Набор реагентов для выявления и ускоренной идентификации холерных вибрионов методом полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени (ГенХол - идентификация - РГФ) по ТУ 21.20.23-053-01898109-2016 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 --- ИПЧИ «Микроб» fXbipcB B.R 1.Ш. ИНСТРУКЦИЯ по ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И УСКОРЕННОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ (ГЕНХОЛ - ИДЕНТИФИКАЦИЯ - РГФ) по ТУ 21.20.23-053-01898109-2016 1. НАЗНАЧЕНИЕ Набор реагентов для выявления и ускоренной идентификации холерных вибрионов методом полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени (ГенХол - идентификация - РГФ)», далее - набор реагентов «ГенХол - идентификация - РГФ», предназначен для выявления ДНК возбудителя холеры в пробах клинического материала и объектов окружающей среды с одновременным определением его эпидемической значимости, серогруппы, биовара и принадлежности холерных вибрионов биовара эльтор к генетически измененным вариантам по ctxB гену методом полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени. Холера - особо опасное инфекционное заболевание с диарейным синдромом, фекально-оральным механизмом передачи возбудителя инфекции, водным, пищевым и контактным путями распространения. Возбудитель холеры - холерный вибрион относится к семейству Vibrionaceae, роду Vibrio и виду Vibrio cholerae. V cholerae по наличию специфического 0-антигена распределяются на серологические группы. В настоящее время известно 206 серологических 0-групп холерных вибрионов. Возбудителями холеры являются холерные вибрионы 01 и 0139 серологических групп, холерные вибрионы не 01/не 0139 серологических групп могут вызывать спорадические или групповые случаи диарей, не склонные к эпидемическому распространению. Холерные вибрионы в пределах 01 серогруппы делятся на два биовара: классический и эльтор, имеющих существенные фенотипические и генетические отличия. В последние годы во всем мире щирокое распространение получили генетически измененные варианты холерных вибрионов биовара эльтор, которые характеризуются более высокой вирулентностью. Область применения набора - клиническая лабораторная диагностика, эпидемиологический мониторинг. Набор реагентов используется в клинической лабораторной диагностике для исследования материала, полученного от лиц обоего пола любого возраста с подозрением на холеру вне зависимости от формы и наличия манифестации заболевания (больных, вибриононосителей, контактных), а также в ходе эпидемиологического мониторинга объектов окружающей среды, в том числе проб воды из поверхностных водоёмов, хозяйственно-бытовых и сточных вод, смывов с объектов окружающей среды, пищевых продуктов. Инструкция по применению "ГенХол - идентификация - РГФ" Страница 1 из 41 --- стр. 2 --- 2. ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗДЕЛИЯ Для проведения исследований могут быть использованы амплификаторы для ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени типа RotorGene (RG) и CFX. Компоненты набора являются одноразовыми. В состав набора входят 12 реагентов: № п/п Реактив Описание Объем (мл) Количество 1. ПЦР-смесь-эпид Смесь праймеров, зондов, дНТФ и натрия азида - прозрачная бесцветная жидкость 0,25 1 пробирка 2 . ПЦР-смесь-таксон Смесь праймеров, зондов, дНТФ и натрия азида - прозрачная бесцветная жидкость 0,25 1 пробирка 3. ПЦР-смесь- В203С Смесь праймеров, дНТФ и натрия азида - прозрачная бесцветная жидкость 0,25 1 пробирка 4. ПЦР-смесь- В203Т Смесь праймеров, дНТФ и натрия азида - прозрачная бесцветная жидкость 0,25 1 пробирка 5. ПЦР-смесь-РГФ прозрачная бесцветная жидкость, содержащая Трис-НС1; калия хлорид; магния хлорид; Tween-20, глицерин, азид натрия 0,5 2 пробирки 6 . ПЦР-смесь-аллель прозрачная бесцветная жидкость, содержащая Трис-НС1; калия хлорид; магния хлорид; Tween-20, глицерин, SYBRGreen, азид натрия 0,5 2 пробирки 7. Taq ДНК-полимераза прозрачная бесцветная жидкость, представляющая собой фермент с активностью 5 ед/мкл 0,08 1 пробирка 8. ТЕ-буфер