Набор реагентов для выявления ДНК возбудителя чумы методом полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени (ГенПест - индикация - РГФ) по ТУ 9398-050-01898109-2014 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 ---
ни «Микроб»
в В.В.
20{^'.Г'Я .ч Ь ' '— =
ИНСТРУКЦИИ _________
по ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОЙ ДЛЯ ЕвЫЯВЛЕНИЯ
ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
С УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
(ГЕНПЕСТ ~ ИНДИКАЦИЯ - РГФ)
1. НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов для выявления ДНК возбудителя чумы методом полимеразной
цепной реакции с учеюм результатов в режиме реальншо времени (ГенИест - индикация
- РГФ), далее - набор реагентов «ГенПест - индикация - РГФ», предназначен для
выявления ДНК чумного микроба в пробах клинического, биологического материала и
объектов окружающей среды методом полимеразной цепной реакции с учетом
результатов в режиме реального времени.
2. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Область применения набора - клиническая лабораторная диагностика,
ЭНИДСМИ0Л01 ический мониторинг. Набор pcaienroB может быть использован в
учреждениях, имеющих Лицензию на деятельность в области использования возбудителей
инфекционных заболеваний человека и животных J-iV групп патогсиносги.
стационарных и мобильных лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое
заключение на проведение работ с микроорганизмами 1-IV групп патогенности.
3. ТРЕБОВАНИЯ К ПЕРСОНАЛУ, УЧАСТВУЮЩЕМУ В ВЫПОЛНЕНИЙ
ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования Moiyi выполпя1ь специалисты не моложе 18 лет с высшим и
средним медицинским, биологическим или иным образованием, окончивщие
соответствующие курсы специальной подготовки с освоением меюдов безопасной
работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) I-II групп патогенности.
4. ПРИНЦИП МЕТОДА
Вынвлеиие ДНК возбудителя чумы методом полимеразной ценной реакции с
учетом результатов в режиме реального времени основано на амплификации фрагмента
l eiiayiltN Yersiniapestis с образованием флуоресценции по каналу FAM.
Проведение анализа включает два основных этапа: выделение ДНК из проб
клиническо1 'о материала, амплификация участка ДНК возбуди геля чумы па приборе типа
Rotor Gene и регистрация с помощью программного обеспечения кривых флуоресценции.
Амплификация фрагмента ДНК происходит в буферном растворе за счет
праймеров, комплементарных последовательности yihN гена чумного микроба,
олигонуклеотидпого зонда тина TaqMan с флуорссцептпыми метками FAM-RI QI. смеси
нуклеотидов (дНТФ), фермента Taq ДНК-полимеразы. Все компоненты, за исключением
фермента, содержаться в 11ЦР-смсси-1 и ПЦР-смеси-Р1'Ф. Образование флуоресцентного
сигнала происходит за счет освобождения флуоресцентных меток при расщеплении зонда
ферментом I'aq ДНК-нолимераза (5'-экзонуклеазная активность). С каждым циклом ПЦР
число свободных флуоресцентных меток экспоненциально возрастает, что приводит к
повышению уровня флуоресценции в пробирке.
--- стр. 2 ---
5. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА
Реактив Описание Объем
(мл)
Количество
ПЦР-смесь-1 Смесь праймеров, дНТФ и натрия азида,
сухая, в виде розоватого осадка; после
растворения - прозрачная бесцветная
жидкость
0,06 5 пробирок
ПЦР-смесь-
РГФ
прозрачная фиолетовая жидкость,
содержащая Грис-НС1; калия хлорид; магния
хлорид; Tween-20, глицерин
0,6 1 пробирка
Растворитель прозрачная бесцветная жидкость,
представляющая собой Н2О, свободную от
нуклеаз
0,6 1 пробирка
Taq ДНК-
полимсраза
прозрачная бесцветная жидкость,
представляющая собой фермент с
активностью 5 ед/мкл
0,012 I пробирка
ТЕ-буфер прозрачная бесцветная жидкость,
содержащая трис-НС1; Каг-ЭДТА
5,0 2 пробирки
ПКО ДНК Y.
peslis
препарат ДНК Y. pestis, сухой, в виде следа
от высушенной капли на дне пробирки; после
растворения - прозрачная бесцветная
жидкость
0,1 3 пробирки
Набор реагентов «ГенПест - индикация - РГФ» рассчитан на 60 определений с учетом
контрольных образцов.
6. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ*:
Наименование Основные характеристики или обозначения
документации, производитель
Амплификатор типа RotorGene Амплификатор «RotorGene 3000», «RotorGene
6000», «RotorGene Q», «Qiagen», Германия
Ламинарный бокс биологической
безопасности класс ИВ
Ламинарный бокс биологической
безопасности класс П БАВп-«Ламипар-С-1,2».
«Ламинарные системы», Россия
ГЩР-бокс Бокс абактсриалыюй воздушной среды для
работы с ДНК-пробами (ПЦР-бокс) при
проведении 1Ш,Р-диагностики БАВ-НЦР-
"Ламинар-С" «Ламинарные системы», Россия
М икроцснтрифуга-встряхиватель Микроцентрифуга-встряхиватель «ТЭТА-2».
«Биоком», Россия
Термостат твердотельный Термостат твердотельный от 25 до 100 °С.
Термо 24-15, «Биоком», Россия.
Микроцентрифуга настольная Микроцентрифуга на 13400 об/мин "Mini Spin"
"Eppendorf, Германия
Отсасыватель медицинский Отсасыватель медицинский "OM-l" ОАО
"Утес", Россия
Термостат твердотельный с функцией
охлаждения
термостат твердотельный с функцией
охлаждения от 4 до 120 *^С, «Биоком», Россия
Набор электронных или механических
дозаторов переменного объема
Набор электронных или механических
дозаторов переменного объема (0,5-10, 10-100
мкл, 100-1000 мкл), Eppendorf, Германия
--- стр. 3 ---
Штатив-подставка для дозаторов Штатив-подставка для дозаторов
универсальная на 5 дозаторов, «Хеликон»,
Россия
Штатив «рабочее место» для
микропробирок на 0,2 мл
1итагив «рабочее место» для микропробирок
на 0,2 мл, 10x20 мест, «Хеликон», Россия
Штатив «рабочее место» для
микропробирок на 1,5 мл
иПатив «рабочее место» для микронробирок
на 1,5 мл, 5x10 мест с увеличенным
расстоянием между лунками, «Хеликон»,
Россия
Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной
камерой не вьше минус 18°С
«А'1 'лант», Россия
Наконечники универсальные для
дозаторов переменного объемом с
аэрозольным барьером до 10 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Наконечники универсальные для
дозаторов переменного объемом с
аэрозольным барьером до 100 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Наконечники универсальные для
дозаторов переменного объемом с
аэрозольным барьером до 200 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Наконечники универсальные для
дозаторов переменного объемом с
аэрозольным барьером до 1000 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Микроцентрифужные пробирки объемом
1.5 мл
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с
плоской крышкой
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Одежда однора:ювая медицинская из
нетканого и полимерного материалов
РЗН 2013/668
Перчатки медицинские диагностические
одноразовые. Часть 1. Спецификация па
перчатки из каучукового латекса или
раствора
ГОСТ Р 52239-2004
* Примечание: допускается применение оборудования другого типа, по своим
характеристикам не уступающего рекомендуемому.
7. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ, ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ
НАБОРА
Транспортирование набора рсагеш ов «ГенПест - индикация - РГФ» осуществляют
всеми видами крытых транспортных средств в соответствии с требованиями ГОСТ 15150
и правилами, установленными для каждого вида транспорта. Условия трансноргирования
- при температуре от 2 до 8 не более 2 суток, при температуре от минус 16 до минус
20 °С - неограниченно.
