Набор реагентов для выявления и дифференциации генотипов (1, 2, 4) вируса Западного Нила (West Nile virus) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и гибридизационно-флуоресцентной детекцией "Амплиген-WNV-генотип-1/2/4" по ТУ 21.20.23-015-01898084-2019 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 ---
щ
ИНСТРУК
(^■^КУЗ Волгоградский научно-
ский противочумный
отребнадзора
Топорков А.В.
2021 г.
________^ ____:н Е н и ю
«НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЬШВЛЕНЙйТ! ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ГЕНОТИПОВ
(1,2,4) ВИРУСА ЗАПАДНОГО НИЛА {WESTNILE VIRUS) МЕТОДОМ
ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИЕЙ И
ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ
«АМПЛИГЕН-В7УГ-ГЕНОТИП-1/2/4» ПО ТУ 21.20.23-015-01898084-2019»
1. НАЗНАЧЕНИЕ
«Набор реагентов для выявления и дифференциации генотипов (1, 2, 4) вируса
Западного Нила {West Nile virus) методом полимеразной цепной реакции с обратной
транскрипцией и гибридизационно-флуоресцентной детекцией «Амплиген-В^К-генотип-
1/2/4» по ТУ 21.20.23-015-01898084-2019», далее по тексту - набор реагентов «Амплиген-
1РЛ/Г-генотип-1/2/4» предназначен для качественного обнаружения РНК и дифференциации
генотипов (1, 2, 4) вируса Западного Нила в пробах клинического материала методом
полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и гибридизационно-
флуоресцентной детекцией в режиме реального времени Набор реагентов «Амплиген-^fWF-
генотип-1/2/4» может быть использован для клинической лабораторной диагностики и
проведения эпидемиологического мониторинга. В качестве клинического материала от
человека могут быть использованы кровь, плазма и сыворотка крови, лейкоцитарная фракция
крови, спинномозговая жидкость, моча, аутопсийный материал (головной мозг, печень,
селезенка, почки).
Так же возможно применение МИ для исследования биологического материала от
животных (головной мозг, печень, селезенка, почки, кровь), комаров и клещей.
Вирус Западного Нила {WNV, West Nile virus) принадлежит к семейству Flaviviridae,
роду Flavivirus, антигенному комплексу вирусов японского энцефалита {Japanese encephalitis
virus group). По принятой в Российской Федерации классификации патогенных
биологических агентов WNV относят к вирусам II группы патогенности (опасности).
Вирус Западного Нила является возбудителем природно-очаговой арбовирусной
инфекции с трансмиссивным механизмом передачи - лихорадки Западного Нила (ЛЗН).
Природными резервуарами инфекции служат птицы, а в качестве основных переносчиков
выступают орнитофильные комары, иксодовые, гамазовые и аргасовые клещи. Заражение
человека происходит при укусе комаров и клещей. Клинические проявления ЛЗН варьируют
от гриппоподобного синдрома до развития тяжелых осложнений в форме менингита и
менингоэнцефалита. В России достоверно зарегистрирована циркуляция 1, 2 и 4 генотипов
WNVy имеющих разное эпидемическое значение. Так, штаммы WNV генотипов 1 и 2 являются
высокопатогенными для человека, а патогенность WNV 4 генотипа для млекопитающих пока
не установлена. РНК вируса Западного Нила (аналит) может быть обнаружена в
инкубационный период, период острой фазы течения ЛЗН и период реконвалесценции.
Набор реагентов «Амплиген-1КА/К-генотип-1/2/4» используется в клинической
лабораторной диагностике для исследования материала, полученного от лиц обоего пола,
любого возраста с подозрением на ЛЗН вне зависимости от формы и наличия манифестации
заболевания (в анамнезе находивщихся на эндемичных территориях по ЛЗН), а также в ходе
эпидемиологического мониторинга. *
*Введена впервые
Инструкция по применению «Амплиген-^^К-генотип-1/2/4» Страница I из 25
--- стр. 2 ---
2. ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗДЕЛИЯ
Для проведения исследований могут быть использованы амплификаторы для ПЦР с
учетом результатов в режиме реального времени типа Rotor-Gene.
Компоненты набора являются одноразовыми. В состав набора входят 13 реагентов:
Таблица 1
Реагент Описание Объем
(мл)
Количество
ОТ-ПЦР-смесь-1 WNV
генотип-1
прозрачная бесцветная жидкость 0,5 1 пробирка
ОТ-ПЦР-смесь-1 WNV
генотип-2
прозрачная жидкость с бледно-
голубым оттенком 0,5 1 пробирка
ОТ-ПЦР-смесь-1 WNV
генотип-4/ВКО
прозрачная жидкость с бледно-
голубым оттенком 0,5 1 пробирка
ОТ-ПЦР-смесь-2 прозрачная бесцветная жидкость 0,25 3 пробирки
ОТ-ПЦР-смесь-3 прозрачная бесцветная жидкость 0,0375 1 пробирка
Ревертаза MMlv прозрачная бесцветная вязкая
жидкость 0,0375 1 пробирка
Ta^-F-ДНК-полимераза прозрачная бесцветная вязкая
жидкость 0,075 1 пробирка
ПКО кДНК WNV
генотип-1
прозрачная бесцветная жидкость 0,15 1 пробирка
ПКО кДНК WNV
генотип-2
прозрачная бесцветная жидкость 0,15 1 пробирка
ПКО кДНК WNV
генотип-4
прозрачная бесцветная жидкость 0,15 1 пробирка
вко прозрачная бесцветная жидкость 0,5 1 пробирка
око выделения прозрачная бесцветная жидкость 0,75 2 пробирки
ОКО ОТ-ПЦР прозрачная бесцветная жидкость 0,45 1 пробирка
Набор реагентов «Амплиген-1РАК-генотип-1/2/4» рассчитан на проведение 50
определений с учетом контрольных образцов.
Набор реагентов «Амплиген- lfWK-генотип-1/2/4» позволяет обнаруживать
специфические фрагменты РНК WNV посредством полимеразной цепной реакции с обратной
транскрипцией и гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени
и одновременно дифференцировать 1, 2 и 4 генотипы WNV на основании амплификации
фрагмента гена полипротеина WNV {flavivirus polyprotein gene), кодирующего капсидный
белок. Метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) -
представляет собой последовательное проведение двух процессов - реакции обратной
транскрипции, в результате которой в присутствии фермента ревертазы MMlv по матрице
РНК WNV осуществляется синтез кДНК WNV, и полимеразной цепной реакции, в ходе
которой происходит амплификация специфической области кДНК-мищени WNV в
присутствии Taq-F полимеразы, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, буферного раствора и
олигонуклеотидных праймеров, распознающих ДНК-мишень. При постановке ОТ-ПЦР
применяется «горячий старт», обеспечивающийся использованием химически
модифицированной Тд^-полимеразы (ТЬ^^-ДНК-полимераза), которая активируется при
прогреве реакционной смеси при 95 ®С в течение 15 мин, что значительно снижает
количество неспецифических реакций.
Детекция результатов осуществляется путем измерения интенсивности
флуоресцентных сигналов непосредственно в процессе ОТ-ПЦР в режиме реального времени
Инструкция по применению «Амплиген-И^Л^К-генотип-1/2/4» Страница 2 из 25
--- стр. 3 ---
(ОТ-ПЦР-РВ). По каналу FAM/Green детектируется продукт амплификации кДНК WNV 1
генотипа, по каналу ROX/Orange - продукт амплификации кДНК WNV 2 генотипа, по каналу
JOE/Yellow - продукт амплификации кДНК WNV 4 генотипа. Продукты амплификации
соответствуют нуклеотидной последовательности локуса protC гена полипротеина fVNf^
{flavivirus polyprotein gene), кодирующего капсидный белок, определенного генотипа. По
каналу Cy5/Red детектируется продукт амплификации ВКО (внутреннего контрольного
образца).
Проведение анализа включает два этапа: 1) вьщеление нуклеиновых кислот из проб
клинического и биологического материала и 2) проведение полимеразной цепной реакции с
обратной транскрипцией на приборах типа Rotor-Gene. Тип используемых зондов -
«молекулярные маяки». Область «петли» зонда комплементарна анализируемому продукту
ОТ-ПЦР. В ходе реакции происходит гибридизация молекулярного маяка с ампликоном и
расстояние между флуорофором и гасителем увеличивается, что приводит к повышению
флуоресценции, которую фиксирует амплификатор. Учет результатов флуоресценции
проводят по каждому каналу отдельно.
Ограничение метода. В инфицированном материале РНК WNV 1,2 и 4 генотипов может
быть не обнаружена по причине ингибирования ОТ-ПЦР-РВ и/или недостаточной
эффективности выделения РНК. Для достижения показателей аналитической
чувствительности используемый набор для выделения должен обеспечивать эффективность
выделения нуклеиновых кислот на уровне не менее 20%. Ложноотрицательный результат
выявляется с помощью внутреннего контрольного образца (ВКО).
Причиной получения ложноотрицательных результатов ПЦР может быть наличие
интерферирующих веществ (эндогенных, экзогенных). Для анализа потенциального влияния
на работу набора реагентов интерферирующих веществ, содержащихся в биоматериале при
проведении испытаний, использовалась кДНК, вьщеленная из контрольных образцов
предприятия (СОП кДНК WNV-X, СОП кДНК WNV-2, СОП кДНК WNV-4), не содержащих
интерференты. Каждый образец был исследован в концентрации IxlO'* ГЭ/мл в двух
повторах, с добавлением потенциально интерферирующих веществ в концентрацих, содержа
щихся в норме и превышающих верхнюю границу нормальной концентрации данных
веществ в биологических образцах.
Для оценки влияния потенциально интерферирующих веществ на работу набора
реагентов были проанализированы: гемоглобин, билирубин, холестерин, IgG, гепарин, ЭДТА,
которые могут присутствовать в биоматериале (кровь, плазма и сыворотка крови,
лейкоцитарная фракция крови, спинномозговая жидкость, моча, аутопсийный материал
(головной мозг, печень, селезенка, почки), а также иизопропиловый спирт, который может
присутствовать в образце в результате несоблюдения правил пробоподготовки (таблица 2).
Потенциально интерферирующие вещества в концентрациях, которые, как ожидается, будут
встречаться в норме при использовании набора реагентов, не влияют на его специфичность.
Таблица 2
N/n Потенциально
интерферирующие
вещества
Тип
интерферента
Верхняя граница
нормы в образце
Протестированная
концентрация
интерферента в
образце,
превыщающая
верхнюю границу
нормы
Наличие
интерференции
1. Гемоглобин Эндогенный 170 г/л 250 г/л Не обнаружено
2. Общий билирубин Эндогенный 21 мкмоль/л 210 мкмоль/л Не обнаружено
3. Холестерин Эндогенный 7,8 ммоль/л 78 ммоль/л Не обнаружено
4. Ik G Эндогенный 17 г/л 60 г/л Обнаружено
5. Гепарин Экзогенный от 12 до 30
МЕ/мл
30 МЕ/мл Обнаружено
Инструкция по применению «Амплиген-И^^^-генотип-1/2/4» Страница 3 из 25
--- стр. 4 ---
6. ЭДТА Экзогенный от 1,2 до 2,0
мг/мл
до 2,0 мг/мл Не обнаружено
7. Изопропиловый
спирт
Экзогенный - 100 мкл/мл Не обнаружено
Для контроля эффективности экстракции нуклеиновых кислот и реакции
амплификации с набором реагентов, а также отсутствии влияния интерферирующих веществ
предусмотрено использование внутреннего контрольного образца (ВКО).
