Набор реагентов для выявления ДНК возбудителя туляремии методом полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов (ГенТул - индикация - РЭФ) по ТУ 9398-048-01898109-2014 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 --- ИНСТРУКЦИЯ п о ПРИМ ЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИМ УЧЕТОМ РЕЗУЛБТАТОВ (ГЕНТУЛ - ИНДИКАЦИЯ - РЭФ) 1. НАЗНАЧЕНИЕ Набор реагентов для выявления ДНК возбудителя туляремии методом полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов (Геп Гул - индикация - РЭФ), далее - набор реагентов «ГенТул - индикация - РЭФ», предназначен для выявления ДНК возбудителя туляремии в клиническом, биологическом материаю и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции с электрофорет ическим учетом результатов. 2. ОБЛАСТБ ПРИМЕНЕНИЯ Область применения набора - клиническая лабораторная диагностика, эпидемиологический мониторинг. Набор реагентов может быть использован в учреждениях, имеющих Лицензию на деятельность в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных I-1V групп патогенности, стационарных и мобильных лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение на проведение работ с микроорганизмами I-IV групп патогенности. 3. ТРЕБОВАНИЯ К ПЕРСОНАЛУ, УЧАСТВУЮЩ ЕМУ В ВБШОЛНЕНИИ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследования могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с выс»им и средним медицинским, биологическим или иным образованием, окончившие соответствующие курсы специальной подготовки с освоением методов безопасной работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) I-II групп патогенности. 4. ПРИНЦИП МЕТОДА Выявление ДНК возбудителя туляремии методом полимеразной цепной реакции с электрофоретическим учетом результатов основано на амплификации фрагмента iglB C генов F ran cisella tu laren sis размером 268 п.н. Проведение анализа включает три основных этапа: выделение ДНК из проб клинического материала, амплификация участка ДНК возбудителя туляремии, регистрация образовавшихся ПЦР-продуктов (ампликонов) в агарозном геле после проведения электрофореза и его окраски бромидом этидия. Амплификация фрагмента ДНК происходит в буферном растворе за счет праймеров, комплементарных последовательности iglB C генов туляремийного микроба, смеси нуклеотидов (дНТФ), фермента I'aq ДНК-полимеразы в течение 35-40 циклов, состоящих из: денатурации при 95 отжига праймеров при 60 "С, достройки комплиментарной цепи при 72 °С. Все компоненты, за исключением фермента, содержатся в ПЦР-смеси-1 и ПЦР-смеси-РЭФ. --- стр. 2 --- 5. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА 7 реагентов: Реактив Описание Объем (мл) Количество ПЦР-емееь-1 Смесь праймеров, дНТФ и натрия азида, сухая, в виде белого осадка; после растворения - прозрачная бесцветная жидкость 0,06 5 пробирок ПЦР-емееь- РЭФ прозрачная фиолетовая жидкость, содержащая Грис-НС1; калия хлорид; магния хлорид; Tween-20, глицерин, бромфеноловый синий натриевая соль 0,6 1 пробирка Раетворитель прозрачная бесцветная жидкость, представляющая собой ГЬО, свободную от нуклеаз 0,6 1 пробирка I'aq ДНК- полимераза прозрачная бесцветная жидкость, представляющая собой фермент с активностью 5 ед/мкл 0,012 1 пробирка ТЕ-буфер прозрачная бесцветная жидкость, содержащая трис-11С1; Наг-ЭДТА 5,0 2 пробирки Минеральное маело бесцветная вязкая жидкость, представляющая собой минеральное масло легкое белое, парафиновое 1 2 пробирки ПКО ДНК F. tularensis ' • препарат ДНК F. tularensis, сухой, . в виде еледа от высушенной капли на дне пробирки; после растворения - прозрачная бесцветная жидкоезь 0,1 3 пробирки Набор реагентов «Ген Гул - индикация - РЭФ» расечитан на 60 определений е учетом контрольных образцов. 6. