Набор реагентов для выявления ДНК возбудителей чумы, сибирской язвы и туляремии методом ПЦР в режиме реального времени "MULTI-FLU" по ТУ 9398-157-78095326-2012 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 ---
i
' !
4
УТВЕРЖДЕНА
Приказом Росздравнадзора
«УТВЕРЖДАЮ»
Директор
от 20 г. № Д.М.Н.,
спотребнадзора
1с: ‘Л с= .\д4^ 9i\*.
Ч -Я '■
J S . £ {
Ф М
ИНСТРУКЦИЯ
п о ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ
ДНК ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЧУМЫ, СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ И ТУЛЯРЕМИИ МЕТОДОМ
ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛБНОГО ВРЕМЕНИ
«MULTI-FLU»
иНАЗНАЧЕНИЕ
1.1. Набор реагентов «MULTI-FLU» предназначен для выявления ДНК возбудителей
чумы, сибирской язвы и туляремии в биологическом материале и объектах окружающей
среды методом ПЦР (полимеразной цепной реакции) в режиме реального времени.
1.2. Область применения набора реагентов - клиническая лабораторная диагностика,
эпидемиологический мониторинг.
2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА
2.1. Принцип действия
Обнаружение фрагментов нуклеиновых кислот возбудителей инфекций основано на
использовании метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. В основе
этого метода лежит изменение сигнала флуоресценции в ходе реакции. Это изменение
происходит благодаря использованию специфического для искомой ДНК
олигонуклеотидного зонда, меченого флуоресцентной меткой, который, подобно праймеру, в
ходе реакции комплементарно связывается с одной из цепей ампликона.
При амплификации используют одновременно восемь олигонуклеотидных праймеров,
комплементарных фрагменту ДНК гена метилтрансферазы Y . p estis, фрагменту ДНК гена
элемента вставки ISFtuS F. tularensis, фрагменту ДНК гена sspE хромосомы В. an thracis, а
также ДНК внутреннего положительного контроля и четыре флуоресцентных зонда. Процесс
амплификации специфичных фрагментов заключается в повторении циклов температурной
денатурации ДНК, отжиге праймеров и зондов и последующей достройке полинуклеотид-
--- стр. 2 ---
ных цепей с этих праймеров ДНК-полимеразой с детекцией результатов по изменению
флуоресценции в режиме реального времени.
2.2. Состав набора
Набор реагентов состоит из 7 пробирок с реагентами для проведения полимеразной
цепной реакции в режиме реального времени.
Набор реагентов для проведения ПЦР в режиме реального времени.
Набор рассчитан на 100 определений.
№ Состав набора Описание Объем Кол-во
1. Реакционная смесь, PC прозрачная бесцветная
жидкость 550 мкл 4 пробирки
2. Фермент, Taq ДНК-полимераза прозрачная бесцветная
жидкость
55 мкл 1 пробирка
3.
Положительный контрольный
образец ДНК Y . p estis, F. tularensis
и В. an th racis, ПКО
прозрачная бесцветная
жидкость
100 мкл 1 пробирка
4. Отрицательный контрольный
образец, ОКО
прозрачная бесцветная
жидкость
200 мкл 1 пробирка4
3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА
3.1. Диагностическая чувствительность (доля правильных положительных результа
тов) - не менее 85 %. Набор реагентов должен выявлять ДНК каждого возбудителя - Yersinia
p estis, B acillu s an th racis и F r a n c is e lla tularensis в концентрации 1 хЮ'* м.к./мл каждого воз
будителя.
3.2. Диагностическая специфичность (доля правильных отрицательных результатов) -
не менее 90 %.
4, МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
4.1. Потенциальный риск применения набора реагентов - класс 3 (Приказ М3 РФ №
4н от 06.06.2012 г).
4.2. Работу проводят в соответствии с санитарными правилами СП 1.3. 1285 - 03
«Безопасность работы с микроорганизмами I-I1 групп патогенности», МУ 1.3.2569-09 «Орга
низация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот
при работе с материалом, содержащим микроорганизмы 1-1V групп патогенности».
4.3. Уничтожение использованных наборов реагентов, а также наборов с истекшим
сроком годности проводить сжиганием.
5. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ
5Л. Для проведения ПЦР в режиме реального времени требуется:
настольный бокс с бактерицидной лампой (например «Циклотемп»
СП «РТС») или стерильный ламинарный шкаф;
--- стр. 3 ---
24
4
- микроцентрифуга-вортекс;
- микроцентрифуга для стрипов;
- амплификатор для ПЦР-РВ;
- одноразовые полипропиленовые пробирки на 0,2, 0,5 и 1,5 мл;
- одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером
до 10 мкл;
- одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером
до 200 мкл;
- отдельный набор автоматических пипеток для постановки ПЦР в режиме реального
аремени переменного объема;
- отделъный халат и одноразовые резиновые перчатки;
- штативы для наконечников, микропробирок на 0,2 и 1,5 мл;
- холодильник на 2-8 “С и на минус 20 °С;
- емкость для сброса наконечников;
- комплект средств для обработки рабочего места.
4
6. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ
Материалом для исследования служат; суспензии культур исследуемых микробов или
подозрительных изолятов; кровь, мокрота, промывные воды бронхов, мазок из носоглотки,
пунктаты бубона, отделяемое язв; органы грызунов, зайцеобразных, насекомоядных и назем
ных хищников; эктопаразиты (блохи, клещи, комары); почва, остатки пищи из гнезд хищных
птиц, их погадки, экскременты грызунов и хищников, вода открытых водоемов.
Материал для исследования забирают в стерильные емкости с герметично завинчи
вающимися крышками в соответствии с требованиями СП 1.3. 1285 - 03 «Безопасность рабо
ты с микроорганизмами I-I1 групп патогенности», МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транс
портирования биоматериалов в микробиологические лаборатории», МУ 1.3.2569-09 «Орга
низация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот
при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности», СП
1.2.036. - 95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов 1-
IV групп патогенности».
Транспортирование материала в лабораторию для исследований проводят при темпе
ратуре от плюс 2 до плюс 8 °С в течение 1 суток в соответствии с СП 1.2.036. - 95 «Порядок
учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности».
После проведения предварительной обработки проб допускается их транспортировка при
температуре от минус 16 до минус 20 °С в течение 7 суток или в сосуде Дьюара с жидким
азотом - длительно.
--- стр. 4 ---
I
6.1. Чистые культуры микроорганизмов
Из культур чумного, сибиреязвенного, туляремийного микроба или подозрительных
изолятов готовят суспензии в 2 мл 0,9 % раствора натрия хлористого по отраслевому стан
дартному образцу мутности 10 единиц ГИСК им. Л. А. Тарасевича (ОСО 42-28-59-86П), что
соответствует 1x10^ м.к./мл для Y . pestis и В. anthracis и 5x10^ м.к./мл - для F. tularensis.
Затем проводят 10-кратные разведения подготовленных суспензий в 0,9% растворе натрия
хлористого до конечной концентрации 1x10^ - 1x10^ м.к./мл. ДНК выделяют из 100 мкл сус
пензии.
6.2. Кровь
Кровь у людей берут из локтевой вены в количестве 4,5 мл с помощью одноразовой
иглы (диаметр 0,8-1,1 мм) и специальной вакуумной системы типа «Vacuett» с ЭДТА или
цитратом натрия, или стерильным шприцем в стерильные стеклянные или пластиковые про
бирки с цитратом натрия (3,8 % раствор цитрата натрия в соотношении 1:9). Аккуратно пе
ремешивают покачиванием до полного смешивания с антикоагулянтом. Вносят 1,5 мл в мик
ропробирку и центрифугируют при 800об/мин (380 g при диаметре ротора 50 мм) в течение
10 минут; затем верхний слой плазмы (500-600 мкл) с лейкоцитами переносят во другую
микропробирку и центрифугируют при 8000 g в течение 5 минут. Надосадочную жидкость
(за исключением 200 мкл жидкости над осадком клеток) удаляют, а осадок клеток и 200 мкл
надосадочной жидкости используют для обеззараживания материала и выделения ДНК.
