Набор реагентов для in vitro диагностики наличия мутаций гена BRAF методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в образцах пациентов, фиксированных в формалине и залитых в парафин, 64 реакции — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 3 ---
с с I IVnl диагностики
V V I-------1 in-vitro •2SX*^
Хранить при
температуре от -25 °С
до-15 “ С
REF BRAFX-RT64
Набор реагентов для in vitro диагностики наличия мутаций гена BRAF методом
полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в образцах пациентов
фиксированных в формалине и залитых в парафин, 64 реакции
Набор валидирован для приборов:
Амплификатор нуклеиновых кислот Applied Biosystems QuantStudio 5 с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме
реального времени
РЗН 2019/8446 от 06.06.2019
(бессрочно)
Прибор для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального
времени Rotor-Gene Q
ФСЗ 2010/07595 от 10.08.2010
(бессрочно)
Анализатор LightCycler 480-П для проведения ПЦР-анализа в режиме
реального времени
ФСЗ 2009/03609 от 06.06.2016
(бессрочно)
Термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот 1000 с Модулем
реакционным оптическим CFX96
ФСЗ 2008/03399 от 21.06.2016
(бессрочно)
Инструкция по применению — Версия 2.8
--- стр. 4 ---
Содержание
Наименование медицинского изделия 5
Производитель и его уполномоченный представитель 5
Назначение медицинского изделия 5
3.1. Описание целевого аналита 6
3.2. Функциональное назначение медицинского изделия 6
3.3. Специфическая патология, состояние или фактор риска, для обнаружения, определения
или дифференцирования которого предназначено изделие 6
3.4. Тип анализируемого образца 6
Описание функциональных элементов и составных частей 6
4.1. Комплектность 6
4.2. Состав реагентов 7
4.3. Описание характеристик 9
4.3.1. Внешний вид 9
4.3.2 Рабочие характеристики изделия 9
4.3.3 Диагностические характеристики изделия 10
Сведения о предназначении изделия для клинической лабораторной диагностики 10
Перечень и описание материалов медицинского изделия, вступающих в непосредственный или
опосредованный контакт с организмом пациента 11
Предназначение изделия с указанием пользователя
Принцип действия медицинского изделия
8.1. Проведение анализа
8.1.1. Выделение ДНК
8.1.2. Подготовка реагентов (для всех приборов)
8.1.3. Настройки прибора
8.2. Анализ данных
8.2.1. Настройки приборов для проведения анализа
8.2.2 Интерпретация результатов
9.1. Реагенты
9.2. Оборудование
9.3. Вспомогательные материалы
И
1 1
11
11
12
14
17
18
19
22
22
23
Сведения для идентификации медицинских изделий с целью получения безопасной комбинации
и информация об известных ограничениях по совместному использованию медицинских изделий
23
--- стр. 5 ---
Условия хранения и обслуживания медицинского изделия 23
Информация о порядке действий в случае нарушения упаковки, о стерильном состоянии и методе
стерилизации 24
Информация для пользователей 24
13.1. Сведения и меры предосторожности, предпринимаемые в отношении потенциально
инфекционного материала, содержащегося в изделии 24
13.2. Сведения о мерах предосторожности и меры, предпринимаемые в случае сбоя или
отклонений в функционировании изделия, определяемых по внешним признакам 25
13.3. Сведения о безопасности от воздействия химических и загрязняющих веществ, в том
числе предельно допустимые концентрации веществ или входящих в него компонентов 25
13.4. Сведения о пожарной безопасности 25
13.5. Сведения о взрывобезопасности 25
13.6. Сведения о радиационной безопасности 25
13.7. Сведения о безопасности при обслуживании изделия, в том числе требования
безопасности при ошибочных действиях обслуживающего персонала и самопроизвольном
нарущении функционирования 25
13.8. Сведения о защитных средствах и мероприятиях обеспечения безопасности 25
13.9. Требования к помещениям 26
13.10. Меры предосторожности при использовании изделия по назначению 26
13.11. Меры предосторожности в случае предсказуемого риска 27
13.12. Меры по защите окружающей среды 27
13.13. Информация о токсикологическом воздействии 27
13.14. Информация об обстоятельствах, при которых пользователь должен
проконсультироваться с медицинским специалистом 27
Кратность применения и техническое обслуживание 28
Информация о надлежащей обработке изделия для его повторного использования, включая
очистку, дезинфекцию, упаковку и при необходимости метод повторной стерилизации 28
Специальные требования в отношении помещений, специальной подготовки или особой
квалификации пользователя и третьих лиц 28
Информация об условиях, необходимых для сбора, обработки и подготовки образцов, данные по
стабильности анализируемых образцов, в том числе условия и длительность хранения, условия
транспортировки, ограничения по циклам заморозки (размораживания) 28
Информация о подготовке к использованию изделия 29
Информация, необходимая для проверки правильности установки изделия и его готовности к
безопасной работе по назначению 29
19.1. Методы снижения рисков при работе с изделием 29
--- стр. 10 ---
Смесь
праймеров
для
выявления
BRAF
V600K
(Коричнева
я крышка с
отметкой К)
- Пробы (флуоресцентно-меченные
гидролизные олигонуклеотидные
пробы)
- Праймер (известная
последовательность нуклеотидов,
комплементарная мутантному
варианту испытуемого гена)
- Вода*
-тТЕ(1ХТЕбуфер pH 8)
7732-18-5
118-5-53-1
60-00-4
88,8 % вода
11,2% ЮТА
12,6 нг/мкл
олигонуклеоти
ды
1 X
400 мкл
Смесь
праймеров
для
выявления
BRAF
V600R
(Коричнева
я крышка с
отметкой R)
- Пробы (флуоресцентно-меченные
гидролизные олигонуклеотидные
пробы)
- Праймер (известная
последовательность нуютеотидов,
комплементарная мутантному
варианту испытуемого гена)
- Вода*
-ШТЕ(1ХТЕбуфер pH 8)
7732-18-5
1185-53-1
60-00-4
88,8 % вода
11,2% ЮТА
12,6 нг/мкл
олигонуклеоти
ды
1 X
400 мкл
Смесь
праймеров
для
выявления
BRAF
V600D
(Коричнева
я крышка с
отметкой D)
- Пробы (флуоресцентно-меченные
гидролизные олигонуклеотидные
пробы)
- Праймер (известная
последовательность нуклеотидов,
комплементарная мутантному
варианту испытуемого гена)
- Вода*
-ЮТЕ (IX ТЕ буфер pH 8)
7732-18-5
1185-53-1
60-00-4
88,8 % вода
11,2% ЮТА
12,6 нг/мкл
олигонуклеоти
ды
1 X
400 мкл
Смесь
праймеров
для
выявления
BRAF
V600M
(Коричнева
я крышка с
отметкой
М)
- Пробы (флуоресцентно-меченные
гидролизные олигонуклеотидные
пробы)
- Праймер (известная
последовательность нуклеотидов,
комплементарная мутантному
варианту испытуемого гена)
- Вода*
-ЮТЕ (IX ТЕ буфер pH 8)
7732-18-5
1185-53-1
60-00-4
88,8 % вода
11,2% ЮТА
12,6 нг/мкл
олигонуклеоти
ды
1 X
400 мкл
Смесь
положитель
ных
контролей
(ПК)
(Красная
крышка)
- Смесь синтетических специфических
последовательностей
олигонуклеотидов
- Вода*
7732-18-5
0,50 фг/мкл
99 % вода
Прошел
финальную
проверку
Положителен
для
1 X
100 мкл
--- стр. 11 ---
определяемых
мутаций
4.Э. Описание характеристик
4.3.1. Внешний вид
Парамет
Р
Наименование
Реакционн
ая смесь
для
определени
я мутации
(2Х)
Смесь
праймеров
для
определен
ия BRAF
V600E
Смесь
праймеров
для
определен
ия BRAF
V600K
Смесь
праймеров
для
определен
ия BRAF
V600R
Смесь
праймеров
для
определен
ия BRAF
V600D
Смесь
праймеров
для
определен
ия BRAF
V600M
Смесь
положите
льного
контроля
BRAF
V600E/K/
R/D/M
Количест
во (шт)
4 1 1 1 1
Объем
реагента
(мкл)
1300 400 400 400 400 400 100
Материал
пробирки
Поли-проп
илен
Поли-про
пилен
Поли-про
пилен
Поли-про
пилен
Поли-про
пилен
Поли-про
пилен
Поли-пр
опилен
Цвет
крышки
пробирки
Фиолетова
я
Коричнева
я
Коричнева
я
Коричнева
я
Коричнева
я
Коричнев
ая
Красная
Высота
пробирки,
мм*
44 44 44 44 44 44 44
‘допустимое отклонение составляет ±5%.