Причиной получения ложноположительного результата является контаминация на
этапе выделения нуклеиновых кислот или на этапе проведения реакции ОТ-ПЦР в режиме
реального времени. Ложноположительный результат выявляется с помощью отрицательных
контрольных образцов (ОКО выделения, ОКО ОТ-ПЦР).
Повторяемость и воспроизводимость.
Повторяемость и внутрисерийная воспроизводимость анализа была протестирована в ходе
лабораторных испытаний с использованием положительных стандартных образцов
предприятия СОП кДНК WNV-\^ СОП кДНК WNV-2, СОП кДНК WNV-4 в концентрации
IxlO'* ГЭ/мл каждый и отрицательных стандартных образцов предприятия - СОП кДНК YFV
- стандартный образец предприятия кДНК вируса желтой лихорадки {Yellow fever virus), СОП
кДНК RUBV - стандартный образец предприятия кДНК вируса краснухи (Rubella virus) в
концентрации 1x10^ ГЭ/мл каждый, в 5 повторах на наборе одной серии.
Межсерийная воспроизводимость анализа была протестирована в ходе лабораторных
испытаний с использованием положительных стандартных образцов предприятия СОП
кДНК WNVA, СОП кДНК WNV-2, СОП кДНК WNVA в концентрации \х\0^ ГЭ/мл каждый и
отрицательных стандартных образцов предприятия - СОП кДНК YFV - стандартный образец
предприятия кДНК вируса желтой лихорадки (Yellow fever virus), СОП кДНК RUBV -
стандартный образец предприятия кДНК вируса краснухи (Rubella virus) в концентрации
1x10^ ГЭ/мл каждый, на двух сериях набора реагентов.
3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
ИЗДЕЛИЯ
Аналитическая чувствительность.
Набор должен выявлять и дифференцировать РНК/кДНК WNV 1, 2 и 4 генотипов в
пробах с концентрацией не менее IxlO"*ГЭ/мл.
Аналитическая специфичность.
Набор не должен давать положительных результатов с РНК/кДНК гетерологичных
вирусов в пробах с концентрацией 1x10^ ГЭ/мл.
Диагностические характеристики.
Диагностические характеристики набора будут определены по результатам
клинических испытаний.
4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С ИЗДЕЛИЕМ
4.1 Информация об инфекционных или микробных рисках
Набор реагентов может быть использован в учреждениях, имеющих Лицензию на
деятельность в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека и
животных I-IV групп патогенности, стационарных и мобильных лабораториях, имеющих
санитарно-эпидемиологическое заключение на проведение работ с микроорганизмами I-IV
групп патогенности.
Следует рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные, поэтому
этапы подготовки биологических образцов и проведение ПЦР-анализа проводят в
соответствии с требованиями СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические
требования по профилактике инфекционных болезней», МУ 1.3.2569-09 «Организация
Инструкция по применению «Амплиген->ГУР'-генотип-1/2/4» Страница 4 из 25
--- стр. 5 ---
работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе
с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности», МУ 3.1.3012-12
«Сбор, учет и подготовка к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих в
природных очагах опасных инфекционных болезней».
4.2 Необходимость обучения персонала
Исследования на ЛЗН могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и
средним медицинским, биологическим или иным образованием, окончившие
соответствующие курсы профессиональной переподготовки с освоением методов безопасной
работы с возбудителями инфекционных болезней I-IV групп патогенности (опасности), не
имеющие противопоказаний к лечению специфическими препаратами и имеющие допуск к
работе с ПБА на основании приказа руководителя организации.
4.3 Меры безопасности, позволяющие предохранять оператора
Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными,
вредного влияния на организм оператора не оказывают. При работе с набором реагентов
следует соблюдать меры предосторожности для лабораторий:
- проводить работу с использованием средств индивидуальной защиты в соответствии
с СанПиН 3.3686-21;
- использовать одноразовые перчатки без талька;
- этапы выделения РНК/кДНК проводить в боксах биологической безопасности II
класса;
- подготовку к ПЦР с использованием набора реагентов проводить в ПЦР-боксах;
- использовать одноразовые наконечники для автоматических дозаторов при
различных операциях;
- сбрасывать использованные одноразовые расходные материалы (пробирки,
наконечники), посуду в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующее средство;
- удалять отходы с продуктами ПЦР только в закрытом виде, не допускается открывать
пробирки после амплификации;
- осуществлять влажную уборку поверхностей рабочих столов, штативов,
оборудования и др. до начала и после завершения работ с применением дезинфицирующих
средств, обрабатывать помещения бактерицидными облучателями в соответствии с СанПин
3.3686-21.
Избегать контакта с кожей, глазами и слизистыми оболочками, при попадании на них
компонентов набора промыть большим количеством воды. При приеме внутрь компонентов
набора реагентов за медицинской помощью следует обратиться немедленно.
4.4 Информация об экологических рисках
Уничтожение неиспользованных компонентов набора или серий с истекшим сроком
годности проводить в соответствии с СанПиН 2.1.3684-21.
4.5 Информация о физических рисках, в том числе возможность взрыва или
возгорания.
Набор реагентов следует применять по назначению в комбинации с приборами,
прошедшими надлежащее техническое обслуживание. Необходимо строгое соблюдение
инструкций по эксплуатации электрооборудования, безопасности при работе с
электроприборами.
Набор реагентов не содержит материалов, обладающих канцерогенным, мутагенным
действием, а также влияющих на репродуктивную функцию человека.
При использовании по назначению и соблюдении мер предосторожности набор
реагентов является безопасным.
4.6 Информация о рисках применения, приводящих к ошибочному результату
исследования:
■ Использование набора реагентов «Амплиген-11^К-генотип-1/2/4» с истекшим
сроком годности;
Инструкция по применению «Амплиген-И^К-генотип-1/2/4» Страница 5 из 25
--- стр. 6 ---
- Нарушение условий транспортирования, хранения набора реагентов;
- Нарушения упаковки и внешнего вида компонентов набора реагентов;
- Нарушение условий транспортирования, хранения и подготовки проб;
- Нарушение условий окружающей среды при эксплуатации набора реагентов;
- Нарушение процесса проведения анализа, регистрации и учета результатов;
- Применение по назначению МИ в комбинации со средствами измерения,
прошедшими поверку и/или калибровку.
не
5. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ДЛЯ РАБОТЫ С
ИЗДЕЛИЕМ*
Таблица 3
Наименование Основные характеристики или обозначения
документации, производитель
Амплификатор типа Rotor-Gene Амплификатор «RotorGene Q», («QIAGEN»,
Германия), РУ № ФСЗ 2010/07595
Ламинарный-потоковый шкаф II класса
биологической безопасности
Ламинарно-потоковый шкаф II класса
биологической безопасности Biowizard Standard
GL-130, Kojair, Финляндия
ПЦР-бокс Бокс абактериальной воздушной среды для
работы с ДНК-пробами (ПЦР-бокс) при
проведении ПЦР-диагностики БАВ-ПЦР-
«Ламинар-С» «Ламинарные системы», Россия
Микроцентрифуга-встряхиватель Микроцентрифуга-вортекс «Microspin FV-2400»,
НПФ ООО «BioSan», Латвия
Термостат твердотельный Термостат твердотельный от 25 до 100 °С,
«ТЕРМО 48», «Биоком», Россия
Термостат твердотельный с функцией
охлаждения
Термостат твердотельный с функцией
охлаждения от 4 до 120 °С, «Биоком», Россия
Микроцентрифуга настольная Микроцентрифуга «Mini-Spin», «Eppendorf»,
Германия
Отсасыватель медицинский Отсасыватель медицинский «В-40», «Висма
Планар» Беларусь
Холодильник «MPR-214F» рабочий диапазон температур -
основная камера от +2 до +14 ’С, морозильная
камера -20-30 “С, 220В, 155 Вт, «Sanyo», Япония
Дозатор 0,5-10 мкл ILS (САРР), Дания
Дозатор 5-50 мкл ILS (САРР), Дания
Дозатор 20-200 мкл ILS (САРР), Дания
Дозатор 100-1000 мкл ILS (САРР), Дания
Штатив-подставка для дозаторов Штатив-подставка для дозаторов универсальная
на 5 дозаторов, «Хеликон», Россия
96-ти луночный алюминиевый штатив
(для пробирок 0,2 мл)
«Corbett Research», Австралия;
«01AGEN», Германия
Штатив «рабочее место» для
микропробирок на 1,5 мл
Штатив «рабочее место» для микропробирок на
1,5 мл, 5x10 мест с увеличенным расстоянием
между лунками, «Интерлабсервис», Россия
Одноразовые наконечники с фильтром
до 10 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Одноразовые наконечники с фильтром ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Инструкция по применению «Амплиген-ЖА/Г-генотип-1/2/4» Страница 6 из 25
--- стр. 7 ---
ДО 20 мкл
Одноразовые наконечники с фильтром
до 100 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Одноразовые наконечники с фильтром
до 200 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Одноразовые наконечники с фильтром
до 1000 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Микроцентрифужные пробирки
объемом 1,5 мл
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Микроцентрифужные пробирки для
ПЦР объемом 0,6 мл.
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с
плоской крышкой
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Пестик для пробирок типа Eppendorf
1,5-2,0 мл
ФСЗ 2011/10287, «SSI», США
Ступка фарфоровая (№1) ГОСТ 9147-80
Пестик фарфоровый (№1) ГОСТ 9147-80
Порошок стеклянный марки ПСЗО ГОСТ Р 52233-2004
Комплект реагентов для экстракции
РНК/ДНК из клинического материала
«РИБО-преп» по ТУ 9398-071-
01897593-2008
ФСР 2008/03147, ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора, Россия
Комплект реагентов для первого этапа
вьщеления РНК из биологического
материала «РИБО-золь-С» по ТУ 9398-
074-01897593-2008
ФСР 2008/03148, ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора, Россия
Одежда одноразовая медицинская из
нетканого и полимерного материалов
РЗН 2013/668
Перчатки медицинские диагностические
одноразовые. Часть 1. Спецификация на
перчатки из каучукового латекса или
раствора
ГОСТ Р 52239-2004
Спирт этиловый ректификованный из
пищевого сырья
ГОСТ 5962-2013
Натрий хлористый ГОСТ 4233-77
* примечание: допускается применение оборудования другого типа, по своим
характеристикам не уступающего рекомендуемому.
6. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ПРОБЫ
Материалом для исследований на наличие возбудителя ЛЗН служат:
1) пробы клинического материала (образцы цельной крови, сыворотки и/или плазмы
крови, лейкоцитарная фракция крови, спинномозговая жидкость, моча);
2) пробы аутопсийного материала от человека (головной мозг, печень, селезенка,
почки);
3) пробы биологического материала (кровь, суспензии органов животных, суспензии
комаров, клещей).
Материал для исследования забирают в стерильные емкости с герметично
завинчивающимися крьппками в соответствии с требованиями СанПиН 3.3686-21
«Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней»,
МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические
лаборатории», МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы
Инструкция по применению «Амплиген-ЖА^'-генотип-1/2/4» Страница 7 из 25
--- стр. 8 ---
амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы
I-IV групп патогенности».
Транспортирование материала в лабораторию для исследований проводят при
температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С в течение 1 суток в соответствии с СанПиН 3.3686-21
«Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».
