Набор реагентов для выявления и внутривидовой дифференциации штаммов чумного микроба методом мультилокусной ПЦР в формате биочипа (Пест-МЛ ПЦР-биочип) по ТУ 21.20.23-056-01898109-2020 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 ---
АЮ»
ИНСТРУКЦИЯ
по ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И
ВНУТРИВИДОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ ЧУМНОГО МИКРОБА
МЕТОДОМ МУЛЬТИЛОКУСНОЙ ПЦР в ФОРМАТЕ БИОЧИПА
(ПЕСТ-МЛ ПЦР-БИОЧИП)
1. НАЗНАЧЕНИЕ
«Набор реагентов для выявления и внутривидовой дифференциации штаммов
чумного микроба методом мультилокусной ПЦР в формате биочипа (Пест-МЛ ПЦР-
биочип)» по ТУ 21.20.23-056-01898109-2020, далее - набор реагентов «Пест-МЛ ПЦР-
биочип», предназначен для качественного выявления ДНК возбудителя чумы в пробах
клинического материала (кровь, мокрота, мазок из зева, пунктаты бубона, отделяемое
язв); биологического материала (органы), культур микроорганизмов с одновременным
определением его принадлежности к основному и неосновным подвидам, биоварам, а
также дифференциации вирулентных изолятов от авирулентных, методом
мультилокусной полимеразной цепной реакции с учетом результатов в формате биочипа.
Чума - зоонозная природно-очаговая бактериальная особо опасная инфекционная
болезнь с преимущественно трансмиссивным механизмом передачи возбудителя,
носителем которого являются дикие грызуны, а переносчиками - эктопаразиты
(преимущественно, блохи).
Заражение человека в природных очагах происходит при укусе инфицированными
блохами, контакте с больными и погибшими от чумы грызунами, при забое и разделке
больных чумой промысловых и домашних животных. Чума может передаваться и от
человека к человеку как антропонозное заболевание, а также при контакте с трупами или
вещами умершего больного чумой человека.
Болезнь характеризуется интоксикацией, лихорадкой, поражением лимфатической
системы, легких и других внутренних органов, возможным развитием сепсиса, высокой
контагиозностью и летальностью. Размножение бактерий в макрофагах лимфатических
узлов приводит к их резкому увеличению, слиянию и образованию конгломерата
(«бубона»). Дальнейшая генерализация инфекции может приводить к развитию
септической формы, сопровождающейся поражением практически всех внутренних
органов, при поражении легких развивается легочная форма болезни.
Возбудителем чумы является Yersinia pestis. Согласно отечественной схеме
внутривидовой дифференциации, штаммы возбудителя чумы объединены в 5 подвидов:
Y. pestis ssp. pestis (основной) и четыре неосновных подвида - Y. pestis ssp. caucasica
(кавказский), Y. pestisss^. altaica (алтайский), Y. pestis ssp. Лш'с/пса(гиссарский) и
Y. pestisssp. ulegeica (улегейский). Для штаммов возбудителя чумы основного подвида
(ssp. pestis) характерна высокая вирулентность и высокая эпидемическая значимость, в то
время как штаммы неосновных подвидов имеют избирательную вирулентность и низкую
эпидемическую значимость. Штаммы основного подвида Y. pestisдQJlЯтcя на три биовара
по биохимическим свойствам (различиях в способности к денитрификации и ферментации
глицерина): antiqua (античный), те^/еуд//5(средневековый) и orientalis (восточный).
Набор реагентов используется в клинической лабораторной диагностике для
исследования материала, полученного от лиц обоего пола любого возраста с подозрением
на чуму вне зависимости от формы и наличия манифестации заболевания (контактных и
проживающих на территории природных очагов чумы), а также в ходе
Л и с т i Всего листов 23
Не допускается частичная или по.шая перепечатка настоящего акта и ппгпож'ении к не.му без разрешения
лаборатории
--- стр. 2 ---
эпидемиологического мониторинга природных
биологического материала от животных-носителей.
очагов чумы для исследования
2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА
Компоненты набора реагентов являются одноразовыми,
входят 14 компонентов (таблица 1).
