Набор реагентов для ускоренной идентификации штаммов Yersinia pestis методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени (Ген Yersinia pestis идентификация - РГФ) по ТУ 9398-034-01898109-2011 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 3 --- • калибровочные пробы (КП), аттестованные по международному стандарту на HBsAg NIBSC 00/588, содержащие известные количества HBsAg. Флаконы маркированы «Калибровочная проба №1», «Калибровочная проба №2», «Калибровочная проба № 3», «Калибровочная проба №4», «Калибровочная проба №5», «Калибровочная проба № 6»; точные значения концентрации HBsAg указаны на этикетках флаконов, ориентировочные: 0; 0.1; 0.5; 1.0; 2.0; 5.0 МЕ/мл; 6 флаконов (по 1 мл) (лиофилизованные препараты или жидкости) (см. таблицу 1 ); • конъюгат aнти-HBsAg-пepoкcидaзa, маркирован «Конъюгат Е» - 1 флакон (8 мл) или 1 флакон (16 мл) в зависимости от варианта комплектации (см. таблицу 1 ); • аналитический водно-солевой раствор, маркирован «Буфер А» - 1 флакон (6 мл) или 1 флакон (12 мл) в зависимости от варианта комплектации (см. таблицу 1 ); • водно-солевой раствор для разведения образцов сыворотки и плазмы крови, марки рован «Буфер Д» - 1 флакон (50 мл) или 2 флакона (50 мл) в зависимости от варианта ком плектации (см. таблицу 1 ); • концентрированный водно-солевой раствор для промывки лунок, маркирован «Бу фер Р» - 1 флакон (14 мл) или 2 флакона (14 мл) в зависимости от варианта комплектации (см. таблицу 1 ); • раствор тетраметилбензидина, маркирован «Раствор ТМБ» - 1 флакон (14 мл) или 2 флакона (14 мл) в зависимости от варианта комплектации (см. таблицу 1 ); • стоп-реагент, маркирован «Стоп-реагент» - 1 флакон (14 мл) или 2 флакона (14мл) в зависимости от варианта комплектации (см. таблицу 1 ); • контрольная сыворотка с известным содержанием HBsAg, маркирована «Кон трольная сыворотка» - 1 флакон (1 мл) (лиофилизованный препарат или жидкость) (см. таблицу 1 ); • прозрачный пластиковый пакет с замком (при упаковке стрипов в пакет из 2-слойного полиэтилена) - 1 ш т. или 2 ш т. в зависимости от комплектации (см. табли ц у 1 ). --- стр. 4 --- п Таблица 1 . Варианты комплектации Название компонента Комплект стрипов 96 определений комплект 192 определения 2 комплекта Комплект калибровочных проб 1 комплект - 1 мл 1 комплект - 1 мл Контрольная сыворотка 1 флакон - 1 мл 1 флакон - 1 мл Конъюгат анти-HBsAg- пероксидаза 1 флакон - 8 мл 1 флакон - 16 мл Аналитический водно-солевой раствор 1 флакон - 6 мл 1 флакон - 12мл Водно-солевой раствор для разве дения образцов сыворотки и плаз- мы крови________________________ 1 флакон - 50 мл 2 флакона - по 50 мл Концентрированный буферный раствор для промывки лунок 1 флакон - 14 мл 2 флакона - по 14 мл Раствор ТМБ 1 флакон - 14 мл 2 флакона - по 14 мл Стоп-реагент 1 флакон - 14 мл 2 флакона - по 14 мл Прозрачный пластиковый пакет с замком 1 шт. 2 шт. 3. А Н А Л И Т И Ч Е С К И Е И Д И А Г Н О С Т И Ч Е С К И Е Х А Р А К Т Е Р И С Т И К И 3.1. Диагностическая специфичность набора определялась на 200 отрицательных сыворотках крови человека, и составила 99,5%. 3.2. Диагностическая чувствительность определялась на 100 положительных сы воротках крови человека, и составила 100 %. 3.3. Коэффициент вариации результатов определения HBsAg в одном и том же образце с использованием набора «ГепатитИФД-HBsAg» не превышает 8% . 3.4. Линейность. Зависимость концентрации HBsAg в анализируемых образцах сыворотки крови при разведении их буфером Д имеет линейный характер в диапазоне концентраций калибровочных проб №3 - № 6 и составляет 90-110%. 3.5. Точность. Данный аналитический параметр проверяется тестом на «откры тие» HBsAg — проверка соответствия значения определяемой концентрации HBsAg рас чётной величине, полученной путем смешивания равных объемов контрольной сыворотки и КП№3. Процент открытия составляет 90-110% . 3.6. Аналитическая чувствительность. Минимальная достоверно определяемая набором концентрация HBsAg по 0 С 0 4 2 -2 8 -3 11-00 в анализируемом образце не превы шает 0,05 МЕ/мл. --- стр. 5 --- 4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ 4.1. Потенциальный риск применения набора - класс 3. 4.2. Все компоненты набора в используемых концентрациях являются неток сичными. 4.3. При работе с набором следует соблюдать требования ГОСТ Р 52905-2007 «Лаборатории медицинские. Требования безопасности». 4.4. Стоп-реагент представляет собой 1 Н раствор соляной кислоты. Избегать разбрызгивания и попадания на кожу и слизистые. В случае попадания стоп-реагента на кожу и слизистые необходимо промыть пораженный участок большим количеством про точной воды. 4.5. При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пла стиковые перчатки, т.к. производные крови, входящие в состав набора, и исследуемые об разцы являются потенциально инфицированным материалом, способным длительное вре мя сохранять и передавать возбудителей различных вирусных инфекций. 4.6. Химическая посуда и оборудование, которые используются в работе с на бором, должны быть соответствующим образом маркированы и храниться отдельно. 4.7. Запрещается прием пищи, использование косметических средств и курение в помещениях, предназначенных для работы с наборами. 