Набор реагентов для идентификации штаммов возбудителя чумы методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени (ГенПест - идентификация - РГФ) по ТУ 9398-051-01898109-2014 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 ---
«УТВЕРЖДАЮ»
Директор*ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»
Роспотребнадзора
Ъ Кутырев В.В.
Ю 2(У^г.« - »-•
/ ^ ч
п н с т р Ш ц Ш ^ ^ ^
ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ
ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ М ЕТОДОМ МУЛ Ы ИЛ ОКУ (НОЙ
ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ В РЕЖИМЕ
РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
(ГЕНПЕСТ - ИДЕНТИФИКАЦИЯ - РГФ)
1. НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов для идентификации штаммов возбудителя чумы методом
мультилокусной полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального
времени (ГенПест - идентификация - РГФ), далее - набор реагентов «ГенПест -
идентификация - РГФ», предназначен для выявления чумного микроба и
дифференциации вирулентных изолятов от авирулентных, выделенных из клинического,
биологического материала и проб из объектов окружающей среды, методом
мультилокусной полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального
времени.
2. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Область применения набора - клиническая лабораторная диагностика,
эпидемиологический мониторинг. Набор реагентов может быть использован в
учреждениях, имеющих Лицензию на деятельность в области использования возбудителей
инфекционных заболеваний человека и животных 1-1У групп патогенности,
стационарных и мобильных лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое
заключение на проведение работ с микроорганизмами 1-1У групп патогенности.
3. ТРЕБОВАНИЯ К ПЕРСОНАЛУ, УЧАСТВУЮЩЕМУ В ВЫПОЛНЕНИИ
ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и
средним медицинским, биологическим или иным образованием, окончившие
соответствующие курсы специальной подготовки с освоением методов безопасной
работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) 1-П групп патогенности.
4. ПРИНЦИП МЕТОДА
Идентификация штаммов возбудителя чумы методом мультилокусной
полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени
основано на амплификации
гена р1а на плазмиде рР$1 чумного микроба с образованием флуоресценции по
каналу РАМ,
локуса За на хромосоме чумного микроба с образованием флуоресценции по каналу
ЮЕ,
гена со/7 на плазмиде рРга чумного микроба с образованием флуоресценции по
каналу КОХ,
гена кт$Н на хромосоме чумного микроба с образованием флуоресценции по каналу
РАМ,
гена 1гр2 на хромосоме чумного микроба с образованием флуоресценции по каналу
ЮЕ,
--- стр. 2 ---
гена 1сгУ на плазмиде рСасЗ чумного микроба с образованием флуоресценции по
каналу КОХ
Вирулентные штаммы чумного микроба содержат в составе хромосомы
полноценную область пигментсорбции (р§т) и плазмиду рСаб, тогда как авирулентные
изоляты - лишены одной или обеих детерминант вирулентности. Детекцию области
пигментсорбции проводят на основании наличия генов ктяН и кр2 , детекцию плазмиды
рСаб - на основании наличия гена 1сгУ.
Проведение анализа включает два основных этапа: выделение ДНК из проб чистых
культур, амплификация участков ДНК возбудителя чумы на приборе типа Ко1ог Сепе и
регистрация с помощью программного обеспечения кривых флуоресценции.
Амплификация фрагмента ДНК генов За, р1а, са/1 происходит в одной
реакционной смеси при использовании ПЦР-смеси-К1, генов ктяН, кр2, 1сгУ - ПЦР-
смеси-К2. Тип используемых зондов - ТацМап. Образование флуоресцентного сигнала
происходит за счет освобождения флуоресцентных меток при расщеплении зонда
ферментом Тац ДНК-полимераза (З’-экзонуклеазная активность). С каждым циклом ПЦР
число свободных флуоресцентных меток экспоненциально возрастает, что приводит к
повышению уровня флуоресценции в пробирке. Учет результатов флуоресценции
проводят по каждому каналу отдельно.
5. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА
Компоненты набора являются одноразовыми. В состав набора входят 7 реагентов:
Реактив Описание Объем
(мл)
Количество
ПЦР-смесь-
К1
Смесь праймеров, дНТФ и натрия азида,
сухая, в виде розоватого осадка; после
растворения - прозрачная бесцветная
жидкость
0,06 5 пробирок
ПЦР-смесь-
К2
Смесь праймеров, дНТФ и натрия азида,
сухая, в виде розоватого осадка; после
растворения - прозрачная бесцветная
жидкость
0,06 5 пробирок
ПЦР-смесь-
РГФ
прозрачная фиолетовая жидкость,
содержащая Трис-НС1; калия хлорид; магния
хлорид; Т\уееп-20, глицерин
0,6 2 пробирки
Растворитель прозрачная бесцветная жидкость,
представляющая собой Н 2О, свободную от
нуклеаз
0,6 2 пробирки
Тая ДНК-
полимераза
прозрачная бесцветная жидкость,
представляющая собой фермент с
активностью 5 ед/мкл
0,024 1 пробирка
ТЕ-буфер прозрачная бесцветная жидкость,
содержащая трис-НС1; Ыа 2-ЭДТА
5,0 2 пробирки
ПКО ДНК У.
резИ$
препарат ДНК У. рея!к, сухой, в виде следа
от высушенной капли на дне пробирки; после
растворения - прозрачная бесцветная
жидкость
0,1 6 пробирок
Набор реагентов «ГенПест - индентификация - РГФ» рассчитан на 60 определений с
учетом контрольных образцов.
2
--- стр. 3 ---
6. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ*:
Наименование Основные характеристики или обозначения
документации, производитель
Амплификатор типа ЛоЮгОепе Амплификатор «КоЮгОепе 3000», «КоЮгОепе
6000», «КоШгОепе 0», «(Да§еп», Германия
Ламинарный бокс биологической
безопасности класс ПВ
Ламинарный бокс биологической
безопасности класс II БАВп-«Ламинар-С-1,2»,
«Ламинарные системы», Россия
ПЦР-бокс Бокс абактериальной воздушной среды для
работы с ДНК-пробами (ПЦР-бокс) при
проведении ПЦР-диагностики БАВ-ПЦР-
"Ламинар-С" «Ламинарные системы», Россия
Микроцентрифуга-встряхиватель Микроцентрифуга-встряхиватель «ТЭТА-2»,
«Биоком», Россия
Термостат твердотельный Термостат твердотельный от 25 до 100 °С,
Термо 24-15, «Биоком», Россия.
Микроцентрифуга настольная Микроцентрифуга на 13400 об/мин "МЫ 8рш"
"ЕррепёогГ, Германия
Отсасыватель медицинский Отсасыватель медицинский "ОМ-1" ОАО
"Утес", Россия
Термостат твердотельный с функцией
охлаждения
термостат твердотельный с функцией
охлаждения от 4 до 120 °С, «Биоком», Россия
Дозатор 0,5-10 мкл ВюЬк, Финляндия
Дозатор 10 - 100 мкл ВюЬк, Финляндия
Дозатор 20 - 200 мкл ВюЬк, Финляндия
Дозатор 100 - 1000 мкл ВюЬк, Финляндия
Штатив-подставка для дозаторов Штатив-подставка для дозаторов
универсальная на 5 дозаторов, «Хеликон»,
Россия
Штатив «рабочее место» для
микропробирок на 0,2 мл
Штатив «рабочее место» для микропробирок
на 0,2 мл, 10x20 мест, «Хеликон», Россия
Штатив «рабочее место» для
микропробирок на 1,5 мл
Штатив «рабочее место» для микропробирок
на 1,5 мл, 5х 10 мест с увеличенным
расстоянием между лунками, «Хеликон»,
Россия
Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной
камерой не выше минус 18°С
«Атлант», Россия
Наконечники универсальные для
дозаторов переменного объемом с
аэрозольным барьером до 10 мкл
ФСЗ 2009/05025 «Аху§еп», США
Наконечники универсальные для
дозаторов переменного объемом с
аэрозольным барьером до 100 мкл
ФСЗ 2009/05025 «Аху§еп», США
Наконечники универсальные для
дозаторов переменного объемом с
аэрозольным барьером до 200 мкл
ФСЗ 2009/05025 «Аху§еп», США
Наконечники универсальные для
дозаторов переменного объемом с
аэрозольным барьером до 1000 мкл
ФСЗ 2009/05025 «Аху^еп», США
3
--- стр. 4 ---
4
У
1 Микроцентрифужные пробирки объемом
1,5 мл
ФСЗ 2012/11892 «Аху§еп», США
Пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с
плоской крышкой
ФСЗ 2012/11892 «Аху§еп», США
Одежда одноразовая медицинская из
нетканого и полимерного материалов
РЗН 2013/668
Перчатки медицинские диагностические
одноразовые. Часть 1. Спецификация на
перчатки из каучукового латекса или
раствора
ГОСТ Р 52239-2004
* Примечание: допускается применение оборудования другого типа, по своим
характеристикам не уступающего рекомендуемому.
7. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ, ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ
НАБОРА
Транспортирование набора реагентов «ГенПест - идентификация - РГФ»
осуществляют всеми видами крытых транспортных средств в соответствии с
требованиями ГОСТ 15150 и правилами, установленными для каждого вида транспорта.
Условия транспортирования - при температуре от 2 до 8 °С не более 2 суток, при
температуре от минус 16 до минус 20 °С - неограниченно.
Условия хранения компонентов набора реагентов «ГенПест - идентификация -
РГФ» - ПЦР-смесь-К1, ПЦР-смесь-К2, ПЦР-смесь-РГФ, Растворитель, ТЕ-буфер, ПКО
ДНК У. ре$И$ при температуре от плюс 2 до плюс 8 °С, Тац ДНК-полимераза - при
температуре от минус 16 до минус 20 °С. Срок годности - 9 месяцев.
Условия эксплуатации набора реагентов «ГенПест - идентификация - РГФ» - при
температуре от 18 до 25 °С. Срок хранения сухих компонентов ПЦР-смесь-К1, ПЦР-
смесь-К2, ПКО ДНК У. ре$И$ после растворения - 2, 2 и 6 месяцев, соответственно.
8. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Использование набора реагентов «ГенПест - идентификация - РГФ» с истекшим
сроком годности недопустимо.
Работу проводят в соответствии с требованиями СП 1.3.3118- 13 «Безопасность
работы с микроорганизмами 1-П групп патогенности», МУ 1.3.2569 - 09 «Организация
работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при
работе с материалом, содержащим микроорганизмы 1-1V групп патогенности».
9. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ
Материалом для исследования служат суспензии культур чумного микроба или
подозрительных изолятов.
Из культур чумного микроба или подозрительных изолятов готовят суспензии в
2 мл 0,9 % раствора натрия хлористого по отраслевому стандартному образцу мутности 10
единиц ФГБУ «НЦЭСМП» (ОСО 42-28-85-П (ЮМЕ)), что соответствует 1x109 м.к./мл для
У. резИз. Затем проводят 10-кратные разведения подготовленных суспензий в 0,9 %
растворе натрия хлористого до конечной концентрации 1 х 104 м.к./мл.
10. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
ПЦР-анализ состоит из следующих этапов: обеззараживание материала, выделение
ДНК; амплификация, регистрация и учет результатов.
10.1 Обеззараживание материала:
Подготовленные для исследования пробы обеззараживают в соответствии с МУ
1.3.2569 - 09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации
4
--- стр. 5 ---
нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы 1-1У групп
патогенности».
Дополнительно к исследуемым образцам готовят отрицательный контроль
выделения (ОКВ). Для этого в отдельную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл
вносят 100 мкл ТЕ-буфера.