В состав набора реагентов
Таблица 1
Компонент Описание Объем/шт. Количество
Биочипы
стеклянные слайды с иммобилизованными
олигонуклеотидными зондами, располо
женными дискретно в виде округлых пя
тен (спотов) и сгруппированных в отдель
ные зоны (эрреи)
4 шт. 1 контейнер
ПЦР-буфер
прозрачная бесцветная жидкость, содер
жащая Трис-НС1; сульфат аммония; маг
ния хлорид; Твин-20
1.0 мл 1 пробирка
Taq ДНК-
полимераза
прозрачная бесцветная жидкость, содер
жащая фермент с активностью 5 ед/мкл
0.05 мл 1 пробирка
ПЦР-смесь 1 прозрачная светло-голубого цвета жид
кость, содержащая праймеры и дНТФ
0,5 мл 1 пробирка
ПЦР-смесь 2 прозрачная светло-голубого цвета жид
кость, содержащая праймеры и дНТФ
0,5 мл 1 пробирка
ПЦР-смесь 3 прозрачная светло-голубого цвета жид
кость, содержащая праймеры и дНТФ
0.5 мл 1 пробирка
ПЦР-смесь 4 прозрачная светло-голубого цвета жид
кость, содержащая праймеры и дНТФ
0,5 мл 1 пробирка
Блокирующий
раствор
прозрачная бесцветная жидкость, содер
жащая SSPE-буфер. раствор Денхардта,
ДНК спермы лосося
5,0 мл 1 пробирка
Гибридизаци-
онный раствор
слегка вязкая прозрачная бесцветная жид
кость, содержащая формамид, SSPE-
буфер, раствор Денхардта, ДНК спермы
лосося
3,5 мл 1 пробирка
Отмывочный
раствор 1
прозрачная бесцветная жидкость, содер
жащая SSPE-буфер
5,0 мл 2 пробирки
Отмывочный
раствор 2
прозрачная бесцветная жидкость, содер
жащая SSPE-буфер с добавлением доде-
цилсульфата натрия
5,0 мл 1 пробирка
ТЕ-буфер прозрачная бесцветная жидкость, содер
жащая трис-НС1; Na2-ЭДTA
0,5 мл 1 пробирка
Среда LB светло-бежевый мелкодисперсный поро
шок, содержащий триптон. дрожжевой
экстракт, NaCl
5 г 1 пробирка
ПКО ДНК
Y. pestis
прозрачная бесцветная жидкость, пред
ставляющая собой водный раствор ДНК
Y. р^5Ц‘ 50Сновного и неосновных подвидов
0,05 мл 1 пробирка
«Набор реагентов для выявления и внутривидовой дифференциации штаммов чум
ного микроба методом мультилокусной ГЩР в формате биочипа (Пест-МЛ ПЦР-биочип)»
рассчитан на проведение 48 исследований, включая исследование 40 нативных проб и по
одному положительному и отрицательному контролям для каждого слайда. Один слайд
Лист 2 Всего листов 23
Не допускается частичная или полиоя перепечатка настоящего акта и пргаожений к нему без разрешения
лаборатории
--- стр. 3 ---
предназначен для проведения 12 исследований, включая 10 проб нативного материала и
два контроля (положительный и отрицательный). Каждый слайд рассчитан на однократ
ное применение. В случае исследования материала в количестве менее 10 проб, повторное
использование чипа для дальнейшего анализа оставшихся свободных эрреев не допуска
ется. Рекомендуется, при возможности, доводить количество исследуемых проб до 10,
чтобы задействовать всю площадь поверхности ДНК-чипа.
В основу метода положена схема молекулярно-генетического анализа специфиче
ских фрагментов ДНК Y. pestis путем проведения от 1 до 4-х мультилокусных ассимет-
ричных ПЦР с применением флуоресцирующих праймеров и последующей гибридизации
с олигонуклеотидными зондами, иммобилизованными на твердой подложке - биочипе.
Биочип представляет собой стекло (слайд) размером 25x75 мм, толщиной 1 мм с модифи
цированной у-аминопропилсиланами поверхностью, с иммобилизованными на его по
верхности одноцепочными олигонуклеотидными зондами, комплементарными к специ
фическим фрагментам ДНК Y. pestis, дискретно нанесенными в виде пятен округлой фор
мы (спотов) и сгруппированными в отдельные зоны (эрреи). Каждый эррей имеет иден
тичный набор и размещение зондов, предназначен для постановки анализа одной пробы
(Рисунок 1). На одном биочипе расположено 12 эрреев для проведения 12 исследований
(Рисунок 2).
Ооооооо00000
оооооо
0
00©©©
1 - Chip-45-Zond, 2 - Chip-Med(-24)-Zond, 3 - Chip-Med(-70)-Zond, 4 - Chip-gIpD(-93)-
Zond, 5 - Chip-Pro-Zond, 6 - Chip-Phage-Zond, 7 - Chip-3a-Zond, 8 - Chip-yihN-Zond, 9 -
Chip-irp2-Zond, 10 - Chip-pIa-Zond, 11 - Chip-lcrV-Zond, 12-Chip-cafl-Zond
Рисунок 1 - Расположение зондов в одном эррее
Рисунок 2 - Расположение эрреев на биочипс
На поверхности биочипа иммобилизованы 12 видов олигонуклеотидных зондов в
двух повторах, объединенных в один кластер. Полимеразную цепную реакцию осуществ
ляют с использованием праймеров в 4-х мультиплексных смесях в отдельных пробирках.
Лист 3 Всего листов 23
Не допускается частичная гаи полная перепечатка настоящего акта и приложении к нему без разрешения
.шборатории
--- стр. 4 ---
Один из пары праймеров, рассчитанных для каждой мишени, несет в своем составе флуо
ресцентный краситель Су5. С помощью указанных праймеров в ПЦР проводят амплифи
кацию участков «За», «yihN», «irp2», «р1а», «cafl», «IcrV», «45», «Med24», «Med70»,
«glpD», «Pro», «Phage». Принадлежность выделенного изолята к виду Y. pestis, к основно
му и неосновным подвидам, биовару, определению вирулентности (по наличию генов ос
новных факторов патогенности) устанавливают по наличию или отсутствию флуоресцен
ции на стекле в местах нанесения соответствующих зондов после проведения гибридиза
ции с ампликонами, полученными в результате от 1 до 4-х мультиплексных ПЦР. Реги
страцию флуоресценции осуществляют с помощью флуоресцентного сканера микрочипов
при длине волны возбуждения 635 нм.
Подтверждение наличия в пробе ДНК Y. pestis осуществляют на основании нали
чия флуоресценции по мишеням«у1ЬЫ» и «За», являющимися маркерными для штаммов
этого вида, а также флуоресценции по мишеням «р1а» и «саП », расположенными на плаз
мидах pPst и pFra, соответственно, которые также характерны для штаммов чумного мик
роба. У штаммов возбудителя чумного микроба кавказского подвида будет отсутствовать
флуоресценция по мишени «р1 а».