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛ! Ы*: Наименование Основные характеристики или обозначения документации, производитель Амплификатор Терцик Амплификатор Терцик, «ДНК-технология», Россия Ламинарный бокс биологической безопасности класс ПВ Ламинарный бокс биологической безопасности класс 1 1 ЬАВн-«Ламинар-С-1,2», «Ламинарные системы», Россия НЦР-бокс Бокс абакт'сриалыюй воздушной среды для работы с ДНК-пробами (ПЦР-бокс) при проведении 1 1 1 (Р-диагностики БАВ-ИЦР- "Ламинар-С" «Ламинарные системы», Россия Микроцснгрифуга-встряхиватель Микроцентрифуга-вс гряхиватель «ТЭТА-2», «Биоком», Россия Термостат твердотельный Термостат твердотельный от 25 до 100 °С, Термо 24-15, «Биоком», Россия. Микроцентрифуга настольная Микроцентрифуга на 13400 об/мин "Mini Spin" "Eppendorf, Германия Отсасыватель медицинский Отсасыватель медицинский "ОМ-1" ОАО "Утес", Россия --- стр. 3 --- Источник питания Источник питания "Эльф- 8" "ДНК- •техноло1'ия", Россия Камера для горизонтального электрофореза Камера для горизонтального электрофореза Sub Cell GT System "БиоРад", США Гель-документирующая система Гель-документирующая система Gel Doc 2000 "БиоРад", США Термостат твердотельный с функцией охлаждения термостат твердотельный с функцией охлаждения от 4 до 120 “С, «Биоком», Россия Набор электронных или механических дозаторов переменного объема Набор электронных или механических дозаторов iicpcMCHHOi o объема (0,5-10, 10-100 мкл, 100-1000 мкл), Eppendorf, Германия Ш гатив-подставка для дозаторов Штатив-подставка для дозаторов универсальная на 5 дозаторов, «Хеликон», Россия IlIiaTHB «рабочее место» для микропробирок на 0,6 мл Штатив «рабочее меето» для микропробирок на 0,6 мл, 10x20 мест, «Хеликон», Россия Штатив «рабочее место» для микропробирок на 1,5 мл ПЛтатив «рабочее место» для микропробирок на 1,5 M j i , 5x10 мест с увеличенным раеетоянием между лунками. «Хеликон». Россия Xoj[o;iHjibHHK от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 18°С «Атлан т», Россия 11аконсчники универсальные для дозаторов переменного объемом с аэрозольным барьером до 10 мкл ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США Наконечники универсальные для дозаторов переменного объемом с аэрозольным барьером до 100 мкл ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США Наконечники универсальные для дозаторов переменного объемом с аэрозольным барьером до 2 00 мкл ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США Наконечники универсальные для дозаторов переменн 010 объемом с аэрозольным барьером до 1000 мкл ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США Пробирки для ПЦР объемом 0,6 мл ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США Одежда одноразовая медицинская из нетканого и полимерного материалов РЗН 2013/668 Перчатки медицинские диагноетические одноразовые. Часть 1. Спецификация на перчатки из каучукового латекса или раствора ГОСТ Р 52239-2004 * 11римечание: допускается применение оборудования другого тина, по своим характеристикам не уступающего рекомендуемому. 7. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА Уеловия храпения - 11Ц,Р-смесь-1, ГЩР-смееь-РЭФ, Растворитель, ТК-буфер, ИКО ДНК F. tularensis, минеральное масло при температуре от плюс 2 до плюс 8 “С, Taq ДНК- полимсраза - при температуре от минус 16 до минус 20 “С. Срок годности - 9 месяцев. --- стр. 4 --- индикация - РЭФ» с истекшим сроком М ЕРЫ п р е:д о с т о р о ж н о с т и Использование набора реагентов «ГенТул годности недопустимо. Работу проводят в соответствии с требованиями СП 1.3.3118 - 13 «Безопасность работы с микроорганизмами 1-11 групп патогенности (опасности)», МУ 1.3.2569 - 09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых КИСЛО! при работе с материалом, содержаихим микроорганизмы I-1V групп патогенности». 9. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОГ,РАЗЦЫ Материалом для исследования служат: - пробы чистых культур микрооршнизмов: бактериальные суспензии культур туляремийного микроба или подозрительных изолятов; - пробы клинического материала; кровь, мокрот, промывные воды бронхов, мазок из носоглотки, пунктаты бубона, отделяемое язв; - пробы биологического материала: органы грызунов, зайцеобразных, насекомоядных и на:хемных хищников; эктопаразиты (блохи, клещи, комары); остатки пищи из гне:щ хищных н'гиц, их погадки, экскременты 1’ рызунов и хищников, - пробы объектов окружающей среды: почва, вода открытых водоемов. Материал для исследования забирают в стерильные емкости с герметично завинчивающимися крышками в соответствии с требованиями СП 1.3.3118 - 13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности», МУ 4.2.2039-05 «З'ехника сбора и транспортирования биоматсриалов в микробиологические лаборатории», МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Грапспортирование материала в лабораторию для исследований проводят при температуре от плюс 2 до плюс 8 °С в течение 1 суток в соответствии с СП 1.2.036 - 95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов 1-1V I'pyiiii патогенности». После проведения предварительной обработки проб допускается их зранспортировка при температуре от минус 16 до минус 20 “С в течение 7 суток или в сосуде Дьюара с жидким азотом - длительно. С целью предотврапхения хювреждения ДИК-михиеней возможно использ^^ние транспортной среды следующего состава: сахароза 0,218 моль, КН 2РО4 0,0038 моль К2НРО 4 0,0072 моль; БСЛ 1 %. При необходимости длительного хранения и (или) транспортирования, при отсутствии низкотемпературных холодильников, используют спеххиальную транспортную среду HSP: саркозил 1 %; ЭДТА 0,05 моль; проназа Е 1 мг/мл. Исследуемый материал может храниться в среде ESP при температуре от плюс 20 до плюс 30 в темном месте до 10 дней. 9.1. Подготовка проб чистых культур микроорганизмов. Из культур туляремийного микроба или подозрительных изолятов х отовят суспензии в 2 мл 0,9 % раствора натрия хлористого по отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц ФЕБУ «НЦЭСМП» (ОСО 42-28-85-П (ЮМЕ)), что соответствует 5x10^-м.к./мл для F. tularensis. Затем проводят 10-кратные разведения подготовленных суспензий в 0,9 % растворе натрия хлористого до конечной концентрации 1x 10^ м.к./мл. 9.2. Подютовка проб клинического мазериала: 9.2.1.Кровь Кровь у людей берут из локтевой вены в количестве 4,5 мл с помощью одноразовой иглы (диаметр 0,8-1,1 мм) и специальной вакуумной системы типа «Vacuett» с ЭДТА или цитратом натрия, или стерильным шприцем в стерильные стеклянные или пластиковые пробирки с цитратом натрия (3,8 % раствор цитрата натрия в соотношении 1:9). Аккуратно перемешивают покачиванием до полного смсхнивания с антикоагулянтом. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и выделения ДНК. --- стр. 5 --- 9.2.2. Мокрота Мокроту забирают в количестве не менее 1,0 мл в одноразовые градуированные стерильные флаконы с широким горлом и завинчивающимися крышками обьсмом не менее 50 мл. Для разжижения мокроты применяют .либо приготовленную ех tem pore смесь NALC (Ы-ацетил-1,-цистеина 0,25 г, 25 мл 4% раствора NaOll, 25 мл 0,1 моль тризамещенного натрия цитрата), либо раствор «Муколизин» (Na 2HP()4 0,0774 моль, Nall 2P0 4 0,0226 моль, бета-МЭ 0,094 моль, 5 % азид натрия в конечной концстрации 0,05 %). Пробу объемом 1-2 мл смешивают либо с равным объемом смеси NALC, либо с пятикратным об 1>емом раствора «Муколизин». Пробы со смесью NALC перемешивают покачиванием в течение 20-30 с и инкубируют в течение 15 мин, периодически вс гряхивая. Затем разводят фосфатным буфером 0,067 моль (pH 6,8) до конечного объема 50 мл. Пробу центрифугируют в течение 10 мин при 9000 об/мин. Осадок ресуспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлористого. Пробы с раствором «Муколизин» перемешивают покачиванием в течение 20-30 с и инкубируют в течение 20-30 мин, периодически встряхивая. Затем отбирают 1 мл разжиженной мокроты, помещают в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой и центрифугируют при 9000 об/мин в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлористого. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и выделения ДИК. 9.2.3. Промывные воды бронхов Для получения промывных вод бронхов при бронхоскопии вводят до 7 мл стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида. После чего 2-3 мл лаважной жидкости огбираю'г в стерильную пробирку. Из пробы отбирают 1 мл и помещают в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой, центрифугирует при 12000 об/мин в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлористого. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и выделения ДНК. 9.2.4. Мазок из носоглотки Взятие мазка из носоглотки проводят натощак или не ранее, чем через 2-4 часа после еды. Корень языка придавливают шпателем, материал берут стерильным зондом, не касаясь языка, слизистой полости рта, зубов, и помещают в пробирку с трансноргпой средой или 0,9 % раствором натрия хлористого объемом 100 мкл. Затем выполняю*;^тапы обеззараживания мазериала и выделения ДНК. 9.2.5. Пунктаты бубона, отделяемое язв Забор материала язвы или бубона производят стерильным шприцем. Если бубон имеет сохранившуюся кожу (невскрывшийся бубон), то ее протирают предварительно спиртом. Пункцию бубона производят как в его центре, так и на периферии. Из вскрывшегося бубона материал забирают в местах с сохраненной тканью, а также берут отделяемое бубона. Исследуемый материал в количестве не менее 100 мкл помещают в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с транспортной средой или 0,9 % раствором натрия хлористого обьсмом 100 мкл. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и выделения ДНК. 9.3. Под| оговка проб биологического материала 9.3.1. Пробы органов лабораторных и диких животных Органы лабораторных и диких животных отбирают при вскрытии, соблюдая регламентированные меры безопасности. Кусочки органов массой до Ю г растирают в стерильной ступке со стеклянным порошком, после чего добавляют 0,9 % раствор натрия хлорида в соотношении 1:5 (вес/объем). Надосадочную жидкость отбирают с помощью пипетки через ватный тампон в отдельную пробирку. Центрифугируют в течение 10 мин при 12000 об/мин. Осадок ресуспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлористого. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и выделения ДНК. 9.3.2. Пробы эктопаразитов (клещи, комары, блохи). --- стр. 8 --- в течение 5-10 е для оеаждения капель ео стенок пробирки. После растворения ПКО ДИК F. tularensis хранят при температуре минус 20 °С. 10.3.2. Подготовка реакционной смеси Из холодильной камеры извлекают ПЦР-смесь-1, ПЦР-смесь-РЭФ, ТЕ-буфер, минеральное масло, из морозильной камеры извлекают I’ aq ДНК-полимеразу и ПКО ДНК F. tularensis. Пробирку с ПКО ДНК F. tularensis полностью оттаивают, перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе и центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 5-10 с для осаждения капель со стенок пробирки. Определяют количество реакций в экснсримеиге из расчете: количество исследуемых проб, ОКБ, положительный контроль (К+) и отрицательный контроль (К-). Огбирают необходимое количество пробирок "ПЦР-смесь-1" из расчета, что одна пробирка рассчитана на 12 реакций. В пробирку добавляют 60 мкл Растворителя, выдерживают при комнатной температуре в течение 20-30 с, тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе в течение 5-7 с и центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 5-10 с для осаждения капель со стенок пробирки. Разведенную ПЦР-смесь-1 хранят при температуре плюс 4 “С не более 2 месяцев. • В о гдельной микронробиркс объемом 0,6 мл или 1,5 мл готовят реакционную смесь из расчета, что на 1 реакцию необходимо: Реагент Объем, мкл ПЦР-смссь-1 5 ПЦР-смесь-РЭФ 10 I'aq ДНК- нолимераза 0,2 тщательно перемешивают наПодготовленную смесь микроцентрифуге/встряхивателе. 10.3.3. Подготовка реакционных пробирок Для проведения реакции в штатив отбирают необходимое количество микронробирок объемом 0,6 мл. Затем в пробирки вносят по 15 мкл подготовленной реакционной смеси (п. 10.3.2.). Во все пробирки сверху добавляют каплю минерального масла (15-20 мкл). Затем в пробирки под масло вносят по 10 мкл ДНК из исследуемых проб и ОКВ. В микропробирку с отрицательным контролем амплификации (К-) вносят 10 мкл 'ГН-0у^)сра, в микропробирку с положительным контролем амплификации (К+) - 10 мкл ПКО ДНК F. tularensis. 