4.3.2 Рабочие характеристики изделия
Таблица 19.
Рабочие характеристики изделия
Характеристика Реак
ция
Мутация Репортер Значение
Предел
обнаружения
1 Комплекс
V600E/
V600E2
V600E FAM 1,0%
V600E2 FAM 0,5 %
2 V600K FAM 1,0%
--- стр. 12 ---
3 V600R РАМ 1,0%
4 V600D РАМ 1,0%
5 V600M РАМ 2,0 %
Характеристика Реак
ция
Мутация Значение
Аналитическая
специфичность
1 Комплекс
V600E/
V600E2
V600E • Значение Ct канала VIC
для мутантных образцов должно
находиться в диапазоне 28 - 31.5.
• Если какой-либо образец
имеет несколько сигналов РАМ,
со значениями в диапазоне
утверждения, верным должен
считаться наиболее ранний
сигнал.
V600E2
2 V600IC
3 V600R
4 V600D
5 V600M
Характеристика Реак
ция
Мутация Значение
Прецизионность 1 Комплекс
V600E/
V600E2
V600E
Значения Ct для ПК должны
попадать в следующие
диапазоны: по VIC от 29.0 до
32.0; по РАМ <30.0
• КВ < 5 %
V600E2
2 V600K
3 V600R
4 V600D
5 V600M
4.3.3 Диагностические характеристики изделия
Таблица 20.
Рабочие характеристики изделия
Характеристика Значение
Диагностическая чувствительность 100 % (15/15 С1о,о5% 79,61-100)
5.Сведения о предназначении изделия для клинической лабораторной диагностики
Область применения - клиническая лабораторная диагностика (in vitro).
10
--- стр. 13 ---
б.Перечень и описание материалов медицинского изделия, вступающих в
непосредственный или опосредованный контакт с организмом пациента
Набор для определения мутации гена BRAF не содержит материалов, вступающих в
непосредственный или опосредованный контакт с организмом пациента (телом человека).
1. Предназначение изделия с указанием пользователя
Набор для определения мутации гена BRAF предназначен для профессионального применения в
клинической лабораторной диагностике (in vitro) квалифицированным персоналом со средним и
высшим медицинским образованием, дополнительно прошедшим специальное обучение для
работы изделием.
8. Принцип действия медицинского изделия
Ген BRAF кодирует серин-треониновую протеинкиназу, которая играет ключевую роль в
регулировании сигнального пути MAPK/ERK, влияя на рост клеток, дифференциацию и
пролиферацию. В 600 кодоне 15 экзона гена BRAF часто возникают мутации при различных
типах рака. Мутации приводят к конститутивно активной форме белка, которая может привести к
онкогенезу и прогрессированию рака.
Исследования показали, что пациенты с прогрессирующей меланомой, которая содержит
мутации гена BRAF в 600 кодоне, вероятно, ощутят клиническую пользу от лечения
ингибиторами киназы, которые нацелены на белок, который несет мутацию.
8.1. Проведение анализа
8.1.1. Выделение ДНК
Геномная ДНК из замороженных или зафиксированных формалином и залитых в парафин (FFPE)
тканей, может быть выделена с помощью Набора для выделения нуклеиновых кислот из
биологических образцов в варианте исполнения: “Набор QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit”
(P3H 2021/15704).
Проведите процедуру выделения геномной ДНК в соответствии с протоколом производителя.
Достаточное количество ДНК может быть выделено из зафиксированных формалином и залитых
в парафин блоков (FFPE) или свежих замороженных срезов (около 2-10 мкг). После выделения
ДНК следует измерить концентрацию с помощью спектрофотометрического или
флуоресцентного анализа (например, на приборах Nanodrop. УФ-спектрофотометр, Qubit) и
довести концентрацию ДНК до 10 нг/мкл. Если концентрация ниже Юнг/мкл, то её
компенсируют объемом воды во время постановки реакции.
Для анализа требуется примерно 100 нг ДНК, 20 нг образца на реакцию. Однако качество ДНК,
выделенной из FFPE блоков, может варьироваться из-за фрагментации. Таким образом,
концентрация ДНК не отражает количество амплифицируемой ДНК, доступной для анализа. Для
определения оптимального количества ДНК для проведения какого-либо анализа методом
ПЦР-РВ рекомендуется использовать набор анализа внутреннего контроля качества компании
«ЭнтроГен» (кат. № IQCA-RT50).
И
--- стр. 15 ---
(с допустимым
избытком 5 %)
Реакционная смесь для определения
мутации 2Х
IX 78,75 мкл
Смесь положительных контролей*, вода или
ДНК
20 нг 5,25 мкл
Вода без нуклеаз 42 мкл
*5,5 мкл положительного контроля (ПК) на мастер-микс с допустимым избытком эквивалентно 1
мкл ПК на реакцию.
2. Перемешать каждую пробирку на вортексе и центрифугировать в течение 10 секунд при
комнатной температуре.
3. Распределить по 24 мкл мастер-микса на лунку, как показано на рисунке 1.
4. Добавить по 6 мкл каждой смеси праймеров для определения мутации (V600E, V600K,
V600R, V600D или V600M) в соответствии с рисунком I.
5. Перемешать смесь пипетрованием несколько раз.
6. Заклеить плашку оптической герметичной пленкой (плашки АВ1/«Рош») или закрыть
крышками (для пробирок Rotor-Gene).
7. (Дополнительно, но рекомендуется для приборов ABI и «Рош») Центрифугировать
плашку в течение 1 минуты на скорости 1500 об./мин..
Рисунок 1. Предложенный макет плашки для одного эксперимента при анализе 14 образцов. ПК:
смесь положительного контроля; КБМ: контроль без матрицы (вода); S1-14: неизвестные
образцы.
13
--- стр. 16 ---
Термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот 1000 с Модулем реакционным
оптическим CFX96
1. В «Мастере запуска» (Startup Wizard) выбрать «Создать новый эксперимент» (Create New
Experiment) и убедиться, что в раскрывающемся списке выбрано CFX96. Нажать ОК.
2. Во вкладке «Протокол» (Protocol) окна «Установка эксперимента» (Experiment Setup)
выбрать «Создать новый» (Create New) и ввести следующие параметры цикла.
8.1.Э. Настройки прибора
Этап Температура Время
1 95 °С 10 мин
2 95 °С 15 сек.
3 58 °С 30 сек.
+ чтение плашки
4 Повторить с шага 2 еще 39 раз
ЗАВЕРШЕНИЕ
3. Изменить объем образца на 30 мкл.
4. После завершения нажать «ОК», чтобы сохранить щаблон протокола. Обратить внимание
на расположение сохраняемого файла щаблона, чтобы использовать его для последующих
анализов. Нажать «Дальще» (Next), чтобы перейти к окну «Установка плашки» (Plate Setup).
5. Во вкладке «Плащка» (Plate) нажать «Создать новый» (Create New), чтобы создать макет
плащки.
6. Нажать на кнопку «Выбрать флуорофоры» (Select Fluorophores) и отметить поля рядом с
FAM и VIC. Все другие поля должны остаться не отмеченными. Нажать ОК.
7. Выберите строку А1-А5 на макете плащки и измените Тип образца (Sample Туре) на
Положительный контроль (Positive Control).
8. Выберите строку BI-B5 на макете платки и измените Тип образца (Sample Туре) на КЕМ
(контроль без матрицы).
9. Выбрать оставтиеся лунки (С1-Н5; А-Н 7-11) на макете платки и изменить «Тип
образца» (Sample Туре) на «Неизвестные» (Unknown).