Дифференциацию вирулентных и авирулентных изолягов чумного микроба
осуществляют на основании наличия флуоресценции по мишеням «1гр2» и «IcrV», входя
щих в состав острова высокой патогенности хромосомной области пигментации и плаз
миды pCad, соответственно. Данные генетические маркеры ассоциированы с вирулентно
стью патогена и выявляются у вирулентных штаммов возбудителя чумы, отсутствие одно
го или обоих указанных локусов приводит к снижению вирулентности чумного микроба.
Дифференциацию штаммов чумного микроба по принадлежности к основному
и неосновным подвидам осуществляют на основании наличия флуоресценции по мише
ни «45»: у культур основного подвида - сигнал флуоресценции будет отсутствовать, у
культур неосновных подвидов - сигнал флуоресценции отмечен.
Дифференциацию штаммов чумного микроба основного подвида по биоварам
осуществляют на основании наличия флуоресценции по мишеням «glpD», «Med24»,
«pCKF», «Phage» и «Med70» хромосомной локализации:
- у штаммов Y. /7 е5?/5Восточного биовара (1.0R1) сигнал флуоресценции по мишеням
«glpD» и «Рго» - будет отсутствовать, по мишеням «Med24», «Med70» и «Phage» - будет
отмечен,
- у штаммов средневекового биовара (за исключением филогенетической линии
2.MED0) сигнал флуоресценции по мишеням «Med24», «Med70», «Рго» и «Phage» - будет
отсутствовать, по мишени «glpD» - будет отмечен,
- у штаммов средневекового биовара филогенетической линии 2.MED0 сигнал флуо
ресценции по мишеням «Med70» и «Phage» - будет отсутствовать, по мишеням «Med24»,
«glpD» и «Рго» - будет отмечен,
- у штаммов античного биовара филогенетических линий 0.ANT/4.ANT сигнал флу
оресценции по мишеням «Рго» и «Phage» - будет отсутствовать, по мишеням «Med24»,
«Med70» и «glpD» - будет отмечен,
- у штаммов античного биовара филогенетической линии 1 .ANT сигнал флуоресцен
ции по мишени «Рго» - будет отсутствовать, по мишеням «Med24», «Med70», «glpD» и
«Phage» - будет отмечен,
у штаммов античного биовара филогенетических линий 2.ANT сигнал флуоресцен
ции по мишеням «Med70», «Рго» и «Phage» - будет отсутствовать, по мишеням «Med24» и
«glpD» - будет отмечен.
Выполнение исследований включает в себя несколько этапов: подготовка проб ис
следуемого материала, обогащение нативного материала в жидкой питательной среде,
обеззараживание материала, выделение ДНК. проведение мультилокусных ПЦР, гибриди
зация на ДНК-чипе, учет результатов реакции, интерпретация данных.
Лист 4 Всего листов 23
Не дот скается частичная гпи полная перепечатка настоящего акта и пртожений к нему без разрешения
лаборатории
--- стр. 5 ---
3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
ЗЛ. Аналитические характеристики
Аналитическая чу вствительность
Набор должен выявлять ДНК Y. pestis в исследуемом материале в концентрации не
менее 1x10^ м.к./мл и определять принадлежность патогена к основному и неосновным
подвидам, биоварам. а также дифференцировать вирулентные штаммы чумного микроба
от авирулентных.
Аналитическая специфичность
Набор не должен давать положительных результатов с ДНК микроорганизмов дру
гих родов в исследуемом материале в концентрации 1x10^ м.к./мл.
Аналитическая специфичность подтверждена использованием в ходе испытаний об
разца для контроля, содержащего F. tularensis 15 НИИЭГ в концентрации 1x10^ м.к./мл.
При тестировании образцов ДНК F. tularensis 15 НИИЭГ неспецифических реакций выяв
лено не было.
3.2. Повторяемость и воспроизводимость
Повторяемость и воспроизводимость бьыи определены путем тестирования положи
тельных и отрицательных модельных образцов. Положительные образцы представляли
собой Y. pestis spp., отличающиеся по принадлежности к подвидам, биоварами. вирулент
ности чумного микроба, в концентрации 1x10^ м.к./мл; в качестве отрицательного об
разца были использованы Y. pseudotuherculosis, Y. enterocolitica, Y. intermedia, Y. freder-
iksenii, Y. kristensenii, Y. nurmii, Y. moUaretii, Y bercovieri, Y. aleksiciae, E. coli, F. tularensis
в концентрации lx 10^м.к./мл.
Условия повторяемости включати в себя тестирование в одной и той же лаборато
рии, одним и тем же оператором, с иепользованием одного и того же оборудования в пре
делах короткого промежутка времени.
Условия воспроизводимости - тестирование в двух независимых лабораториях, раз
ными операторами, в разные дни.
Тип образцов
Повторяемость Воспроизводимость
Количеетво
образцов
Совпадение
результатов, %
Количество
образцов
Совпадение
результатов, %
Положительные 39 100 39 100
Отрицательные 33 100 33 100
k 3.3. Диагностические характеристики
Диагностическая чувствительность - не менее 99,0% с доверительной вероятно
стью 90%; при анализе 156 положительных проб (26 проб бактериальных суспензий мик
роорганизмов, 104 проб клинического материала, 26 проб биологического материала), ис
кусственно контаминированных Y. pestis в концентрации 1x10^ м.к./мл, получен положи
тельный результат с верной дифференциацией по принадлежности к виду, биовару, опре
делением вирулентности в 156 случаях.