5. О Б О Р У Д О В А Н И Е И М А Т Е Р И А Л Ы • Спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптиче скую плотность раствора в лунках при длине волны 450 нм; • прибор для встряхивания рамки со стрипами (термостатируемый щейкер), позво ляющий производить встряхивание со скоростью 400-800 об/мин при температуре +37°С; • пипетки полуавтоматические одноканальные со сменными наконечниками с изме няемым объемом отбора жидкостей: на 5-50 мкл; 40-200 мкл; 200-1000 мкл; 1000- 5000 мкл; • пипетка полуавтоматическая восьмиканальная со сменными наконечниками, по зволяющая отбирать объемы жидкости до 300 мкл; • цилиндр мерный, позволяющий отмерять 50-1000 мл; • стакан стеклянный подходящего объема; • вода дистиллированная; • бумага фильтровальная; • перчатки резиновые или пластиковые; • 1 % раствор гипохлорита натрия или 6% раствор перекиси водорода; • контейнер для дезинфекции; • ванночки для внесения реагентов восьмиканальной пипеткой. --- стр. 6 --- 6. А Н А Л И З И Р У Е М Ы Е О Б Р А З Ц Ы 6.1. Забор крови из вены осуществляют с соблюдением правил асептики. После формирования сгустка сыворотку отделяют путем центрифугирования. Забор крови для получения плазмы осуществляют в пробирку, содержащую антикоагулянт. После центри фугирования сыворотку или плазму переносят в отдельную пробирку. 6.2. Для проведения анализа не следует использовать гемолизированную или мут ную сыворотку и плазму, а также образцы сыворотки, содержащие азид натрия. 6.3. Образцы сыворотки и плазмы крови разрешается хранить при температуре +2...8°С не более 2 суток; при необходимости более длительного хранения рекомендуется аликвотировать образец и хранить в замороженном виде при температуре -20°С или ни же. Не допускается повторное замораживание образца. 7. П Р О В Е Д Е Н И Е А Н А Л И З А 7.1. Подготовка реагентов 7.1.1. Стрипы. Перед вскрытием пакет необходимо выдержать при комнатной темпе ратуре (+18...25°С ) не менее 30 минут. Вскрыть пакет и переставить на свободную рамку необходимое количество стрипов. 7.1.2. Жидкие калибровочные пробы и контрольная сыворотка готовы к использова нию. Для восстановления лиофилизованных калибровочных проб и контрольной сыво ротки перед вскрытием флаконов легким постукиванием стряхнуть частицы, прилипшие к стенкам флаконов или к крышкам. Открыть флаконы и положить крышки перевернутыми на сухую поверхность. В каждый флакон с калибровочной пробой и контрольной сыво роткой внести по 1 мл дистиллированной воды и закрыть крышками. Выдержать флаконы в течение 10 минут при комнатной температуре (+18...25°С ) без перемешивания. Затем, аккуратно наклоняя и вращая флаконы, перемешать их содержимое до полного растворе ния, избегая пенообразования. В течение следующих 10 минут вьщержать флаконы при комнатной температуре, периодически перемешивая. 7.1.3. Конъюгат Е готов к использованию. Расход конъюгата на один стрип составля ет 0,66 мл. 7.1.4.Промывочный раствор. Необходимое количество буф ера? развести дистилли рованной водой в 20 раз. Например: 5 мл буфера Р + 95 мл дистиллированной воды. Тщательно перемешать, избегая пенообразования. 7.1.5. Буфер А готов к использованию. Расход Буфера А на один стрип составляет 0,5 мл. 7.1.6. Буфер Д готов к использованию. 7.1.7. Раствор тетраметилбензидина (ТМБ) готов к использованию. Расход ТМБ на один стрип составляет 1,15 мл. 7.1.8. Стоп-реагент готов к использованию. Расход стоп-реагента на один стрип со ставляет 1,15 мл. --- стр. 7 --- 7.1.9. Все реагенты перед проведением анализа должны быть тщательно перемеша ны и доведены до комнатной температуры (+18.. .25°С). В Приложениях 1 и 2 приведены схемы проведения количественного и качественно го анализов, соответственно. 7.1.10. Разведение исследуемых образцов крови. Если концентрация HBsAg в ис следуемых образцах по предварительным данным выше 5 МЕ/мл, образцы следует развес ти буфером Д в 100 и 1000 раз. Пример подготовки образца к анализу: Образец № 1 (разведение в 100 раз): 990 мкл буфера Д + 10 мкл исследуемого образца. Образец № 2 (разведение в 1000 раз): 270 мкл буфера Д + 30 мкл образца № 1. При каждом разведении необходимо тщательное перемешивание. 7.2. Постановка анализа 7.2.1. Составить протокол маркировки лунок. Лунки промаркировать следующим образом: 7.2.1.1. Количественный анализ: А1, А2 - № 1 - для измерения величины оптической плотности раствора ТМБ; В1, В2 - № 2 - для измерения величины оптической плотности КП №1; С1, С2 - № 3 - для измерения величины оптической плотности КП №2; D1, D2 - № 4 - для измерения величины оптической плотности КП №3; Е1, Е2 - № 5 - для измерения величины оптической плотности КП №4; F1, F2 - № 6 - для измерения величины оптической плотности КП №5; G1, G 2 - № 7 - для измерения величины оптической плотности КП № 6; Н1, Н2 - № 8 - для измерения величины оптической плотности контрольной сыворот ки. 7.2.1.2. Качественный анализ: А1, А2 - № 1 - для измерения величины оптической плотности раствора ТМБ; В1, В 2 - № 2 - для измерения величины оптической плотности КП №1 (отрицательный контроль); С 1, С2 - № 3 - для измерения величины оптической плотности КП №2 (слабоположи тельный контроль); D1, D2 - № 4 - для измерения величины оптической плотности КП № 6 (положительный контроль). 