Условия хранения компонентов набора реагентов «ГенПест - индикация - РГФ» -
ПЦР-смесь-Г ПЦР-смесь-РГФ, Растворитель, ГН-буфер, ПКО ДПК У. pestis при
температуре от плюс 2 до плюс 8 “С, Taq ДНК-полимераза - при температуре от минус 16
до минус 20 °С. Срок годности набора реагентов «ГенПест - индикация - РГФ» - 9
месяцев.
Условия эксплуатации набора реагентов «ГенПест - индикация - РГФ» - при
температуре от 18 до 25 ^С. Срок хранения сухих компонентов ПЦР-смесь-1 и ПКО ДНК
}’, pestis после растворения - 2 и 6 месяцев, соо гве rci венно.
--- стр. 4 ---
8. РГФ» с истекшим сроком
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Использование набора реагентов «ГенПест - индикация
годности недопустимо.
Работу проводят в соответствии с требованиями СП 1.3.3118 - 13 «Безопасность
работы с микроорганизмами 1-11 групп патогенности», МУ 1.3.2569 - 09 «Организация
работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при
рабо те с материалом, содержащим микроорганизмы 1-1V групп пато1енпос1и».
9. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ
Материалом для исследования служат:
- пробы чистых культур микроорганизмов: бактериальные суспензии культур чумного
микроба или подозрительных изолятов;
- пробы клинического материала: кровь, мокрота, мазки из зева, моча, пункшт из
бубона, отделяемое кожных элементов, фекалии, ликвор;
пробы биологического материала: органы животных; эктопаразиты (блохи, клещи),
остатки пищи из гнезд хищных птиц, их погадки, экскременты грызунов и хищников.
- пробы объектов окружающей среды: почва.
Материал для исследования забирают в стерильные емкости с герметично
завинчивающимися крыщками в соответствии с требованиями СП 1.3.3118 — 13
«Безопасность работы с микроорганизмами 1-11 групп патогенное] и», МУ 4.2.2039-05
«Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические
лаборатории». МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы
амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим
микроорганизмы 1-1V групп пато1 'енности».
Транспортирование материала в лабораторию для исследований проводят при
температуре о т плюс 2 до плюс 8 ^'С в течение 1 суток в соответствии с СП 1.2.036 - 95
«Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп
патогенности». После проведения предварительной обработки проб допускается их
транспортировка при температуре от минус 16 до минус 20 "С в течение 7 суток или в
сосуде Дьюара с жидким азотом - длительно.
С целью предотвращения повреждения ДНК-мищеней возможно использование
транспортной среды следующего состава: сахароза 0,218 моль, КП2РО4 0,0038 моль,
К2НРО4 0,0072 моль; БСА I %. При необходимости длительного хранения и (или)
|раиспортирования, при отсутствии низкотемпературных холодильников, используют
специальную транспортную среду ESP: саркозил 1 %; ЭДТА 0,05 моль; проназа Е 1 мг/мл.
Исследуемый материал может храниться в среде ESP при темперазуре от плюс 20 до плюс
30 '^С в темном месте до 10 дней.
9.1. Подготовка проб чистых культур микроорганизмов. Из культур чумного
микроба или подозрительных изолятов готовят суспензии в 2 мл 0,9 % раствора натрия
хлорисюго по отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц ФЕБУ «НЦЭСМП»
(ОСО 42-28-85-П (ЮМЕ)), что соответствует 1x10^ м.к./мл для 7. pestis. Затем проводят
10-кратные разведения подготовленных суспензий в 0,9 % растворе натрия хлористого до
конечной концентрации 1x10^ м.к./мл.