Диагностическая специфичность - не менее 99,0 %с доверительной вероятностью
90%; при исследовании 64 отрицательных проб (24 пробах бактериальных суспензий мик
роорганизмов, 32 пробах клинического материала. 8 пробах биологического материала),
искусственно контаминированных гетерологичными микроорганизмами Y. pseudotuhercu
losis, Y. enterocolitica, Y. intermedia, Y. frederiksenii. Y. kristensenii, Y. nurmii, Y. moUaretii,
Y bercovieri, Y. aleksiciae, E. coli. F. tularensis в концентрации 1x10^ м.к./мл, получен отри
цательный результат в 64 случаях.
4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С ИЗДЕЛИЕМ
4.1. Информация об инфекционных или микробных рисках.
Лист 5 Всего листов 23
Ис дотгкыепк'я частичная и:ш полная перепечатка настоящего акта и птаожении к нему без оатешения
.'шборатории
--- стр. 6 ---
Набор реагентов может быть использован в учреждениях, имеющих Лицензию на
деятельность в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека
и животных I-IV групп патогенности, стационарных и мобильных лабораториях, имею
щих санитарно-эпидемиологическое заключение на проведение работ с микроорганизма
ми I-IV групп патогенности.
Исследования могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и средним
медицинским, биологическим или иным образованием, окончившие соответствующие
курсы специальной подготовки с освоением методов безопасной работы с патогенными
биологическими агентами (ПБА) I-1I групп патогенности.
Следует рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные, поэтому
этапы подготовки образцов и проведение 11ЦР-анализа проводят в соответствии с требо
ваниями СП 1.3.3118 - 13 «Безопасность работы с микроорганизмами 1-П групп патоген
ности» и МУ 1.3.2569 - 09 «Организация работы лабораторий, использующих методы ам
плификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы
I-1 V групп патогенности».
4.2. Информация об экологических рисках.
Уничтожение неиспользованных компонентов набора или наборов реагентов с ис
текшим сроком годности проводить в соответствии с СанПиН 2.1.7.2790-10.
4.3. Информация о физических рисках, в том чис. 1е возможность взрыва или
возгорания.
Набор реагентов следует применять по назначению в комбинации с приборами,
прошедшими надлежащее техническое обслуживание. Необходимо строгое соблюдение
инструкций по эксплуатации электрооборудования, безопасности при работе с электро
приборами.
4.4. Информация о рисках применения, приводящих к ошибочному результату
исследования:
- Использование набора реагентов «Пест-МЛ ПЦР-биочип» с истекшим сроком
годности;
- Нарушение условий транспортирования, хранения набора реагентов;
- Нарушения упаковки и внешнего вида компонентов набора реагентов;
- Нарушение условий транспортирования, хранения и подготовки проб;
- Нарушение условий окружающей среды при эксплуатации набора реагентов;
- Нарушение процесса проведения анализа, регистрации и учета результатов.
- Применение по назначению МИ в комбинации со средствами измерения, не
прошедшими поверку и/или калибровку.
5. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ПРИ РАБОТЕ С
ИЗДЕЛИЕМ*
Таблица 2
№
п/п
Наименование Основные характеристики, производитель
1 Дозатор 0,5-10 мкл Дозатор механический 0,5 - 10 мкл,В1оЬН,
Германия
2 Дозатор 10 - 100 мкл Дозатор механический 10-100 мкл, Biohit,
Германия
3 Дозатор 20 - 200 мкл Дозатор механический 20 - 200 мкл,
EppendorfResearchPlus, Германия
4 Дозатор 100-1000 мкл Дозатор механический 100 - 1000 мкл. Biohit,
Германия
5 Амплификатор с горячей
крышкой
Aмплификaтop«Mastercycler», «Eppendorf»,
Германия
Лист 6 Всего листов 23
Не допускается частичная гаи по.шая перепечатка настоящего акта и пргпожений к нему dei разрешения
лаборатории
--- стр. 7 ---
4
i
6 Сканер микрослайдов Сканер микрослайдов GenePix 4100А со
встроенным программным обеспечением
сканирования и анализа биочипов GenePix Pro 6.0,
длина волны возбуждения: 532 нм, 635 нм,
разрешение: от 5 мкм/пикс до 100 мкм/пикс,
максимальная область сканирования: 22x71,5 мм.
Скорость сканирования: 6,5 мин для одного канала.
«MolecularDevices», США
7 Центрифуга лабораторная Центрифуга лабораторная медицинская LMC-3000,
максимальная скорость: (100-3000) об./мин, ротор
под пробирки объемом 50 мл, «BioSan», Латвия
8 Микроцентрифуга-
встряхиватель
Микроцентрифуга-встряхиватель MicroSpinFV-
2400, постоянная скорость вращения: 2800 об/мин,
центробежная сила: до 700 g, «BioSan», Латвия
9 Термошейкер для
иммунопланшет
Термощейкер для иммунопланшет PST-60HL,
скорость вращения платформы (250-1200) об./мин,
диапазон устанавливаемой температуры
платформы: (25-60) °С, таймер: от 1 мин до 96
4,BioSan, Латвия
10 Термостат твердотельный Т ермостат твердотельный СН-100,регу лируемая
температура: от минус 10 °С до 100 °С, шаг
установки температуры: 0,1 °С, «Биоком», Россия.