7.2.2. Внести во все лунки, кроме лунок А1 и А2, по 25 мкл аналитического буфе ра. 7.2.3. Внести в соответствующие лунки по 100 мкл калибровочных проб и кон трольной сыворотки, в оставшиеся лунки по 100 мкл исследуемых образцов в дубликатах. Примечание: общее время внесения калибровочных проб, контрольной сыворотки и исследуемых сывороток крови не должно превышать 15 минут, иначе время инкубации разных образцов будет значительно различаться, что приведет к неправильным резуль татам. 7.2.4. Инкубировать стрипы в течение 30 минут при встряхивании в термостати- руемом шейкере при температуре +37°С со скоростью 600-800 об/мин. --- стр. 8 --- 7.2.5. Н е у д а л я я со д е р ж и м о г о л у н о к , во все лунки, кроме А1 и А2, немедленно внести по 50 мкл конъюгата анти-НВ 5А§-пероксидаза. 7.2.6. Инкубировать в течение 30 минут при встряхивании в т ер м о ст а т и р у ем о м ш ей к ер е п р и т е м п е р а т у р е + 3 7 °С со ск о р о ст ь ю 6 0 0 -8 0 0 о б /м и н . 7.2.7. По окончании инкубации удалить содержимое лунок в контейнер с дезинфи цирующим раствором ( 1% раствором гипохлорита натрия или 6% раствором перекиси во дорода) и промыть лунки пять раз. При каждой промывке во все лунки добавить по 300 мкл промывочного раствора, приготовленного по п. 7.1 .4 ., встряхнуть рамку на шей кере в течение 5 -1 0 секунд с последующим декантированием. После последнего деканти рования тщательно удалить остатки жидкости из лунок постукиванием рамки со стрипами в перевернутом положении по фильтровальной бумаге. Допускается промывка лунок при помощи автоматического промывочного устрой ства. 7.2.8. Немедленно внести во все лунки по 100 мкл раствора тетраметилбензидина. 7.2.9. И н к у б и р о в а т ь ст р и п ы в т е ч ен и е 10 м и н у т п р и в ст р я х и в а н и и в теп м о- ^ ст а т и р у ем о м ш е й к ер е п р и т е м п е р а т у р е + 3 7 °С со ск о р о с т ь ю 6 0 0 -8 0 0 о б/м и н . 7.2.10. Добавить во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор тетраметилбензидина, по 100 мкл стоп-реагента для остановки ферментной реакции, встряхивать на шейкере в течение 1-2 минут. 7.2.11. Если невозможно измерить оптическую плотность в лунках планшета непо средственно после выполнения п. 7.2.Ю ., то следует иметь в виду, что окраска в лунках планшета стабильна в течение не более 20 минут при температуре +18...25°С . 8. Р Е Г И С Т Р А Ц И Я Р Е З У Л Ь Т А Т О В Измерить на фотометре вертикального сканирования оптическую плотность в лун ках при длине волны 450 нм. При регистрации результатов н е о б х о д и м о в ы ч и т а т ь величину оптической плот ности в лунках А1 и А2 из значений оптических плотностей всех остальных лунок. Примечание: среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках ^ А1 и А2 не должно превышать 0,09 ед.ОП. 9. У Ч Е Т Р Е З У Л Ь Т А Т О В 9.1. К о л и ч е с т в е н н ы й ан ал и з 9.1.1. Построить калибровочный график зависимости оптических плотностей от концентрации HBsAg в калибровочных пробах (МЕ/мл) (Рисунок 2). Внешний вид графи ка зависит от способа преобразования осей. Примечание 1: для построения калибровочных графиков рекомендуется использо вать программное обеспечение «ИФА Мастер». Примечание 2: для построения калибровочного графика на масштабной бумаге не обходимо использовать данные оптических плотностей после вычитания из них средней величины оптической плотности лунок с ТМБ. Если программа фотометра не позволяет вычитать величину оптической плотно сти лунок А 1 и А2, то необходимо пользоваться формулой: В-Вт, 8 --- стр. 16 --- i 4 • калибровочные пробы (КП), аттестованные по международному стандарту на HBsAg NIBSC 00/588, содержащие известные количества HBsAg. Флаконы маркированы «Калибровочная проба №1», «Калибровочная проба №2», «Калибровочная проба №3», «Калибровочная проба №4», «Калибровочная проба №5», «Калибровочная проба № 6 »; точные значения концентрации HBsAg указаны на этикетках флаконов, ориентировочные: 0; 0.1; 0.5; 1.0; 2.0; 5.0 МЕ/мл; 6 флаконов (по 1 мл) (лиофилизованные препараты или жидкости) (см. таблицу 1); • конъюгат aнти-HBsAg-пepoкcидaзa, маркирован «Конъюгат Е» - 1 флакон (8 мл) или 1 флакон (16 мл) в зависимости от варианта комплектации (см. таблицу 1); • аналитический водно-солевой раствор, маркирован «Буфер А» - 1 флакон (6 мл) или 1 флакон (12 мл) в зависимости от варианта комплектации (см. таблицу 1); • водно-солевой раствор для разведения образцов сыворотки и плазмы крови, марки рован «Буфер Д» - 1 флакон (50 мл) или 2 флакона (50 мл) в зависимости от варианта ком плектации (см. таблицу 1); • концентрированный водно-солевой раствор для промывки лунок, маркирован «Бу фер Р» - 1 флакон (14 мл) или 2 флакона (14 мл) в зависимости от варианта комплектации (см. таблицу 1); • раствор тетраметилбензидина, маркирован «Раствор ТМБ» - 1 флакон (14 мл) или 2 флакона (14 мл) в зависимости от варианта комплектации (см. таблицу 1); • стоп-реагент, маркирован «Стоп-реагент» - 1 флакон (14 мл) или 2 флакона (14мл) в зависимости от варианта комплектации (см. таблицу 1); • контрольная сыворотка с известным содержанием