прозрачная бесцветная жидкость, содержащая трис-НС1; Маг-ЭДТА 1,0 3 пробирки 9. ПКО ДНК V . cholerae -РГФ препарат ДНК V. cholerae, сухой, в виде следа от высушенной капли на дне пробирки; после растворения - прозрачная бесцветная жидкость 0,1 3 пробирки 1 0. ПКО ДНК ctxBeltor препарат ДНК V . cholerae, содержащей аллель ctxBeltor, сухой, в виде следа от высушенной капли на дне пробирки; после растворения - прозрачная бесцветная жидкость 0,1 3 пробирки 1 1. ПКО ДНК ctxBclass препарат ДНК V. cholerae, содержащей аллель ctxBclass сухой, в виде следа от высушенной капли на дне пробирки; после растворения - прозрачная бесцветная жидкость 0,1 3 пробирки 1 2. Растворитель прозрачная бесцветная жидкость, представляюшая собой НгО, свободную от нуклеаз 1,0 2 пробирки Инструкция по применению "ГенХол - идентификация - РГФ" Страница 2 из 41 --- стр. 3 --- Набор реагентов «ГенХол - идентификация - РГФ» рассчитан на 50 определений с учетом контрольных образцов. В основу метода положен мультилокусный анализ наличия или отсутствия фрагментов генома вибрионов, ассоциированных с эпидемической значимостью и таксономическим положением патогена методом ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени: - гена ctxA, отвечающего за синтез А-субъединицы холерного токсина, с образованием флуоресценции по каналу РАМ, - гена ctxB, отвечающего за синтез В-субъединицы холерного токсина и несущего полиморфные нуклеотиды у типичных и генетически измененных штаммов холерных вибрионов биовара эльтор, с образованием флуоресценции по каналу РАМ, генов tcpAB, отвечающих за синтез токсин-корегулируемых пилей адгезии, с образованием флуоресценции по каналу JOE, гена wbeN, входящего в кластер генов, кодирующих синтез 01 антигена холерных вибрионов, с образованием флуоресценции по каналу РАМ, гена wbfR, входящего в кластер генов, кодирующих синтез 0139 антигена холерных вибрионов, с образованием флуоресценции по каналу JOE, гена ЫуА, отвечающего за синтез гемолизина холерных вибрионов и имеющего делению 11 п.н. у холерных вибрионов классического биовара, с образованием флуоресценции по каналу ROX, гена ШВ, отвечающего за синтез липопротеина внешней мембраны и являющегося специфичным для холерных вибрионов, с образованием флуоресценции по каналу ROX. Эпидемические значимые штаммы холерных вибрионов содержат в составе хромосомы CtxA и tcpAB гены, тогда как эпидемически безопасные штаммы лишены этих генов. Амплификация ctxA и tcpAB генов осуществляется в одной смеси «ПЦР-смесь- эпид». Штаммы V. cholerae 01 серогруппы несут в составе хромосомы гены 1о1В и wbeN, V . cholerae 0139 серогруппы - гены 1о1В и wbfR, V. cholerae не 01 не 0139 серогруппы - только ген 1о1В. Амплификация данных генов осуществляется в одной смеси «ПЦР-смесь- таксон». Биовары холерных вибрионов имеют отличия в нуклеотидной последовательности МуА гена: у классического биовара выявлена делеция размером 11 п.н., а у эльтор биовара и V . cholerae не 01 серогруппы - её нет. Амплификация ЫуА гена осуществляется с использованием «ПЦР-смесь-эпид». Выявление данного локуса с учетом принадлежности вибрионов к определенной серогруппе позволяет провести дифференциацию биоваров V . cholerae: амплификация ЫуА гена у холерных вибрионов 01 серогруппы (по результатам реакции с «ПЦР-смесью-таксон»: FAM^JOE'ROX^) указывает на их принадлежность к V. cholerae биовара эльтор, тогда как отсутствие амплификации ЫуА гена у холерных вибрионов 01 серогруппы (по результатам реакции с «ПЦР-смесью- таксон»: FAM'^JOE'ROX^) указывает на их принадлежность к V. cholerae классического биовара, Г енетически измененные варианты холерных вибрионов биовара эльтор характеризуются более высокой вирулентностью. В качестве генетических маркеров таких штаммов могут быть использованы полиморфные нуклеотиды в гене ctxB. Так, в нуклеотидной последовательности ctxB гена в позиции 203 у типичных штаммов вибрионов эльтор находится нуклеотид «Т» (аллель ctxBeltor), а у генетически измененных - нуклеотид «С» (аллель ctxBclass). Использование аллельспецифичных