10.3.4. Проведение термоциклирования 11одготовлецт 1ыс микроиробирки помешают в термоциклер. Запускают на термоциклере программу (таблица). Когда температура в ячейках достигнет 95 °С (режим паузы), пробирки помещают в ячейки прибора, закрывают крышку и снимают программу с паузы. Матричный режим 1 этап 2 этап 3 этап 4 этап 5 этап 6 этап 95 °С - пауза 95 °С - 5 мин 95 °С - 40 с 62 "С - 40 с 72 “С - 40 с 5 циклов 95 °С - 30 с 60 °С - 3 0 с 72°С- 30с 30 циклов 72 “С - 5 мин 10 “С - хранение Активный режим 1 этап 2 этап 3 этап 4 этап 5 этап 6 этан 95 Т - пауза 95 "С - 5 мин 95 °С-10с 62 “С - 1 0 с 72 °С- Юс 5 циклов 95 °С - 7 с 60 - 7 с 72 Т - 7 с 30 циклов 72 °С - 5 мин 10 “С - хранение По окончании ПЦР реакционную смесь (продукты реакции) хранят при температуре от 2 "С до 8 °С. --- стр. 9 --- 11. РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ Регистрацию результатов ПЦР осуществляют методом электрофореза в 1,7-2 % агарозном геле с использованием коммерческих наборов «ЭФ», «Комплект №1 для электрофоретической детекции» и др. Работу проводят в соответствии с инструкциями к указанным наборам. Электрофорез проводят при градиенте напряжения 10 В/см в течение 25-30 мин. 12. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ Результаты учитывают на основании наличия (или отсутствия) электрофореграмме специфичных полос амплифицированной ДНК. К учету результатов исследуемых проб приступают только в случае прохождения ноложизелглюго (К+), отрицательного (К-) контроля амплификации и ОКВ: Наименование контроля Амплификация фрагмента ДНК размером 268 п.н. К + + К- - ОКВ - Пробы Амплификация фрагмента ДНК размером 268 п.н. Результат анализа 0 > А ( U л ю ст о 5 & - 1 - Положительный/ В пробе выявлена ДНК F. tu laren sis — Огр и цате л ь н ы й / В пробе ДНК F. tu la ren sis нс обнаружена Выявляется полоса, не соответствующая фрагменту положительного контроля Отрицательный/ В пробе ДНК F. tu la ren sis не обнаружена 13. АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА 13.1. Аналитическая чувствительность. 11абор должен выявлять ДНК F. tularensis в суспензии концентрацией не менее 1X10‘ ^ м.к./мл. 13.2. Аналитическая специфичное гь. Набор не должен давать положительных результатов с ДНК микроорганизмов других родов суспензиях концентрацией Ix lO '^ м.к./мл 13.3. Диагностическая чувствительность Диагностическая чувствительность - не менее 98,5 % с доверительной вероятностью 90%. При исследовании 208 положительных проб (124 пробы бактериальных суспензий микроорганизмов и 84 пробы клинического, биологического материала и объектов окружающей среды), содержащих F. tularensis в концентрации 1x10 м.к./мл, положительный результат получен в 208 случаях. 13.4. Диагностическая специфичность Диагностическая специфичность - не менее 99 % с доверительной вероятностью 90%. При исследовании 208 положительных проб, содержащих возбудитель туляремии, положительный ответ получен в 208 случаях, при исследовании 60 отрицательных образцов, содержащих гетерологичные микроорганизмы в концентрации 1x10'* м.к./мл, отрицательный результат в НЦР получен во всех 60 случаях. 14. БЕЗОПАСНАЯ УТИЛИЗАЦИЯ Уничтожение нсиснользованных компонентов набора или наборов реагентов с истекшим сроком годности проводить в соответствии с СанПиН 2.1.7.2790-10. --- стр. 10 --- 15. ГАРАНТИИ И ИНФОРМАЦИЯ О ПРОИЗВОДИТЕЛЕ Производит ель гарантирует качество набора реагентов «ГенТул - индикация - РЭФ» при соблюдении условий транспортирования, хранения и эксплуатации в течение указанного срока г одности. Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Российский научно- исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы но надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора) (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46 Тел. (845-2) 51- 59-65). Зам. директора по экспериментальной и производственной работе ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора А.К. Никифоров Генеральный директор ООО «ВЫМПЕЛ-МЕДЦЕНТР» Ю.Н. Егоров 2 2 ИЮН 2015