HBsAg, маркирована «Кон трольная сыворотка» - 1 флакон (1 мл) (лиофилизованный препарат или жидкость) (см. таблицу 1); • прозрачный пластиковый пакет с замком (при упаковке стрипов в пакет из 2-слойного полиэтилена) - 1 шт. или 2 шт. в зависимости от комплектации (см. табли цу 1). --- стр. 17 --- Таблица 1 . Варианты комплектации Название компонента Комплект Стрипов 96 определений комплект 192 определения 2 комплекта Комплект калибровочных проб 1 комплект - 1 мл 1 комплект - 1 мл Контрольная сыворотка 1 флакон - 1 мл 1 флакон - 1 мл Конъюгат анти-HBsAg- пероксидаза____________ 1 флакон - 8 мл 1 флакон - 16 мл Аналитический водно-солевой раствор 1 флакон - 6 мл флакон - 12мл Водно-солевой раствор для разве дения образцов сыворотки и плаз- мы крови________________________ 1 флакон - 50 мл 2 флакона - по 50 мл Концентрированный буферный раствор для промывки лунок 1 флакон - 14 мл 2 флакона - по 14 мл Раствор ТМБ 1 флакон - 14 мл 2 флакона - по 14 мл Стоп-реагент 1 флакон - 14 мл 2 флакона - по 14 мл Прозрачный пластиковый пакет с замком 1 шт. 2 шт. 3. А Н А Л И Т И Ч Е С К И Е И Д И А Г Н О С Т И Ч Е С К И Е Х А Р А К Т Е Р И С Т И К И 3.1. Диагностическая специфичность набора определялась на 200 отрицательных сыворотках крови человека, и составила 99,5%. 3.2. Диагностическая чувствительность определялась на 100 положительных сы воротках крови человека, и составила 100 %. 3.3. Коэффициент вариации результатов определения HBsAg в одном и том же образце с использованием набора «ГепатитИФА-HBsAg» не превышает 8%. 3.4. Линейность. Зависимость концентрации HBsAg в анализируемых образцах сыворотки крови при разведении их буфером Д имеет линейный характер в диапазоне концентраций калибровочных проб №3 - № 6 и составляет 90-110%. 3.5. Точность. Данный аналитический параметр проверяется тестом на «откры тие» HBsAg — проверка соответствия значения определяемой концентрации HBsAg рас чётной величине, полученной путем смешивания равных объемов контрольной сыворотки и КП№3. Процент открытия составляет 90-110% . 3.6. Аналитическая чувствительность. Минимальная достоверно определяемая набором концентрация HBsAg по 0 С 0 4 2 -2 8 -3 1 1-00 в анализируемом образце не превы шает 0,05 МЕ/мл. --- стр. 18 --- 5 ^ 4. М Е Р Ы П Р Е Д О С Т О Р О Ж Н О С Т И 4.1. Потенциальный риск применения набора - класс 3. 4.2. Все компоненты набора в используемых концентрациях являются неток сичными. 4.3. При работе с набором следует соблюдать требования ГОСТ Р 52905-2007 «Лаборатории медицинские. Требования безопасности». 4.4. Стоп-реагент представляет собой 1 Н раствор соляной кислоты. Избегать разбрызгивания и попадания на кожу и слизистые. В случае попадания стоп-реагента на кожу и слизистые необходимо промыть пораженный участок большим количеством про точной воды. 4.5. При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пла стиковые перчатки, т.к. производные крови, входящие в состав набора, и исследуемые об разцы являются потенциально инфицированным материалом, способным длительное вре мя сохранять и передавать возбудителей различных вирусных инфекций. 4.6. Химическая посуда и оборудование, которые используются в работе с на бором, должны быть соответствующим образом маркированы и храниться отдельно. 4.7. Запрещается прием пищи, использование косметических средств и курение в помещениях, предназначенных для работы с наборами. 5. О Б О Р У Д О В А Н И Е И М А Т Е Р И А Л Ы • Спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптиче скую плотность раствора в лунках при длине волны 450 нм; • прибор для встряхивания рамки со стрипами (термостатируемый шейкер), позво ляющий производить встряхивание со скоростью 400-800 об/мин при температуре +37°С; • пипетки полуавтоматические одноканальные со сменными наконечниками с изме няемым объемом отбора жидкостей: на 5-50 мкл; 40-200 мкл; 200-1000 мкл; 1000- 5000 мкл; • пипетка полуавтоматическая восьмиканальная со сменными наконечниками, по зволяющая отбирать объемы жидкости до 300 мкл; • цилиндр мерный, позволяющий отмерять 50-1000 мл; • стакан стеклянный подходящего объема; • вода дистиллированная; • бумага фильтровальная; • перчатки резиновые или пластиковые; • 1% раствор гипохлорита натрия или 6% раствор перекиси водорода; • контейнер для дезинфекции; • ванночки для внесения реагентов восьмиканальной пипеткой. --- стр. 19 --- и 6. АНАЛИЗИРУЕМ Ы Е ОБРАЗЦЫ 6.1. Забор крови из вены осуществляют с соблюдением правил асептики. После формирования сгустка сыворотку отделяют путем центрифугирования. Забор крови для получения плазмы осуществляют в пробирку, содержащую антикоагулянт. После центри фугирования сыворотку или плазму переносят в отдельную пробирку. 6.2. Для проведения анализа не следует использовать гемолизированную или мут ную сыворотку и плазму, а также образцы сыворотки, содержащие азид натрия. 6.3. Образцы сыворотки и плазмы крови разрещается хранить при температуре +2...8°С не более 2 суток; при необходимости более длительного хранения рекомендуется аликвотировать образец и хранить в замороженном виде при температуре -20°С или ни же. Не допускается повторное замораживание образца. 7. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА 7.1. Подготовка реагентов 7.1.1. Стрипы. Перед вскрытием пакет необходимо выдержать при комнатной темпе ратуре (+18...25°С ) не менее 30 минут. Вскрыть пакет и переставить на свободную рамку необходимое количество стрипов. 7.1.2. Жидкие калибровочные пробы и контрольная сыворотка готовы к использова нию. Для восстановления лиофилизованных калибровочных проб и контрольной сыво ротки перед вскрытие.м флаконов легким постукиванием стряхнуть частицы, прилипшие к стенкам флаконов или к крышкам. Открыть флаконы и положить крышки перевернутыми на сухую поверхность. В каждый флакон с калибровочной пробой и контрольной сыво роткой внести по 1 мл дистиллированной воды и закрыть крышками. Выдержать флаконы в течение 10 минут при комнатной температуре (+18...25°С ) без перемешивания. Затем, аккуратно наклоняя и вращая флаконы, перемешать их содержимое до полного растворе ния, избегая пенообразования. В течение следующих 10 минут выдержать флаконы при комнатной температуре, периодически перемешивая. 7.1.3. Конъюгат Е готов к использованию. Расход конъюгата на один стрип составля ет 0,66 мл. 7.1.4.Промывочный раствор. Необходимое количество буфера? развести дистилли рованной водой в 20 раз. Например: 5 мл буфера Р + 95 мл дистиллированной воды. Тщательно пере.мешать, избегая пенообразования. 7.1.5. Буфер А готов к использованию. Расход Буфера А на один стрип составляет 0,5 мл. 7.1.6. Буфер Д готов к использованию. 7.1.7. Раствор тетраметилбензидина (ТМБ) готов к использованию. Расход ТМБ на один стрип составляет 1,15 мл. 7.1.8. Стоп-реагент готов к использованию. Расход стоп-реагента на один стрип со ставляет 1,15 мл. --- стр. 20 --- 7.1.9. Все реагенты перед проведением анализа должны быть тщательно перемеша ны и доведены до комнатной температуры (+18...25°С ). В Приложениях 1 и 2 приведены схемы проведения количественного и качественно го анализов, соответственно. 7.1.10. Разведение исследуемых образцов крови. Если концентрация HBsAg в ис следуемых образцах по предварительным данным выше 5 МЕ/мл, образцы следует развес ти буфером Д в 100 и 1000 раз. Пример подготовки образца к анализу: Образец № 1 (разведение в 100 раз): 990 мкл буфера Д + 10 мкл исследуемого образца. Образец № 2 (разведение в 1000 раз): 270 мкл буфера Д + 30 мкл образца № 1. При каждом разведении необходимо тщательное перемешивание. 7.2. Постановка анализа 7.2.1. Составить протокол маркировки лунок. Лунки промаркировать следующим образом: 7.2.1.1. Количественный анализ: А1, А2 - № 1 - для измерения величины оптической плотности раствора ТМБ; В1, В2 - № 2 - для измерения величины оптической плотности КП №1; С1, С2 - № 3 - для измерения величины оптической плотности КП №2; D1, D2 - № 4 - для измерения величины оптической плотности КП №3; Е1, Е2 - № 5 - для измерения величины оптической плотности КП №4; F1, F2 - № 6 - для измерения величины оптической плотности КП №5; G1, G 2- № 7 - для измерения величины оптической плотности КП № 6 ; Н 1, П2 - № 8 - для измерения величины оптической плотности контрольной сыворот ки. 7.2.1.2. Качественный анализ: А1, А2 - № 1 - для измерения величины оптической плотности раствора ТМБ; В1, В2 - № 2 - для измерения величины оптической плотности КП №1 (отрицательный контроль); С 1, С2 - № 3 - для измерения величины оптической плотности КП №2 (слабоположи тельный контроль); D1, D2 - № 4 - для измерения величины оптической плотности КП № 6 (положительный контроль). 7.2.2. Внести во все лунки, кроме лунок А1 и А2, по 25 мкл аналитического буфе ра. 7.2.3. Внести в соответствующие лунки по 100 мкл калибровочных проб и кон трольной сыворотки, в оставшиеся лунки по 100 мкл исследуемых образцов в дубликатах. Примечание', общее время внесения калибровочных проб, контрольной сыворотки и исследуемых сывороток крови не должно превышать 15 минут, иначе время инкубации разных образцов будет значительно различаться, что приведет к неправильным резуль татам. 7.2.4. Инкубировать стрипы в течение 30 минут при встряхивании в термостати- руемом шейкере при температуре +37°С со скоростью 600-800 об/мин. 7 --- стр. 21 --- Ь ‘1 7.2.5. Н е у д а л я я со д ер ж и м о го л у н о к , во все лунки, кроме А1 и А2, немедленно внести по 50 мкл конъюгата aнти-HBsAg-пepoкcидaзa. 7.2.6. Инкубировать в течение 30 минут при встряхивании в т ер м о ста т и р у ем о м ш ей к ер е при тем п ер ату р е + 3 7 °С со ск о р о сть ю 6 0 0 -8 0 0 о б/м и н . 7.2.7. По окончании инкубации удалить содержимое лунок в контейнер с дезинфи цирующим раствором (Г / о раствором гипохлорита натрия или 6% раствором перекиси во дорода) и промыть лунки пять раз. При каждой промывке во все лунки добавить по 300 мкл промывочного раствора, приготовленного по п. 7.1.4., встряхнуть рамку на шей кере в течение 5-10 секунд с последующим декантированием. После последнего деканти рования тщательно удалить остатки жидкости из лунок постукиванием рамки со стрипами в перевернутом положении по фильтроватьной бумаге. Допускается промывка лунок при помощи автоматического промывочного устрой ства. 7.2.8. Немедленно внести во все лунки по 100 мкл раствора тетраметилбензидина. 