К исследуемым образцам и ОКВ добавляют натрия мертиолят до концентрации
1:10000 (0,01%) с последующим прогреванием их при (56±1) °С в течение 30 минут.
Затем к 100 мкл образцов, обработанных мертиолятом натрия и разлитых в
микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, добавляют лизирующий буфер на основе
6 моль гуанидинизотиоцианата в объеме, указанном в инструкции к набору для выделения
ДНК, и инкубируют 15 минут при температуре (65±1) °С. После выполнения данного
этапа материал считается обеззараженным.
10.2 Выделение ДНК
Выделение ДНК осуществляют методом нуклеосорбции на силикагеле в
присутствии гуанидинтиоцианата с использованием коммерческих наборов «ДНК-сорб
В», «Рибо-преп» или аналогичных. Работу проводят в соответствии с инструкциями к
указанным наборам.
10.3 Проведение ПЦР - амплификации ДНК
10.3.1. Подготовка ПКО ДНК У. ре$М$
Перед началом работы готовят ПКО ДНК У. реаИа. Для этого в пробирку с сухим
ПКО добавляют 100 мкл растворителя, выдерживают при комнатной температуре в
течение 20-30 с, тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе в течение
5-7 с и центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 5-10 с для осаждения капель со
стенок пробирки. После растворения ПКО ДНК У. ре$И$ хранят при температуре минус
20 °С.
10.3.2. Подготовка реакционной смеси
Проведение исследований с набором реагентов «ГенПест- идентификация - РГФ»
включает одномоментную постановку реакции в двух пробирках для каждой исследуемой
пробы или контрольного образца. В одной пробирке используется ПЦР-смесь-К1
(предназначена для амплификации фрагментов генов р1а, За и са/1), во второй - ПЦР-
смесь-К2 (предназначена для амплификации генов ИтяН, 1гр2 и /стР). Тая-полимераза и
«ПЦР-смесь- РГФ» используются с обеими реакционными смесями («К1» и «К2»)
одинаково.
Из холодильной камеры извлекают ПЦР-смесь-К1, ПЦР-смесь-К2, ПЦР-смесь-
РГФ, ТЕ-буфер, из морозильной камеры извлекают Тац ДНК-полимеразу и ПКО ДНК У .
ре$И$. Пробирку с ПКО ДНК У. рехНз полностью оттаивают, перемешивают на
микроцентрифуге/встряхивателе и центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 5-10
с для осаждения капель со стенок пробирки.
Определяют количество реакций в эксперименте для каждой ПЦР-смеси (К1, К2)
из расчета: количество исследуемых проб, ОКВ, положительный контроль (К+) и
отрицательный контроль (К-).
Отбирают необходимое количество пробирок «ПЦР-смесь-К1» и «ПЦР-смесь-К2»
из расчета, что одна пробирка рассчитана на 12 реакций. В пробирки добавляют 60 мкл
Растворителя, выдерживают при комнатной температуре в течение 20-30 с, тщательно
перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе в течение 5-7 с и центрифугируют при
3000-5000 об/мин в течение 5-10 с для осаждения капель со стенок пробирки.
Разведенную ПЦР-смесь-1 хранят при температуре плюс 4 °С не более 2 месяцев.
В отдельной микропробирке объемом 0,6 мл или 1,5 мл готовят реакционную смесь
из расчета, что на 1 реакцию необходимо:
5
--- стр. 6 ---
Реагент Объем, мкл
ПЦР-смесь-К1 или К2 5
ПЦР-смесь-РЕФ 10
Тац ДНК-полимераза 0,2
Подготовленную смесь тщательно перемешивают на
микроцентрифуге/встряхивателе.
10.3.3. Подготовка реакционных пробирок
Для проведения реакции в штатив отбирают необходимое количество
микропробирок объемом 0,2 мл. Затем в пробирки вносят по 15 мкл подготовленной
реакционной смеси (п. 10.3.2.).