11 Отсасыватель вакуумный
медицинский с колбой-
ловушкой
Отсасыватель медицинский «ОМ-1», максимальная
производительность по воде: не менее 6 л/мин,
время создания остаточного давления 0,17 кгс/см^:
60 с,«Утес», Россия
12 Ламинарный бокс
биологической безопасности
класс ПВ
Ламинарный бокс биологической безопасности
класс II БАВп-«Ламинар-С-1,2», «Ламинарные
системы», Россия
13 ПЦР-бокс Бокс абактериальной воздушной среды для работы
с ДНК-пробами (ПЦР-бокс) при проведении ПЦР-
диагностики БАВ-ПЦР-«Ламинар-С»,
«Ламинарные системы», Россия
14 Термостатсуховоздушный Термостат суховоздушный с температурным
диапазоном от 5 до 80 °С, Sanyo, Япония
15 Стерилизатор паровой Стерилизатор паровой с температурным
диапазоном от 105 до 134°С, Sterivap, Чехия
16 Холодильник от 2 до 8 ® С с
морозильной камерой не выше
минус 18°С
«Атлант», Россия
17 Штатив-подставка для
дозаторов
Штатив-подставка для дозаторов универсальная на
5 дозаторов, «Хеликон», Россия
18 Штатив «рабочее место» для
микропробирок на 0,6 мл
Штатив «рабочее место» для микропробирок на 0,6
мл, 10x20 мест, «Хеликон», Россия
19 Штатив «рабочее место» для
микропробирок на 1,5 мл
Штатив «рабочее место» для микропробирок на 1,5
мл, 5x10 мест с увеличенным расстоянием между
лунками, «Хеликон», Россия
20 Натрия мертиолят «Sigma», США
21 Спирт этиловый
ректификованный из
пищевого сырья
ГОСТ 5962-2013
22 Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
Лист 7 Всего листов 23
Не допускается частичная lau полная перепечатка настоящего акта и птиожений к нему без разрешения
лаборатории
--- стр. 8 ---
♦
4
23 Комплект реагентов для
вьщеления ДНК из
клинического материала
"ДНК-сорб-В"
ФСР 2009/05220
24 Пробирки для ПЦР объемом
0,2 мл
ФСЗ 2011/10287 «SSI», США
25 Пробирки для ПЦР объемо.м
0,6 мл
ФСЗ 2011/10287 «SSI», США
26 Микроцентрифужные
пробирки объемом 1,5 мл
ФСЗ 2011/10287 «SSI», США
27 Центрифужные пробирки типа
Falcon объемом 50 мл
ФСЗ 2011/10287 «SSI», США
28 Наконечники универсальные
для дозаторов переменного
объемом с аэрозольным
барьером до 10 мкл
ФСЗ 2011/10287 «SS1», США
29 Наконечники универсальные
для дозаторов переменного
объемом с аэрозольным
барьером до 100 мкл
ФСЗ 2011/10287 «SSI», США
30 Наконечники универсальные
для дозаторов переменного
объемом с аэрозольным
барьером до 200 мкл
ФСЗ 2011/10287 «SSI», США
31 Наконечники универсальные
для дозаторов переменного
объемом с аэрозольным
барьером до 1000 мкл
ФСЗ 2011/10287 «SSI», США
32 Рамка-держатель стекол «Whatman» (кат. № 10486001), Великобритания
33 Камера инкубационная 16-
луночная
«Whatman» (кат. № 10486046), Великобритания
34 Пинцет пластиковый 125 мм ФСР 2010/07936
«Полимерные изделия». Россия
35 Одежда одноразовая
медицинская из нетканого и
полимерного материалов
РЗН 2013/668
36 Перчатки медицинские
диагностические одноразовые.
Часть 1. Спецификация на
перчатки из каучукового
латекса или раствора
ГОСТ Р 52239-2004
37 Пипетки стеклянные ГОСТ 29227-91
38 Пробирки стеклянные ГОСТ 1770-74
39 Вата гигроскопическая ГОСТ 5556-81
* Примечание: допускается применение оборудования другого типа, по своим характери
стикам не уступающего рекомендуемому.
6. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ПРОБЫ
Материалом для исследования служат (МУК 4.2.2940-11 «Порядок организации и
проведения лабораторной диагностики чумы для лабораторий территориального,
регионального и федерального уровней»):
-пробы культур микроорганизмов: бактериальные суспензии культур чумного
микроба или подозрительных изолятов;
-пробы клинического материала: кровь, мокрота, мазок из зева, пунктаты бубона,
отделяемое язв;
Лист 8 Всего листов 23
Не допускается частичная или полная перепечатка настоящего акта и положении к нему без разрешения
лаборатории
--- стр. 9 ---
-пробы биологического материала: органы грызунов, зайцеобразных,
насекомоядных и наземных хищников.
Материал для исследования забирают в стерильные емкости с герметично завинчи
вающимися крышками в соответствии с требованиями СП 1.3.3118-13 «Безопасность ра
боты с микроорганизмами I-II групп патогенности», МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и
транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории», МУ 1.3.2569-09
«Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых
кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».
Транспортирование материала в лабораторию для исследований проводят при
температуре отплюс 2 до плюс 8 в течение 1 суток в соответствии с СП 1.2.036.-95
«Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп
патогенности». После проведения предварите.льной обработки проб допускается их
транспортировка при температуре от минус 24 до минус 16 * ^ С в течение 7 суток, либо в
сосуде Дьюара с жидким азотом - длительно.