7.2.9. И н к у б и р о в а т ь ст р и п ы в т е ч ен и е 10 м и н у т при в ст р я х и в а н и и в т е р м о ст а т и р у ем о м ш ей к ер е п р и т е м п ер а т у р е + 3 7 °С со ск о р о ст ь ю 6 0 0 -8 0 0 об/м и н . 7.2.10. Добавить во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор тетраметилбензидина, по 100 мкл стоп-реагента для остановки ферментной реакции, встряхивать на щейкере в течение 1 -2 минут. 7.2.11. Если невозможно измерить оптическую плотность в лунках планшета непо средственно после выполнения п. 7.2.10., то следует иметь в виду, что окраска в лунках планшета стабильна в течение не более 20 минут при температуре +18...25°С . 8. Р Е Г И С Т Р А Ц И Я Р Е З У Л Ь Т А Т О В Измерить на фотометре вертикального сканирования оптическую плотность в лун ках при длине волны 450 нм. При регистрации результатов н е о б х о д и м о в ы ч и т а т ь величину оптической плот ности в лунках А1 и А2 из значений оптических плотностей всех остальных лунок. Пр 1ш ечание: среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках А1 и А2 не должно превышать 0,09 ед.ОП. 9. У Ч Е Т Р Е З У Л Ь Т А Т О В 9.1. К о л и ч ес т в ен н ы й ан ал и з 9.1.1. Построить калибровочный график зависимости оптических плотностей от концентрации HBsAg в калибровочных пробах (МЕ/мл) (Рисунок 2). Внешний вид графи ка зависит от способа преобразования осей. Пргшечание 1: для построения калибровочных графиков рекомендуется использо вать программное обеспечение «ИФА Мастер». Причечание 2: для построения калибровочного графика на масштабной бумаге не обходимо использовать данные оптических плотностей после вычитания из них средней величины оптической плотности лунок с ТМБ. Если программа фотометра не позволяет вычитать величину оптической плотно сти лунок АI и А2, то необходимо пользоваться формулой: В-Вт, 8 --- стр. 29 --- 9 ^ • калибровочные пробы (КП), аттестованные по международному стандарту на HBsAg NIBSC 00/588, содержащие известные количества HBsAg. Флаконы маркированы «Калибровочная проба №1», «Калибровочная проба №2», «Калибровочная проба №3», «Калибровочная проба №4», «Калибровочная проба №5», «Калибровочная проба № 6 »; точные значения концентрации HBsAg указаны на этикетках флаконов, ориентировочные: 0; 0.1; 0.5; 1.0; 2.0; 5.0 МЕ/мл; 6 флаконов (по 1 мл) (лиофилизованные препараты или жидкости) (см. таблицу 1); • конъюгат aнти-HBsAg-пepoкcидaзa, маркирован «Конъюгат Е» - 1 флакон (8 мл) или 1 флакон (16 мл) в зависимости от варианта комплектации (см. таблицу 1); • аналитический водно-солевой раствор, маркирован «Буфер А» - 1 флакон (6 мл) или 1 флакон (12 мл) в зависимости от варианта комплектации (см. таблицу 1); • водно-солевой раствор для разведения образцов сыворотки и плазмы крови, марки рован «Буфер Д» - 1 флакон (50 мл) или 2 флакона (50 мл) в зависимости от варианта ком плектации (см. таблицу 1); • концентрированный водно-солевой раствор для промывки лунок, маркирован «Бу фер Р» - 1 флакон (14 мл) или 2 флакона (14 мл) в зависимости от варианта комплектации (см. таблицу 1); • раствор тетраметилбензидина, маркирован «Раствор ТМБ» - 1 флакон (14 мл) или 2 флакона (14 мл) в зависимости от варианта комплектации (см. таблицу 1); • стоп-реагент, маркирован «Стоп-реагент» - 1 флакон (14 мл) или 2 флакона (14мл) в зависимости от варианта комплектации (см. таблицу 1); • контрольная сыворотка с известным содержанием HBsAg, маркирована «Кон трольная сыворотка» - 1 флакон (1 мл) (лиофилизованный препарат или жидкость) (см. таблицу 1); • прозрачный пластиковый пакет с замком (при упаковке стрипов в пакет из 2-слойного полиэтилена) - 1 шт. или 2 шт. в зависимости от комплектации (см. табли цу 1)- --- стр. 30 --- % Таблица 1 . Варианты комплектации Название компонента 96 определений 192 определения Комплект стрипов 1 комплект 2 комплекта Комплект калибровочных проб 1 комплект - 1 мл 1 комплект - 1 мл Контрольная сыворотка 1 флакон - 1 мл 1 флакон - 1 мл Конъюгат анти-HBsAg- пероксидаза ___________ 1 флакон - 8 мл 1 флакон - 16 мл Аналитический водно-солевой раствор 1 флакон - 6 мл 1 флакон - 12мл Водно-солевой раствор для разве дения образцов сыворотки и плаз- мы крови________________________ 1 флакон - 50 мл 2 флакона - по 50 мл Концентрированный буферный раствор для промывки лунок 1 флакон - 14 мл 2 флакона - по 14 мл Раствор ТМБ 1 флакон - 14 мл 2 флакона - по 14 мл Стоп-реагент 1 флакон - 14 мл 2 флакона - по 14 мл Прозрачный пластиковый пакет с замком 1 шт. 2 шт. 3. А Н А Л И Т И Ч Е С К И Е И Д И А Г Н О С Т И Ч Е С К И Е Х А Р А К Т Е Р И С Т И К И 3.1. Диагностическая специфичность набора определялась на 200 отрицательных сыворотках крови человека, и составила 99,5%. 3.2. Диагностическая чувствительность определялась на 100 положительных сы воротках крови человека, и составила 100 %. 3.3. Коэффициент вариации результатов определения HBsAg в одном и том же образце с использованием набора «ГепатитИФА-HBsAg» не превышает 8% . 3.4. Линейность. Зависимость концентрации HBsAg в анализируемых образцах сыворотки крови при разведении их буфером Д имеет линейный характер в диапазоне концентраций калибровочных проб №3 - № 6 и составляет 90-110%. 