10. Выделите каждую строку отдельно (начиная с С1-С5) и введите название образца в поле
Наименование образца (Sample Name). Когда закончите, нажмите Enter на клавиатуре, чтобы
записать название образца. Выполните этот шаг для каждого образца.
11. Нажать на «Настройки» (Settings) и выбрать тип используемой плашки (например, BR
Белая (White) или BR Прозрачная (Clear)).
12. После этого нажать кнопку ОК, чтобы сохранить макет плашки.
13. Нажать «Дальше» (Next), затем нажать «Запустить анализ» (Start Run), чтобы начать
анализ.
14
--- стр. 17 ---
Амплификатор нуклеиновых кислот Applied Biosystems QuantStudio 5 с
гибридиэационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме реального времени
1. Запустить программу SDS, затем перейти к «Файл» (File) > «Новый эксперимент» (New
Experiment) > «Установка эксперимента» (Experiment Setup).
2. Введите имя эксперимента, затем выберите систему QuantStudio 5ТМ. Выберите тип
блока (96-луночный блок 0,2 мл).
3. Выберите Количественное определение (Quantitation) > - Сравнительный СТ (ДАСТ)
(Comparative СТ (АДСТ)) для типа эксперимента.
4. Выберите TaqMan® для химического анализа и выбрите «Быстрый» (Fast) для режима
анализа.
5. Перейти к разделу «Метод» (Method) и в поле «Характеристики плашки» (Plate Attributes)
убедиться в том, что Пассивный референсный краситель (Passive Reference Dye)
установлен на «ОТСУТСТВУЕТ» (NONE). Перейти к вводу следующих параметров:
Объем 30 мкл крышка 105°
Температура Время Циклы Сбор данных
95 °С 10 мин XI Отсутствует
95 °С 15 сек.
Х40
Отсутствует
60 °С 30 сек. Вкл.
6. Перейти к разделу «Плашка» (Plate) и в поле «Характеристики плашки» (Plate Attributes)
убедиться в том, что Пассивный референсный краситель (Passive Reference Dye)
установлен на «ОТСУТСТВУЕТ» (NONE).
7. Перейти к вкладке «Расширенная настройка» (Advanced Setup). В поле «Мишени»
(Targets) необходимо изменить название Цели 1 на FAM и убедиться в том, что детектором
является FAM. Установить гаситель люминисценции на «Отсутствует» (None) или
NFQ-MGB.
8. Нажать кнопку «Добавить» (Add), чтобы добавить второй детектор и назвать его 1C.
Изменить репортер для этого детектора на VIC и установить гаситель люминисценции на
«Отсутствует» (None) или NFQ-MGB.
9. В поле «Образцы» (Samples) необходимо добавить ПК для смеси положительного
контроля, КБМ для контроля без матрицы (вода), а также наименования образцов.
10. «Назначить мишени и образцы» (Assign Targets and Samples) в разметку плашки, как
рекомендовано выше. Оба детектора должны быть добавлены в каждую лунку,
содержащую образец, реакцию ПК или КБМ.
11. Убедиться в том, что объем реакционной смеси установлен на 30 мкл, а «Сбор данных»
(Data Collection) включен на этапе при температуре 60 °С.
15
--- стр. 18 ---
12. Поставить реакционную плашку в прибор, нажать «ЗАПУСТИТЬ АНАЛИЗ» (START
RUN).
Прибор для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
Rotor-Gene Q
1. Выбрать «Файл» (File) > «Новый» (New), в диалоговом окне нажать вкладку
«Расширенные» (Advanced), выбрать «Двухэтапный» (Two Step) и нажать «Новый» (New).
2. Выбрать 72-луночный ротор, отметить поле «Предохранительное кольцо присоединено»
(Locking Ring Attached) и нажать «Далее» (Next), затем Мастер пропуска (Skip Wizard).
3. Перейти к «Вид» (View) > «Настройки анализа» (Run Settings), ввести 30 мкл для объема
реакционной смеси и нажать «ОК».
4. Перейти к Вид (View)> Редактор профиля (Profile Editor). В поле должно быть указано два
цикла; «Инкубация» (Hold) и «Циклирования» (Cycling).
5. Ввести следуюшие параметры этапа, нажав на каждый этап на панели справа:
Этап Темперах
ура
Время Сбор данных
Инкубация 95 °С 10 минут Не производится
Установленный
этап
95 °С 15 секунд Не производится
Установленный
этап 40 циклов
60 °С 30 секунд Запрашиваемые каналы:
зеленый (Green) и желтый
(Yellow)
6. Нажмите ОК. Также, вы можете сохранить такой шаблон для дальнейших запусков, нажав
на кнопку «Сохранить как» вверху диалогового окна.
7. Перейти к «Вид» (View) > «Оптимизация уровня сигнала» (Gain Optimization), из
раскрываюшегося списка «Настройки каналов» (Channel Settings) выбрать «Все каналы»
(АН Channels) и задайте калибровку перед первым измерением (Perform Optimization
Before 1st Acquisition). Примечание: Этот этап нужно выполнять только один раз при
использовании новой партии реагентов. После определения Оптимизации уровня сигнала
(Gain Optimization) используйте те же настройки для будущих запусков с реагентами с тем
же номером партии.
8. Загрузить стрипы пробирок в ротор.
9. Перейти к «Анализ» (Run) > «Запустить анализ» (Start Run), затем нажать кнопку
«Запустить» (Start), чтобы начать анализ.
16
--- стр. 19 ---
примечание: диалоговое окно «Редактировать образцы» (Edit Samples) открывается сразу после
запуска анализа. Информацию об образцах можно вводить во время работы прибора или после
завершения анализа.
Анализатор LightCycler 480-11 для проведения ПЦР-анализа в режиме реального времени
1. В «Навигации» (Navigator) необходимо нажать «Новый» (New), чтобы запустить новый
эксперимент LightCycler® 480.
2. Выбрать «Двухцветная гидролизуемая проба / UPL проба» (Dual Color Hydrolysis Probe /
UPL Probe) для «Формата обнаружения» (Detection Format).
3. Нажать «Настроить» (Customize), чтобы убедиться в том, что выбраны FAM (460-510) и
VIC/HEX/Yellow555 (533-580).
4. Изменить объем реакционной смеси на 30 мкл.
5. Добавьте следующие целевые значения программы и температуры:
Наименование программы Циклы Режим анализа
Денатурация 1 Нет
Циклирование 40 Количественная оценка
Для этапа Денатурации:
Цель (°С) Режим сбора данных Удержание (чч:мм:сс)
95 Нет 00:10:00
Для этапа Циклирования:
Цель (“С) Режим сбора данных Удержание
(чч:мм:сс)
Скорость линейного
изменения (°С/сек.)
95 Нет 00:00:15 4.4
60 Однократное 00:00:30 2.2
6. Перейти к «Редактору образца» (Sample Editor) и выбрать «Относительный
количественный анализ» (Rel Quant) в качестве «Рабочего процесса» (Workflow), затем
назначить образцы для плашки.
7. Выбрать кнопку «Эксперимент» (Experiment) и нажать «Запустить анализ» (Start Run),
чтобы сохранить файл и начать анализ.
8.2. Анализ данных
Важно: для пороговых значений может потребоваться корректировка с учетом
чувствительности флуоресцентной детекции каждого термоциклера. В качестве исходной
точки необходимо использовать перечисленные ниже параметры.
17
--- стр. 20 ---
8.2.1. Настройки приборов для проведения анализа
Термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот 1000 с Модулем реакционным
оптическим CFX96
Проводите анализ данных в программном обеспечении прибора ПЦР в реальном времени
с использованием следующих критериев:
• Manual threshold (Ручное пороговое значение): (см. Пороговое значение ниже)
• Baseline (Исходные данные): Auto Calculated (Рассчитано автоматически)
Прибор Пороговое значение
FAM
Пороговое значение VIC
CFX 135 220
Примечание: пороговые значения, возможно, потребуется скорректировать с учетом
различий в оптике и аппаратном обеспечении прибора Термоциклера для амплификатора
нуклеиновых кислот 1000 с Модулем реакционным оптическим CFX96.