праймеров, входяших в состав смесей «ПЦР-смесь-В203С» и «ПЦР-смесь-В203Т», обеспечивает амплификацию данного гена с различной интенсивностью у типичных и генетически измененных вариантов холерных вибрионов эльтор. Инструкция по применению "ГенХол - идентификация - РГФ" Страница 3 из 41 --- стр. 4 --- Если CtB203C < CtB203T в 0,8 и более раз (больше чем на - 4 и более циклов) или наблюдается амплификация только с PC В203С, то исследуемый штамм V. cholerae биовара эльтор содержит аллель ctxBclass и является генетически измененным по ctxB гену. Если С 1в2озс ^ CtB203T в 1,2 и более раз (больше чем на 4 и более циклов) или наблюдается амплификация только с PC В203Т, то исследуемый штамм V. cholerae биовара эльтор содержит аллель ctxBeltor и является типичным по ctxB гену. Проведение анализа включает три этапа: 1. вьщеление ДНК из проб клинического материала, 2. амплификация с «ПЦР-смесью-эпид» и «ПЦР-смесью-таксон» на приборах типа Rotor Gene и планшетных амплификаторах типа CFX, для выявления холерных вибрионов с одновременным определением эпидемической значимости и таксономического положения, 3. в случае обнаружения в пробе ДНК эпидемически опасных штаммов V. cholerae 01 серогруппы биовара эльтор определение их принадлежности к генетически измененным вариантам с использованием смесей «ПЦР- смесь-В203С» и «ПЦР-смесь-В203Т». Тип используемых зондов в смесях «ПЦР-смесь-эпид» и «ПЦР-смесь-таксон» - TaqMan. Образование флуоресцентного сигнала происходит за счет освобождения флуоресцентных меток при расщеплении зонда ферментом Taq ДНК-полимераза (5’- экзонуклеазная активность). С каждым циклом ПЦР число свободных флуоресцентных меток экспоненциально возрастает, что приводит к повышению уровня флуоресценции в пробирке. Учет результатов флуоресценции проводят по каждому каналу отдельно. Амплификация аллельспецифичных праймеров в смесях «ПЦР-смесь-В203С» и «ПЦР-смесь-В203Т» осуществляется в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green, что приводит к накоплению флуоресцентного сигнала за счет связывания красителя с образующимися ампликонами. 3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ИЗДЕЛИЯ Аналитическая чувствительность. Набор должен выявлять ДНК V . cholerae в суспензии с концентрацией не менее 1x10^ м.к./мл и идентифицировать патоген по таксономическому положению (01 и 0139 серогруппа, биовар), эпидемической значимости (ctxA и tcpAB гены) и дифференцировать генетически измененные варианты токсгенных штаммов V . cholerae eltor по наличию полиморфных нуклеотидов в ctxB гене. Аналитическая специфичность. Набор не должен давать положительных результатов с ДНК микроорганизмов других родов в суспензиях с концентрацией 1 х Ю "* м.к./мл Диагностическая чувствительность - не менее 98.5 % с доверительной вероятностью 90%; при анализе 278 положительных проб (152 проб бактериальных суспензий микроорганизмов, 54 проб клинического материала и 72 проб объектов окружающей среды), содержащих холерные вибрионы в концентрации 1x10 ^ м.к./мл, получен положительный результат с верной идентификацией по принадлежности к серогруппам, биовару и эпидемической значимости - в 278 случаях; из них при анализе 74 положительных проб (48 проб бактериальных суспензий, 26 пробах клинического материала, объектов окружающей среды), содержащих V. cholerae 01 биовара Элътор л эпидемически значимые в концентрации 1x10 м.к./мл, бъш верно определен тип ctxB гена в 74 случаях. Диагностическая специфичность - не менее 99 % с доверительной вероятностью 90%; при анализе 278 положительных проб (152 проб бактериальных суспензий микроорганизмов, 54 проб клинического материала и 72 проб объектов окружающей среды), содержащих холерные вибрионы в концентрации 1x10 ^ м.