3.5. Точность. Данный аналитический параметр проверяется тестом на «откры тие» HBsAg - проверка соответствия значения определяемой концентрации HBsAg рас чётной величине, полученной путем смешивания равных объемов контрольной сыворотки и КП№3. Процент открытия составляет 90-110% . 3.6. Аналитическая чувствительность. Минимальная достоверно определяемая набором концентрация HBsAg по 0 С 0 4 2 -2 8 -3 1 1-00 в анализируемом образце не превы шает 0,05 МЕ/мл. --- стр. 31 --- 4. М Е Р Ы П Р Е Д О С Т О Р О Ж Н О С Т И 4.1. Потенциальный риск применения набора - класс 3. 4.2. Все компоненты набора в используемых концентрациях являются неток сичными. 4.3. При работе с набором следует соблюдать требования ГОСТ Р 52905-2007 «Лаборатории медицинские. Требования безопасности». 4.4. Стоп-реагент представляет собой 1 Н раствор соляной кислоты. Избегать разбрызгивания и попадания на кожу и слизистые. В случае попадания стоп-реагента на кожу и слизистые необходимо промыть пораженный участок большим количеством про точной воды. 4.5. При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пла стиковые перчатки, т.к. производные крови, входящие в состав набора, и исследуемые об разцы являются потенциально инфицированным материалом, способным длительное вре мя сохранять и передавать возбудителей различных вирусных инфекций. 4.6. Химическая посуда и оборудование, которые используются в работе с на бором, должны быть соответствующим образом маркированы и храниться отдельно. 4.7. Запрещается прием пищи, использование косметических средств и курение в помещениях, предназначенных для работы с наборами. 5. О Б О Р У Д О В А Н И Е И М А Т Е Р И А Л Ы • Спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптиче скую плотность раствора в лунках при длине волны 450 нм; • прибор для встряхивания рамки со стрипами (термостатируемый шейкер), позво ляющий производить встряхивание со скоростью 400-800 об/мин при температуре +37°С; • пипетки полуавтоматические одноканальные со сменными наконечниками с изме няемым объемом отбора жидкостей: на 5-50 мкл; 40-200 мкл; 200-1000 мкл; 1000- 5000 мкл; • пипетка полуавтоматическая восьмиканальная со сменными наконечниками, по зволяющая отбирать объемы жидкости до 300 мкл; • цилиндр мерный, позволяющий отмерять 50-1000 мл; • стакан стеклянный подходящего объема; • вода дистиллированная; • бумага фильтровальная; • перчатки резиновые или пластиковые; • 1% раствор гипохлорита натрия или 6% раствор перекиси водорода; • контейнер для дезинфекции; • ванночки для внесения реагентов восьмиканальной пипеткой. --- стр. 32 --- fifO 6. А Н А Л И З И Р У Е М Ы Е О Б Р А З Ц Ы 6.1. Забор крови из вены осуществляют с соблюдением правил асептики. После формирования сгустка сыворотку отделяют путем центрифугирования. Забор крови для получения плазмы осуществляют в пробирку, содержащую антикоагулянт. После центри фугирования сыворотку или плазму переносят в отдельную пробирку. 6.2. Для проведения анализа не следует использовать гемолизированную или мут ную сыворотку и плазму, а также образцы сыворотки, содержащие азид натрия. 6.3. Образцы сыворотки и плазмы крови разрешается хранить при температуре +2...8°С не более 2 суток; при необходимости более длительного хранения рекомендуется аликвотировать образец и хранить в замороженном виде при температуре -20°С или ни же. Не допускается повторное замораживание образца. 7. П Р О В Е Д Е Н И Е А Н А Л И З А 7.1. П о д г о т о в к а р еа ген т о в 7.1.1. Стрипы. Перед вскрытием пакет необходимо выдержать при комнатной темпе ратуре (+18...25°С ) не менее 30 минут. Вскрыть пакет и переставить на свободную рамку необходимое количество стрипов. 7.1.2. Жидкие калибровочные пробы и контрольная сыворотка готовы к использова нию. Для восстановления лиофилизованных калибровочных проб и контрольной сыво ротки перед вскрытием флаконов легким постукиванием стряхнуть частицы, прилипшие к стенкам флаконов или к крышкам. Открыть флаконы и положить крышки перевернутыми на сухую поверхность. В каждый флакон с калибровочной пробой и контрольной сыво роткой внести по 1 мл дистиллированной воды и закрыть крышками. Вьщержать флаконы в течение 10 минут при комнатной температуре (+18...25°С ) без перемешивания. Затем, аккуратно наклоняя и вращая флаконы, перемешать их содержимое до полного растворе ния, избегая пенообразования. В течение следующих 10 минут выдержать флаконы при комнатной температуре, периодически перемешивая. 7.1.3. Конъюгат Е готов к использованию. Расход конъюгата на один стрип составля ет 0,66 мл. 7.1.4.Промывочный раствор. Необходимое количество буф ера? развести дистилли рованной водой в 20 раз. Например: 5 мл буфера Р + 95 мл дистиллированной воды. Тщательно перемешать, избегая пенообразования. 7.1.5. Буфер А готов к использованию. Расход Буфера А на один стрип составляет 0,5 мл. 7.1.6. Буфер Д готов к использованию. 7.1.7. Раствор тетраметилбензидина (ТМБ) готов к использованию. Расход ТМБ на один стрип составляет 1,15 мл. 7.1.8. Стоп-реагент готов к использованию. Расход стоп-реагента на один стрип со ставляет 1,15 мл. --- стр. 33 --- » ! 7.1.9. Все реагенты перед проведением анализа должны быть тщательно перемеша ны и доведены до комнатной температуры (+18.. .25°С). В Приложениях 1 и 2 приведены схемы проведения количественного и качественно го анализов, соответственно. 