Набор реагентов для определения статуса мутаций гена EGFR методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени в пробе геномной ДНК человека из образцов фиксированной в парафине ткани (Тест-EGFR-ткань-5) по ТУ 21.20.23-004-25226389-2020 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 --- УТВЕРЖДАЮ альный директор ООО «Л-сфера» _Р. Р. Халилов «П» августа 2021 г. И Н С Т Р У К Ц И Я Набор реагентов для определения статуса мутаций гена EGFR методом ПЦР-РВ в пробе геномной ДНК человека из образцов фиксированной в парафине ткани (Тест-ЕСРК-ткань-5) по ТУ 21.20.23-004-25226389-2020 Версия 2 от 11.08.2021 У --- стр. 2 --- Содержание Введение..........................................................................................................................................3 1. Назначение...............................................................................................................................5 2. Принцип метода.....................................................................................................................6 3. Состав набора реагентов...................................................................................................8 4. Характеристики набора реагентов.....................................................9 4.2 Характеристики аналитической эффективности .........................................10 5. Перечень рисков, связанных с применением набора реагентов «Тест- Е6РВ-ткань-5».............................................................................................................................12 6. Меры предосторожности при работе с набором..............................................12 8. Анализируемые пробы....................................................................................................15 9. Подготовка компонентов набора для исследования.....................................20 10. Проведение анализа................................................................................21 11. Регистрация и интерпретация результатов.......................................................24 12. Информация о стабильности медицинского изделия.................................26 13. Условия хранения, транспортирования ............................................26 и эксплуатации набора.................................................................................26 14. Утилизация..............................................................................................27 15. Гарантийные обязательства, контакты ............................................28 Приложение А ..........................................................................................................................30 J --- стр. 3 --- Целевой аналит - ген EGFR, исследуемый при обследовании пациентов с диагнозом «немелкоклеточный рак легкого» для качественного определения статуса мутации L858R и 27 делеций (del) в 19 экзоне гена EGFR для определения показаний к таргетной терапии. Материалом для проведения исследования служат пробы геномной ДНК человека из образцов фиксированной в парафине ткани. Научная обоснованность. Рак легкого — одна из наиболее распространенных форм злокачественных онкологических заболеваний. Ежегодно в России от рака легкого погибают около 60 тыс. человек, что составляет 20% от всех умерших от злокачественных заболеваний. ф Идентификация и расшифровка механизма действия рецептора эпидермального фактора роста опухоли (EGFR — Epidermal Growth Factor Receptor) стала одним из многообещающих открытий в онкологии. За последние несколько лет изучение рецептора эпидермального фактора роста стало одним из актуальных аспектов современной онкологии. Установлено, что высокая частота гиперэкспрессии EGFR характерна для немелкоклеточного рака легкого (40—70%), рака яичников (35—70%), толстой кишки (25— 77%) и др. Известно, что выявление повышенной экспрессии EGFR является фактором неблагоприятного прогноза течения болезни. Активация механизмов с участием EGFR приводит к усилению пролиферативной активности опухолевых клеток, неоангиогенезу, замедлению апоптоза, более раннему появлению метастазов. Большинство соматических мутаций гена EGFR, обнаруживаемых у больных немелкоклеточным раком легкого (ЫМРЛ), локализованы в экзонах 18—21, кодирующих ^ тирозинкиназный домен. Открытие этих мутаций немедленно связали с положительным ответом на терапию ингибиторами тирозинкиназы EGFR. Наиболее частыми являются делеции в экзоне 19 (45% от всех мутаций), за ними следует нуклеотидная замена Т на G в положении Введение 2573 экзона 21, что приводит к аминокислотной замене лейцина на аргинин в положении 858 аминокислотной последовательности (L858R, 41%), на вставки в экзоне 20 и нуклеотидные замены в экзонах 18 и 20 приходится 