к./мл. Инструкция по применению "ГенХол - идентификация - РГФ" Страница 4 из 41 --- стр. 5 --- получен положительный результат с верной идентификацией по принадлежности к серо группам, биовару и эпидемической значимости - в 278 случаях, при исследовании 84 отрицательных проб (70 проб чистых культур, 6 проб клинического материала и 8 проб объектов окружающей среды), содержащих гетерологичные микроорганизмы V.parahaemolyticus, V. mimicus, V . damsella, V . furnissii, V. cincinnatiensis, V. fluvialis, V. metschnikovii, V . vulnificus, V. alginolyticus, B. subtilis, B. anthracis, B. abortus, C. braakii, E. faecal, E. cloacae, E.aerogenes, E. coli, F. tularensis, K. pneumoniae, L. monocytogenes, P. mirabilis, P. vulgaris, P. aeruginosa, S. typhimurium, S. flexneri, S. aureus, S. epidermidis, St. pyogenes, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica в концентрации 1x10'* м.к./мл, получен отрицательный результат в 84 случаях. 4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С ИЗДЕЛИЕМ 4.1. Информация об инфекционных или микробных рисках. Набор реагентов может быть использован в учреждениях, имеющих Лицензию на деятельность в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных 1-IV групп патогенности, стационарных и мобильных лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение на проведение работ с микроорганизмами I-IV групп патогенности. Исследования могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и средним медицинским, биологическим или иным образованием, окончивщие соответствующие курсы специальной подготовки с освоением методов безопасной работы с патогенными биологическими агентами (ПБА) I-I1 групп патогенности. Следует рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные, поэтому этапы подготовки образцов и проведение ПЦР-анализа проводят в соответствии с требованиями СП 1.3.3118 - 13 «Безопасность работы с микроорганизмами 1-11 групп патогенности» и МУ 1.3.2569 - 09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». 4.2. Информация об экологических рисках. Уничтожение неиспользованных компонентов набора или наборов реагентов с истекщим сроком годности проводить в соответствии с СанПиН 2.1.7.2790-10. 4.3. Информация о физических рисках, в том числе возможность взрыва или возгорания. Набор реагентов следует применять по назначению в комбинации приборами, прошедшими надлежащее техническое обслуживание. Необходимо строгое соблюдение инструкций по эксплуатации электрооборудования, безопасности при работе с электроприборами. 4.4. Информация о рисках применения, приводящих к ошибочному результату исследования: Использование набора реагентов «ГенХол - идентификация - РГФ» с истекщим сроком годности; Нарущение условий транспортирования, хранения набора реагентов; Нарущения упаковки и внещнего вида компонентов набора реагентов; Нарущение условий транспортирования, хранения и подготовки проб; - Нарущение условий окружающей среды при эксплуатации набора реагентов; Нарущение процесса проведения анализа, регистрации и учета результатов. Применение по назначению МИ в комбинации со средствами измерения, не прощедщими поверку и/или калибровку. Инструкция по применению "ГенХол - идентификация - РГФ" Страница 5 из 41 --- стр. 6 --- 5. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, необходимые при работе с изделием’' Наименование Основные характеристики или обозначения документации, производитель Амплификатор типа RotorGene Амплификатор «RotorGene 6000», «RotorGene Q», «Qiagen», Германия Амплификатор типа CFX Амплификатор CFX 96 «БиоРад», США Ламинарный бокс биологической безопасности класс ПВ Ламинарный бокс биологической безопасности класс П БАВп-«Ламинар-С-1,2», «Ламинарные системы», Россия ПЦР-бокс Бокс абактериальной воздушной среды для работы с ДНК-пробами (ПЦР-бокс) при проведении ПЦР-диагностики БАВ-ПЦР- "Ламинар-С" «Ламинарные системы», Россия Микроцентрифуга-встряхиватель Микроцентрифуга-встряхивателъ «ТЭТА-2», «Биоком», Россия Термостат твердотельный Термостат твердотельный от 25 до 100 °С, Термо 24-15, «Биоком», Россия. Микроцентрифуга настольная Микроцентрифуга на 13400 об/мин "Mini Spin" "Eppendorf', Г ермания Отсасыватель медицинский Отсасыватель медицинский "ОМ-1" ОАО "Утес", Россия Термостат твердотельный с функцией охлаждения термостат твердотельный с функцией охлаждения от 4 до 120 °С, «Биоком», Россия