После проведения предварительной обработки проб допускается их транспортировка при
температуре от минус 16 °С до минус 20 °С в течение 7 суток или в сосуде Дьюара с жидким
азотом - длительно.
7. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ (АНАЛИЗА)
7.1 Подготовка исследуемых образцов
7.1.1 Подготовка проб клинического (биологического) материала
Кровь, плазма крови. Забор крови производят натощак или через 3 ч после приема
пищи из локтевой вены в количестве 5-10 мл одноразовой иглой (диаметр 0,8— 1,1 мм) в
специальную вакуумную систему типа «Vacuetty> (сиреневые крыщки - 6% ЭДТА) или
одноразовым щприцем в пластиковые пробирки с цитратом натрия (3,8 %-й раствор цитрата
натрия в соотношении 1:9). Пробирку закрывают крышкой и аккуратно переворачивают
несколько раз вверх дном, чтобы кровь в пробирке тщательно перемешалась с
антикоагулянтом.
Плазму крови получают центрифугированием пробирок с цельной кровью при 800-
1600 g в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем отбирают плазму в количестве не
менее 1 мл отдельными наконечниками с фильтром (пастеровскими пипетками) в стерильные
пробирки объемом 1,5 или 2,0 мл. Затем выполняют этап обеззараживания материала (п. 7.2).
Лейкоцитарная фракция цельной крови. Лейкоцитарную фракцию цельной крови
следует отбирать после центрифугирования цельной крови и удаления плазмы. Используя
наконечник с фильтром аккуратно собрать лейкоцитарную массу с поверхности осадка
клеток в объеме 0,2 мл и перенести в стерильную пробирку объемом 1,5-2,0 мл. Затем
выполняют этап обеззараживания материала (п. 7.2).
Сыворотка крови. Для получения сыворотки забор крови проводят натощак из
локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8—1,1 мм) в одноразовые пробирки без
антикоагулянта. Пробирки с кровью отстаивают при комнатной температуре в течение 30
мин до полного образования сгустка или помещают в термостат при 37 °С на 15 мин. Затем
центрифугируют при 800-1600 g в течение 10 мин при комнатной температуре. Сыворотку
переносят отдельными наконечниками с фильтром (пастеровскими пипетками) в стерильные
пробирки объемом 1,5 или 2,0 мл. Затем выполняют этап обеззараживания материала (п. 7.2).
Спинномозговая жидкость. Спинномозговую жидкость собирают, используя
одноразовые иглы, в одноразовые пластиковые пробирки объемом 1,5 или 2,0 мл.
Предварительная обработка проб не требуется. Затем выполняют этап обеззараживания
материала (п. 7.2).
Моча. Для анализа отбирают первую порцию утренней мочи в количестве не меньше
20-30 мл в специальный сухой стерильный флакон на 50 мл. Переносят 1 мл мочи, используя
наконечник с фильтром, в стерильные одноразовые пробирки объемом 1,5 мл.
Центрифугируют 5 мин при 10000 g, при наличии большого количества солей
ресуспендируют только верхний слой осадка солей в объеме 1 мл и затем снова
концентрируют. Используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой, полностью удаляют
супернатант, не захватывая осадок. К осадку добавляют 0,9% раствор хлорида натрия до
конечного объема 0,2 мл, тщательно перемешивают содержимое на вортексе. Затем
выполняют этап обеззараживания материала (п. 7.2).
7.1.2 Подготовка проб аутопсийного материала от человека
Аутоптаты органов. Кусочки ткани органов отбирают при вскрытии, соблюдая
регламентированные меры безопасности. Для растирания кусочков органов используют либо
Инструкция по применению «Амплиген-И^Р'-генотип-1/2/4» Страница 8 из 25
--- стр. 9 ---
охлажденную стерильную ступку и пестик либо микропробирки объемом 1,5 мл с пестиком
для пробирок типа Eppendorf.
В стерильной охлажденной ступке кусочки органов массой до 10 г растирают до
гомогенного состояния, после чего добавляют охлажденный 0,9 % раствор натрия хлорида в
соотношении 1:5 (масса/объем). Надосадочную жидкость отбирают с помощью пипетки
через ватный тампон в отдельную пробирку. Переносят по 1 мл пробы в
микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с завинчивающими крышками, используя
наконечник с фильтром. Центрифугируют в течение 10 мин при 12000 об/мин. Осадок
ресуспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлорида. Затем выполняют этапы
обеззараживания материала (п. 7.2).
В микропробирках объемом 1,5 мл кусочки органов массой 0,1 г растирают пестиками
до гомогенного состояния, затем добавляют равный объем (не менее 100 мкл) охлажденного
стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида и тщательно перемешивают. Суспензию
отстаивают при комнатной температуре в течение 2-3 мин, затем верхнюю фазу переносят в
отдельную микропробирку объемом 1,5 мл, используя наконечник с фильтром. Затем
выполняют этапы обеззараживания материала (п. 7.2).
7.1.3 Подготовка проб органов от животных, комаров и клещей
Биоптаты (аутоптаты) органов. Кусочки ткани органов животных отбирают при
вскрытии, соблюдая регламентированные меры безопасности. Для растирания кусочков
органов используют либо охлажденную стерильную ступку и пестик либо микропробирки
объемом 1,5 мл с пестиком для пробирок типа Eppendorf.
В стерильной охлажденной ступке кусочки органов массой до 10 г растирают до
гомогенного состояния, после чего добавляют охлажденный 0,9 % раствор натрия хлорида в
соотношении 1:5 (масса/объем). Надосадочную жидкость отбирают с помощью пипетки
через ватный тампон в отдельную пробирку. Переносят по 1 мл пробы в
микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с завинчивающими крышками, используя
наконечник с фильтром. Центрифугируют в течение 10 мин при 12000 об/мин. Осадок
ресуспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлорида. Затем выполняют этапы
обеззараживания материала (п. 7.2).
В микропробирках объемом 1,5 мл кусочки органов массой 0,1 г растирают пестиками
до гомогенного состояния, затем добавляют равный объем (не менее 100 мкл) охлажденного
стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида и тщательно перемешивают. Суспензию
отстаивают при комнатной температуре в течение 2-3 мин, затем верхнюю фазу переносят в
отдельную микропробирку объемом 1,5 мл, используя наконечник с фильтром. Затем
выполняют этапы обеззараживания материала (п. 7.2).
Комары и клещи. Предварительно формируют пулы комаров и клещей по видам.
Группировку проб осуществляют в соответствии с МУ 3.1.3012-12 «Сбор, учет и подготовка
к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих в природных очагах опасных
инфекционных болезней».
Клещей помещают в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, куда вносят 1 мл
96 %-го этанола, встряхивают на вортексе и центрифугируют в течение 3-5 с при 2000 g для
удаления капель с крышки пробирки. С помощью вакуумного отсасывателя отдельными
наконечниками для каждой пробы удаляют спирт из пробирки. Вносят в пробирку 1 мл 0,9%
раствор хлорида натрия, встряхивают пробирку и осаждают капли с крышки пробирки на
микроцентрифуге в течение 3-5 с при 2000 g. С помощью вакуумного отсасывателя
отдельными наконечниками для каждой пробы удаляют раствор хлорида натрия из пробирки.
Переносят клещей в стерильную фарфоровую чашку, добавляют 0,7—1,0 мл 0,9% раствор
хлорида натрия и гомогенизируют пробу. Наконечником с фильтром переносят пробу в
микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 1200 g в течение 2
мин для осветления пробы. РНК вьщеляют из 0,1 мл надосадочной жидкости.
При выделении РНК из комаров используют данную методику обработки проб, за
Инструкция по применению «Амплиген-И'Л^Г-генотип-1/2/4» Страница 9 из 25
--- стр. 13 ---
4. Нажимают кнопку «Next»/«Далее».
5. Выбирают объем реакционной смеси: «Reaction volume»/«Объем реакции» - 25 мкл.
Для прибора Rotor-Gene Q» должно быть не активно (не отмечено галочкой) окно «15 р1 oil layer
volume»/«15 pL объем масла/воска».
М ктер Нового Теста
Этот экран отображает смешанные опши иля этого теста Залогн4гв
поля, нажните С^еа.. когда еы готовы перейти на след, сгр
Оператор:
Замечания;
Компоновка
Объвм р 5 -tJ
реакции (pL): ^
Г 15и1 с добаа. воска
Вьоид I «Ц а э а д | Далее»
Данная область
греднаэнэчена для
отображения
справки
элемаигое
мастера. Для
стфаеки по этой
теме проведите
мышь над этой
темой, бы можете
также нажать на
раскрываюшийся
список для
отображения
справки о
ВОЭМОЖНЬ 1>1
|^ановквх
6. Нажимают кнопку «МехЫДалее».
Инструкция по применению «Амплиген-Н'Л^^'-генотип-1/2/4» Страница 13 из 25
--- стр. 14 ---
Н еоер H oeofe T iers
Этот фвфш
С в б о АtS»StipSfipSiSl npeSH i». и ^ сгор ы а
б|Я>г ps6o>srb Hs
Чтобы
H SM ew r» Ц Ю Ф М 1 » .n p a sK S
fSAKTOp про«мл> J
UerswsK S K S H S M
Им Негре esc ib i« K T « cЦ|чже> оеиале :
Gwen 47lbn 5IOmi 5
Yelew saibn 555nn S
Oiengt SeSnn GlOnn 5
Red ь л т 6Ю«Т1 5
Crieson GSOran л(н> 7
Ь в № А .
Q p a s K S
Ц рм и > C n w
y M fM T k
Qriin ru J
Q n. ipesH socH
«Ы «ШДалее»
f l Рсмегор Профим
7. В верхней части окна нажимают кнопку «Editprofile»!«Редактор профиля».
' . t" М St
Нмнй От>р. CoapjwrsKR Cnpstu
Т ест таолгыгее оеоло О пк.Г peew вжеу лревстеелеп тест, «шорый допкен быть вмплен
Нежгимге не цикл нюсе, иго^ ммыыгъ его'
______I вст. после..
8. Задают следующие параметры (Таблица 5):
Таблица 5
Цикл Температура, °С Время Измерение
флуоресценции
Количество
циклов
1 50 30 мин - 1
2 95 15 мин - 1
3
95 5 с -
556 25 с -
72 15с -
4
95 5 с -
4056 25 с ■
FAM/Green,
JOE/Yellow,
ROX/Orange,
CyS/Red
72 15с -
Флуоресценцию измеряют при 56 °С (во втором блоке циклирования) по каналам
FAM/Green, JOEmilow, ROX/Orange, Cy5/Red
Инструкция по применению «AMnnHreH-WWJ^-reHOXHn-l/2/4» Страница 14 из 25
--- стр. 15 ---
t' PcMICTOp профило
tJ w ^
Н01ЫЙ Опер. Сохранить как Справка
Т ест проаолжится около 140 n b w . ГраФик внизу преастаеляет тест, который должен быть выполнен:
Нежьмге не цикл ниже, чтобы изменить его:
Цнш повторить 40 I раз
Нажните на шаг внизу для его HSt'teiieiaM или нажмите ♦ шаг ил* • шаг. чтобы добаеип> щы уаелить шаги зтого цикла
1обьты^^
56грао-
25 сек.
Детек H e ^d h gA
«а Green. Orange. RedYelow
Г Цдлж. Шаг.
С Снижать темпру шага
Эбграо. на5сек.