Амплификатор нуклеиновых кислот Applied Biosystems QuantStudio 5 с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме реального времени
Проводите анализ данных в программном обеспечении прибора ПЦР в реальном времени с
использованием следующих критериев:
Ручное пороговое значение (см. Пороговое значение ниже)
Исходный уровень:
ТАМ: 3-22
VIC3-15
Прибор Пороговое значение FAM Пороговое значение VIC
QuantStudio 5™ 50 000 25 000
Примечание: пороговые значения, возможно, потребуется скорректировать с учетом различий в
оптике и аппаратном обеспечении прибора ABI.
Прибор для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
Rotor-Gene Q
Проводите анализ данных в программном обеспечении прибора ПЦР в реальном времени с
использованием следующих критериев:
Динамическое изменение кривизны: вкл.
Поправка наклона: вкл.
18
--- стр. 27 ---
13.2. Сведения о мерах предосторожности и меры, предпринимаемые в случае сбоя или
отклонений в функционировании изделия, определяемых по внешним признакам
Не используйте изделие с истекшим сроком годности, при нарушении целостности упаковки. В
случае отклонения внешнего вида изделия от нормального проверьте функционирование изделия
на заведомо пригодном образце биоматериала.
13.3. Сведения о безопасности от воздействия химических и загрязняющих веществ, в том
числе предельно допустимые концентрации веществ или входящих в него
компонентов
Неприменимо. Набор для определения мутации гена BRAF не содержит загрязняющих веществ.
13.4. Сведения о пожарной безопасности
Неприменимо. Набор для определения мутации гена BRAF не является пожароопасным.
13.5. Сведения о взрывобезопасности
Неприменимо. Набор для определения мутации гена BRAF не является взрывоопасным.
13.6. Сведения о радиационной безопасности
Неприменимо. Набор для определения мутации гена BRAF не содержит источников излучения.
13.7. Сведения о безопасности при обслуживании изделия, в том числе требования
безопасности при ошибочных действиях обслуживающего персонала и
самопроизвольном нарушении функционирования
При использовании изделия квалифицированным персоналом согласно инструкции по
эксплуатации и с соблюдением мер предосторожности, ошибочные действия персонала и
нарушения функционирования исключены.
13.8. Сведения о защитных средствах и мероприятиях обеспечения безопасности
При использовании Набор для определения мутации гена BRAF по назначению и соблюдении
мер предосторожности (использовании специальной лабораторной одежды; халат и одноразовые
перчатки, фартук) контакт с организмом человека исключен.
Все использованные одноразовые материалы подвергать обработке дезинфицирующими
средствами с последующей утилизацией в соответствии с разделом 24. “Утилизация”.
При работе с жидкими реагентами использовать лицевой щиток или очки для защиты глаз.
25
--- стр. 28 ---
13.9. Требования к помещениям
Работы должны проводиться в проветриваемых помещениях или в помещениях, оборудованных
приточно-вытяжной вентиляцией. Кратность обмена воздуха - не менее 8.
На рабочих местах должны быть обеспечены допустимые параметры микроклимата согласно
нормативным актам.
В помещениях должно быть обеспечено наличие кипяченой воды и аптечки с медикаментами для
оказания первой медицинской помощи.
Требования к помещениям регулируются действующими локальным законодательством и
нормативными актами.
13.10. Меры предосторожности при использовании изделия по назначению
При контакте с биоматериалом необходимо соблюдать меры предосторожности. Во время работы
следует пользоваться перчатками и специальной лабораторной одеждой, так как образцы
биоматериала следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные длительное
время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита В или любого другого возбудителя инфекции.
Меры предосторожности: при работе с изделием необходимо использовать СИЗ и средства
защиты глаз. При попадании в глаза промыть водой и немедленно обратиться к врачу. При
проглатывании обратиться к врачу.
ПЦР амплификация отличается высокой чувствительностью к перекрестной контаминации.
Очень важно проводить этапы, предществующие амплификации (т. е. выделение ДНК,
приготовление ПЦР реакции), в отдельных местах, в идеале в отдельных помещениях с
изолированными системами вентиляции. Особенно важно, чтобы подготовка ПЦР реакции
осуществлялась в помещении с положительным давлением воздуха (или в ламинарном шкафу).
Во избежание контаминации между образцами/реагентами при работе с ДНК и реагентами для
ПЦР необходимо соблюдать дополнительные меры предосторожности:
Протирать рабочую зону, пипеточные дозаторы и оборудование, предназначенное для
использования вблизи рабочей зоны, дезинфицирующим средством для очистки
поверхностей (20%-отбеливатель или аналог), с тем чтобы устранить ДНК и ДНКазы, с
последующим использованием 70 % этилового спирта.
Перед применением каждую пробирку следует перемешать на вортексе.
Центрифугировать все пробирки перед открытием.
После перемешивания/смешивания на вортексе каждую микроцентрифужную пробирку
открывать осторожно, при этом следует избегать касания внутренней части крышки.
Во избежание перекрестной контаминации для всех этапов пипетирования следует
использовать аэрозоль-устойчивые (с фильтром) наконечники.
Между всеми переносами жидкостей необходимо менять наконечники пипеток.
При работе с ДНК/реагентами всегда следует надевать перчатки и менять перчатки между
этапами, предшествующими амплификации, и пост-амплификации.
Перемещение пробирок, штативов, пипеток и другого используемого оборудования
должно идти в направлении от пре-амплификации до пост-амплификации, и никогда
наоборот.
26
--- стр. 29 ---
13.11. Меры предосторожности в случае предсказуемого риска
Если в ходе предварительного анализа рисков выявляются риски, требующие мероприятий по
снижению уровня риска до приемлемого, то к ним применяются процедуры этапа по управлению
рисками.
Меры по уменьшению вреда и вероятности риска для изделия направлены на то, чтобы
остаточный риск снизился до приемлемого.
В результате возможные риски для изделия являются допустимыми: преимуществ для пациента и
медицинского работника больше, чем возможных опасностей.
13.12. Меры по защите окружающей среды
Не допускайте попадания изделия в канализацию.
После использования изделия образцы следует рассматривать как потенциально
инфицированные, способные длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита В
или любого другого возбудителя инфекции. Образцы должны утилизироваться в соответствии с
действующими локальным законодательством и нормативными актами в отношении
биологически опасных отходов.
Жидкие отходы (загрязненная вода, образующаяся после промывки оборудования) должны быть
собраны в специально предназначенные емкости и своевременно вывезены в места захоронения.
13.13. Информация о токсикологическом воздействии
Информация о токсикологическом воздействии представлена в таблице 3.
Таблица 3. Информация о токсикологическом воздействии.
Наименование медицинского изделия
(модификаций при наличии)
Состав
Набор реагентов для in vitro диагностики
наличия мутаций гена BRAF методом
полимеразной цепной реакции в режиме
реального времени в образцах пациентов
фиксированных в формалине и залитых в
парафин, 64 реакции
Отсутствует
13.14. Информация об обстоятельствах, при которых пользователь должен
проконсультироваться с медицинским специалистом
При случайном попадании изделия в желудочно-кишечный тракт немедленно обратитесь к
врачу.
При попадании на кожу или слизистую оболочку глаз немедленно обратитесь к врачу.
27
--- стр. 30 ---
14. Кратность применения и техническое обслуживание
Набор для определения мутации гена BRAF для многократного применения.
Изделие не требует технического обслуживания.
15. Информация о надлежащей обработке изделия для его повторного использования,
включая очистку, дезинфекцию, упаковку и при необходимости метод повторной
стерилизации
Неприменимо. Набор для определения мутации гена BRAF не требует обработки при повторном
использовании.
16. Специальные требования в отношении помещений, специальной подготовки или особой
квалификации пользователя и третьих лиц
Набор для определения мутации гена BRAF предназначен для профессионального применения в
клинической лабораторной диагностике (in vitro) квалифицированным персоналом со средним и
высшим медицинским образованием, дополнительно прошедшим специальное обучение для
работы изделием.
Работы должны проводиться в проветриваемых помещениях или в помещениях, оборудованных
приточно-вытяжной вентиляцией. Кратность обмена воздуха - не менее 8.