С целью предотвращения повреждения ДНК-мишеней возможно использование
транспортной среды следующего состава: сахароза - 0,218 моль; КН2РО4 - 0,0038 моль,
К2НРО4 - 0,0072 моль; 1 % БСА. При необходимости длительного хранения и (или)
транспортировки, при отсутствии низкотемпературных холодильников, используют
специальную транспортную среду ESP: 1 % саркозил; 0,05 моль ЭДТА; 1 мг/мл проназа Е.
Исследуемый материал может храниться в среде ESP при температуре от плюс 20 до плюс
30 в темном месте до 10 дней.
Интерферирующие вещества и ограничения по использованию проб
исследуемого материала
Использование для проведения ПЦР-исследования биологического материала,
содержащего избыточное количество примесей в виде слизи, крови и гноя может
приводить к ингибированию реакции амплификации.
В процессе пробоподготовки для проведения ПЦР-исследований с использованием
Набора регентов «Пест-МЛ ПЦР-биочип» нативный материал проходит этап обогащения
в жидкой питательной среде (см.п.7.2. Настоящей инструкции), после которого бульонная
культура используется для выделения ДНК. В связи с вышеизложенным, органические
примеси из нативных образцов не оказывают интерферирующего влияния на реакцию
амплификации, что подтверждено результатами клинических испытаний.
ш
4
7. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ (АНАЛИЗА)
Исследование состоит из следующих этапов: подготовки проб исследуемого матери
ала, обогащения нативного материала в жидкой питательной среде, обеззараживания ма
териала, выделения ДНК; амплификации (постановки ПЦР), гибридизации полученных
ампликонов на биочипе, регистрации и учета результатов анализа.
7.1. Подготовка исследуемых образцов
7.1.1. Подготовка проб культур микроор 1анизмов
Из культур чумного микроба или подозрительных изолятов готовят суспензии в 2 мл
0,9% раствора натрия хлористого по отраслевому стандартному образцу мутности 10
единиц ФЕБУ «НЦЭСМП» (ОСО 42-28-59-86П), что соответствует 1x10^ м.к./мл для
Y.pestis. Затем проводят 10-кратные разведения подготовленных суспензий в 0,9%
растворе натрия хлористого до конечной концентрации 1x10 - 1x10 м.к./мл.
7.1.2. Подготовка проб клинического материала
Кровь
Кровь у людей берут из локтевой вены в количестве 4,5 мл стерильным шприцем, в
который предварительно вносят 0,5 мл стерильного 4 % раствора натрия цитрата и
переносят в стерильные стеклянные пробирки или специальные пластиковые пробирки с
пробкой. Аккуратно перемешивают покачиванием. Затем отбирают 0,1 мл для посева в
жидкую питательную среду.
Лист 9 Всего листов 23
Не допускается частичная или полная перепечатка настоящего акта и приложений к нему без разрешения
лаборатории
--- стр. 11 ---
■Щ
4
нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп
патогенности».
К исследуемым образцам после этапа обогащения добавляют натрия мертиолят до
концентрации 1:10000 (0,01%) с последующим прогреванием их при (56±1) ‘ 'С в течение
30 минут. Затем 100 мкл образцов, обработанных мертиолятом натрия переносят в про
бирки объемом 1,5 мл, содержащие лизирующий буфер на основе 6 моль гуанидинизо-
тиоцианата в объеме, указанном в инструкции к набору для выделения ДНК, и инкубиру
ют 15 минут при температуре (65±1) °С. После выполнения данного этапа материал счи
тается обеззараженным.
7.4. Выделение ДНК
Выделение ДНК осуществляют методом нуклеосорбции на силикагеле в
присутствии гуанидинтиоцианата с использованием коммерческих наборов «ДНК-сорб
В», «Рибо-преп» или аналогичных. Работу проводят в соответствии с инструкциями к
указанным наборам.
7.5. Проведение ПЦР - амплификацияДНК
7.5.1. Подготовка реакционных смесей
В зависимости от поставленных задач исследования определяют количество необхо
димых реакций в эксперименте (таблица 3). Для проведения реакции в штатив отбирают
необходимое количество микропробирок объемом 0,2 мл для соответствующих ПЦР-
смесей. Пробирки маркируют.
Таблица 3
Задача
ПЦР-смесь Кол-во
проб
Кол-во пробирок
для исследова
ния
1 2 3 4
Определение принадлежности куль
туры к Y. pestis
п ^ п+2
Определения принадлежности куль
туры к Y. /? £ ? 5/г5идифференциация ви
рулентных и авирулентных изолятов
п = 2п+2
Расширенная идентификация штам
мов возбудителя чумы
п = 4п+2
Примечание: серым обозначена исполъзуемая в исследовании ПЦР-смесь
Из морозильной камеры извлекают соответствующие ПЦР-смеси, ПЦР-буфер, Taq
ДНК-полимеразу, ПКО ^HKY.pestis, ТЕ-буфер. Пробирки с ПЦР-смесями, ПЦР-буфером,
Taq ДНК-полимеразой, ПКО ДНКУ.ре.^/^, ТЕ-буферомполностью оттаивают, перемеши
вают на микроцентрифуге/встряхивателе и центрифугируют при 3000-5000 об/мин в тече
ние 5-10 с для осаждения капель со стенок пробирки.
В отдельных микропробирках объемом 0,6 мл или 1,5 мл готовят реакционные смеси
(PC) с соответствующими ПЦР-смесями из расчета, что на 1 реакцию необходимо: соот
ветствующей ПЦР-смеси - 10,0 мкл, ПЦР-буфера - 5,0 мкл, Taq ДНК-полимеразы -
0,2 мкл (таблица 4).