9.2. Подготовка проб клинического материала:
9.2.1. Кровь
Кровь у людей берут из локтевой вены в количестве 4,5 мл с помощью одноразовой
иглы (диаметр 0,8-1,1 мм) и специальной вакуумной системы типа «Vacuelt» с ЭДТА или
цитратом натрия, или стерильным щприцем в стерильные стеклянные или пластиковые
пробирки с цитратом натрия (3,8 % раствор цитрата натрия в соотношении 1.9).
Аккуратно перемешивают покачиванием до полного смешивания с антикоагулянтом.
Затем ВЫ Н0ЛНЯ101 этапы обеззараживания материала и выделения ДНК.
9.2.2. Мокрота
--- стр. 5 ---
Мокроту забирают в количестве не менее 1.0 мл в одноразовые градуировавшею
стерильные флаконы с широким горлом и завинчивающимися крышками объемом не
менее 50 мл. Для ра:?жижения мокр01’ы применяют либо нри1'отовленную ех tempore
смесь NALC (N-aцeтил-L-циcтeинa 0,25 г, 25 мл 4% раствора NaOH, 25 мл 0,1 моль
тризамещенного натрия цитрата), либо раствор «Муколизин» (Na2HP04 0,0774 моль,
NaH2P04 0,0226 моль, бета-МЭ 0,094 моль, 5 % азид натрия в конечной концентрации 0,05
%). Пробу объемом 1-2 мл смешивают либо с равным объемом смеси NALC, либо с
пятикратным объемом раствора «Муколизин». Пробы со смесью NALC перемешивают
покачиванием в течение 20-30 с и инкубируют в течение 15 мин, периодически
встряхивая. Затем разводят фосфатным буфером 0,067 моль (pH 6,8) до конечного объема
50 мл. Пробу центрифугируют в течение 10 мин при 9000 об/мин. Осадок ресуспендируют
в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлористого. Пробы с раствором «Муколизин»
перемешивают покачиванием в течение 20-30 с и инкубируют в течение 20 -j 0 мин .
периодически встряхивая. Затем отбирают 1 мл разжиженной мокроты, помещают в
микроцент'рифужную пробирку объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой и
центрифугируют при 9000 об/мин в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют в 100 мкл 0,9
% раствора натрия хлористого. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и
выделения ДНК.
9.2.3. Мазки из зева
Мазки берут сухими стерильными ватными тампонами на пластиковой основе
вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки
ротоглотки. После взятия материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном)
помещают в стерильную одноразовую пробирку со специальной транспортной средой
(например, № 2) и аккуратно обламывают пластиковый стержень на расстоянии не более
0,5 см от рабочей части, оставляя рабочую часть зонда с материалом в транспортной
среде, которую используют для выделения ДНК.
9.2.4. Моча
Мочу (первую утреннюю порцию) отбирают в количестве не менее 20 - 30 мл в
специальный сухой стерильный флакон. Переносят 1 мл мочи, используя наконечник с
фильтром, в стерильные одноразовые пробирки объемом 1,5 мл. Центрифугируют в
течение 10 минут при 10000 об/мии, полностью удаляют супернатант, не захватывая
осадок. К осадку добавляют транспортную среду до конечного объема 0,2 мл, тщательно
перемешивают еодержимое на вортексе.
9.2.5. Пунктах из бубона, отделяемое кожных элементов
Пунктат из бубона, отделяемое кожных элементов (язв, везикул, пустул, карбункулов)
берут щцрицем емкостью не менее 5 мл. Кожу на участке, намеченном для прокола,
обрабатывают 70° спиртом, а затем смазывают 5 % раствором йода и вновь прО1ира10т 70°
спиртом. Иглу вводят с таким расчетом, чтобы ее острие достигло центральной части бубона,
после чего, оттянув до отказа поршень, медиенно вытягивают иглу. После извлечения иглы из
бубона через нее набирают в шприц 0,5 мл стерильного питательного бульона (pH 7,2),
содержимое выливают в стерильную пробирку и закрывают’ стерильной резиновой пробкой.