Затем в пробирки вносят по 10 мкл ДНК из исследуемых проб и ОКБ. В
микропробирку с отрицательным контролем амплификации (К-) вносят 10 мкл ТЕ-буфера,
в микропробирку с положительным контролем амплификации (К+) - 10 мкл Г1КО ДНК У .
ре 8118.
10.3.4. Проведение термоциклирования
Подготовленные микропробирки помещают в термоциклер типа КхДогОепе.
Программирование амплификатора:
Для работы с прибором «Яо1ог-Оепе» 3000 используют программу “К.о1ог-Оепе 6”, с
прибором «Ко1ог-Оепе» 6000- программу “Ко1ог-Оепе 6000” версии 1.7 (ЪиПё 67) или выше.
При описании программы термины для каждой версии программы представлены следующим
образом: для прибора «К.о{ог-Оепе» 3000 / для англоязычной версии программы «Ко1ог-
Оепе» 6000 / для русскоязычной версии программы «К.о1ог-Оепе» 6000.
1. Нажимают кнопку «Ые\у»/«Новый» в основном меню программы.
2. В открывшемся окне выбирают меню «А<Зуапсеб»/«Детальный мастер» Нажимают
кнопку «1Ме\у»/«Новый». .
3. Выбирают тип ротора «36АУе11 КоЮг»/«36-луночный ротор». Ставят отметку в окне
рядом с надписью «N 0 Оотес! 0.2 т1 ТиЬез»/«Ьоскт§ пп§ аПасЬес1»/«Кольцо закреплено».
4. Нажимают кнопку «Ыех1»/«Далее».
5. Выбирают объем реакционной смеси: КеасПоп уо1ите/Объем реакции - 25 мкл. Для
прибора «Ко1ог-Оепе» 6000 должно быть активно (отмечено галочкой) окно «15 р1 оП 1ауег
уо1ите»/«15 рЬ объем масла/воска».
6. Нажимают кнопку «1ЧехЬ>/«Далее».
7. В верхней части окна нажимают кнопку «Е(Ш ргоШе»/«Редактор профиля».
8. Задают следующие параметры эксперимента:
8.1. Но1ё/Удерж. температуры 95 °С - 5 мин
8.2. СусНп§/Циклирование 95 °С - 30 с
60 °С - 30 с
72 °С - 30 с
о́тез/раз.
8.3.Сус1т§2/Циклирование2
Сус1е гереа^з/Цикл повторить - 10
95 °С - 20 с
56 °С - 20 с - Детекция
72 °С - 20 с
Сус1е гереа1з/Цикл повторить - 35
йтез/раз.
Флуоресценцию измеряют при 56 °С (во втором блоке циклирования) по каналам
РАМ/Огееп, ЮЕ/Уе11о\у, К.ОХ/Огап§е.
8.4. Нажимают кнопку «ОК»/«Да».
9. В нижней части окна нажимают кнопку «СаНЬга1е»/«Оат Ор11т1забоп...»/«Опт.
уровня сигн.». В открывшемся окне нажимают кнопку «СаНЬга1е Асяи1п炙/«Орбгп18е
Асяи1п炙/ «Опт. детек-мых». Для красителей РАМ/Огееп, ЮЕ/Уе11о\у и КОХ/Огапде
указывают в графе Мт КеасИп§/Миним. Сигнал значение 5, а в графе Мах КеасИщ/Максим.
6
--- стр. 7 ---
Сигнал значение 10. В графе ТиЬе рояШоп/Позиция Пробирки указан номер пробирки, по
которой будет автоматически выбран параметр <<§шт>/«усиление сигнала», по умолчанию это
1-я пробирка в роторе. Поэтому в 1-ой позиции в роторе должна ставиться пробирка с
реакционной смесью (ПЦР-смесь «К1»), Помечают галочкой бокс в строке «Рег/огт
СаИЪгаИоп Ве/оге Г' АсцитПоп»А«Рег/огт ОрНптаПоп Ве/оге Р' АсдишНоп»/«Выполнить
оптимизацию при 1-м шаге детекции». Закрыть окно АШо Сат СаИЪгаИоп Ве(ир/Авто-
оптимизация уровня сигнала , нажимают кнопку «С1озе»/«Закрыть». Нажимают кнопку
«Ыех1»/«Далее».