Таблица 4
Реакционная смесь Реагент Объем, мкл
РС-1 ПЦР-смесь 1 10
ПЦР- буфер 5
Taq ДНК-полимераза 0,2
РС-2 ПЦР-смесь 2 10
ПЦР- буфер 5
Taq ДНК-полимераза 0,2
РС-3 ПЦР-смесь 3 10
ПЦР- буфер 5
Лист 1 1 Всего листов 23
Не допускается частична > 1 или полная перепечатка настоящего акта и приложений к нему без разрешения
лаборатории
--- стр. 12 ---
Реакционная смесь Реагент Объем, мкл
Taq ДНК-полимераза 0,2
РС-4 ПЦР-смесь 4 10
ПЦР- буфер 5
Taq ДНК-полимераза 0,2
Подготовленные реакционные смеси тщательно перемешивают на
микроцентрифуге/встряхивателе и вносят по 15 мкл подготовленных смесей в
соответствующие микропробирки.
Затем в пробирки с реакционными смесями вносят по 10 мкл ДНК из исследуемых
проб. В микропробирки с отрицательным контролем амплификации вносят по 10 мкл ТЕ-
буфера. в микропробирки с положительным контролем амплификации - по 10 мкл ПКО
JlHKY.pestis.
7.5.2. Проведение термоцик. 1ирования
Подготовленные пробирки помещают в амплификатор с горячей крьцикой и прово
дят реакцию по следующей программе (таблица 5):
Таблица 5
Циклы Температура Время Количество
циклов
1 95 “с 10 мин 1
2
95 “С 20 с
4551 35 с
72 "с 20 с
3 72 °С 3 мин 1
ВАЖНО: для проведения реакции используют только амплификаторы с горячей
крышкой, которые обеспечивают проведение амплификации без использования мине
рального масла !!!
Образцы после амплификации можно хранить в течение 16 ч при комнатной температу
ре, в течение 1 недели при температуре от 2 до 8 °С и в течение 1 месяца при температуре не
вьпде минус 16 °С.
4
7.6. Проведение реакции гибридизации на ДНК-чипе
ВАЖНО: между отдельными операциями блокировки, гибридизации и промывки
лунки не должны высыхать!!! Нри работе со слайдами необходимо работать в пер
чатках!!!
Для проведения исследования из холодильной камеры извлекают биочипы, отмы
вочный раствор 1, отмывочный раствор 2, из морозильной камеры - блокирующий и ги-
бридизационный растворы. Полностью размораживают блокирующий и гибридизацион-
ный растворы.
Необходимое для анализа количество стекол извлекают из пластмассового контей
нера. При этом, стекло держат за края, не касаясь поверхности. Стекло берут таким обра
зом, чтобы .маркировка стекла располагалась в нижнем правом углу. После отбора необ
ходимого количества стекол, оставшиеся стекла помещают в холодильник и хранят при
температуре от 2 до 8 ® С .
Сверху (со стороны маркировки) на стекло накладывают 16-луночную инкубацион
ную камеру. Стекло вместе с инкубационной камерой вставляют в пазы рамки-держателя
стекол.
7.6.1. Б.юкировка слайдов
Перед этапом гибридизации осуществляют предварительную блокировку поверхно-
Лист 12 Всего листов 23
Не допускается частичная юи патая перепечатка настоящего акта и приложений к нему без ратешеиия
лаборатории
--- стр. 13 ---
сти ДНК-чипов. Для этого в лунки инкубационной камеры вносят по 100 мкл блокирую
щего раствора. Блокировку проводят на термошейкере при температуре 42 в течение
30 мин при скорости вращения платформы 200 об/мин. Затем, содержимое из лунок акку
ратно, не касаясь зоны эррея. отбирают с помощью вакуумного отсасывателя. Для про
мывки в лунки добавляют по 100 мкл отмывочного раствора 1, инкубируют при темпера
туре 42 в течение 5 мин при скорости вращения платформы 250 об/мин. Затем, содер
жимое из лунок аккуратно, не касаясь зоны эррея, отбирают с помощью вакуумного отса
сывателя.
7,6.2.ДНК-гибридизация
Готовят пробирки объемом 0,6 (1,5) мл по количеству исследуемых образцов, вклю
чая контрольные (К+, К-).
ПЦР-продукты каждого исследуемого образца, полученные на предыдущем этапе
амплификации, смешивают в одной пробирке объемом 0,6 мл или 1,5 мл по 10 мкл от
каждой реакционной смеси из расчета одна пробирка - один исследуемый образец. Ко
нечный объем гибридизационной смеси доводят до 80 мкл добавлением гибридизацион-
ного раствора. Пробирки прогревают в твердотельном термостате при температуре 95 в
течение 5 мин.
В лунки инкубационной камеры вносят по 80 мкл прогретой гибридизационной сме
си каждого образца (в одну лунку из одной пробирки от одного образца). В лунку с поло
жительным контрольным образцом (ПКО) и отрицательным контрольным образцом
(ОКО) вносят содержимое ПЦР-продуктов соответствующих контрольных образцов в ги-
бридизационном растворе. Образцы инкубируют на термошейкере при температуре 42
в течение 1.5-2 ч при скорости вращения платформы 200 об/мин.
Затем, содержимое из лунок аккуратно, не касаясь зоны эррея, отбирают с помощью
вакуумного отсасывателя. Слайды отмывают отмывочным раствором 1 при температуре
42 в течение 3 мин при скорости вращения платформы 250 об/мин, путем добавления в
каждую лунку по 100 мкл отмывочного раствора 1. Содержимое лунок аккуратно отбира
ют с помощью вакуумного отсасывателя. Затем, слайды отмывают отмывочным раство
ром 2 при температуре 42 °С в течение 2 мин при скорости вращения платформы
250 об/мин, путем добавления в каждую лунку по 100 мкл отмывочного раствора 2. Со
держимое лунок аккуратно отбирают с помощью вакуумного отсасывателя.
