляет собой приблизительно прямую линию). Необходимо проверить правильность выбранного уровня пороговой линии или параметров расчета базовой линии. Если результат получен при правильном уровне пороговой линии (базовой линии), требуется повторно провести амплификацию и детекцию для этого образца. стр. 41 из 53 --- стр. 42 --- СРОК годности. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ и ХРАНЕНИЯ Срок годности. 12 мес. Набор реагентов с истекшим сроком годности применению не подлежит. Срок годности вскрытых реагентов соответствует сроку годности, указанному на этикетках для невскрытых реагентов, если в инструкции не указано иное. Транспортирование. Набор реагентов транспортировать при температуре от 2 до 8 °С не более 5 сут в термоконтейнерах, содержащих хладоэлементы, всеми видами крытых транспортных средств. Хранение. Форма 1. «РИБО-преп» вариант 100 хранить в холодильной камере при температуре от 2 до 8 °С. «ПЦР-комплект» вариант РРТ-100 Р хранить в холодильной камере при температуре от 2 до 8 °С. ПЦР-смесь-Р1 8АР8-Со\/-2, ПЦР-буфер-С, полимеразу (ТарР), ревертазу-Н, РТ-С-т1х-2 хранить в морозильной камере при температуре от минус 24 до минус 16 °С. ПЦР-смесь-Р1 8АР8-Со\/-2 хранить в защищенном от света месте. Форма 2. «МАГНО-сорб» вариант 100 хранить при температуре от 2 до 25 °С. «ПЦР-комплект» вариант РРТ-100 Р хранить в холодильной камере при температуре от 2 до 8 °С. ПЦР-смесь- Р18АР8-Со\/-2, ПЦР-буфер-С, полимеразу (ТарР), ревертазу-Н, РТ-С-т1х-2 хранить в морозильной камере при температуре от минус 24 до минус 16 °С. ПЦР-смесь-Р1 8АР8-Со\/-2 хранить в защищенном от света месте. Форма 3. «МАГНО-сорб» вариант 100М хранить при температуре от 2 до 25 °С. «ПЦР-комплект» вариант РРТ-ЮОМ Р хранить в холодильной камере при температуре от 2 до 8 °С. ПЦР-смесь-РБ 8АР8-Со\/-2, ПЦР-буфер-С, полимеразу (ТадР), ревертазу-Н, РТ-С-т1х-2 хранить в морозильной камере при температуре от минус 24 до минус 16 °С. ПЦР-смесь-РГ 8АР8- СоУ-2 хранить в защищенном от света месте. Форма 4. «ПЦР-комплект» вариант РРТ-100 Р хранить в холодильной камере при температуре от 2 до 8 °С. ПЦР-смесь- FL 8АР8-Со\/-2, ПЦР-буфер-С, полимеразу (ТадР), ревертазу-Н, КТ-С-т1х-2 хранить в морозильной камере при температуре от минус 24 до минус 16 °С. ПЦР-смесь-РГ 8АР8- СоУ-2 хранить в защищенном от света месте. Холодильные и морозильные камеры должны обеспечивать регламентированный температурный режим. стр. 42 из 53 --- стр. 43 --- г а р а н т и й н ы е о б я з а т е л ь с т в а и з г о т о в и т е л я Изготовитель гарантирует соответствие основных параметров и характеристик набора реагентов требованиям, указанным в технической и эксплуатационной документации, в течение указанного срока годности при соблюдении всех условий транспортирования, хранения и применения. Медицинское изделие техническому обслуживанию и ремонту не подлежит. Рекламации на качество набора реагентов направлять по адресу 111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, дом ЗА, e-mail: obtk@pcr.ru^. При выявлении побочных действий, не указанных в инструкции по применению набора реагентов, нежелательных реакций при его использовании, фактов и обстоятельств, создающих угрозу жизни и здоровью граждан и медицинских работников при применении набора реагентов, рекомендуется направить сообщение по адресу, указанному выше, и в уполномоченную государственную регулирующую организацию (в РФ - Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения) в соответствии с действующим законодательством. ® Отзывы и предложения о продукции «АмплиСенс» вы можете оставить, заполнив анкету потребителя на сайте: www.amplisens.ru . стр. 43 из 53 --- стр. 44 --- ПЕРЕЧЕНЬ ПРИМЕНЯЕМЫХ НАЦИОНАЛЬНЫХ СТАНДАРТОВ - ГОСТ ISO 14971-2021 «Изделия медицинские. Применение менеджмента риска к медицинским изделиям». - ГОСТ Р ИСО 15223-1-2020 «Изделия медицинские. Символы, применяемые при маркировании медицинских изделий, на этикетках и в сопроводительной документации». - ГОСТ Р ИСО 23640-2015 «Изделия медицинские для диагностики in vitro. Оценка стабильности реагентов для диагностики in vitro». - ГОСТ Р 51088-2013 «Медицинские изделия для диагностики ин витро. Реагенты, наборы реагентов, тест-системы, контрольные материалы, питательные среды. Требования к изделиям и поддерживающей документации» (пп. 5.2.1,6.1.3, 6.2, 6.3.2-6.3.5, 6.3.12, 9, 13.2). - ГОСТ 15.309-98 «Система разработки и постановки продукции на производство. Испытания и приемка выпускаемой продукции. Основные положения» (п. 6). - ГОСТ ISO 17511-2011 «Изделия медицинские для диагностики in vitro. Измерение величин в биологических пробах. Метрологическая прослеживаемость значений, приписанных калибраторам и контрольным материалам». - ГОСТ 14192-96 «Маркировка грузов» (п. 4.1). - СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней». - СанПиН 2.1.3684-21 «Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий». СТр. 44 из 53 --- стр. 45 --- БИБЛИОГРАФИЯ 1. Prospective study comparing deep-throat saliva with other respiratory tract specimens in the diagnosis of novel coronavirus disease (COVID-19) / C.K.C. Lai, Z. Chen, G. Lui et al. // J Infect Dis. - 2020. - 222(10). - P. 1612-1619. doi: 10.1093/infdis/jiaa487. 2. Viral RNA Load in Mildly Symptomatic and Asymptomatic Children with COVID-19, Seoul, South Korea / M. S. Han, M.-W. Seong, N. Kim et al. // Emerg Infect Dis. - 2020. - 26(10). - P. 2497-2499. doi: 10.3201/eid2610.202449. стр. 45 ИЗ 53