10. Запускают амплификацию кнопкой «ЗШЛ гип»/«Старт».
11. Дают название эксперимента и сохраняют его на диске (в этом файле будут
автоматически сохранены результаты данного эксперимента).
В процессе работы амплификатора или по окончании его работы программируют
положение пробирок в карусели. Для этого используют кнопку «Ебк затр1ез»/«Правка
образцов» (в нижней правой части основного окна). Все пробы и контроли обозначают
меню 8ашр1ез/Образцы как Е1пкпошпЛ4еизвестный.
11. РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Регистрацию результатов реакции с использованием ПЦР-смеси-К1 и ПЦР-
смеси-К2 проводят единообразно.
Регистрация результатов амплификации по каналу ГАМ/Сгееп:
Нажимают в меню кнопку «Апа1уз1з»/«Анализ», выбирают режим анализа
«С)иапШайоп»/«Количественный», выбирают в меню «СусПп§ А. РАМ»/«Сус1т§ А.
Огееп», нажимают кнопку «8Ьо\у»/«Показать».
1. Отменяют автоматический выбор ТЬгезЬоЫ/Порог.
2. В меню основного окна ОиапПШюп апа1у51з/Количественный анализ активируют
кнопки «□упагшс 1иЬе»/«Динамич.фон», «81оре Соггес1»/«Коррек. уклона», «1§поге Ркз1 -
10 Сус1ез»/«Игнор. первые - 10 циклов».
3. Выбирают линейную шкалу графического изображения результатов, нажимают
кнопку Ыпеаг зса1е/Линейная шкала, в нижней части окна справа (если эта шкала активна
по умолчанию, вместо кнопки Ыпеаг зса1е/Линейная шкала видна кнопка Ьо§ зса1е/Лог.
шкала).
4. В меню окна «Моте зект§з»/«ОиШег Кетоуа1»/«Устранение выбросов» установить
значение 1ЧТС ЫгезЬоЫ/Порог Фона - ПФ (1ЧТС) - 10 %.
5. В меню «СТ Са1си1абоп»/«Вычисление СТ» (в правой части окна) выставить
ТЬгезкоЫ/Порог = 0,05, «ЕПгшпа1е Сус1ез ВеГоге - 8»/«Исключить циклы до - 8».
6. В таблице результатов (окно «ОиапР К.езикз»/«Количественные Результаты»)
появятся значения порогового цикла (С1).
Регистрация результатов амплификации по каналу .ЮЕ/УеИолу:
Нажимают в меню кнопку «Апа1уз1з»/«Анализ», выбирают режим анализа
«Риап1ка1:юп»/«Количественный», выбирают в меню «СусНп^ А. ЮЕ»/«СусПп§ А.
Уе11о\у», нажимают кнопку «8Ьо\у»/«Показать».
1. Отменяют автоматический выбор ТЬгезЬоЫ/Порог.
2. В меню основного окна ()иап1:ка1:юп апа1у81з/Количественный анализ активируют
кнопки «Оупагтпс 1иЬе»/«Динамич. фон», «81оре СоггесЪ>/«Коррек. уклона», «1^поге Ркз! -
10 Сус1ез»/«Игнор. первые - 10 циклов».
3. Выбирают линейную шкалу графического изображения результатов, нажимают
кнопку Ыпеаг зса1е/Линейная шкала, в нижней части окна справа (если эта шкала активна
по умолчанию, вместо кнопки Ыпеаг зса1е/Линейная шкала видна кнопка Ео§ зса1е/Лог.
шкала).
4. В меню окна «Моте зеШп§5»/«ОиШег Кетоуа1»/«Устранение выбросов» установить
значение ЕГГС ЫгезЬоЫ/Порог Фона - ПФ (ТМТС) - 10 %.