72гран не15сек
56 гран на 25 сек
Q K
Нажимают кнопку «ОК»/«Да».
9. В нижней части
Optimisation...»1«Опт.уровня сиги.».
окна нажимают кнопку <f.Calibrate»/«Gain
Мастер Нового Теста
Профиль
Установка канала:
Итля Источник Детектор уровень сигнала 1
Green 470nm 510rm 5
Yelow 530r>m 555nm 5
Orange 5B5nrrr 610nm 5
Red 625nm 680nm 5
Crimson GBOnm ЛОНр 7
НовьА.
Правка..
вровень Сигн.
валить
Отменить
Опт. уровня сигн.
Выход « Иазад I Д а ле е »
Данная область
преднвэначенв для
отображения
справки
злементое
мастера Для
справки по этой
теме проведите
мышь над этой
теноА Вы можете
также нажать на
раскрывающийся
список для
отображения
справкио
возможных
установках.
Инструкция по применению «Амплиген-И'А/^^-генотип-1/2/4» Страница 15 из 25
--- стр. 16 ---
в открывшемся окне нажимают кнопку «.Calibrate Acquiring»!«Optimise Acquiring»/
«Опт.детек-мых».
Авто-оптим изация уровня сигнала
Оптим изация:
. > При аето-опгимиэации уровня сигнала буовт счигьваться Флуоресцентный сигнал
выбранной гроб^фки при различных уровнях усиления сигнала, пока не найается
уровень, при котором сигнал попааает в нужный диапазон.Уровень сигнала
зависит от используем ьк реагентов.
Установить температуру |60 ^ градусов.
Оптим всех Опт. Детек-мых
Г~ Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции
Г* В ы пом гть олгиг>«зацию при БО градусах перед началом теста
- Установки канала:
Добавить..
Имя I Позиция Пробцж и | М иж м Сигнал | М аксим Сигнал j М ик урое Рраека.
^алить
Удалить gee
J Вручную... I Закрыть | £пр.
- ДЛЯ красителя FAM/Green указывают в графе «Min Reading»/ «Миним. Сигнал»
значение 5, в графе «Мах Reading»/«MaKcuM. Сигнал» значение 10, в графе «Tube
ро5/7юи»/«Позиция пробирки» значение 1;
- для красителя JOE/Yellow указывают в графе «Min Reading»/ «Миним. Сигнал»
значение 5, а в графе «Мах Reading»/«Максим. Сигнал» значение 10, в графе «Tube
position»! «Y{(Уimsyiя пробирки» значение 3;
- для красителя ROX/Orange указывают в графе «Min Reading»/ «Миним. Сигнал»
значение 5, а в графе «Мах Reading»/«Максим. Сигнал» значение 10, в графе «Tube
posШon»!«Tloзицilя пробирки» значение 2;
- для красителя CyS/Red указьшают в графе «Min Reading»/ «Миним. Смгно/1»значение 5,
а в графе «Мах Reading»/«Максим. Сигнал» значение 10, в графе «Tube position»!«Позии^
пробирки» значение 3.
Инструкция по применению «Амш1Иген*И'Л^К-генотип-1/2/4» Страница 16 из 25
--- стр. 17 ---
Авто^оптимизация уровня сигнала П
Опп»м»аций.
При авто«ппа44эацм4 уровня сигнала буает считываться ФлуорвсценттъА сггнал
выбранное проб^фки при раэ 1М *>к уровнях усилетя сигнала, пока не н ^ е тс я
уровень, гфи котором сигнал попадает в н у х о ^ диапазон Уровень сигнала
зависит от исгюльзуенъш реагентов.
Установки Авто*оптииизации уровня сигнале
Установки канала;
Канал: Green Позиция Пробирки:
Нужньй диапазон стартового сггнала: [5
Диагизон уровней сигнала: |''0 ^ до
ОК 1 Отменить 1 Справка |
В р у > * я е о .-Закрыть £пр
В графе «Tube розШоп»/«Позиция Пробирки» указан номер пробирки, по которой будет
автоматически выбран параметр «gвw»/«ycилeниe сигнала». В 1-ой позиции в роторе должна
ставиться пробирка с реакционной смесью ОТ-ПЦР-смесь-1 WNV генотип-1. Во 2-ой
позиции в роторе должна ставиться пробирка с реакционной смесью ОТ-ПЦР-смесь-1 WNV
генотип-2. В 3-ой позиции в роторе должна ставиться пробирка с реакционной смесью ОТ-
ПЦР-смесь-1 WNV генотип-4/ВКО.
Помечают галочкой бокс в строке «Perform Calibration Before П' Acquisition»/«Perform
Optimisation Before Acquisition»/«Выполнить оптимизацию при 1-м шаге детекции». Закрыть
окно «Auto Gain Calibration 8ешр»/«Авто-оптимизация уровня сигнала», нажимают кнопку
«С1о8е»/«Закрыть».
Авто-оптимимция урсвня сигнале
Оптинмзеиия:
При еето-огтгимиэеции уровня сигнале будет считываться Флуоресцентный сигнал
выбранной гфобирки гри резлм ш х уровнях усилегмя сигнала, пока не найдется
уровень, при котором оанал попадает в нужный диапазон.Цровень сигнала
Ч Р зависит от ислользуемьн реагентов.
Усгамовигь температуру рП — j градусов.
Огтгнм всех Опт. Детек-мых I
!быпЬлнить опгиннзац^ гаж 1 тн 'и ^е детегуцД
Р Вьполнигьспгимизацию при 60 градусах перш началом теста
Установки канала:
_L
Имя Позиция Пробирки 1 Минин Сигнал Максим Сггнал M m чс
Green 1 5F1 10FI •10
Orange 2 5FI 10FI •10
Yellow 3 5FI 10FI •10
Red 3 5FI 10FI •10
ч 1 . tit \
Добавить..
Правка
^алигь
Удалить Все
Закрыть j £пр
Инструкция ПО применению «Амплиген-Ж/УК-генотип*1/2/4» Страница 17 из 25
--- стр. 18 ---
Нажимают кнопку «Next»!«Далее».
Мастер Нового Теста
Профиль
Редактор профиля.
Установка канала:
Имя Источник Детектор Уровень сигнала I
Gieen 470nm SlOnm 5
Yelow 530nm 555nm 5
Orange 585nm 61 Onm 5
Red 625nm 660nm 5
Ciimson 680nm 710hp 7
Новьй..
Правка..
вровень Сигн.
Удалить
йтменить
Дпг. доовня сигн..
^ « И а э « Д а ле е »
Данная область
предназначена для
отображения
стравки
элементов
мастера. Для
справки по этой
теме проведите
мышь над этой
темой. Вы можете
также нажать на
раскрьвающийся
список для
отображения
справки о
возможных
<^ановках.
10. Запускают амплификацию кнопкой «Start гип»/«Старт». При необходимости
введенные значения термоциклирования могут быть сохранены в качестве шаблона,
используя кнопку «Save template/«Сохр.шаблон».
Мастер Нового Теста liigMl'
С хе м а :
Уста новка 1
Gieen Уро вен ь сигнала 5
Orange Уро вен ь сигнала 5
R ed Уровень сттн а ла 5
Y e lo w Уро вен ь cvrнaлa 5
Оптим изация автоуровня си*нала Д о первого детектир. данны х
Ротор 36-луночный ротор
Ком поновка образцов 1 .2 .3 ...,
О бъём реакции (в м икролиграх) 25
Проверив правильность установок, нажмите Старт д л я начала вы полнения
Те ста. Наж м ите Сохр.Ш аблон. чтобы сохранить ш аблон с програм м ой и
установкам и этого теста.
Стар т
Сохр. ш аблон
Выхсщ « Н азад
Инструкция по применению «Амплиген-ЖЛ^К-генотип-1/2/4» Страница 18 из 25
--- стр. 27 ---
ю»
КУЗ Волгоградский научно-
ьский противочумный
потребнадзора
Топорков А.В.
_____2022 г.
ИНСТРУКЦИЯ по ПРИМЕНЕНИЮ
«НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ГЕНОТИПОВ
(1,2, 4) ВИРУСА ЗАПАДНОГО НИЛА {WESTNILE VIRUS) МЕТОДОМ
ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИЕЙ И
ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ
«АМПЛИГЕНЛЕУКГЕНОТИП-1/2/4» ПО ТУ 21.20.23-015-01898084-2019»
1. НАЗНАЧЕНИЕ
1.1 Предназначение набора реагентов
«Набор реагентов для выявления и дифференциации генотипов (1, 2, 4) вируса
Западного Нила {West Nile virus) методом полимеразной цепной реакции с обратной
транскрипцией и гибридизационно-флуоресцентной детекцией «Амплиген-^УГ-генотип-
1/2/4» по ТУ 21.20.23-015-01898084-2019», далее по тексту - набор реагентов «Амплиген-
ЖУК-генотип-1/2/4» предназначен для качественного обнаружения РНК и дифференциации
генотипов (1, 2, 4) вируса Западного Нила в пробах клинического материала методом
полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и гибридизационно-
флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
В качестве клинического материала от человека могут быть использованы кровь,
плазма и сыворотка крови, лейкоцитарная фракция крови, спинномозговая жидкость, моча,
аутопсийный материал (головной мозг, печень, селезенка, почки).
Так же возможно применение МИ для исследования биологического материала от
животных (головной мозг, печень, селезенка, почки, кровь), комаров и клещей.
Для профессионального применения.
1.2 Область применения набора реагентов
Набор реагентов «Амплиген-1ТУК-генотип-1/2/4» может использоваться в
клинической лабораторной диагностике ЛЗН, а также в ходе эпидемиологического
мониторинга специалистами лабораторий: клинико-диагностических, медицинских,
осуществляющих микробиологические, молекулярно-генетические исследования;
специализированных по проведению санитарно-эпидемиологических исследований и
экспертиз; референс-центров по мониторингу за возбудителями инфекционных и
паразитарных болезней; центров индикации возбудителей инфекционных болезней 1-II групп
патогенности и обеспечения противоэпидемической готовности; центров верификации
диагностической деятельности, научных лабораторий.
1.3 Показания и противопоказания к применению набора реагентов
Набор реагентов «Амплиген-И^К-генотип-1/2/4» используется для исследования
материала, полученного от лиц обоего пола, любого возраста с подозрением на ЛЗН вне
зависимости от формы и наличия манифестации заболевания (в анамнезе находивщихся на
эндемичных территориях по ЛЗН). РНК вируса Западного Нила (аналит) может быть
обнаружена в инкубационный период, период острой фазы течения ЛЗН и период
реконвалесценции.
Набор реагентов не подлежит использованию в случаях; нарушения внутренней
упаковки или не соответствия описанию внещнего вида реагентов; несоблюдения условий
транспортирования и хранения согласно инструкции; истекшего срока годности. Другие *
*Введена впервые
Инструкция по применению «Амплиген-И'Л^К-генотип-1/2/4» Страница I из 27
--- стр. 28 ---
противопоказания отсутствуют, за исключением случаев, когда забор материала не может
быть осуществлен по медицинским показаниям.
1.4 Общая характеристика возбудителя ЛЗН
Вирус Западного Нила {WNV, West Nile virus) принадлежит к семейству Flaviviridae,
роду Flavivirus, антигенному комплексу вирусов японского энцефалита {Japanese encephalitis
virus group). По принятой в Российской Федерации классификации патогенных
биологических агентов WNV относят к вирусам II группы патогенности (опасности).