Fla рабочих местах должны быть обеспечены допустимые параметры микроклимата:
- температура воздуха: 17-23°С (в холодный период года);
- 18-27°С (в теплый период года);
- влажность воздуха 15-75 %.
В помещениях должно быть обеспечено наличие кипяченой воды и аптечки с медикаментами для
оказания первой медицинской помощи.
Для соблюдения требований безопасности необходим инструктаж персонала и выполнение
соответствующих обязательных инструкций по технике безопасности и технологических
процессов. Регулируется действующими локальным законодательством и нормативными актами.
17. Информация об условиях, необходимых для сбора, обработки и подготовки образцов,
данные по стабильности анализируемых образцов, в том числе условия и длительность
хранения, условия транспортировки, ограничения по циклам заморозки
(размораживания)
Реакционный мастер-микс: хранить при температуре от -25®С до -15°С. За один раз
рекомендуется размораживать одну пробирку и хранить ее при температуре от 4оС до 8°С не
более 60 дней. Fie следует замораживать-размораживать реагент более 3 раз, поскольку
повторное замораживание-размораживание отрицательно влияет на эффективность фермента.
Если ожидается, что одна пробирка реагента будет расходоваться дольше 3 недель,
рекомендуется аликвотировать небольшие объемы после первой разморозки.
28
--- стр. 31 ---
Смесь праймеров /проб: хранить при температуре от 4®С до 8°С. После размораживания смесь
остается стабильной в течение 3 недель. Если ожидается, что реагенты будут расходоваться
дольше 3 недель, рекомендуется аликвотировать небольшие объемы после первой разморозки
для дальнейшего их хранения при температуре -25°С до -15°С до востребования.
Смесь положительных контролен: хранить при температуре от 4°С до 8°С в течение 3 недель
после первой разморозки. Если ожидается, что реагенты будут расходоваться дольше 3 недель,
рекомендуется аликвотировать небольшие объемы после первой разморозки для дальнейшего их
хранения при температуре -25°С до -15°С до востребования. Следует избегать повторных циклов
замораживания-размораживания (не более 3).
При условии, что условия хранения и обрашения, описанные выше, соблюдаются должным
образом, данное изделие и его компоненты сохранят свои характеристики в течение всего срока
годности, указанного на этикетках каждой пробирки.
18. Информация о подготовке к использованию изделия
Неприменимо. Набор для определения мутации гена BRAF готово к использованию.
19. Информация, необходимая для проверки правильности установки изделия и его
готовности к безопасной работе по назначению
Неприменимо. Изделие не требует установки.
19.1. Методы снижения рисков при работе с изделием
Проблема Решение
Сигнал внутреннего контроля (VIC) для
образца имеет значение Ct выше, чем верхнее
пороговое значение Ct, указанное в разделе 8.
Если положительный целевой
сигнал (например, FAM, ROX, Су5)
возникает до порогового значения Ct,
значит образец является
положительным. См. таблицу Ct в
разделе 8.
Если целевой сигнал
возникает после порогового значения
или не возникает, реакция была
недостаточно насышена
(недостаточно ДНК), необходимо
провести повторный анализ с
большим количеством ДНК.
Если анализ образца, в
котором, как известно, имеются
ингибиторы ПЦР (например, образцы
меланомы имеют меланин, который
является ингибитором ПЦР),
необходимо провести повторный
анализ образца с меньшим
количеством ДНК или разбавить
29
--- стр. 32 ---
образец водой в соотношении 1:5 и
повторно провести анализ.
Если увеличение/уменьшение
объема ДНК не решает проблему:
1. Повторно выделить ДНК (при
возможности).
2. Переосадить этанолом и вновь
ресуспендировать в меньшем объеме
растворителя.
3. Использовать коммерчески
доступный концентратор ДНК.
Целевой и внутренний контрольные сигналы
являются отрицательными для
положительного контроля (ПК).
Реагенты могут
деградировать. Для получения
дополнительной информации
необходимо связаться со своим
поставщиком.
• Во избежание последующих сбоев в
работе реагента необходимо
выполнять инструкции по хранению
и обращению, которые содержатся в
разделе 11 настоящей инструкции.
Аномальный пик на графике усиления образца
с помощью прибора АВ1.
I' ii ' i я *' . ^ * »’
Fluorescence
Cycle
Флуоресценция
Цикл
Аномальная линия пика может
быть результатом пузырьков в лунке,
содержащей образец.
Центрифугировать плащку перед
повторным запуском образца.
• Аномальный пик может быть
ощибкой детекции флуоресценции
прибором. Провести повторный
анализ другой плашки, чтобы
убедиться в отсутствии
воспроизводимости. Если пик
воспроизводится, необходимо
связаться с производителем прибора.
Сигнал в контроле КБМ. Указывает на контаминацию
геномной ДНК. Оценить
лабораторную процедуру.
Предложения по сведению к
минимуму загрязнения рабочей
поверхности см. в разделе 13.10
настоящей инструкции.
• Если присутствует только сигнал
внутреннего контроля и значение Ct
30
--- стр. 33 ---
> 36, результаты можно использовать
для определения мутационного
статуса образца.
• Если присутствует только целевой
сигнал, результаты могут дать
ложноположительный результат,
требуется повторный запуск.
• Если присутствуют и целевой
сигнал, и сигнал внутреннего
контроля, результаты могут дать
ложноположительный результат,
требуется повторный запуск.
Целевой сигнал пересекает пороговое значение
для образцов КЕМ при проведении анализа на
приборе ABI.
Amplification Plot
Cycle
График
амплификации
Цикл
Обеспечить установку ручных
пороговых значений, предложенных
в настоящей инструкции.
• Убедиться в том, что сигнал не
является истинной амплификацией
путем проверки сигнала на
многокомпонентном графике
(приборы Life Technologies). Если
сигнал горизонтальный, то это не
истинная амплификация.
Если сигнал на многокомпонентном
графике является линейным и сигнал
пересекает пороговое значение,
необходимо отрегулировать базовый
конечный цикл.
Установить начальный цикл на 3 и
остановить: самый ранний цикл VIC
Ct (если сигнал по-прежнему
пересекает пороговое значение,
увеличивать число циклов с шагом 3
до тех пор, пока сигнал не перестанет
пересекать пороговое значение).
Умножитель STD установлен на высоком
уровне кривой амплификации на приборе
LC480/cobas Z480 (см. ниже)
Проверить наличие любого
аномального фонового шума
(например, градиент во
флуоресценции) в течение первых
10 циклов. При возникновении
какого-либо аномального шума
необходимо исключить аномальный
шум, настроив первый цикл для
диапазона цикла после цикла, в ходе
которого наблюдается аномальный
шум.
31
--- стр. 34 ---
STD Mult too high
STD Mult set
appropriately
Cycle
Слишком высокий
STD Mult
STD Mult
установлен
соответствующим
образом
Цикч
При отсутствии аномального
фонового шума, настройка
умножителя STD может быть
несоответствующей для прибора и
должна быть подвергнута повторной
оценке с использованием
стандартных образцов и ранее
испытанного материала.
Образец дикого типа имеет значение Ct
целевого сигнала, которое попадает в
параметры для статуса положительной
мутации.
Если сигнал внутреннего
контроля находится в пределах
диапазона, тогда образец дикого
типа контаминирован
положительным образцом или
положительным контролем.
Провести анализ повторно с новым
образцом дикого типа.
Также возможно, что образец
дикого типа не является истинным
диким типом.
20. Рекомендации в отношении процедур контроля качества
Компоненты настоящего изделия производятся в соответствии со стандартом cGMP (текущая
надлежащая производственная практика). Для обеспечения наивысшего качества продукции
cGMP требует обширной валидации и документирования производственных процедур.
Каждая серия испытана на приборах ABI 7500 и (или) ABI QuantStudio 5 в режиме реального
времени с использованием версии 2.0.6 программного обеспечения 7500 и версии 1.4.3
программного обеспечения для проектирования и анализа QuantStudio 5. Сертификат анализа для
каждой реакции и серий смесей праймеров/проб предоставляется по запросу.