5. В меню «СТ Са1си1а1юп»/«Вычисление СТ» (в правой части окна) выставить
7
--- стр. 8 ---
/
ГкезкоЫ/Порог = 0,05, «ЕНтта1е Сус1ез ВеРоге - 8»/«Исключить циклы до - 8».
6. В таблице результатов (окно «С>иаЩ. Кезикз»/«Количественные Результаты»)
появятся значения порогового цикла (С1).
Регистрация результатов амплификации по каналу КОХ/Огап§е:
Нажимают в меню кнопку «Апа1уз15»/«Анализ», выбирают режим анализа
«(Зиап1какоп»/«Количественныю>, выбирают в меню «СусПп§ А. К.ОХ»/«Сус1т§ А.
Огап§е», нажимают кнопку «8ко\у»/«Показать».
1. Отменяют автоматический выбор Ткгезко1<3/Порог.
2. В меню основного окна (ЗиагйкаОоп апа1уз1з/Количественный анализ активируют
кнопки «Оупагшс 1иЪе»/«Динамич. фон», «81оре Соггес1»/«Коррек. уклона», «1§поге Ркз! -
10 Сус1ез»/«Игнор. первые - 10 циклов».
3. Выбирают линейную шкалу графического изображения результатов, нажимают
кнопку Ыпеаг зса1е/Линейная шкала, в нижней части окна справа (если эта шкала активна
по умолчанию, вместо кнопки Ыпеаг зса1е/Линейная шкала видна кнопка Ьоу зса1е/Лог.
шкала).
4. В меню окна «Моге зеШп§з»/«ОиШег К.етоуа1»/«Устранение выбросов» установить
значение ЫТС ФгезкоШ/Порог Фона - ПФ (МТС) - 5 %.
5. В меню «СТ Са1си1акоп»/«Вычисление СТ» (в правой части окна) выставить
ТкгезкоМ/Порог = 0,05, «ЕНтшаЩ Сус1ез ВеРоге - 8 » /« И с к л ю ч и т ь циклы до - 8».
6. В таблице результатов (окно «ОиапР Кезикз»/«Количественные Результаты»)
появятся значения порогового цикла (СО-
12. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Результаты учитывают на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой
флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что
соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Сб> в
соответствующей графе в таблице).
Пороговое значение С1 для положительных проб по каналам РАМ, ЗОЕ, К.ОХ с ПЦР-
смесью-К1, ПЦР-смесью-К2 составляет во всех случаях не более 33. Если значение (С1)
более 33, требуется повторить ПЦР. Если при повторном исследовании получено значение
(С1) не более 33, результат считают положительным. При повторном получении значение
(С1) более 33, требуется повторить весь анализ, начиная с этапа подготовки проб.
К учету результатов исследуемых проб приступают только в случае прохождения
положительного (К+), отрицательного (К-) контролей амплификации и ОКБ. _________
Контроли Значения порогового цикла (С1) по каналам
ПЦР-смесь-К1 ПЦР-смесь-К2
РАМ
(Огееп)
ЮЕ
(Уе11о\у)
К.ОХ
(Огап§е)
РАМ
(Огееп)
ЮЕ
(Уе11о\у)
КОХ
(Огап§е)
К+ <33 <33 <33 <33 <33 <33
К- ОФ ОФ ОФ ОФ ОФ ОФ
ОКБ ОФ ОФ ОФ ОФ ОФ ОФ
Примечание: ОФ - отсутствие флуоресценции
8
--- стр. 9 ---
Учет и интерпретацию результатов проводят в соответствии с таблицей.