6.3. Мокрота
Мокроту забирают в количестве не менее 1,0 мл в одноразовые градуированные сте
рильные флаконы с широким горлом и завинчивающимися крышками объемом не менее 50
мл. Для разжижения мокроты применяют либо приготовленную ех tempore смесь NALC (N-
ацетил-Ь-цистеина 0,25 г, 25 мл 4 % раствора NaOH, 25 мл 0,1 моль тризамещенного натрия
цитрата), либо раствор «Муколизин» (Na 2HP04 0,0774 моль, NaH 2P04 0,0226 моль, (3-
меркаптоэтанол 0,094 моль, 5 % азид натрия в конечной концентрации 0,05 %). Пробу объе
мом 1-2 мл смешивают либо с равным объемом смеси NALC, либо с пятикратным объемом
раствора «Муколизин». Пробы со смесью NALC перемешивают покачиванием в течение 20-
30 с и инкубируют в течение 15 мин, периодически встряхивая. Затем разводят фосфатным
буфером 0,067 моль (pH 6,8) до конечного объема 50 мл. Пробу центрифугируют в течение
10 мин при 9000 об/мин. Осадок ресуспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлористо
го. Пробы с раствором «Муколизин» перемешивают покачиванием в течение 20-30 с и инку
бируют в течение 20-30 мин, периодически встряхивая. Затем отбирают 1 мл разжиженной
мокроты, помещают в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с завинчивающейся
крышкой и центрифугируют при 9000 об/мин в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют в
--- стр. 5 ---
100 мкл 0,9 % раствора натрия хлористого. Затем выполняют этапы обеззараживания мате
риала и выделения ДНК.
6.4. Промывные воды бронхов
Для получения промывных вод бронхов при бронхоскопии вводят до 7 мл стерильно
го 0,9 % раствора натрия хлорида. После чего 2-3 мл лаважной жидкости отбирают в сте
рильную пробирку. Из пробы отбирают 1 мл и помещают в микроцентрифужную пробирку
объемом 1,5 мл е завинчивающейся крышкой, центрифугируют при 12000 об/мин в течение
10 мин. Оеадок рееуспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлористого. Затем выпол
няют этапы обеззараживания материала и выделения ДНК.
6.5. Мазок из носоглотки
Взятие мазка из ноеоглотки проводят натощак или не ранее, чем через 2-4 чаеа после
еды. Корень языка придавливают шпателем, материал берут етерильным зондом, не касаясь
языка, слизистой полости рта, зубов, и помещают в пробирку с транспортной средой или 0,9
% раствором натрия хлористого объемом 100 мкл. Затем выполняют этапы обеззараживания
материала и выделения ДНК.
6.6. Пунктаты бубона, отделяемое язв
Забор материала язвы или бубона производят етерилънъш шприцем. Если бубон име
ет сохранившуюся кожу (невскрывшийся бубон), то ее протирают предварительно спиртом.
Пункцию бубона производят как в его центре, так и на периферии. Из векрывшегося бубона
материал забирают в местах с сохраненной тканью, а также берут отделяемое бубона. Иееле-
дуемый материал в количестве не менее 100 мкл помещают в микроцентрифужную пробирку
объемом 1,5 мл с транепортной ередой или 0,9 % раетвором натрия хлориетого объемом 100
мкл. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и выделения ДНК.
6.7. Пробы органов лабораторных и диких животных
Органы лабораторных и диких животных отбирают при векрытии, соблюдая регла
ментированные меры безопасности. Кусочки органов массой до 10 г растирают в стерильной
ступке со стеклянным порошком, после чего добавляют 0,9 % раствор натрия хлорида в со
отношении 1:5 (вес/объем). Надосадочную жидкоеть отбирают с помощью пипетки через
ватный тампон в отдельную пробирку. Центрифугируют в течение 10 мин при 12000 об/мин.
Осадок рееуспендируют в 100 мкл 0,9 % раетвора натрия хлориетого. Затем выполняют эта
пы обеззараживания материала и выделения ДНК.
6.8. Пробы эктопаразитов (клещи, комары, блохи).
Клещей, блох и комаров обрабатывают эфиром до обездвижения, нанося каплю эфира
на ватно-марлевую пробку. Поеле определения вида и пола материал может быть объединен
--- стр. 8 ---
бирают 1,0 мл в микроцентрифужные пробирки с завинчивающейся крышкой объемом 1,5
мл и центрифугируют при 12000 в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют в 100 мкл 0,9 %
раствора натрия хлористого. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и выделе
ния ДНК.
6.11. Обеззараживание материала
Подготовленные для исследования пробы обеззараживают в соответствии с МУ
1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нук
леиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы 1-1V групп пато
генности».
Дополнительно к исследуемым образцам готовят отрицательный контроль выделения
(ОКО-В). Для этого в отдельную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл вносят 100
мкл воды или ТЕ-буфера.