Набор электронных или механических дозаторов переменного объема Набор электронных или механических дозаторов переменного объема (0,5-10, 10-100 мкл, 100-1000 мкл), Eppendorf, Германия Штатив-подставка для дозаторов Штатив-подставка для дозаторов универсальная на 5 дозаторов, «Хеликон», Россия Штатив «рабочее место» для микропробирок на 0 ,2 мл Штатив «рабочее место» для микропробирок на 0,2 мл, 10x20 мест, «Хеликон», Россия Штатив «рабочее место» для микропробирок на 1,5 мл Штатив «рабочее место» для микропробирок на 1,5 мл, 5x10 мест с увеличенным расстоянием между лунками, «Хеликон», Россия Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 18°С «Атлант», Россия Наконечники универсальные для дозаторов переменного объемом с аэрозольным барьером до 10 мкл ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США Наконечники универсальные для дозаторов переменного объемом с аэрозольным барьером до 1 0 0 мкл ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США Наконечники зшиверсальные для дозаторов переменного объемом с аэрозольным барьером до 2 0 0 мкл ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США Наконечники универсальные для дозаторов переменного объемом с аэрозольным барьером до 1 0 0 0 мкл ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США Микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США Инструкция по применению "ГенХол - идентификация - РГФ" Страница 6 из 41 --- стр. 7 --- Пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с плоской крышкой ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США Пипетки стеклянные ГОСТ 29227-91 Пробирки стеклянные ГОСТ-1770-74 Одежда одноразовая медицинская из нетканого и полимерного материалов РЗН 2013/668 Перчатки медицинские диагностические одноразовые. Часть 1. Спецификация на перчатки из каучукового латекса или раствора ГОСТ Р 52239-2004 * примечание: допускаетея применение оборудования другого типа, по евоим характериетикам не уетупающего рекомендуемому. 6. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ПРОБЫ Материалом для иееледования служат: - пробы чистых культур микроорганизмов: бактериальные суспензии культур холерных вибрионов или подозрительных изолятов, жидкие среды накопления; - пробы клинического материала: испражнения, рвотные массы, желчь; - пробы объектов окружающей среды: вода (питьевая, из поверхностных водоемов и др.), сточные воды, смывы с поверхностей; - пищевые продукты. Материал для исследования забирают в стерильные емкости с герметично завинчивающимися крышками в соответствии с требованиями СП 1.3.3118 - 13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности», МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории», МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-1V групп патогенности». Транспортирование материала в лабораторию для исследований проводят при температуре от плюс 2 до плюс 8 °С в течение 1 суток в соответствии с СП 1.2.036 - 95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности». После проведения предварительной обработки проб допускается их транспортировка при температуре от минус 16 до минус 20 °С в течение 7 суток или в сосуде Дьюара с жидким азотом - длительно. С целью предотвращения повреждения ДНК-мишеней возможно использование транспортной среды следующего состава: сахароза 0,218 моль, КН 2РО4 0,0038 моль, К2НРО4 0,0072 моль; БСА 1 %. При необходимости длительного хранения и (или) транспортирования, при отсутствии низкотемпературных холодильников, используют специальную транспортную среду ESP: саркозил 1 %; ЭДТА 0,05 моль; проназа Е 1 мг/мл. Исследуемый материал может храниться в среде ESP при температуре от плюс 20 до плюс 30 °С в темном месте до 10 дней. 7. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ (АНАЛИЗА) 7Л. Подготовка исследуемых образцов 7.1Л. Подготовка проб чистых культур микроорганизмов, жидких сред накопления Из культур холерных вибрионов или подозрительных изолятов готовят суспензии в 2 мл 0,9 % раствора натрия хлористого по отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц ФЕБУ «НЦЭСМП» (ОСО 42-28-86-П (5 ME)), что соответствует 1,1 х10^ м.