Бульон можно набрать в шприц и до начала пункции. При вскрывшемся бубоне забирактт
материал отдельно из периферической плотной части и отделяемое свища. Обе порции
исследуют раздельно. При кожных поражениях иглу шприца вводят у края везикулы (пустулы)
и затем продвигают к середине. У карбункулов и язв пунктируют плотный край.
9.2.6. Фекалии
Фекалии отбирают в объеме 1 - 3 мл. Пробу отдельным наконечником с фильтром
или одноразовыми лопатками переносят в стерильный флакон. В микроцентрифужную
пробирку объемом 1.5 мл вносят 0,8 мл фосфатного буфера (или стерильного
изотонического раствора натрия хлористого), отдельным наконечником с фильтром (или
одноразовыми лопатками) вносят 0,1 мл фекалий и тщательно ресуспендируют на
вортексе до образования гомогенной суспензии.
--- стр. 7 ---
счепие 2-3 мин при 5000 об/мин, затем супернатант центрифугируют в течение 15 мин
фИ 12000 об/мин. Осадок суспендируют в 0,2-0,5 мл дистиллированной воды.
>,4, Подготовка проб из объекгов окружающей среды
>.4.1. Почва
Пробы почвы с мест вероятного обсеменения берут в количестве 20-30 г на глубине
Ю 15 см. Отобранные пробы почвы помещают в стерильные пробирки или в банки. К
юследуемому материалу добавляют 0.9 %-ный раствор натрия хлористого 1.10.
гщательно перемешивают в течение 15 мин, отстаивают в течение 10 мин для оседания
фуиных частиц. Падосадочную жидкость дробно центрифугируют: первоначально в
гечение 2-3 мин при 5000 об/мин, затем супернатант центрифугируют в течение 15 мин
1 фи 12000 об/мин. Осадок суснендируюг в 0,2-0,5 мл дисгиллировашюй воды.
10. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
ПЦР-анализ состоит из следующих этапов: обеззараживание материала, выделение
ДНК; амплификация, регистрация и учет результатов.
10.1. Обеззараживание мазериала:
Подготовленные для исследования пробы обеззараживают в соответствии с МУ
1.3.2569 - 09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации
нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп
пагогспносзи».
Дополнительно к исследуемым образцам готовят отрицательный контроль
шлдсления (ОКВ). Для этого в отдельную микроцегггрифужную пробирку обьемом 1,5 мл
вносят 100 мкл ТЕ-буфера.
К исследуемым образцам и ОКВ добавляю! пагрия мершолят до концентрации
1:10000 (0,01%) с последующим прогреванием их при (56±1) С в течение 30 минут.
Загсм к 100 мкл образцов, обработанных мертиолятом натрия и разлитых в
микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют лизирующий буфер на основе
6 моль гуанидинизотиоциапата в объеме, указанном в инструкции к набору для выделения
ДНК, и инкубируют 15 минут при температуре (65±1) ‘'С. После выполнения данного
этапа материал считается обеззараженным.
10.2. Выделение ДНК
Выделение ДНК осуществляют методом нуклеосорбции на силикагеле в
присутствии гуанидинтиоциапата с использованием коммерческих наборов «ДИК-сорб
в». «Рибо-преп» или аналогичных. Работу проводят в соответствии с инструкциями к
указанным наборам.
10.3. Проведение ПЦР - амплификации ДНК
10.3.1. Подготовка ПКО ДНК У . pestis
Перед началом работы готовят ПКО ДНК Г. pestis. Для этого в пробирку е сухим
ПКО добавляют 100 мкл растворителя, выдерживают при комнатной температуре в
течение 20-30 с, тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе в течение
5-7 с и центрифугируют ири 3000-5000 об/мин в течение 5-10 с для осаждения капель со
стенок пробирки. После растворения ПКО ДНК Г. pestis хранят при температуре минус
20 "С.