7.1.10. Разведение исследуемых образцов крови. Если концентрация HBsAg в ис следуемых образцах по предварительным данным выше 5 МЕ/мл, образцы следует развес ти буфером Д в 100 и 1000 раз. Пример подготовки образца к анализу: Образец № 1 (разведение в 100 раз): 990 мкл буфера Д + 10 мкл исследуемого образца. Образец № 2 (разведение в 1000 раз): 270 мкл буфера Д + 30 мкл образца № 1. При каждом разведении необходимо тщательное перемешивание. 7.2. Постановка анализа 7.2.1. Составить протокол маркировки лунок. Лунки промаркировать следующим образом: 7.2.1.1. Количественный анализ: А1, А2 - № 1 - для измерения величины оптической плотности раствора ТМБ; В1, В2 - № 2 - для измерения величины оптической плотности КП №1; С1, С2 - № 3 - для измерения величины оптической плотности КП №2; D1, D2 - № 4 - для измерения величины оптической плотности КП №3; Е1, Е2 - № 5 - для измерения величины оптической плотности КП №4; F1, F2 - № 6 - для измерения величины оптической плотности КП №5; G1, G 2- № 7 - для измерения величины оптической плотности КП № 6 ; Н1, П2 - № 8 - для измерения величины оптической плотности контрольной сыворот ки. 7.2.1.2. Качественный анализ: А1, А2 - № 1 - для измерения величины оптической плотности раствора ТМБ; В1, В 2 - № 2 - для измерения величины оптической плотности КП №1 (отрицательный контроль); С 1, С2 - № 3 - для измерения величины оптической плотности КП №2 (слабоположи тельный контроль); D1, D2 - № 4 - для измерения величины оптической плотности КП № 6 (положительный контроль). 7.2.2. Внести во все лунки, кроме лунок А1 и А2, по 25 мкл аналитического буфе ра. 7.2.3. Внести в соответствующие лунки по 100 мкл калибровочных проб и кон трольной сыворотки, в оставшиеся лунки по 100 мкл исследуемых образцов в дубликатах. Примечание', общее время внесения калибровочных проб, контрольной сыворотки и исследуемых сывороток крови не должно превышать 15 минут, иначе время инкубации разных образцов будет значительно различаться, что приведет к неправильным резуль татам. 7.2.4. Инкубировать стрипы в течение 30 минут при встряхивании в термостати- руемом шейкере при температуре +37°С со скоростью 600-800 об/мин. --- стр. 34 --- Ю 1 7.2.5. Н е у д а л я я с о д е р ж и м о го л у н о к , во все лунки, кроме А1 и А2, немедленно внести по 50 мкл конъюгата анти-НВзА£-пероксидаза. 7.2.6. Инкубировать в течение 30 минут при встряхивании в т ер м о ст а т и р у ем о м ш ей к ер е п р и т е м п е р а т у р е + 3 7 °С со ск о р о ст ь ю 6 0 0 -8 0 0 о б /м и н . 7.2.7. По окончании инкубации удалить содержимое лунок в контейнер с дезинфи цирующим раствором ( 1% раствором гипохлорита натрия или 6% раствором перекиси во дорода) и промыть лунки пять раз. При каждой промывке во все лунки добавить по 300 мкл промывочного раствора, приготовленного по п. 7.1.4., встряхнуть рамку на шей кере в течение 5-10 секунд с последующим декантированием. После последнего деканти рования тщательно удалить остатки жидкости из лунок постукиванием рамки со стрипами в перевернутом положении по фильтровальной бумаге. Допускается промывка лунок при помощи автоматического промывочного устрой ства. 7.2.8. Немедленно внести во все лунки по 100 мкл раствора тетраметилбензидина. 7.2.9. И н к у б и р о в а т ь ст р и п ы в т е ч е н и е 10 м и н у т п р и в ст р я х и в а н и и в т е р м о с т а т и р у ем о м ш е й к ер е п р и т е м п е р а т у р е + 3 7 °С со с к о р о с т ь ю 6 0 0 -8 0 0 об/м и н . 7.2.10. Добавить во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор тетраметилбензидина, по 100 мкл стоп-реагента для остановки ферментной реакции, встряхивать на шейкере в течение 1-2 минут. 7.2.11. Если невозможно измерить оптическую плотность в лунках планшета непо средственно после выполнения п. 7 .2 .1 0 ., то следует иметь в виду, что окраска в лунках планшета стабильна в течение не более 20 минут при температуре +18...25°С . 8. Р Е Г И С Т Р А Ц И Я Р Е З У Л Ь Т А Т О В Измерить на фотометре вертикального сканирования оптическую плотность в лун ках при длине волны 450 нм. При регистрации результатов н е о б х о д и м о в ы ч и т а т ь величину оптической плот ности в лунках А1 и А2 из значений оптических плотностей всех остальных лунок. Примечание: среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках А1 и А2 не должно превышать 0,09 ед.ОП. 9. У Ч Е Т Р Е З У Л Ь Т А Т О В 9.1. К о л и ч е с т в е н н ы й ан ал и з 9.1.1. Построить калибровочный график зависимости оптических плотностей от концентрации HBsAg в калибровочных пробах (МЕ/мл) (Рисунок 2). Внешний вид графи ка зависит от способа преобразования осей. Примечание 1: для построения калибровочных графиков рекомендуется использо вать программное обеспечение «ИФА Мастер». Примечание 2: для построения калибровочного графика на масштабной бумаге не обходимо использовать данные оптических плотностей после вычитания из них средней величины оптической плотности лунок с ТМБ. Если программа фотометра не позволяет вычитать величину оптической плотно сти лунок Л1 и А2, то необходимо пользоваться формулой: В-Вт, 8