Вирус Западного Нила является возбудителем природно-очаговой арбовирусной
инфекции с трансмиссивным механизмом передачи - лихорадки Западного Нила (ЛЗН).
Природными резервуарами инфекции служат птицы, а в качестве основных переносчиков
выступают орнитофильные комары, иксодовые, гамазовые и аргасовые клещи. Заражение
человека происходит при укусе комаров и клещей. Клинические проявления ЛЗН варьируют
от гриппоподобного синдрома до развития тяжелых осложнений в форме менингита и
менингоэнцефалита. В России достоверно зарегистрирована циркуляция 1, 2 и 4 генотипов
WNV^ имеющих разное эпидемическое значение. Так, щтаммы WNV генотипов 1 и 2 являются
высокопатогенными для человека, а патогенность WNV 4 генотипа для млекопитающих пока
не установлена.
2. ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗДЕЛИЯ
Для проведения исследований могут быть использованы амплификаторы для ПЦР с
учетом результатов в режиме реального времени типа Rotor-Gene.
Компоненты набора являются одноразовыми. В состав набора входят 13 реагентов:
Таблица 1
Реагент Описание Объем
(мл)
Количество
ОТ-ПЦР-смесь-1 WNV
генотип-1
прозрачная бесцветная жидкость 0,5 1 пробирка
ОТ-ПЦР-смесь-1 WNV
генотип-2
прозрачная жидкость с бледно-
голубым оттенком 0,5 1 пробирка
ОТ-ПЦР-смесь-1 WNV
генотип-4/ВКО
прозрачная жидкость с бледно-
голубым оттенком 0,5 1 пробирка
ОТ-ПЦР-смесь-2 прозрачная бесцветная жидкость 0,25 3 пробирки
ОТ-ПЦР-смесь-3 прозрачная бесцветная жидкость 0,0375 1 пробирка
Ревертаза MMIv прозрачная бесцветная вязкая
жидкость 0,0375 1 пробирка
Tfl^-F-ДНК-полимераза прозрачная бесцветная вязкая
жидкость 0,075 1 пробирка
ПКО кДНК WNV
генотип-1
прозрачная бесцветная жидкость 0,15 1 пробирка
ПКО кДНК WNV
генотип-2
прозрачная бесцветная жидкость 0.15 1 пробирка
ПКО кДНК WNV
генотип-4
прозрачная бесцветная жидкость 0,15 1 пробирка
ВКО прозрачная бесцветная жидкость 0,5 1 пробирка
ОКО выделения прозрачная бесцветная жидкость 0,75 2 пробирки
ОКО ОТ-ПЦР прозрачная бесцветная жидкость 0,45 1 пробирка
Набор реагентов «Амплиген-1РЛ^К-генотип-1/2/4» рассчитан на
определений с учетом контрольных образцов.
проведение 50
Инструкция по применению «Амплиген->ГЛ^^'-генотип-1/2/4» Страница 2 из 27
--- стр. 29 ---
Набор реагентов «Амплиген-^^^К-генотип-1/2/4» позволяет обнаруживать
специфические фрагменты РНК WNV посредством полимеразной цепной реакции с обратной
транскрипцией и гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени
и одновременно дифференцировать 1, 2 и 4 генотипы WNV на основании амплификации
фрагмента гена полипротеина WNV (Jlavivirus polyprotein gene), кодирующего капсидный
белок. Метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) -
представляет собой последовательное проведение двух процессов — реакции обратной
транскрипции, в результате которой в присутствии фермента ревертазы MMlv по матрице
РНК WNV осуществляется синтез кДНК WNV, и полимеразной цепной реакции, в ходе
которой происходит амплификация специфической области кДНК-мищени WNV в
присутствии Taq-F полимеразы, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, буферного раствора и
олигонуклеотидных праймеров, распознающих ДНК-мищень. При постановке ОТ-ПЦР
применяется «горячий старт», обеспечивающийся использованием химически
модифицированной Гл^-полимеразы (Ta^F-ДНК-полимераза), которая активируется при
прогреве реакционной смеси при 95 в течение 15 мин, что значительно снижает
количество неспецифических реакций.
Детекция результатов осуществляется путем измерения интенсивности
флуоресцентных сигналов непосредственно в процессе ОТ-ПЦР в режиме реального времени
(ОТ-ПЦР-РВ). По каналу FAM/Green детектируется продукт амплификации кДНК WNV 1
генотипа, по каналу ROX/Orange - продукт амплификации кДНК WNV 2 генотипа, по каналу
JOE/Yellow - продукт амплификации кДНК WNV 4 генотипа. Продукты амплификации
соответствуют нуклеотидной последовательности локуса protC гена полипротеина IVNV
(Jlavivirus polyprotein gene), кодирующего капсидный белок, определенного генотипа. По
каналу Cy5/Red детектируется продукт амплификации ВКО (внутреннего контрольного
образца).
Проведение анализа включает два этапа: 1) выделение нуклеиновых кислот из проб
клинического и биологического материала и 2) проведение полимеразной цепной реакции с
обратной транскрипцией на приборах типа Rotor-Gene. Тип используемых зондов -
«молекулярные маяки». Область «петли» зонда комплементарна анализируемому продукту
ОТ-ПЦР. В ходе реакции происходит гибридизация молекулярного маяка с ампликоном и
расстояние между флуорофором и гасителем увеличивается, что приводит к повышению
флуоресценции, которую фиксирует амплификатор. Учет результатов флуоресценции
проводят по каждому каналу отдельно.
Ограничение метода. В инфицированном материале РНК WNV 1, 2 и 4 генотипов может
быть не обнаружена по причине ингибирования ОТ-ПЦР-РВ и/или недостаточной
эффективности выделения РНК. Для достижения показателей аналитической
чувствительности используемый набор для выделения должен обеспечивать эффективность
выделения нуклеиновых кислот на уровне не менее 20%. Ложноотрицательный результат
выявляется с помощью внутреннего контрольного образца (ВКО).
Причиной получения ложноотрицательных результатов ПЦР может быть наличие
интерферирующих веществ (эндогенных, экзогенных). Для анализа потенциального влияния
на работу набора реагентов интерферирующих веществ, содержащихся в биоматериале при
проведении испытаний, использовалась кДНК, выделенная из контрольных образцов
предприятия (СОП кДНК WNV-\, СОП кДНК WNV-2, СОП кДНК WNV-A), не содержащих
интерференты. Каждый образец был исследован в концентрации 1x1 O '* ГЭ/мл в двух
повторах, с добавлением потенциально интерферирующих веществ в концентрацих, содержа
щихся в норме и превыщающих верхнюю границу нормальной концентрации данных
веществ в биологических образцах.
Для оценки влияния потенциально интерферирующих веществ на работу набора
реагентов были проанализированы: гемоглобин, билирубин, холестерин, IgG, гепарин, ЭДТА,
которые могут присутствовать в биоматериале (кровь, плазма и сыворотка крови.
Инструкция по применению «Амплиген-И^/УК-генотип-1/2/4» Страница 3 из 27
--- стр. 30 ---
лейкоцитарная фракция крови, спинномозговая жидкость, моча, аутопсийный материал
(головной мозг, печень, селезенка, почки), а также иизопропиловый спирт, который может
присутствовать в образце в результате несоблюдения правил пробоподготовки (таблица 2).
Потенциально интерферирующие вещества в концентрациях, которые, как ожидается, будут
встречаться в норме при использовании набора реагентов, не влияют на его специфичность.
Таблица 2
N/n Потенциально
интерферирующие
вещества
Тип
интерферента
Верхняя граница
нормы в образце
протестированная
концентрация
интерферента в
образце,
превышающая
верхнюю границу
нормы
Наличие
интерференции
1. Гемоглобин Эндогенный 170 г/л 250 г/л Не обнаружено
2. Общий билирубин Эндогенный 21 мкмоль/л 210 мкмоль/л Не обнаружено
3. Холестерин Эндогенный 7,8 ммоль/л 78 ммоль/л Не обнаружено
4. Ir G Эндогенный 17 г/л 60 г/л Обнаружено
5. Гепарин Экзогенный от 12 до 30
МЕ/мл
30 МЕ/мл Обнаружено
6. ЭДТА Экзогенный от 1,2 до 2,0
мг/мл
до 2,0 мг/мл Не обнаружено
7. Изопропиловый
спирт
Экзогенный - 100 мкл/мл Не обнаружено
Для контроля эффективности экстракции нуклеиновых кислот и реакции
амплификации с набором реагентов, а также отсутствии влияния интерферирующих веществ
предусмотрено использование внутреннего контрольного образца (ВКО).
Причиной получения ложноположительного результата является контаминация на
этапе выделения нуклеиновых кислот или на этапе проведения реакции ОТ-ПЦР в режиме
реального времени. Ложноположительный результат выявляется с помощью отрицательных
контрольных образцов (ОКО выделения, ОКО ОТ-ПЦР).
Повторяемость и воспроизводимость.
Повторяемость и внутрисерийная воспроизводимость анализа была протестирована в ходе
лабораторных испытаний с использованием положительных стандартных образцов
предприятия СОП кДНК WNV-\, СОП кДНК WNV-2, СОП кДНК WNV-A в концентрации
IxlO "^ ГЭ/мл каждый и отрицательных стандартных образцов предприятия - СОП кДНК YFV
- стандартный образец предприятия кДНК вируса желтой лихорадки {Yellow fever virus)^ СОП
кДНК RUBV - стандартный образец предприятия кДНК вируса краснухи {Rubella virus) в
концентрации 1x10^ ГЭ/мл каждый, в 5 повторах на наборе одной серии.
Межсерийная воспроизводимость анализа была протестирована в ходе лабораторных
испытаний с использованием положительных стандартных образцов предприятия СОП
кДНК WNV-1, СОП кДНК WNV-2, СОП кДНК WNV-^ в концентрации 1хЮ‘* ГЭ/мл каждый и
отрицательных стандартных образцов предприятия - СОП кДНК YFV - стандартный образец
предприятия кДНК вируса желтой лихорадки {Yellow fever virus), СОП кДНК RUBV -
стандартный образец предприятия кДНК вируса краснухи {Rubella virus) в концентрации
1x10^ ГЭ/мл каждый, на двух сериях набора реагентов.
3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
ИЗДЕЛИЯ
Аналитическая чувствительность.
Набор должен выявлять и дифференцировать РНК/кДНК WNV 1, 2 и 4 генотипов в
пробах с концентрацией не менее 1x10'* ГЭ/мл.
Инструкция по применению «Амплиген-И'Л^{^-генотип-1/2/4» Страница 4 из 27
--- стр. 31 ---
Аналитическая специфичность.
Набор не должен давать положительных результатов с РНК/кДНК гетерологичных
вирусов в пробах с концентрацией 1x10^ ГЭ/мл.
Диагностические характеристики.
В ходе клинических испытаний доказана диагностическая эффективность МИ «Набор
реагентов для выявления и дифференциации генотипов (1, 2, 4) вируса Западного Нила {West
Nile virus) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и
гибридизационно-флуоресцентной детекцией «Амплиген-WWP-reHOTHn-1/2/4» по ТУ
21.20.23-015-01898084-2019».