32
--- стр. 35 ---
21.Информация о прослеживаемости значений, заданных для калибраторов или
контрольных материалов, которая обеспечивается посредством доступных референтных
методик измерения и эталонов
Неприменимо.
22. Биологический референтный интервал
Неприменимо.
23. Информация об интерферирующих веществах или ограничениях, связанных с
пробой, которые могут повлиять на результат исследования
Неприменимо.
24. Утилизация
Уничтожать неиспользованные при исследованиях изделия и другие реактивы следует как
эпидемиологически опасные отходы в соответствии с принятыми локальными правилами по
обращению и утилизации медицинских отходов.
Дезинфекцию оборудования и помещений также проводить в соответствии с локальными
требованиями.
Общий порядок действий:
1) Изделия, пришедщие в негодность, в том числе в связи с истечением срока годности,
подлежат утилизации.
2) Изделия, пришедщие в негодность, с истекшим сроком годности, являющиеся подделками
или незаконными копиями изделий, а также изделия, обнаруженные и конфискованные
таможенными органами, подлежат уничтожению или утилизации.
3) Уничтожение изделий осуществляется организациями, имеющими соответствующую
лицензию. Уничтожать изделия необходимо на специально оборудованных площадках или
полигонах, а также в помещениях в соответствии с локальными требованиями и с соблюдением
требований по охране окружающей среды.
4) Изготовитель, поставщики, продавцы, импортеры могут уничтожать изделия, потерявшие
потребительские свойства или с истекшим сроком годности, при использовании методов,
согласованных с территориальными органами, ответственными за
санитарно-эпидемиологическое благополучие населения.
5) Изделия во внешней упаковке с предупредительными знаками об опасности следует
уничтожать с соблюдением соответствующих мер безопасности и дезактивации.
6) Жидкие компоненты (реагенты, реактивы) уничтожаются раздавливанием внутренней
упаковки и разведением водой в соотношении 1:100, сливом раствора в канализацию и вывозом
остатка упаковок как производственного или бытового мусора.
Твердые компоненты подлежат дроблению, разведению водой в соотношении 1:100, сливом
раствора в промышленную канализацию и вывозом остатков упаковок как производственного
или бытового мусора. Компоненты изделий, нерастворимые в воде, уничтожают путем сжигания.
33
--- стр. 45 ---
Каждый образец анализируется в 5 реакциях (по 1 на каждую мутацию). Максимальное
количество неизвестных образцов, которые могут быть проанализированы с помощью одного
запуска, варьируется в зависимости от используемого прибора.
Прибор Вместимость
ротора
Количество образцов на
анализ
Applied Biosystems (за исключением StepOne) 96 лунок 17
StepOne, Applied Biosystems 48 лунок 7
RotorGene 100 лунок 18
LightCycler 480. Roche 96 лунок 17
1. Подготовить мастер-микс для каждого образца в соответствии с таблицей ниже:
Реагенты Конечная
концентрация
Объем для каждого
образца
(с допустимым
избытком 5 %)
Реакционная смесь для определения мутации 2Х IX 78,75 мкл
Смесь положительных контролен*, вода или ДНК 20 нг 5,25 мкл
Вода без нуклеаз 42 мкл
*5,5 мкл положительного контроля (ПК) на мастер-микс с допустимым избытком эквивалентно 1
мкл ПК на реакцию.
2. Перемешать каждую пробирку на вортексе и центрифугировать в течение 10 секунд при
комнатной температуре.
3. Распределить по 24 мкл мастер-микса на лунку, как показано на рисунке 1.
4. Добавить по 6 мкл каждой смеси праймеров для определения мутации (V600E, V600K,
V600R, V600D или V600M) в соответствии с рисунком 1.
5. Перемешать смесь пипетрованием несколько раз.
6. Заклеить плашку оптической герметичной пленкой (плашки АВ1/«Рош») или закрыть
крышками (для пробирок Rotor-Gene).
7. (Дополнительно, но рекомендуется для приборов ABI и «Рош») Центрифугировать
плашку в течение 1 минуты на скорости 1500 об./мин..
--- стр. 46 ---
Рисунок 1. Предложенный макет плашки для одного эксперимента при анализе 14 образцов. ПК:
смесь положительного контроля; КБМ: контроль без матрицы (вода); SI-14: неизвестные
образцы.
4.3. Настройки прибора
Термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот 1000 с Модулем реакционным
оптическим CFX96
1. В «Мастере запуска» (Startup Wizard) выбрать «Создать новый эксперимент» (Create New
Experiment) и убедиться, что в раскрывающемся списке выбрано CFX96. Нажать ОК.
2. Во вкладке «Протокол» (Protocol) окна «Установка эксперимента» (Experiment Setup)
выбрать «Создать новый» (Create New) и ввести следующие параметры цикла.
Этап Температура Время
1 95 °С 10 мин
2 95 °С 15 сек.
3 58 °С 30 сек.
+ чтение плашки
4 Повторить с шага 2 еще 39 раз
ЗАВЕРШЕНИЕ
3. Изменить объем образца на 30 мкл.
10
--- стр. 47 ---
4. После завершения нажать «ОК», чтобы сохранить шаблон протокола. Обратить внимание
на расположение сохраняемого файла шаблона, чтобы использовать его для последующих
анализов. Нажать «Дальше» (Next), чтобы перейти к окну «Установка плашки» (Plate Setup).
5. Во вкладке «Плашка» (Plate) нажать «Создать новый» (Create New), чтобы создать макет
плашки.
6. Нажать на кнопку «Выбрать флуорофоры» (Select Fluorophores) и отметить поля рядом с
FAM и VIC. Все другие поля должны остаться не отмеченными. Нажать ОК.
7. Выберите строку А1-А5 на макете плашки и измените Тип образца (Sample Туре) на
Положительный контроль (Positive Control).
8. Выберите строку BI-B5 на макете плашки и измените Тип образца (Sample Туре) на КБМ
(контроль без матрицы).
9. Выбрать оставшиеся лунки (С1-Н5; А-Н 7-11) на макете плашки и изменить «Тип
образца» (Sample Туре) на «Неизвестные» (Unknown).
10. Выделите каждую строку отдельно (начиная с С1-С5) и введите название образца в поле
Наименование образца (Sample Name). Когда закончите, нажмите Enter на клавиатуре, чтобы
записать название образца. Выполните этот шаг для каждого образца.
11. Нажать на «Настройки» (Settings) и выбрать тип используемой плашки (например, BR
Белая (White) или BR Прозрачная (Clear)).
12. После этого нажать кнопку ОК, чтобы сохранить макет плашки.
13. Нажать «Дальше» (Next), затем нажать «Запустить анализ» (Start Run), чтобы начать
анализ.
Амплификатор нуклеиновых кислот Applied Biosystems QuantStudio 5 с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме реального времени
1. Запустить программу SDS, затем перейти к «Файл» (File) > «Новый эксперимент» (New
Experiment) > «Установка эксперимента» (Experiment Setup).
2. Введите имя эксперимента, затем выберите систему QuantStudio 5ТМ. Выберите тип
блока (96-луночный блок 0,2 мл).
3. Выберите Количественное определение (Quantitation) > - Сравнительный СТ (ДАСТ)
(Comparative СТ (ДДСТ)) для типа эксперимента.
4. Выберите TaqMan® для химического анализа и выбрите «Быстрый» (Fast) для режима
анализа.
5. Перейти к разделу «Метод» (Method) и в поле «Характеристики плашки» (Plate Attributes)
убедиться в том, что Пассивный референсный краситель (Passive Reference Dye)
установлен на «ОТСУТСТВУЕТ» (NONE). Перейти к вводу следующих параметров:
Объем 30 мкл крышка 105°
Температура Время Циклы Сбор данных
95 °С 10 мин XI Отсутствует
95 °С 15 сек.
Х40
Отсутствует
60 °С 30 сек. Вкл.
11
--- стр. 48 ---
6. Перейти к разделу «Плашка» (Plate) и в поле «Характеристики плашки» (Plate Attributes)
убедиться в том, что Пассивный референсный краситель (Passive Reference Dye)
установлен на «ОТСУТСТВУЕТ» (NONE).