К исследуемым образцам и ОКО-В добавляют натрия мертиолят до концентрации
1:10000 (0,01%) с последующим прогреванием их при (56±1) °С в течение 30 минут. Затем к
100 мкл образцов и ОКО-В, обработанных мертиолятом натрия и разлитых в микроцентри
фужные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют лизирующий буфер на основе 6 моль гуаниди-
низотиоцианата в объеме, указанном в инструкции к набору для выделения ДНК, и инкуби
руют 15 минут при температуре (65±1) °С. После выполнения данного этапа материал счи
тается обеззараженным.
Обработка исследуемого материала, инфицированного (подозрительного на инфици
рование) бактериями 11-IV групп патогенности, образующими споры, проводится следую
щим способом;
Исследуемый материал в количестве 0,1 мл засевают в пробирки с 0,9 мл бульона
Хоттингера, pH 7,2 и инкубируют с аэрацией при 37 в течение 2,5 ч. Добавляют пеницил
лин до конечной концентрации 1000 ед/мл и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин. После
инкубации с пенициллином, исследуемый материал прогревают на водяной бане в течение
10 мин. при температуре 100 *^С. Затем 100 мкл обработанного образца переносят в про
бирки объемом 1,5 мл и добавляют лизирующий раствор, приготовленный на основе 6 М
гуанидинтиоизоцианата в объеме, указанном в инструкции по применению к набору реаген
тов, и инкубируют 15 мин при 65 С. После выполнения данных процедур материал считает
ся обеззараженным.
6.12. Выделение ДНК
Выделение ДНК из проб, содержащих (подозрительных на содержание) возбудителей
К pestis, F. tularensis и В. anthracis, для анализа методом ПЦР в режиме реального времени
8
--- стр. 9 ---
проводят в соответствии с методическими указаниями «Организация работы лабораторий,
использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содер
жащим микроорганизмы I-IV групп патогенности. МУ 1.3.2569-09» в условиях, предусмат
ривающих работу с возбудителями оеобо опасных инфекционных заболеваний согласно СП
1.3.1285-03.
Для выделения ДНК из биологического материала и объектов окружающей среды ис
пользуют сертифицированные коммерческие наборы, например набор реагентов серии
«ДНК-экстран» для выделения ДНК из крови, тканей и культур клеток (кат. номер ЕХ-509,
ЕХ-511 и ЕХ-512, фирма «Синтол» Россия), набор реагентов для выделения ДНК из объектов
окружающей среды «М-Сорб_ООМ» (кат. номер ООМ-502, фирма «Синтол», Россия), набо
ры Диа-сорб, Рибо-сорб фирмы «Интерлабсервис» или аналогичные. Работу проводят в со
ответствии с инструкциями к наборам, начиная с этапа добавления нуклеосорбента.
Полученный препарат ДНК используется для проведения анализа с помощью набора
реагентов «MULTI-FLU».
7. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Анализ с помощью набора реагентов состоит из двух этапов:
- проведение ПЦР в режиме реального времени;
- учет результатов анализа.
В каждую постановку обязательно включают положительный (ПКО), отрицательный
(ОКО) контрольные образцы и отрицательный контрольный образец выделения (ОКО-В).
7Л. Подготовка к проведению реакции ПЦР в режиме реального времени.
7.1.1. Взять необходимое количество пробирок для амплификации из расчета N+3, где N-
количество исследуемых образцов. Поместить пробирки в щтатив. Маркировать
пробирки в соответствии с протоколом исследования. Для приборов, производящих
измерение через крышку пробирки, маркировку наносить на стенку пробирки; для
приборов, производящих измерение через стенку пробирки - на крышку.
7.1.2. Реакционную смесь разморозить, перемешать на встряхивателе и центрифугировать
3-5 секунд для сброса капель. Приготовить рабочую реакционную смесь из расчета:
20 мкл реакционной смеси, 0,5 мкл фермента - на каждую пробирку. Для N
количества исследуемых проб рабочая реакционная смесь составит: 20,5 * (N+3) мкл.
Перемешать на встряхивателе.
7.1.3. Внести в приготовленные ПЦР пробирки по 20 мкл приготовленной рабочей
реакционной смеси.
--- стр. 10 ---
q -
7.1.4. Положительный, калибровочные, отрицательные контрольные образцы ПЦР и
исследуемые образцы разморозить, перемешать на встряхивателе и центрифугировать
3-5 секунд для сброса капель.