Диагностические характеристики набора установлены в лабораторных условиях с
применением 420 образцов клинического и биологического материала, из них:
- образцов клинического материала (положительных проб): 108 образцов
клинического материала от пациентов, инфицированных West Nile virus; 36 образцов
клинического материала от пациентов, искусственно контаминированных стандартными
образцами предприятия West Nile virus (СОП кДНК WNVA^ СОП кДНК WNV-2, СОП кДНК
WNV-A);
- образцов биологического материала (положительных проб): 99 образцов
биологического материала от животных, комаров и клещей, инфицированных West Nile virus;
33 образца биологического материала от животных и клещей, искусственно
контаминированных стандартными образцами предприятия West Nile virus (СОП кДНК
WNVA, СОП кДНК WNV-2, СОП кДНК WNV-4);
- образцов клинического материала (отрицательных проб): 54 образца клинического
материала от пациентов, инфицированных Dengue virus 1, 2, 3 типов, Crimean-Congo
hemorrhagic fever virus. Neisseria meningitidis; 18 образцов клинического материала от
пациентов, искусственно контаминированных стандартными образцами предприятия Yellow
fever virus. Rubella virus (СОП кДНК YFV, СОП кДНК RUBV);
- образцов биологического материала (отрицательных проб): 54 образца
биологического материала от клещей, инфицированных Crimean-Congo hemorrhagic fever
virus, Borrelia burgdorferi s.l; 18 образцов биологического материала от животных и комаров,
искусственно контаминированных стандартными образцами предприятия Yellow fever virus.
Rubella virus (СОП кДНК YFV, СОП кДНК RUBV).
Определение РНК и дифференциация генотипов (1, 2, 4) вируса Западного Нила {West
Nile virus) подтверждена с использованием метода сравнения, в качестве которого
применялся метод секвенирования по Сенгеру, заключающийся в определении
нуклеотидных последовательностей с помощью Генетического анализатора «НАНОФОР 05»
и программного обеспечения Unipro UGENE.
Диагностическая чувствительность - не менее 98,5 % с доверительной
вероятностью 90% при анализе 276 положительных образцов (108 образцов клинического
материала от человека, инфицированных West Nile virus; 36 образцов клинического
материала от человека, искусственно контаминированных стандартными образцами
предприятия West Nile virus в концентрации I^IO"* ГЭ/мл; 99 образцов биологического
материала от животных, комаров и клещей, инфицированных West Nile virus; 33 образца
биологического материала от животных и клешей, искусственно контаминированных
стандартными образцами предприятия West Nile virus в концентрации IxlO'^ ГЭ/мл),
содержащих РНК/кДНК West Nile virus был получен положительный результат в 276
случаях.
Диагностическая специфичность - не менее 99 % с доверительной вероятностью
90% при исследовании 144 отрицательных образцов (54 образца клинического материала от
человека, инфицированного Dengue virus 1, 2, 3 типов, Crimean-Congo hemorrhagic fever
virus. Neisseria meningitidis; 18 образцов клинического материала от человека, искусственно
контаминированного стандартными образцами предприятия Yellow fever virus, Rubella virus в
Инструкция по применению «Амплиген-И'Л'Р'-генотип-1/2/4» Страница 5 из 27
--- стр. 32 ---
концентрации 1хЮ^ ГЭ/мл; 54 образца биологического материала от клещей,
инфицированного Chmean-Congo hemorrhagic fever virus, Borrelia burgdorferi s.l; 18 образцов
биологического материала от животных и комаров, искусственно контаминированного
стандартным образцом предприятия Yellow fever virus в концентрации 1x10^ ГЭ/мл) получен
отрицательный ответ в 144 случаях.
4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С ИЗДЕЛИЕМ
4.1 Информация об инфекционных нли микробных рисках
Набор реагентов может быть использован в учреждениях, имеющих Лицензию на
деятельность в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека и
животных I-IV групп патогенности, стационарных и мобильных лабораториях, имеющих
санитарно-эпидемиологическое заключение на проведение работ с микроорганизмами I-IV
групп патогенности.
Следует рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные, поэтому
этапы подготовки биологических образцов и проведение ПЦР-анализа проводят в
соответствии с требованиями СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические
требования по профилактике инфекционных болезней», МУ 1.3.2569-09 «Организация
работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе
с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности», МУ 3.1.3012-12
«Сбор, учет и подготовка к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих в
природных очагах опасных инфекционных болезней».
4.2 Необходимость обучения персонала
Исследования на ЛЗН могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и
средним медицинским, биологическим или иным образованием, окончившие
соответствующие курсы профессиональной переподготовки с освоением методов безопасной
работы с возбудителями инфекционных болезней I-IV групп патогенности (опасности), не
имеющие противопоказаний к лечению специфическими препаратами и имеющие допуск к
работе с ПБА на основании приказа руководителя организации.
4.3 Меры безопасности, позволяющие предохранять оператора
Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными,
вредного влияния на организм оператора не оказывают. При работе с набором реагентов
следует соблюдать меры предосторожности для лабораторий:
- проводить работу с использованием средств индивидуальной защиты в соответствии
сСанПиН 3.3686-21;
- использовать одноразовые перчатки без талька;
- этапы выделения РНК/кДНК проводить в боксах биологической безопасности II
класса;
- подготовку к ПЦР с использованием набора реагентов проводить в ПЦР-боксах;
- использовать одноразовые наконечники для автоматических дозаторов при
различных операциях;
- сбрасывать использованные одноразовые расходные материалы (пробирки,
наконечники), посуду в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующее средство;
- удалять отходы с продуктами ПЦР только в закрытом виде, не допускается открывать
пробирки после амплификации;
- осуществлять влажную уборку поверхностей рабочих столов, штативов,
оборудования и др. до начала и после завершения работ с применением дезинфицирующих
средств, обрабатывать помещения бактерицидными облучателями в соответствии с СанПин
3.3686-21.
Избегать контакта с кожей, глазами и слизистыми оболочками, при попадании на них
компонентов набора промыть большим количеством воды. При приеме внутрь компонентов
набора реагентов за медицинской помощью следует обратиться немедленно.
4.4 Информация об экологических рисках
Инструкция по применению «Амплиген-И^^'-генотип-1/2/4» Страница 6 из 27
--- стр. 33 ---
Уничтожение неиспользованных компонентов набора или серий с истекшим сроком
годности проводить в соответствии с СанПиН 2.1.3684-21.
4.5 Информация о физических рисках, в том числе возможность взрыва или
возгорания.
Набор реагентов следует применять по назначению в комбинации с приборами,
прошедшими надлежащее техническое обслуживание. Необходимо строгое соблюдение
инструкций по эксплуатации электрооборудования, безопасности при работе с
электроприборами.
Набор реагентов не содержит материалов, обладающих канцерогенным, мутагенным
действием, а также влияющих на репродуктивную функцию человека.
При использовании по назначению и соблюдении мер предосторожности набор
реагентов является безопасным.
4.6 Информация о рисках применения, приводящих к ошибочному результату
исследования:
- Использование набора реагентов «Амплиген-ЖУК-генотип-1/2/4» с истекшим
сроком годности;
- Нарушение условий транспортирования, хранения набора реагентов;
- Нарушения упаковки и внешнего вида компонентов набора реагентов;
- Нарушение условий транспортирования, хранения и подготовки проб;
- Нарушение условий окружающей среды при эксплуатации набора реагентов;
- Нарушение процесса проведения анализа, регистрации и учета результатов;
- Применение по назначению МИ в комбинации со средствами измерения, не
прошедшими поверку и/или калибровку.
5. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ДЛЯ РАБОТЫ С
ИЗДЕЛИЕМ*
Таблица 3
Наименование Основные характеристики или обозначения
документации, производитель
Амплификатор типа Rotor-Gene Амплификатор «RotorGene Q», («QIAGEN»,
Германия), РУ № ФСЗ 2010/07595
Ламинарный-потоковый шкаф II класса
биологической безопасности
Ламинарно-потоковый шкаф II класса
биологической безопасности Biowizard Standard
G L-130, Koiair, Финляндия
ПЦР-бокс Бокс абактериальной воздушной среды для
работы с ДНК-пробами (ПЦР-бокс) при
проведении ПЦР-диагностики БАВ-ПЦР-
«Ламинар-С» «Ламинарные системы», Россия
Микроцентрифуга-встряхиватель Микроцентрифуга-вортекс «Microspin FV-2400»,
НПФ ООО «BioSan», Латвия
Термостат твердотельный Термостат твердотельный от 25 до 100 °С,
«ТЕРМО 48», «Биоком», Россия
Термостат твердотельный с функцией
охлаждения
Термостат твердотельный с функцией
охлаждения от 4 до 120 ®С, «Биоком», Россия
Микроцентрифуга настольная Микроцентрифуга «Mini-Spin», «Eppendorf»,
Германия
Отсасыватель медицинский Отсасыватель медицинский «В-40», «Висма
Планар» Беларусь
Холодильник «MPR-214F» рабочий диапазон температур
основная камера от +2 до +14 С, морозильная
Инструкция по применению «Амплиген-И^Л^К-генотип-1/2/4» Страница 7 из 27
--- стр. 34 ---
камера -20-30 “С, 220В, 155 Вт, «Sanyo», Япония
Дозатор 0,5-10 мкл ILS (САРР), Дания
Дозатор 5-50 мкл ILS (САРР), Дания
Дозатор 20-200 мкл ILS (САРР), Дания
Дозатор 100-1000 мкл ILS (САРР), Дания
Штатив-подставка для дозаторов Штатив-подставка для дозаторов универсальная
на 5 дозаторов, «Хеликон», Россия
96-ти луночный алюминиевый штатив
(для пробирок 0,2 мл)
«Corbett Research», Австралия;
«OIAGEN», Германия
Штатив «рабочее место» для
микропробирок на 1,5 мл
Штатив «рабочее место» для микропробирок на
1,5 мл, 5x10 мест с увеличенным расстоянием
между лунками, «Интерлабсервис», Россия
Одноразовые наконечники с фильтром
до 10 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Одноразовые наконечники с фильтром
до 20 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Одноразовые наконечники с фильтром
до 100 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Одноразовые наконечники с фильтром
до 200 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Одноразовые наконечники с фильтром
до 1000 мкл
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Микроцентрифужные пробирки
объемом 1,5 мл
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Микроцентрифужные пробирки для
ПЦР объемом 0,6 мл.
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с
плоской крышкой
ФСЗ 2012/11892 «Axygen», США
Пестик для пробирок типа Eppendorf
1,5-2,0 мл
ФСЗ 2011/10287, «SSI», США
Ступка фарфоровая (№1) ГОСТ 9147-80
Пестик фарфоровый (№1) ГОСТ 9147-80
Порошок стеклянный марки ПСЗО ГОСТ Р 52233-2004
Комплект реагентов для экстракции
РНК/ДНК из клинического материала
«РИБО-преп» по ТУ 9398-071-
01897593-2008
ФСР 2008/03147, ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора, Россия
Комплект реагентов для первого этапа
выделения РНК из биологического
материала «РИБО-золь-С» по ТУ 9398-
074-01897593-2008
ФСР 2008/03148, ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора, Россия
Одежда одноразовая медицинская из
нетканого и полимерного материалов
РЗН 2013/668
Перчатки медицинские диагностические
одноразовые. Часть 1. Спецификация на
перчатки из каучукового латекса или
раствора
ГОСТ Р 52239-2004
Спирт этиловый ректификованный из
пищевого сырья
ГОСТ 5962-2013
Натрий хлористый ГОСТ 4233-77
Инструкция no применению «Амплиген-И^К-генотип-1/2/4» Страница 8 из 27
--- стр. 35 ---
* Примечание: допускается применение оборудования другого типа, по своим
характеристикам не уступающего рекомендуемому.
6. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ПРОБЫ
Материалом для исследований на наличие возбудителя ЛЗН служат:
1) пробы клинического материала (образцы цельной крови, сыворотки и/или плазмы
крови, лейкоцитарная фракция крови, спинномозговая жидкость, моча);
2) пробы аутопсийного материала от человека (головной мозг, печень, селезенка,
почки);
3) пробы биологического материала (кровь, суспензии органов животных, суспензии
комаров, клещей).
Материал для исследования забирают в стерильные емкости с герметично
завинчивающимися крыщками в соответствии с требованиями СанПиН 3.3686-21
«Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней»,
МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические
лаборатории», МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы
амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы
I-IV групп патогенности».
Транспортирование материала в лабораторию для исследований проводят при
температуре от плюс 2 °С до плюс 8 °С в течение 1 суток в соответствии с СанПиН 3.3686-21
«Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней»,
После проведения предварительной обработки проб допускается их транспортировка при
температуре от минус 16 °С до минус 20 ®С в течение 7 суток или в сосуде Дьюара с жидким
азотом - длительно.
7. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ (АНАЛИЗА)
7Л Подготовка исследуемых образцов
7.1 Л Подготовка проб клинического (биологического) материала
Кровь, плазма крови. Забор крови производят натощак или через 3 ч после приема
пищи из локтевой вены в количестве 5-10 мл одноразовой иглой (диаметр 0,8—1,1 мм) в
специальную вакуумную систему типа «Vacuett» (сиреневые крыщки - 6% ЭДТА) или
одноразовым шприцем в пластиковые пробирки с цитратом натрия (3,8 %-й раствор цитрата
натрия в соотношении 1:9). Пробирку закрывают крышкой и аккуратно переворачивают
несколько раз вверх дном, чтобы кровь в пробирке тщательно перемешалась с
антикоагулянтом.
Плазму крови получают центрифугированием пробирок с цельной кровью при 800-
1600 g в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем отбирают плазму в количестве не
менее 1 мл отдельными наконечниками с фильтром (пастеровскими пипетками) в стерильные
пробирки объемом 1,5 или 2,0 мл. Затем выполняют этап обеззараживания материала (п. 7.2).
Лейкоцитарная фракция цельной крови. Лейкоцитарную фракцию цельной крови
следует отбирать после центрифугирования цельной крови и удаления плазмы. Используя
наконечник с фильтром аккуратно собрать лейкоцитарную массу с поверхности осадка
клеток в объеме 0,2 мл и перенести в стерильную пробирку объемом 1,5-2,0 мл. Затем
выполняют этап обеззараживания материала (п. 7.2).
Сыворотка крови. Для получения сыворотки забор крови проводят натощак из
локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8— 1,1 мм) в одноразовые пробирки без
антикоагулянта. Пробирки с кровью отстаивают при комнатной температуре в течение 30
мин до полного образования сгустка или помещают в термостат при 37 °С на 15 мин. Затем
центрифугируют при 800-1600 g в течение 10 мин при комнатной температуре. Сыворотку
переносят отдельными наконечниками с фильтром (пастеровскими пипетками) в стерильные
пробирки объемом 1,5 или 2,0 мл. Затем выполняют этап обеззараживания материала (п. 7.2).
Спинномозговая жидкость. Спинномозговую жидкость собирают, используя
Инструкция по применению «Амплиген-Ж/УК-генотип-1/2/4» Страница 9 из 27
--- стр. 36 ---
одноразовые иглы, в одноразовые пластиковые пробирки объемом 1,5 или 2,0 мл.
Предварительная обработка проб не требуется. Затем выполняют этап обеззараживания
материала (п. 7.2).
Моча. Для анализа отбирают первую порцию утренней мочи в количестве не меньше
20-30 мл в специальный сухой стерильный флакон на 50 мл. Переносят 1 мл мочи, используя
наконечник с фильтром, в стерильные одноразовые пробирки объемом 1,5 мл.
Центрифугируют 5 мин при 10000 g, при наличии большого количества солей
ресуспендируют только верхний слой осадка солей в объеме 1 мл и затем снова
концентрируют. Используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой, полностью удаляют
супернатант, не захватывая осадок. К осадку добавляют 0,9% раствор хлорида натрия до
конечного объема 0,2 мл, тщательно перемешивают содержимое на вортексе. Затем
выполняют этап обеззараживания материала (п. 7.2).
7.1.2 Подготовка проб аутопсийного материала от человека
Аутоптаты органов. Кусочки ткани органов отбирают при вскрытии, соблюдая
регламентированные меры безопасности. Для растирания кусочков органов используют либо
охлажденную стерильную ступку и пестик либо микропробирки объемом 1,5 мл с пестиком
для пробирок типа Eppendorf.
В стерильной охлажденной ступке кусочки органов массой до 10 г растирают до
гомогенного состояния, после чего добавляют охлажденный 0,9 % раствор натрия хлорида в
соотношении 1:5 (масса/объем). Надосадочную жидкость отбирают с помощью пипетки
через ватный тампон в отдельную пробирку. Переносят по 1 мл пробы в
микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с завинчивающими крышками, используя
наконечник с фильтром. Центрифугируют в течение 10 мин при 12000 об/мин. Осадок
ресуспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлорида. Затем выполняют этапы
обеззараживания материала (п. 7.2).
В микропробирках объемом 1,5 мл кусочки органов массой 0,1 г растирают пестиками
до гомогенного состояния, затем добавляют равный объем (не менее 100 мкл) охлажденного
стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида и тщательно перемешивают. Суспензию
отстаивают при комнатной температуре в течение 2-3 мин, затем верхнюю фазу переносят в
отдельную микропробирку объемом 1,5 мл, используя наконечник с фильтром. Затем
выполняют этапы обеззараживания материала (п. 7.2).
7.1.3 Подготовка проб органов от животных, комаров и клещей
Биоптаты (аутоптаты) органов. Кусочки ткани органов животных отбирают при
вскрытии, соблюдая регламентированные меры безопасности. Для растирания кусочков
органов используют либо охлажденную стерильную ступку и пестик либо микропробирки
объемом 1,5 мл с пестиком для пробирок типа Eppendorf.
В стерильной охлажденной ступке кусочки органов массой до 10 г растирают до
гомогенного состояния, после чего добавляют охлажденный 0,9 % раствор натрия хлорида в
соотношении 1:5 (масса/объем). Надосадочную жидкость отбирают с помощью пипетки
через ватный тампон в отдельную пробирку. Переносят по 1 мл пробы в
микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл с завинчивающими крышками, используя
наконечник с фильтром. Центрифугируют в течение 10 мин при 12000 об/мин. Осадок
ресуспендируют в 100 мкл 0,9 % раствора натрия хлорида. Затем выполняют этапы
обеззараживания материала (п. 7.2).
В микропробирках объемом 1,5 мл кусочки органов массой 0,1 г растирают пестиками
до гомогенного состояния, затем добавляют равный объем (не менее 100 мкл) охлажденного
стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида и тщательно перемешивают. Суспензию
отстаивают при комнатной температуре в течение 2-3 мин, затем верхнюю фазу переносят в
отдельную микропробирку объемом 1,5 мл, используя наконечник с фильтром. Затем
выполняют этапы обеззараживания материала (п. 7.2).
Комары и клещи. Предварительно формируют пулы комаров и клещей по видам.
Инструкция по применению «Амплиген-И'УУК-генотип-1/2/4» Страница 10 из 27
--- стр. 41 ---
14ктер Нового Tcoi
Этот экран отображвег смешанные 0П1М4 для этого теста 3«полн<гв
поля, нажмите След. когда вы готовы перейти на след стр
Оператор:
Обьвм -Ц
раакшы tPLt ^
|~ 16Ысдобав. воска
Комюноека 11.2.3 3]
Вьвий I «Ц а э а д | Далее»
Данная область
греднвэначена для
отображения
сгравки
элементов
мастера. Для
справки по этой
теме проведите
г-миь над этой
темой бы можете
также нажать на
раскрываошь^кся
стмсокдля
отображение
стравки о
еоэможньм
установках.
6. Нажимают кнопку «NextУ>l<(Дalee».
М».н.р Иаеоге Теста
JrerrpMMk
пявстштег
собой
Ееявстоо гроФкля..
Исгяноом км п*:
Ити Иотоеаж Датастое Уовам см п«м 1
О тм 47(km 51 Oran 5
Vtlof. S30nm 555m 5
Oiarq* SBSrm 61 O n S
Rad 62bm EEDm 5
Cimton G90nm 710» 7
Ц о»А..
Орика.
У ром м О гн
М й й в п ь
О т м а и м гь
Опт ромяснтн ..
teoeiHb. когсО к Я
б|рв< работать на
леибора Чтобы
iHH iiTb проешь.
Поавта
бьаой «Ц аам Д а ли »
7. В верхней части окна нажимают кнопку «Editproflle»l«PedaKmop профшя».
Инструкция по применению «Амплиген-И'Л^К-генотип-1/2/4» Страница 15 из 27
--- стр. 42 ---
8. Задают следующие параметры (Таблица 5):
Таблица 5
Цикл Температура, °С Время Измерение
флуоресценции
Количество
циклов
1 50 30 мин - 1
2 95 15 мин - 1
3
95 5 с -
556 25 с -
72 15с -
4
95 5 с -
4056 25 с
FAM/Green,
JOE/Yellow,
ROX/Orange,
Cy5/Red
72 15с -
Флуоресценцию измеряют при 56 °С (во втором блоке циклирования) по каналам
FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange, CyS/Red
Инструкция по применению «Амплиген-И^Л^К-генотип-1/2/4» Страница 16 из 27
--- стр. 43 ---
t L Радакгор Пробили
Л , С
Номй Откр. Спранитъкак
9С правка
Твстгройолжигсяоколо140|4а1ГраФИ(енизу прваставляеттест. которъА должен быть выпо/мн:
Нажмите на 1и*л ниже, чтобы измемлъ его:
Удерж темп-ры
Удерж, тенп-ры 2
Вет. после... [
Вставить до^
Удалить I
Цмсл повторить 40 | раз
Q K
Нажимают кнопку «ОК»/«Да».
9. В нижней части
Optimisation... )> !«Опт.уровня сиги.».
окна нажимают кнопку «Calibrate »/«Gain
Маст^ Нового Теста
Профиль
Установке канала:
Имя Источник Детектор Урове»ъ сигнала 1
Green 470rvn 51 Опт 5
Yellow 530nm 555nm 5
Orange 585nm Б1 Опт 5
Red 6 2 5 rw T i660nm 5
Crimson 680nm 710hp 7
Ыоаый... I
Правка..
вровень Сигн.
^^далигь
Дпт. аровнясига..|
Дтменить I
Данная область
преднаэначена для
отображения
справки
елемеигов
мастера. Для
справки по этой
теме проведите
мьшь над этой
темой. Вы можете
также нажать на
раскрывающийся
список для
отображения
справки о
возможным
^ютаноекак.
Выход « Назад Далее» |
В открывшемся окне нажимают кнопку «Calibrate Acquiring»!«Optimise Acquiring»!
Инструкция по применению «Амплиген-И?/^'-генотип-1/2/4» Страница 17 из 27
--- стр. 44 ---
« Опт. детек-мых».