7. Перейти к вкладке «Расширенная настройка» (Advanced Setup). В поле «Мишени»
(Targets) необходимо изменить название Цели 1 на FAM и убедиться в том, что детектором
является FAM. Установить гаситель люминисценции на «Отсутствует» (None) или
NFQ-MGB.
8. Нажать кнопку «Добавить» (Add), чтобы добавить второй детектор и назвать его 1C.
Изменить репортер для этого детектора на VIC и установить гаситель люминисценции на
«Отсутствует» (None) или NFQ-MGB.
9. В поле «Образцы» (Samples) необходимо добавить ПК для смеси положительного
контроля, КБМ для контроля без матрицы (вода), а также наименования образцов.
10. «Назначить мишени и образцы» (Assign Targets and Samples) в разметку плашки, как
рекомендовано выше. Оба детектора должны быть добавлены в каждую лунку,
содержащую образец, реакцию ПК или КБМ.
11. Убедиться в том, что объем реакционной смеси установлен на 30 мкл, а «Сбор данных»
(Data Collection) включен на этапе при температуре 60 °С.
12. Поставить реакционную плашку в прибор, нажать «ЗАПУСТИТЬ АНАЛИЗ» (START
RUN).
Прибор для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
Rotor-Gene Q
1. Выбрать «Файл» (File) > «Новый» (New), в диалоговом окне нажать вкладку
«Расширенные» (Advanced), выбрать «Двухэтапный» (Two Step) и нажать «Новый» (New).
2. Выбрать 72-луночный ротор, отметить поле «Предохранительное кольцо присоединено»
(Locking Ring Attached) и нажать «Далее» (Next), затем Мастер пропуска (Skip Wizard).
3. Перейти к «Вид» (View) > «Настройки анализа» (Run Settings), ввести 30 мкл для объема
реакционной смеси и нажать «ОК».
4. Перейти к Вид (View)> Редактор профиля (Profile Editor). В поле должно быть указано два
цикла; «Инкубация» (Hold) и «Циклирования» (Cycling).
5. Ввести следующие параметры этапа, нажав на каждый этап на панели справа:
Этап Температур
а
Время Сбор данных
Инкубация 95 °С 10 минут Не производится
Установленный этап 95 °С 15 секунд Не производится
12
--- стр. 49 ---
Установленный этап 60 °С 30 секунд Запрашиваемые каналы: зеленый
40 циклов (Green) и желтый (Yellow)
6. Нажмите OK. Также, вы можете сохранить такой шаблон для дальнейших запусков, нажав
на кнопку «Сохранить как» вверху диалогового окна.
7. Перейти к «Вид» (View) > «Оптимизация уровня сигнала» (Gain Optimization), из
раскрывающегося списка «Настройки каналов» (Channel Settings) выбрать «Все каналы»
(АН Channels) и задайте калибровку перед первым измерением (Perform Optimization
Before 1st Acquisition). Примечание: Этот этап нужно выполнять только один раз при
использовании новой партии реагентов. После определения Оптимизации уровня сигнала
(Gain Optimization) используйте те же настройки для будущих запусков с реагентами с тем
же номером партии.
8. Загрузить стрипы пробирок в ротор.
9. Перейти к «Анализ» (Run) > «Запустить анализ» (Start Run), затем нажать кнопку
«Запустить» (Start), чтобы начать анализ.
Примечание: диалоговое окно «Редактировать образцы» (Edit Samples) открывается сразу после
запуска анализа. Информацию об образцах можно вводить во время работы прибора или после
завершения анализа.
Анализатор LightCycler 480-II для проведения ПЦР-анализа в режиме реального времени
1. В «Навигации» (Navigator) необходимо нажать «Новый» (New), чтобы запустить новый
эксперимент LightCycler® 480.
2. Выбрать «Двухцветная гидролизуемая проба / UPL проба» (Dual Color Hydrolysis Probe /
UPL Probe) для «Формата обнаружения» (Detection Format).
3. Нажать «Настроить» (Customize), чтобы убедиться в том, что выбраны FAM (460-510) и
VTC/HEX/Yellow555 (533-580).
4. Изменить объем реакционной смеси на 30 мкл.
5. Добавьте следующие целевые значения программы и температуры:
Наименование программы Циклы Режим анализа
Денатурация 1 Нет
Циклирование 40 Количественная оценка
Для этапа Денатурации:
Цель (°С) Режим сбора данных Удержание (чч:мм:сс)
95 Нет 00:10:00
Для этапа Циклирования:
13
--- стр. 50 ---
Цель (С) Режим сбора данных Удержание (чч:мм:сс) Скорость линейного
изменения
(°С/сек.)
95 Нет 00:00:15 4.4
60 Однократное 00:00:30 2.2
6. Перейти к «Редактору образца» (Sample Editor) и выбрать «Относительный
количественный анализ» (Rel Quant) в качестве «Рабочего процесса» (Workflow), затем
назначить образцы для плашки.
7. Выбрать кнопку «Эксперимент» (Experiment) и нажать «Запустить анализ» (Start Run),
чтобы сохранить файл и начать анализ.
14
--- стр. 51 ---
Важно: для пороговых значении может потребоваться корректировка с учетом
чувствительности флуоресцентной детекции каждого термоциклера. В качестве исходной
точки необходимо использовать перечисленные ниже параметры.
5.1. Настройки прибора для анализа
Термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот 1000 с Модулем реакционным
оптическим CFX96
Проводите анализ данных в программном обеспечении прибора ПЦР в реальном времени
с использованием следующих критериев:
• Manual threshold (Ручное пороговое значение): (см. Пороговое значение ниже)
• Baseline (Исходные данные): Auto Calculated (Рассчитано автоматически)
5. Анализ данных
Прибор Пороговое значение FAM Пороговое значение VIC
CFX 135 220
Примечание: пороговые значения, возможно, потребуется скорректировать с учетом
различий в оптике и аппаратном обеспечении прибора Термоциклера для амплификатора
нуклеиновых кислот 1000 с Модулем реакционным оптическим CFX96.
Амплификатор нуклеиновых кислот Applied Biosystems QuantStudio 5 с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме реального времени
Проводите анализ данных в программном обеспечении прибора ПЦР в реальном времени с
использованием следующих критериев:
Ручное пороговое значение (см. Пороговое значение ниже)
Исходный уровень:
РАМ: 3-22
VIC 3-15
Прибор Пороговое значение РАМ Пороговое значение VIC
QuantStudio 5™ 50 000 25 000
Примечание: пороговые значения, возможно, потребуется скорректировать с учетом различий в оптике и аппаратном
обеспечении прибора ABI.
Прибор для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
Rotor-Gene Q
Проводите анализ данных в программном обеспечении прибора ПЦР в реальном времени с
использованием следующих критериев:
15
--- стр. 52 ---
Динамическое изменение кривизны: вкл.
Поправка наклона: вкл.
Удаление выбросов: 5 %
Пороговое значение зеленого канала: 0,02
Пороговое значение желтого канала: 0,04
Анализатор LightCycIer 480-П для проведения ПЦР-анализа в режиме реального времени
Проводите анализ данных в программном обеспечении прибора ПЦР в реальном времени с
использованием следующих критериев:
Выбрать «Абсолютная количественная оценка/Базовые точки» (Abs Quant/Fit Points)
Полоса шумов (STD Mult): VIC [60], FAM [30]
5.2 Интерпретация результатов
Для анализа полученных результатов для каждого образца используйте таблицу и Рисунок 2
ниже.
Амплификатор нуклеиновых кислот Applied Biosystems QuantStudio 5 с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме реального времени:
V I C а FAM Ct Результат
0 < а < 2 6 Ct>37,5; Отсутствие мутации. Повторный анализ не требуется.
0 < а < 2 6 Ct < 37,5; Ct = 0 Повторный анализ с меньшей концентрацией ДНК.
26<Ct<3] Ct>37,5; Ct =0 Отсутствие мутации. Повторный анализ не требуется.
26<Ct<3l Ct < 37,5 Положительный тест на мутацию.
Ct>31;Ct = 0^ Ct>37,5;Ct-0 Повторный анализ с большей концентрацией ДНК.