Далее слайды вынимают из рамок, снимают аккуратно инкубационные камеры,
слайды ополаскивают дистиллированной водой объемом не менее 30 мл, помещают в цен
трифужные пробирки с крышкой объемом 50 мл и высушивают путем центрифугирования
при 1000 об/мин в течение 1 мин. Стекло вынимают из пробирки, после чего производят
учет результатов. Допускается хранение стекол при температуре от плюс 18 °С до плюс
25 °С в защищенном от света месте.
7,7. Регистрация и оценка результатов.
Учет результатов осуществляют с использованием флуоресцентного сканера биочи
пов при длине волны 635 нм. Необходимо использование флуоресцентных сканеров и
компьютерного обеспечения, снабженных программой количественного анализа сканиро
ванных изображений (например, сканеры серии GenePix® «MolecularDevices», США).
7.7.1. Учет результатов при помощи сканера серии GenePix®
(«MolecularDevices», США)^
Включить прибор и запустить программу GenePixPro 6.0 (далее программа).
Вставить стекло в сканер лицевой поверхностью вниз, располагая верх стекла по
направлению вперед.
В рабочем окне программы в правой панели нажать кнопку «PreviewScan» ® и
'При использовании других видов сканеров, регистрация и количественный анализ флуоресценции в спотах
осуществляется в соответствии с Инструкциями пользователя к данным приборам и программному
обеспечению для обработки изображений.
Лист 13 Всего листов 23
Не допускается частичная или полная перепечатка настоящего акта и приложений к нему без разрешения
лаборатории
--- стр. 14 ---
4
%»
выполнить предварительное сканирование стекла.
Ограничить область сканирования, предварительно нажав в левой панели рабочего
окна программы кнопку «ScanArea» И (Рисунок 3).
Выполнить сканирование ограниченной области, нажав в правой панели кнопку
«DataScan» ® . Время сканирования составляет 6,5 мин.
Ьтт пита
• Vgi'ip^Cl
««•ю га J
S ч «I
шш
Ш
Ш
ш
I|0
I '
а
ш
Рисунок 3 - Интерфейс программы GenePixPro 6.0 с ограниченной областью сканирова
ния слайда
После сканирования наложить на полученное изображение шаблон для количе
ственного измерения уровня флуоресценции в местах локализации зондов. Для этого па
левой панели рабочего окна программы нажать кнопку «NewBlocks» и задать
параметры в соответствии с рисунком 4, где Numberofcolumns - количество эрреев по
горизонтали на одном слайде (2), Numberofrows - количество эрреев по вертикали на
одном слайде (6), Columnspacing - расстояние между эрреями по горизонтали (9000),
Rowspacing - расстояние между эрреями по вертикали (9000);Numberofcolumns -
количество спотов в одном эррее по горизонтали (6), Columnspacing - расстояние между
спотами по горизонтали (750), Numberofrows — количество спотов в одном эррее по
вертикали (4), Rowspacing - расстояние между с спотов по вертикали (750).
Featurediameter - диаметр спотов (300).
Лист 14 Всего листов 23
Не допускается частичная inu полная перепечатка настоящего акта и приложений к нелп- без разрешения
лаборатории
--- стр. 15 ---
9' New Blocks
Blocks
Niirbe* of cokimt:
CohJim spocrig (amt [ЭОбО
Cokrnn sepatebon (amt 4500
Nutibeto(torn; ^
| j Row spaceig (amt {9000 ^
Row sepaobon (omt 6000
Feabeet
Numbot ol cokmts:
Cokfir tpaceig toffit
Niinbeiol rows:
Row spacfig (amt
Feabae dariele* (amt
Rotabon (dogteest
w ’ijp l]
[750
[300“
Io “
Feahae L a ^
(• RactangJaf
C Orange packing 1 1 1
^ Orange packmg 112
<~ Orange pack^ ЯЗ
^ Oitfige packing Я4
OK J CanceJ I H e k >
Рисунок 4 - Окно «NewBlocks»
[S' 1 л .C использованием инструментов «BlockMode» и «ZoomMode» 1Ж i.левой пане-
ли совместить прямоугольные блоки полученного шаблона с эрреями ДНК-чипа, округ
лые элементы блоков - с местами локализации зондов, в соответствии с рисунком 5.
S п т
штшш
FaewVW
i
■
ь>
9
%
%
ш
ш
I
А !
!% 1
Рисунок 5 - Интерфейс программы GenePixPro 6.0 с наложенным шаблоном для количе
ственного учета флуоресценции
Нажать в правой панели рабочего окна программы кнопку «Analyse» . В
результате анализа автоматически осуществляется переход на вкладку «Results» и
формируется таблица, представленная на рисунке 6, где Block - номер эррея (нумерация
эрреев идет слева направо, сверху вниз), Column - номер столбца спотов эррея (нумерация
идет слева направо в соответствии с рисунком 1), Row - номер строки спотов эррея
(нумерация сверху вниз), F635Mean - средний уровень флуоресценции при длине волны
возбуждения 635 нм в пределах одного спота (от 0 до 65535).
Лист 15 Всего листов 23
Не допускается частичная tnu полная перепечатка настоящего акта и птиожении к нему без разрешения
лаборатории