к./мл для V . cholerae. Затем проводят 10-кратные разведения подготовленных суспензий в 0,9 % растворе натрия хлористого до конечной концентрации 1x1 0^ м.к./мл. Инструкция по применению "ГенХол - идентификация - РГФ" Страница 7 из 41 --- стр. 8 --- Из жидкой среды накопления, в которую посеян биологический материал и пробы из объектов окружающей среды, отбирают по 1 мл из верхнего слоя в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с завинчивающимися крышками, центрифугируют в течение 15 мин при 12000 об/мин. Осадок ресуспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлористого. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и вьщеления ДНК. 7.1.2. Подготовка проб клинического материала Фекалии При наличии диареи фекалии в количестве 10-20 мл собирают в стерильную посуду объемом 60-100 мл стерильными ложками или автоматической пипеткой переменного объема. При отсутствии диареи материал забирают в количестве 1-2 г в стерильные емкости объемом 60-100 мл. Фекалии могут бытъ забраны во флакон или пробирку с 1 % пептонной водой. Ректалъные мазки забирают стерилънъш ватным тампоном или одноразовой стерильной ректальной петлей, предварительно смоченной стерильным 0,9 % раствором натрия хлористого, и помещают во флакон или пробирку с 1 % пептонной водой (среда накопления). Жидкие фекалии переносят по 1-5 мл в микроцентрифужные пробирки с завинчивающими крьппками. Пробирки центрифугируют при 9000 об/мин в течение 5 мин. Затем отбирают по 0,2 мл верхней бело-желтой части осадка (если отсутствует бело желтый пограничный слой или полностью осадок, то отбор производят на границе осадка и супернатанта или со дна пробирки, соответственно) и переносят в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой. Пробирки центрифугируют при 12000 об/мин в течение 15 мин. Осадок ресуспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлористого. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и въщеления ДНК. К плотным фекалиям добавляют 0,9 % раствор натрия хлористого в соотношении 1:9, тщателъно ресуспендируют с использованием микроцентрифуги-встряхивателя. Отбирают по 1 мл в микроцентрифужные пробирки. Дальнейшую подготовку проводят так же как при исследовании жидких испражнений. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и вьщеления ДНК. При исследовании испражнений и ректальных мазков, забранных во флаконы или пробирки с 1 % пептонной водой, отбирают по 1 мл из верхнего слоя пептонной воды в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с завинчивающей крышкой, центрифугируют в течение 15 мин при 12000 об/мин. Осадок ресуспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлористого. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и вьщеления ДНК. Рвотные массы Рвотные массы в количестве 10-20 мл собирают в стерильную посуду ложками или автоматической пипеткой переменного объема. Далънейшую подготовку проводят так же как при исследовании жидких испражнений. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и вьщеления ДНК. Желчь Желчь берут при дуоденальном зондировании. В отдельные пробирки собирают две порции: из желчного пузыря и желчных протоков (В и С). Для исследования отбирают по 100 мкл в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Затем выполняют этапы обеззараживания материала и въщеления ДНК. 7.1.3. Подготовка проб из объектов окружающей среды Вода (питьевая, из поверхностных водоемов и др.) Пробы берут в объеме 500 мл в стерилъную емкостъ с завинчивающейся крышкой. Для концентрирования бактериальнък клеток используют либо дробное центрифугирование, либо вакуумную фильтрацию. Инструкция по применению "ГенХол - идентификация - РГФ" Страница 8 из 41 --- стр. 13 --- 4. Нажимают кнопку «Нех1»/«Далее». С 5. Выбирают объем реакционной смеси: Reaction уо1гдте/Объем реакции - 25 мкл. Для прибора «Rotor-Gene» 6000 должно быть активно (отмечено галочкой) окно «15 р1 oil layer volume»/«15 pL объем масла/воска». Нажимают