10.3.2. Подготовка реакционной смеси
Из холодильной камеры и;звлекают ПЦР-смесь-1, ПЦР-смесь-РГФ, ТЕ-буфер, i
морозильной камеры извлекают Taq ДПК-полимеразу и ПКО ДПК У . pestis. Пробирку с
ПКО ДНК Y. pestis полностью оттаивают. перемешивают на
--- стр. 8 ---
1икроиен фифуге/встряхивателе и центрифугируют при 3000-5000 об/мин в гечсиие 5-10
для осаждения капель со стенок пробирки.
Определяю!' количество реакций в эксперименте из расчете: количесгво
1 сследуемых проб, ОКВ, положительный контроль (К+) и отрицательный контроль (К-).
Отбирают необходимое количество пробирок «ПЦР-смесь-1» из расчета, что одна
(робирка рассчитана на 12 реакций. В пробирки добавляют 60 мкл Растворителя,
1 > 1 держивают при комнатной температуре в течение 20-30 с, тщательно перемешиваю!' па
шкроцентрифуге/встряхивателе в течение 5-7 с и центрифугируют при 3000-5000 об/мин
I течение 5-10 с для осаждения капель со стенок пробирки. Разведенную 1ЩР-смесь-1
:ранят при температуре плюс 4 “С не более 2 месяцев.
В отдельной микропробирке объемом 0,6 мл или 1,5 мл готовят реакционную смесь
!3 расчета, что на 1 реакцию необходимо:
Реагент Объем, мкл
ИЦР-смссь-1 5
ПЦР-смесь-РГФ 10
Taq ДНК-
полимераза 0,2
Подготовленную смесь
шкроцентрифуге/встряхивателе.
тщательно перемешивают на
0.3.3. Подготовка реакционных пробирок
Для проведения реакции в штатив отбирают необходимое количество
шкропробирок объемом 0,2 мл. Затем в пробирки вносят по 15 мкл подготовленной
)еакционной смеси (п. 10.3.2.).
Затем в пробирки вносят по 10 мкл ДМК из исследуемых проб и ОКВ. В
шкропробирку с отрицательным контролем амплификации (К-) вносят 10 мкл ТЕ-буфера,
; микропробирку с положительным контролем амплификации (К+) - 10 мкл ПКО ДНК F.
ularensis.
0.3.4. Проведение гермоциклировапия
Подготовленные микропробирки помещают в термоциклер типа RotorGene.
Программирование амилификагора:
1ля работы с прибором «Rotor-Gene» 3000 используют программу “Rotor-Gene 6”, с прибором
: Rotor-Gene» 6000- про1рамму “Rotor-Gene 6000" версии 1.7 (build 67) или выше. При
)писании программы термины для каждой версии программы представлены следующим
)бразом: для прибора «Rotor-Gene» 3000 / для англоязычной версии программы «Rotor-
лепе» 6000 / для русскоязычной версии программы «Rotor-Gene» 6000.
1. Иажимаюг кнопку «Кеш»/«Новый» в осповиом меню программы.
2. В открывшемся окне выбирают меню «Advanced»/«Дeтaльный мастер» Нажимают
спопку «New»/«J 1овый».
3. Выбирают тип ротора «36-Well КоЮг»/«36-луночный ротор». Ставят отметку в окне
)ядом с надписью «No Domed 0.2 mi rubcs»/«Locking ring attachcd»/«Kojibiio закреплено».
4. Нажимают кнопку «ЫехО>/«Далее».
5. Выбираюг объем реакционной смеси; Reaction volumc/Обьсм реакции - 25 мкл. Дл>!
фибора «Rotor-Gene» 6000 должно быть активно (отмечено галочкой) окно «15 р1 oil layer
olume»/«15 pL объем масла/воска».
6. Нажимают кнопку «Ыех1»/«Далее».
7. В верхней части окна иажимаю!' кнопку «Edilprofile»/«PcnaKTop профиля».