Пробы Значения порогового цикла (СД по каналам Результат анализа
ПЦР-смесь- К1 ПЦ]5-смесь-К2
РАМ
(Огее
п)
ЗОЕ
(Уе11о
ш)
КОХ
(Огап
ве)
РАМ
(Огее
п)
ЗОЕ
(Уе1
1о\у)
КОХ
(Огап
ее)
Р1а За са/1 ктяН 1гр2 1сгУ
<33
или
ОФ
<33 <33
или
ОФ
<33 <33 <33 Положительный
В пробе выявлена ДНК
вирулентного штамма
чумного микроба,
содержащего полноценную
область пигментсорбции
(р§т+) и плазмиду рСас!
^следуемые пробы
<33
или
ОФ
<33 <33
или
ОФ
ОФ ОФ <33 Положительный
В пробе выявлена ДНК
авирулентного штамма
чумного микроба, у которого
отсутствует полноценная
область пигментсорбции
(РЙШ-)
К <33
или
ОФ
<33 <33
или
ОФ
<33 <33 ОФ Положительный
В пробе выявлена ДНК
авирулентного штамма
чумного микроба, у которого
отсутствует плазмида рСас1
<33
или
ОФ
ОФ <33
или
ОФ
<33
или
ОФ
<33
или
ОФ
<33
или
ОФ
Отрицательный
Штамм не относится
к виду У резкз
Примечание: ОФ - отсутствие флуоресценции
13. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
13.1. Аналитическая чувствительность.
Набор должен выявлять ДНК У. ре$И$ в суспензиях концентрацией не менее 1 х 104
м.к./мл и дифференцировать вирулентные изоляты от авирулентных по наличию
полноценной области пигментсорбции и плазмиды рСаё.
13.2. Аналитическая специфичность
Набор не должен давать положительных результатов с ДНК микроорганизмов других
родов в суспензиях концентрацией 1 х 104 м.к./мл.
13.3. Диагностическая чувствительность
Диагностическая чувствительность - не менее 98,5 % с доверительной вероятностью 90
% при исследовании 200 положительных образцов, содержащих У. ре$Н$ в концентрации
не менее 1><104 м.к./мл; не менее 98,5 % с доверительной вероятностью 90 % при
дифференциации 200 образцов, содержащих вирулентные или авирулентные штаммы У.
резИз в концентрации не менее 1 х 104 м.к./мл.
13.4. Диагностическая специфичность
Диагностическая специфичность - не менее 99 % с доверительной вероятностью 90%
при исследовании 200 положительных образцов, содержащих У ре$(В, в концентрации не
менее 1*Ю4 м.к./мл, и 60 отрицательных образцов, содержащих гетерологичные
микроорганизмы (РЛгйагепш, Ь.рпеиторкИа, В. аШкгасУ, В.аЪоПин, У.ско1егае,
9
--- стр. 10 ---
Еп1егоЪас1ег, Б.аигет, 8. тШз, Р. \щ1рагЕ, К.рпеитотае, Е.соН, Р.аеги&пояа, М. тограпИ,
У.р$еис1о1иЪегси1о515), в концентрации не менее 1><104м.к./мл.
14. БЕЗОПАСНАЯ УТИЛИЗАЦИЯ
Уничтожение неиспользованных компонентов набора или наборов реагентов с
истекшим сроком годности проводить в соответствии с СанПиН 2.1.7.2790-10.
15. ГАРАНТИИ И ИНФОРМАЦИЯ О ПРОИЗВОДИТЕЛЕ
Производитель гарантирует качество набора реагентов «ГенПест - идентификация
- РГФ» при соблюдении условий транспортирования, хранения и эксплуатации в течение
указанного срока годности.
Производитель - Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Российский
научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по
надзору в сфере защиты прав потребителей и благопдоу-чии«4*адовека (ФКУЗ РосНИПЧИ
«Микроб» Роспотребнадзора) (410005, г. Саратов,^^^д авер ^^р кая, 46 Тел. (845-2) 51-
69-65).
Зам. директора по экспериментальной и
производственной работе ФКУЗ
РосНИПЧИ «Микроб»
Генеральный директор
ООО «Вымпел-медцентр»
А.К.Никифоров
Ю.Н.Егоров
I г И Ю Н 2 0 1 5
10