кнопку «Мех1»/«Далее». Инструкция по применению "ГенХол - идентификация - РГФ" Страница 13 из 41 --- стр. 14 --- 6. в верхней части окна нажимают кнопку «Edit profile»/«Редактор профиля». Профиль п р г и г г Редактор Установка профиля канала: 1 ◄ ------------------- Имя 1 Источник 1 Детектор 1 Уровень сигнала Цовый... Green 470nm 510nm 10 Yelow 530nm 555nm 10 Orange 585nm 610nm 10 Уровень Сити. Red 625nm BBOnm 10 Crimson BBOnm 710hp 7 Удалить Blue 365nm 4B0nm 7 Отменить Qnr. уровня СИГН... Выход « Назад 1 Д а ле е » | Наж^^яе эту кнопку, чтобы перейти на слеа. стр. мастера. Если это эаблокироеано. вы должны выполнить некот. действия на этой странице теред продолжением. % ш Новый V Опер. Сохранить как 9 Справка Т ест проволжигся около 107 мин. ГраФик вниз;) прелстввляег тест, который должен быть выполнен: 1/1/1/1 / 1/1/1/[/1/ИТОИГОИШ И11 ff И [ ш и П О Нажмите на цикл ниже, чтобы изменить его: Циклироеание Циклироеание2 Вставить до.. Удалить Температура: Время: 95 I град. 5 |мин. о 10 times/раз. 8. Задают следующие параметры эксперимента: Hold/Удерж, температуры 95 °С - 5 мин Cycling/Циклирование 95 °С - 30 с 60 °С - 30 с 72 °С - 30 с Cycle repeats/Цикл повторить Cycling2/H,HiaiHpoBaHHe2 95 °С - 20 с 56°С - 20 с - Детекция 72 °С - 20 с Cycle repeats/Цикл повторить - 35 times/раз. Флуоресценцию измеряют при 56 °С (во втором блоке циклирования) по каналу FAM/Green, JOE/Yellow, RO)COrange. Инструкция по применению "ГенХол - идентификация - РГФ" Страница 14 из 41 --- стр. 15 --- 1 я , n U 9 Но1ЫЙ О ткр. С охранить как С праака Тест проАОлжигся около 107 мин.ГраФик вниеу преаставляет тест, который должен быть выполнен; Нажмите на цикл ниже, чтобы изменить его: Удерж темп-ры Вот. после.-. I Вставить до . ■[ Удалить I Цикл повторить 35 | рае Нажмите на шаг внизу для его изменения или нажмите * шаг или • шаг. чтобы добавить или удалить шаги этого цикла. Обычный шаг 56 град. 20 сек ДетекиаСус1пдА на Green. Orange. Yelow Г Удлин, Шаг Р Снижать теьк^ру шага 95 град, на 20 сек. ■ з н 72 град на 20 сек 56 град, на 20 сек. Q K Нажимают кнопку «ОК»/«Да». 9. В нижней части окна Optimisation.. .»/«Опт.уровня сигн.». нажимают кнопку «Calibrate»/«Gain Профиль ffi Ееаактор профиля... | Установка канала: Нажмите эту кнопку, чтобы перейти на след стр. мастера Если это заблокировано, вы должны выполнить некот. действия на этой странице перед продолжением Имя Источник Gteen 470rm 510nm 10 Yelow 530nm 555nm 10 Orange 585nm BlOnm 10 Red 625nm BBOntn 10 Dimson 680nm 710hp 7 Blue 365nm 460nrin 7 Цовый.. Правка... уровень Сигн. валить Отменить Qrrr. уровня сигн... Выход «Н а з а д Д але е» Инструкция по применению "ГенХол - идентификация - РГФ" Страница 15 из 41 --- стр. 16 --- в открывшемся окне нажимают кнопку «Calibrate Acquiring»/«Optimise Acquiring»/ «Опт.детек-мых». Авто-оптимизация уровня сигнала г Оптимизация: - При авто-оптимизации доовня сигнала баавт счигьваться флаоресценгиьЛ сигнал выбранной пробирки при различных уровнях усиления сигнала, пока не найается уровень, при котором сигнал попацает в нужный диапазон у ровень сигнала зависит от используемых реагентов Установить температуру |56 ^ градусов. Опгтел. всех | Опт. Детек-мых ^ Г~ Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции Г Выполнпь оптимизашао при 56 градусах перед началом теста Установки канала: ^ Добавить.. Имя I Позиция Пробирки I Миним Сигнал I Максим. Сигнал | Мин, урое Правка.. ^алигь [!Э я й !!^ .