7.1.5. Внести в пробирки (на стенку пробирок) по 5 мкл отрицательных контрольных
образцов (ОКО и ОКО-В), исследуемых образцов и, в последцюю очередь,
положительных контрольных образцов ДНК в соответствии с маркировкой, используя
наконечники с аэрозольным барьером, перемешать на встряхивателе и
центрифугировать.
Подготовленные микропробирки помепхают в амплификатор «CFX96» BIO-RAD.
7.2. Программирование амплификатора:
Для работы с прибором «CFX96» BIO-RAD используют программу Bio-Rad CFX
Manager.
• В открывшемся окне программы выбирают меню «В11е»/«Файл». Нажимают кнопку
«New»/«HoBbffl».
• Далее нажимают кнопку «Ехрептеп1»/«Эксперимент». Открывается окно, «Experiment
setup/« Установка эксперимента». На данном графическом интерфейсе, вьщелено три
кнопки «Рго1осо1»/«Протокол», «Р1а1е»/«Вкладка» «Start Кип»/«Старт». Далее открывают
вкладку «Protocol»/«Пpoтoкoл».
• Задают параметры эксперимента.
• Указывают объем реакционной смеси.
Hold/Удерж, температуры
Cycling/Циклирование
95 °С - 5 мин
62 °С - 40 с
95 °С- 15 с
Cycle repeats/Цикл повторить - 50 times/раз.
Флюоресценцию измеряют по каналу ROX, HEX, FAM, Су5.
Нажимают кнопку «ОК»/«Да».
Нажимают кнопку «Next»/«Дaлee».
Далее открывают вклaдкy«Plate»/«Bклaдкa»
Задают параметры расположения пробирок в меню «Plate», выбирают канал детекции
ROX, HEX, FAM, Су5, тип пробирок. Все пробы и контроли обозначают в меню Plate
как Unknown/Неизвестный.
Нажимают кнопку «Next»/«Дaлee».
10
--- стр. 11 ---
!2
Запускают амплификацию кнопкой «Start гип»/«Старт».
7.3. Регистрация результатов
Дают название эксперимента и сохраняют его на диске (в этом файле будут автомати
чески сохранены результаты данного эксперимента).
Регистрация результатов амплификации по каналам РАМ, HEX, ROX, Су5.
Нажимают в меню кнопку «Р11е»/«Файл», далее кнопку «Ореп»/Открыть, далее кнопку
«Data file» выбирают протокол анализа.
В таблице результатов регистрируют значения Ct.
8. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ
Результаты анализа не подлежат учету:
— в случае регистрации прибором ОКО по каналам ЕАМ, HEX и ROX;
— в случае отсутствия регистрации прибором ОКО и ОКО-В по каналу Су5;
Результаты анализа подлежат учету:
— в случае отсутствия регистрации прибором ОКО по каналам ЕАМ, HEX и ROX;
— в случае регистрации прибором ОКО и ОКО-В по каналу Су5;
— в случае регистрации прибором ПКО по каналам ЕАМ, HEX и ROX .
Регистрация ОКО и ОКО-В по каналу Су5 свидетельствует о выделении ДНК в про
цессе пробоподготовки и отсутствии ингибиторов ПЦР.
Образец считается положительным на присутствие специфических фрагментов ге
номной ДНК В. anthracis , если зарегистрирован рост флуоресценции по каналу ЕАМ (зонда,
специфичного для фрагмента ДНК гена sspE хромосомы В. anthracis), а значение порогового
цикла меньше 50, и отрицательным, если автоматически значение порогового цикла не опре
делено.
Образец считается положительным на присутствие специфических фрагментов ге
номной ДНК F. tularensis , если зарегистрирован рост флуоресценции по каналу HEX (зон
да, специфичного для фрагмента ДНК гена элемента вставки ISFtuS F. tularensis), а значение
порогового цикла меньше 50, и отрицательным, если автоматически значение порогового
цикла не определено.
Образец считается положительным на присутствие специфических фрагментов ге
номной ДНК Y . pestis, если зарегистрирован рост флуоресценции по каналу ROX (зонда,
специфичного для фрагмента ДНК гена метилтрансферазы Y . pestis), а значение порогового
цикла меньше 50, и отрицательным, если автоматически значение порогового цикла не опре
делено.
11