Ct>3l; Ct<37,5 Положительный тест на мутацию.
Все прочие приборы:
VICCt FAMCt Результат
0 < Ct < 26 Ct >37,0 Отсутствие мутации. Повторный анализ не требуется.
0 < Ct < 26 36,5 < Ct < 37; Ct = 0 Повторный анализ с меньшей концентрацией ДНК.
0 < Ct < 26 0<Ct<36,5 Положительный тест на мутацию.
26<Ct<31 37,0<Ct;Ct-0 Отсутствие мутации. Повторный анализ не требуется.
26 < Ct < 31 Ct<37,0 Положительный тест на мутацию.
Ct>31;Ct=0* 37,0 < Ct; Ct=0 Повторный анализ с большей концентрацией ДНК.
Ct>31;Ct = 0* Ct<37,0 Положительный тест на мутацию.
16
--- стр. 56 ---
воспроизводится, необходимо связаться с
производителем прибора.
Fluorescence
Cycle
Ф.чуоресценция
Цикл
Сигнал в юэнтроле КБМ. Указывает на контаминацию
геномной ДНК. Оценить лабораторную
процедуру. Предложения по сведению к
минимуму загрязнения рабочей
поверхности см. в разделе 13.10 настоящей
инструкции.
• Если присутствует только сигнал
внутреннего контроля и значение Ct> 36,
результаты можно использовать для
определения мутационного статуса
образца.
• Если присутствует тольют целевой сигнал,
результаты могут дать
ложноположительный результат, требуется
повторный запуск.
• Если присутствуют и целевой сигнал, и
сигнал внутреннего контроля, результаты
могут дать ложноположительный результат,
требуется повторный запуск.
Целевой сигнал пересекает пороговое значение для
образцов КБМ при проведении анализа на
приборе ABI.
Amplification Plot
Cycle
График амплификации
Цикл
Обеспечить установку ручных
пороговых значений, предложенных в
настоящей инструкции.
■ Убедиться в том, что сигнал не является
истинной амплификацией путем проверки
сигнала на многокомпонентном графике
(приборы Life Technologies). Если сигнал
горизонтальный, то это не истинная
амплификация.
Если сигнал на многокомпонентном
графике является линейным и сигнал
пересекает пороговое значение,
необходимо отрегулировать базовый
ю)нечный цикл.
Установить начальный цикл на 3 и
остановить: самый ранний цикл VIC Ct
(если сигнал по-прежнему пересекает
пороговое значение, увеличивать число
циклов с шагом 3 до тех пор, пока сигнал
не перестанет пересекать пороговое
значение).
20
--- стр. 57 ---
Умножитель STD установлен на высоком уровне кривой
амплификации на приборе LC480/cobas Z480 (см. ниже)
STD Mult too high
STD Mull set appropriately
Cycle
C.iuuiKav высокий STD Mult
STD Mull установлен
соответствующим образом
Цикл
Проверить наличие любого
аномального фонового шума (например,
градиент во флуоресценции) в течение
первых 10 циклов. При возникновении
какого-либо аномального шума
необходимо исключить аномальный шум,
настроив первый цикл для диапазона
цикла после цикла, в ходе которого
наблюдается аномальный шум.
При отсутствии аномального
фонового шума, настройка умножителя
STD может быть несоответствующей для
прибора и должна быть подвергнута
повторной оценке с использованием
стандартных образцов и ранее
испытанного материала.
Образец дикого типа имеет значение Ct целевого
сигнала, которое попадает в параметры для статуса
положительной мутации.
Если сигнал внутреннего контроля
находится в пределах диапазона, тогда
образец дикого типа контаминирован
положительным образцом или
положительным контролем. Провести
анализ повторно с новым образцом дикого
типа.
Также возможно, что образец
дикого типа не является истинным диким
типом.
21
--- стр. 58 ---
{Перевод надписей и нотариального заверения на документе «Инструкция по применению
медицинского изделия „Наборреагентов для in vitro диагностики наличия мутаций гена
BRAF методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в образцах
пациентов фиксированных в формачине и зачитых в парафин, 64 реакции “»,
представленном на русском языке. ]
{Перевод с английского языка на русский язык]
13 декабря 2021 г.
Inodnucbl
--- стр. 59 ---
НОТАРИАЛЬНОЕ УДОСТОВЕРЕНИЕ ШТАТА КАЛИФОРНИЯ
____________________________________________§ 1189 ГРАЖДАНСКОГО КОДЕКСА
Нотариус или иное должностное лицо, заполняющее данное удостоверение, подтверждает только личность
лица, подписавшего документ, к которому прилагается настоящее удостоверение, и не удостоверяет
верность, точность или действительность упомянутого документа._______________________________
Штат Калифорния
Округ Лос-Анджелес
13 декабря 2021 г. ко мне,
Лато
)
Митре Н. Кати, нотариусу.
лично явился
Указать имя и должность дапжностиого лща
Мэтью Минковски.
И.ия (имена) подписавшего(-их) лица (лиц)
который подтвердил мне на основании достаточных доказательств, что он является лицом, чья
подпись проставлена на указанном документе, а также что он подписал указанный документ в
качестве правомочного лица, и что его подпись на указанном документе означает, что указанный
документ подписан физическим или юридическим лицом, от имени которого действовало указанное
лицо.
{Печать:
Митра Н. Катц
Округ Лос-Анджелес, Калифорния
Нотариус
Лицензия № 2226229
Моя лицензия действительна до
23 декабря 2021 г.
NSPI]
Поставить нотариальную печать
Я удостоверяю под СТРАХОМ НАКАЗАНИЯ ЗА
ЛЖЕСВИДЕТЕЛЬСТВО в соответствии с
законодательством штата Калифорния, что изложенное
выше является точным и верным.
В СВИДЕТЕЛЬСТВО ЧЕГО я ставлю собственноручную
подпись и официальную печать.
Подпись /подпись!
Подпись нотариуса
СВЕДЕНИЯ, УКАЗЫВАЕМЫЕ ПО ВЫБОРУ_
Указание данной информации может предотвратить изменение документа ши попытки
повторного пршожения данного бланка к другому документу в мошеннических целях.
Характеристика прилагаемого документа
Название или тип документа:____________
медииинского изделия.___________________
Инструкиия____по____применению
кол-во страниц:.Дата документа:_________________________________
Дополнительное(-ые) подписавшее(-ие) лицо(-а):_____________________________
Должностное(-ые) положемие(-я), указанное(-ые) подписавшим(-и) лицом(-ами)
корпорации
Имя подписавшего лица:
□ Должностное лицо
должность(-и):__________________________
□ Партнер — □ с ограниченной
ответственностью □ полный
□ Физическое лицо
П Доверенное лицо
□ Доверительный собственник
□ Законный представитель или арбитражный
управляющий
□ Прочее:______________________________
корпорации —
Имя подписавшего лица:
□ Должностное лицо
должность(-и):__________________________
□ Партнер — □ с ограниченной
ответственностью □ полный
□ Физическое лицо
□ Доверенное лицо
□ Доверительный собственник
□ Законный представитель или арбитражный
управляющий
□ Прочее:
Подписавшее лицо представляет интересы:__ Подписавшее лицо представляет интересы: _
© Национальная ассоциация нотариусов, 2015 г, • www.NationaINotaiy.org* 1-800-US НОТАРИУС (1-800-876-6827). Документ №5907,
--- стр. 60 ---
Текст данного документа перевёл переводчик Рахимкулов Эльдар Серкалиевич. Знание иностранного
язьта подтверждаю. Выполненный перевод является правильным, точным и полным.
Российская Федерация
Город Москва
Семнадцатого февраля две тысячи двадцать второго года
Я, Тонкий Дмитрий Валерьевич, нотариус города Москвы, свидетельствую подлинность подписи
переводчика Рахимкулова Эльдара Серкалиевича.
Подпись сделана в моем присутствии.
Личность подписавшегоД0к^9ШШз^жтановлена.
Зарегистрировано ^ррё6п^еД1^^
Уплачено за соверщеШа^ндт.
Всего прошнуровано,
и скреплено печатью
77-2022- У ^
ствия: 400 ру^
Нотариус
Д.В. Точкин