ь Д д в ]| Старт I Вручную | Закрыть | £пр. | Авто-оптимизация уровня сигнала > Оптимизация: При авто-оптимизации уровня сигнала будет считываться Флуоресцентный сигнал выбранной пробирки при различных уровнях усиления сигнала, пока не найается уровень, при котором сигнал попадает в нужный диапазон Уровень сигнала зависит от используемых реагентов. Установить температуру [56 -^градусов. Г Г Ус » 3 | Установки Авто-оптимизации уровня сигнала - Установки канала: Канал: Green Позиция Пробирки: Нужный диапазон стартового сигнала: [б ^ FI до Диапазон уровней сигнала: ГтО -Н до ОК J Отменить I Справка Старт Вручную. Закрыть £пр. - ДЛЯ красителя FAM/Green указывают в графе Min Reading/Миним. Сигнал значение 5, а в графе Мах Reading/Максим. Сигнал значение 10, - для красителя JOE/Yellow указьшают в графе Min Reading/Миним. Сигнал значение 5, а в графе Мах Reading/Максим. Сигнал значение 10, для красителя ROX/Orange указывают в графе Min Reading/Миним. Сигнал значение 5, а в графе Мах Reading/Максим. Сигнач значение 10. Инструкция по применению "ГенХол - идентификация - РГФ" Страница 16 из 41 --- стр. 17 --- Auto-Gain Optimisation Setup - Optimisation: - % Auto-Gain Optimisalion wil read the fluoiesence on the inserted sample at dffeierrt gain levels until it finds one at which the fluotescence levels ate acceptaUe. The range of fluotescerrce you ate looking for depends on the chemisliy you ace performing. Sot temperature to |56 ^ degrees. Optimise A l I Optimise Acquiring | P? Perform Optimisation Before 1st Acrjuisition t~ Perform Optimisation At 56 Degrees At Beginning Of Run Channel Settings: - 3 Name Tube Position Min Rearing Max Readho Min Gain Max Gain Green 1 5FI 10FI ■10 10 Yelow 1 5FI 10FI -10 10 Orange 1 5FI 10FI •10 10 ‘ 1 trt Add... Edit... Oertrove Remove A l | Start Manual J Close I Ыв1р В графе Tube position/Позиция Пробирки указан номер пробирки, по которой будет автоматически выбран параметр «gaw»/«ycHneHHe сигнала», по умолчанию это 1-я пробирка в роторе. Поэтому в 1-ой позиции в роторе должна ставиться пробирка с реакционной смесью РС-эпид. Помечают галочкой бокс в строке «Perform Calibration Before Р‘ Acquisition»/«Perform Optimisation Before P' Acquisition»/«Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции». Закрьпъ окно Auto Gain Calibration Setup/Авто-оптимизация уровня сигнала, нажимают кнопку «С1озе»/«Закрыть». Нажимают кнопку «Нех1»/«Далее». Профиль Ееаактор профиля... [ Устаноекд канала: Имя IИсточник i Депгектос Уровень сигнала I Green 470nm SlOnm 10 Yelow 530rm K5nm 10 Orange 585nm 610nm 10 Red 625rm BEOnm 10 Crimson BBOnm 710hp 7 Blue 3Knm 480nm 7 Ют!'чо6вня сигн!i| Выход «Нем а I Далее» | Цовый. Ораека... вровень Сигн I ^алигь О т м е н и т ь Нажмите эту ки(М1ку. чтобы перейти на слеа. стр. мастера. Если это эаблокировано. вы должны выполнить некот доЕ^твия на этой странице перед продолжением. 10. Запускают амплификацию кнопкой «Start гап»/«Старт». При необходимости введенные значения термоциклирования могут быть сохранены в качестве шаблона, используя кнопку « Save template/ «Сохр. шаблон». Инструкция по применению "ГенХол - идентификация - РГФ" Страница 17 из 41 --- стр. 18 --- Схема; flfrlflffflflflill i i « < 4% ]^ Ыстаноека 1 I 1 1 Green Уровень сигнала 10 Orange Уровень сигнала 10 Yelow Уровень сигнала 10 Оптимизация аетоуровня сигнала До пе(»ого детектир. данных Ротор 36'луночный ротор Компон(»ка образцов 1,2.3. . Объём реакции (в микролитрах) 25 Проверив превильность установок, нажмите Старт для начала выполнения Теста. Нажк«4ге Сохр.Шаблон. чтобы сохранить шаблон с программой и установками этого теста. Старт Сохр. шаблон Выход I «Назад | 11. Дают название эксперимента и сохраняют его на диске (в этом файле будут автоматически сохранены результаты данного эксперимента). ____ й I вооо S«n«> So^wtf» Т(о »!*417.ма: М и Анино CNfTfCIOR ypWHH «fTOM П^Н Р М Щ» Ои* ии. В процессе работы амплификатора или по окончании его работы программируют положение пробирок в карусели. Для этого использзлот кнопку «Edit 8атр1ез»/«Правка образцов» (в нижней правой части основного окна). Все пробы и контроли обозначают меню Samples/Образцы как Unknown/Неизвестный. Программирование амплификатора типа CFX 1. Включают прибор и дожидаются окончания автоматической калибровки прибора. 2. Запускают программу «СЕХ Manager». 3. Выбирают новый эксперимент «Create а New Run». 4. Задают программу амплификации (активно окно «Protocol»), используя либо уже готовый шаблон - кнопка «Select Existing», либо создают новый - кнопка «Creative New». Инструкция по применению "ГенХол - идентификация - РГФ" Страница 18 из 41