Двто-оптимимция уровня сигнам
г Опгим иавция:
%
При аетоюпгимиэации уровня сигнала буает сш гы ваться флуоресцентный сигнал
выбраш ой пробирки при р а зли ч е н уровнях усиления сигнала, пока не найается
уровень, при котором см н ал попаавет в нужньй диапазон Уровень сигнала
зависит от испо/ъэуемьн реагентов.
Установить температуру [б0 • ^градусое.
Опгим. всех I Опт. Детек-мых I
П Вы полнить оптимизацию 1-м шаге детекции
(~ Вы полнить оптимизацию при 60 градусах перед началом теста
Установки канала:
▼ i Добавить.,. I
И м я 1 Позиция П робкж и | Мнним Сигнал | Максим. С>гная I М и к уров Ораека.
валить
У д а лл -ь gee
тарт J I Закрьпъ I £пр. {
- ДЛЯ красителя FAM/Green указывают в графе «Min Reading»/ «Миним. Сигнач»
значение 5. в графе «Мах Reading»/«Максим. Сигнач» значение 10, в графе «Tube
position»! «Иогшщя пробирки» значение 1;
- для красителя JOE/Yellow указывают в графе «Min Reading»/ «Миним. Сигнач»
значение 5, а в графе «Мах Reading»/«Максим. Сигнач» значение 10, в графе «Tube
position»!«Т\ошщ\я пробирки» значение 3;
- для красителя ROX/Orange указывают в графе «МЫ Reading»/ «Мииим. Сигнач»
значение 5. а в графе «Мах Reading»/«Максим. Сигнач» значение 10, в графе «Tube
p o s i t i o n » ! пробирки» значение 2;
- для красителя CyS/Red указывают в графе «МЫ Reading»/ «Миним. Смгнш^значение 5.
а в графе «Мах Reading»/«MaKCUu. Сигнач» значение 10, в графе «Tube position»!«Нозшщя
пробирки» значение 3.
Инструкция по применению «Амплиген-К'^У^'-генотип-1/2/4» Страница 18 из 27
--- стр. 45 ---
!
Двто-оптмшоацни уровни сигшиа I а 1
Оптимизация:
При ввто-олпамации уровня сигнала буает счигьеаться Флуоресцентный сигнал
еыбратой пробирки различных уровнях усиления сигнала, пока не найоется
уровень, при котором сигнал полацает в нужный диапазон Уровень сигнала
заеисиг от используемых реагентов
г Установки канала
Канал; Gieen Позиция Пробирки:
Нужныйдиапаэон стартового сигнала: js ~^Пдо
Диапазон уровней огнала: 1-Ю
ОК Отме»«4ть Страека -!
Старт I Врувуо.. { Закрыть { £пр. |
В графе «Tube position»/«Позиция Пробирки» указан номер пробирки, по которой будет
автоматически выбран параметр «gaw»/«ycHneHHe сигнала». В 1-ой позиции в роторе должна
ставиться пробирка с реакционной смесью ОТ-ПЦР-смесь-1 WNV генотип-1. Во 2-ой
позиции в роторе должна ставиться пробирка с реакционной смесью ОТ-ПЦР-смесь-1 WNV
генотип-2. В 3-ой позиции в роторе должна ставиться пробирка с реакционной смесью ОТ-
ПЦР-смесь-1 WNV генотип-4/ВКО.
Помечают галочкой бокс в строке «Perform Calibration Before Р' Acquisition»/«Perform
Optimisation Before P' Acquisition»/«Выполнить оптимизацию при П.м шаге детекции». Закрыть
окно «Auto Gain Calibration 8еШр»/«Авто-оптимизация уровня сигнала», нажимают кнопку
«С1о8е»/«Закрыть».
Авто-оптиммэвция уровня сигнала
гОтимизация:
%
При аето-огтп*<мзеции уровня сигнала будет счттьввгъся Флуоресцентный сигнал
выбранной пробирки при раэлн>ыьн jfxiBHm усиления сигнала, пока не найдется
уровень, при котором сигнал попадает в нужньй диепазонУрове» сагнала
зависит от используемьн реагентов
Установить температуру |б0*~ —} градусов.
Опгнм. всех I Опт. Детек-мьи |
F Вьлолнитъостгимизашао при 60 градусах перед началом теста
Установки канала:
Имя Поэ»Д1ияПооби1ки 1 Минаи СигналМаксии. СигналМинчс
Green 1 5FI 10FI ■10
Orange2 5FI 10FI -10
Yelow 3 5FI 1CFI • 10
Red 3 5FI 1CFI ■10
. Г ■-- - *
Добавить..
Правка.
Мделить
Удалить Все
j бручнук. I Закрыть £пр.
I
Инструкция по применению «Амплиген-И'/УР’-генотип-1/2/4» Страница 19 из 27
--- стр. 46 ---
Нажимают кнопку «Next»f«Mwiee».
Мастер Нового Теста
Профиль
Еасдктор профиля... [
Установка канала:
Имя Источнж 1 Детектор Уровеж сигнале 1
Green 470nm 51 Опт 5
YeAwv 530nm 555nm 5
Orange 585ran 61 Опт 5
Red 625nm 660nm 5
Crimson 680nm 710hp 7
Цовый...
Правка..
^рове№ Сигн.
][|далигь
flfTT. уоеняснгн.. |
Дтменигь I
Лажая область
греанаэиачена ОЛЯ
отображежй
справки
элементов
мастера. Для
справки по этой
теме провеоите
Mbuib наа этой
темой. Вы можете
также нажать на
раскрьеаюшийся
список ОЛЯ
отображения
справки о
еоэможньн
установках.
L-ZijwgifiL^ « Цаэаи | Далее» \
10. Запускают амплификацию кнопкой «Start гт»/«Старт». При необходимости
введенные значения термоциклирования могут быть сохранены в качестве шаблона,
используя кнопку «Save template/«Сохр.шаблон».
Мастер Нового Теста
Схем а;
,> > Р
Ъ '
V.. с, ^ 9 ’V
Установка Значение 1
Green Уровень сигнала 5
Orange Уровень сигнала 5
Red Уровень сигнала 5
V elbw Уровень сигнала 5
Оптим изация автоуровня сигнала Д о первого детектир. данных
Ротор 36-луночный ротор
Компоновка образцов 1.2.3...
О бъём реакции (в микролитрах) 25
Проверив правильность установок, нажмите Старт д л я начала еьвю лнения
Теста. Наж м ите Сохр.Ш аблон. что&< сохранить ш аблон с програм м ой и
устакоекам и этого теста.
£тарт
Сохр. шаблон
Выхоа « Н азад
Инструкция по применению «Амплиген-И^/УК-генотип-1/2/4» Страница 20 из 27
--- стр. 73 ---
--- стр. 74 ---
* ''У Т № Р Ц ^
ь ^:.i:
олгоградскии
^тельский
#Ф тйН бнадзора
Топорков А.В.
СВИДЕТЕЛЬСТВО
на стандартный образец предприятия кДНК вируса желтой лихорадки
{Yellow fever virus) «СОП кДНК YFV»
Серия: 4/21
Назначение; стандартный образец предприятия кДНК вируса желтой лихорадки {Yellow
fever virus) «СОП кДНК YFV» предназначен для проверки соответствия «Набора реагентов
для выявления и дифференциации генотипов (1, 2, 4) вируса Западного Нила {West Nile
virus) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и
гибридизационно-флуоресцентной детекцией «Амплиген-РКЛ^К-генотип-1/2/4» по ТУ
21.20.23-015-01898084-2019» при изготовлении серии препарата и проведении
предусмотренных ТУ испытаний.
Аттестуемая характеристика: отсутствие специфической флуоресценции по каналам
FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange аналогично, как при исследовании препаратов РНК,
выделенных из культур клеток, инфицированных Yellow fever virus с концентрацией 1x10^
ГЭ/мл.
Дополнительные сведения: СОП кДНК YFV представляет собой микроцентрифужную
пробирку объемом 1,5 мл с завинчивающийся крышкой, содержащую 0,1 мл раствора кДНК
Yellow fever virus^ полученной из аттенуированного штамма Yellow fever virus 17D (ФГБНУ
«ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН», Россия), с концентраций |хЮ^ ГЭ/мл.
Количество наборов -10 шт.
Документ, определяющий п о р я д о к и у с л о в и я применения СОП: Инструкция по
применению СОП кДНК YFV для проверки соответствия набора реагентов «Амплиген-
РГЛ^К-генотип-1/2/4» техническим условиям.
Условия хранения: СОП кДНК YFV должен храниться при температуре от минус 18*' до
минус 20 °С.
Срок действия; 1 год
Дата выпуска: 25.03.2021 г.
Маркировка пробирок;
ФКУ1 ЦслгосршсскЯ П1учн1> -
нсспсдоытслшпЯ ирстничумнмй
институт I’OCIIOT^IIIU'U;).
СОП кДНК Y F V
0,1 нл
Xpuiim<л минус I6iiuминус20°С
Серна
Лате ит|\т«лс 1 1иа
Гпленл’
Т.у|ыи>;ц1И ш ЛИМ 1КУ1ИШ
Зав. ОБТК, в.н.с. Е.В. Прохватилова
--- стр. 75 ---
УТВЕРЖДАЮ
Дй'ре1^ор ФКУЗ Волгоградский
л едовател ьс ки й
ный
спотребнадзора
___Топорков А.В.
2019 г.
ИНСТРУКЦИЯ
по применению стандартного образца предприятия кДНК
вируса желтой лихорадки {Yellowfever virus) «СОИ кДНК YFV»
для проверки соответствия набора реагентов
«Амплигеи-^^К-генотип-1/2/4»
техническим условиям
1. Общие указания
1.1. Инструкция устанавливает порядок и условия применения стандартного образца
предприятия кДНК вируса желтой лихорадки {Yellow fever virus) «СОП кДНК YFVy> для
проверки соответствия набора реагентов «Амплиген-ЖАК-генотип-1/2/4» техническим
условиям.
2. Подготовка к применению
2.1. Все работы с СОП кДНК YFV должны проводиться на аттестованном и поверенном
оборудовании.
2.2. СОП кДНК YFV применяют для контроля изготовления отдельных компонентов и
готового препарата «Амплиген-/УАК-генотип-1/2/4» новой серии.
3. Условия и порядок применения
3.1. Перед применением пробирку с СОП кДИК YFV достают из морозильной камеры и
полностью размораживают при комнатной температуре. Пробирку перемешивают на
микроцентрифуге/встряхивателе в течение 5 с., центрифугируют при 2000-2500 об/мин
в течение 5-10 с для осаждения капель со стенок.
3.2. Отбирают 100 мкл препарата СОП кДНК YFV и переносят в чистую
микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
3.3. Проводят выделение кДНК из 100 мкл препарата СОП кДНК YFV в соответствии с
инструкцией к набору реагентов «РИБО-преп» по ТУ 9398-071-01897593-2008 (ФБУН
ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) или аналогичных. На этапе
выделения кДНК добавляют 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО) в
лизирующий раствор.
3.4. Дополнительно на этапе экстракции кДНК готовят отрицательный контроль
выделения. Для этого в отдельную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл
вносят 100 мкл ОКО и 10 мкл ВКО.
3.5. Постановку ОТ-ПЦР и учет результатов осуществляют в соответствии с инструкцией
к набору реагентов «Амплиген-ЖУК-генотип-1/2/4». При проведении ОТ-ПЦР с
каждой ОТ-ПЦР-смесью-1 используют следующий набор образцов и контролей
(Таблица 1).