8. Задают следующие параметры эксперимента:
8.1. Hold/Удерж, температуры 95 X - 5 мин
8.2. Cycling/LlHKnHpoBaHHe 95 °С - 30 с
60 °С - 30 с
--- стр. 9 ---
8.3.Cyciing2/l 1иклироваиие2
72 °C - 30 с
Cycle repeats/Цикл повторить - 10 times/рав.
95 °C - 20 с
56°C - 20 с - Детекция
72 °С - 20 с
Cycle repeats/Цикл повторить - 35 times/раз.
Флуоресценцию измеряют при 56 °С (во втором блоке циклирования) но каналу
FAM/Green.
8.4. Нажимают кнопку «ОК»/«Да».
9. В нижней части окна нажимают кнопку «Calibrate»/«Gain
Optimisation...»/«Опт.уровня сиги.». В открывшемся окне нажимают кнопку «Calibrate
Acquiring»/«Optimise Acquiring»/ «Опт.детек-мых». Для красителя FAM/Green ука:5ывают в
1рафе Min Reading/Мииим. Сигнач значение 5, а в 1 рафе Мах Reading/Максим. Сигнач
значение 10. В графе Tube position/Позиция Пробирки указан номер пробирки, по которой
будег автоматически выбрал парамегр «g^:^ш»/«ycилcниc сигнала», по умолчанию эго 1-я
пробирка в роторе. Поэтому в 1-ой позиции в роторе должна ставиться пробирка с
реакционной смесью. Помечают галочкой бокс в строке «Perform Calibration Before Т'
Acquisition»/«Perform Optimisation Before P' Acquisition»/«Выполнить оптимизацию при I-м
шаге детекции». Закрыт ь окно Лию Gain Calibration Setup/Авто-оптимизация уровня сигнача.
нажимают кнопку «С1о8е»/«Закрыть». Нажимают кнопку «Next»/«Дaлee».
10. Запускают амплификацию кнопкой «Start гип»/«Старт».
11. Дают название эксперимента и сохраняют его на диске (в этом файле будут
автоматически сохранены результаты данного эксперимента).
В процессе работы амплификатора или по окончании его работы программируют
положение пробирок в карусели. Для этого используют кнопку «Hdit samples»/«npaBKa
образцов» (в нижней правой части основного окна). Все пробы и контроли обозначают
меню Samples/Образцы как Unknown/Неизвестный.
11. РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Регистрация результатов амплификации по каналу FAM/Green:
1. Нажимают в меню кнопку «Апа1уз18»/«Анализ», выбирают режим анализа
«Quantitation»/«KoaH4ecTBeHHbm», выбирают в меню «Cycling А. FAM»/«Cycling А.
Green», нажимают кнопку «Show»/«HoKa3aTb».
2. Отменяют автоматический выбор Threshold/Порог.
3. В меню основного окна Quantitation analysis/Количсственный анализ активируют
кнопки «Dynamic 1иЬе»/«Динамич.фон» и «Slope Correct»/«KoppeK. уклона».
4. Выбирают линейную шкалу графического изображения результатов, нажимают кнопку
Linear scale/Линейная шкала, в нижней части окна справа (если эта шкала активна по
умолчанию, вместо k eio h k h Linear scale/Линейная шкала видна кнопка Log
scale/Лог.шкала).
5. В меню окна «More settings»/«Outlier Кетоуа1»/«Устрапение выбросов» установить
значение NTC threshold/Hopor Фона - ПФ (NTC) ~ 15 %.
6. В меню «СТ Са1си1аг1оп»/«Вычисленис СТ» (в правой части окна) выставить
Threshold/Порог = 0,05.
7. В таблице результатов (окно «Quant. Ее5и118»/«Количественные Результаты») появятся
значения порогового цикла (Ct).
12. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Результаты учитывают' на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой
флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что
соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «СЧ» в
соответствующей графе в таблице результатов).