14% мутаций. Данные мутации встречаются у 10% больных НМРЛ европеоидного происхождения и у 50% азиатов. Назначение ингибиторов тирозинкиназы (ТК) больным НМРЛ с наличием делеций в 19 экзоне (Dell9) или мутации L858R гена EGFR, связанных с чувствительностью к ингибиторам тирозинкиназы (ТК), является эффективным методом лечения, приводящим к существенному сокращению размеров опухолевых очагов и контролю проявлений заболевания на достаточно продолжительный срок. Область применения набора реагентов • клиническая лабораторная диагностика, онкология. Показания и противопоказания к применению Показания к применению: Набор реагентов «Тест-EGFR- ткань-5» рекомендуется при обследовании пациентов с диагнозом «немелкоклеточный рак легкого» для качественного определения статуса мутации L858R и 27 делеций (del) в 19 экзоне гена EGFR методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени в пробе геномной ДНК человека из образцов фиксированной в парафине ткани, для определения показаний к таргетной терапии низкомолекулярными ингибиторами тирозинкиназы EGFR. Противопоказания: отсутствуют. --- стр. 5 --- достаточная для проведения исследования должна составлять t -10( нг/мкл. Ткань опухоли не является гомогенной, в связи с эти; результаты анализа, полученные из образца ткани, могут н совпадать с результатами других секций той же самой опухолг Кроме того, образцы опухоли могут содержать и нормальнун (неопухолевую ткань). При использовании пробы геномной ДНК выделенной из ткани, не содержащей опухоль, набор «Тест-EGFR ткань-5» не сможет выявить мутации гена EGFR. Метод ПЦР крайне чувствителен к контаминации Соблюдайте осторожность, чтобы избежать контаминации образце исследуемой ДНК и реакционных смесей содержимым из пробирк! ПКО или продуктами ПЦР. Набор реагентов «Тест-ЕОРК-ткань-5» не може использоваться для диагностики какой-либо патологии. Набо реагентов «Тест-ЕОРК-ткань-5» предназначен только дл качественного определения статуса мутации L858R и 27 делеци (del) в 19 экзоне гена EGFR. Общее время проведения анализа составляет 2-2,5 ч. 3. Состав набора реагентов Набор реагентов выпускается в 1 форме комплектации - «Тест-ЕСРК-ткань-5». Каждый набор «Тест-ЕСРК-ткань-5» содержит реагенты, рассчитанные на проведение 5 определений. Состав набора Набор реаг'ентов «Тест-ЕОРК-ткань-5» включает: Таблица 1 - Состав набора реагентов «Тест-ЕСРК-ткань-5» № пп Название реагента Описание Количество пробирок, объём, мкл 1 ПЦР-смесь del Прозрачная бесцветная жидкость, может иметь оттенок розового цвета 1 пробирка (60 мкл) 2 ПЦР-смесь L858R Прозрачная бесцветная жидкость, может иметь оттенок розового цвета 1 пробирка (60 мкл) 3 ПКО Прозрачная бесцветная жидкость 1 пробирка (60 мкл) 4 ОКО Прозрачная бесцветная жидкость 1 пробирка (60 мкл) 5 Taq- полимераза Прозрачная бесцветная жидкость 1 пробирка. (300 мкл) Положительный контрольный образец (ПКО) готов к использованию и представляет собой смесь геномной ДНК из культуры клеток человека линии Jurkat в концентрации 400 копий гена EGFR в 1 мкл и искусственно синтезированной вставки размером 300 п.н., содержащей эквимолярную смесь мутации L858R и 27 делеций (del) в 19 экзоне rtwBiEGFR, в плазмидный век юр pAL- ТА с концентрацией 20 копий плазмидной ДНК в 1 мкл. Содержит 5% мутантных и 95% нормальных копий ДНК. В качестве ОКО используют воду деионизованную. Все ПЦР-смеси содержат праймеры и зонды к внутреннему контрольному образцу (ВКО). Зонды к ВКО помечены HEX (см. раздел 11 «Регистрация и интерпретация результатов»). Эго 8 --- стр. 6 --- контроль эффективности экстракции ДНК и возможного наличи: ингибиторов в пробе, присутствие которых может привести ложноотрицательным результатам. В составе набора отсутствуют лекарственные средства дл медицинского применения, вещества человеческого или животног происхождения. 4. Характеристики набора реагентов 4.1 Технические и функциональные характеристики Таблица 2 - Технические и функциональные характеристики Наименование показателя Характеристики и нормы Отрицательный результат с ОКО Отсутствие роста сигнала флуоресценции в реакциях «del» и «L858R» с ОКО по каналам РАМ и HEX 4.2 Характеристики аналитической эффективности Таблица 3 - Аналитические характеристики набора реагентов «Тест-ЕСРК-ткань-5» Наименование показателя Характеристики и нормы 1. Технические характеристики 1.1 Внешний вид ПЦР-смесь del Прозрачная бесцветная жидкость, может иметь оттенок розового цвез ПЦР-смесь L858R Прозрачная бесцветная жидкость, может иметь оттенок розового цве'г ПКО Прозрачная бесцветная жидкость ОКО Прозрачная бесцветная жидкость Taq-полимераза Прозрачная бесцветная жидкость 1.2. Комплектность В соответствии с п. 1.4 ТУ 21.20.23 004-25226389-2020 1.3. Маркировка В соответствии с п. 4 ТУ 21.20.23- 004-25226389-2020 1.4. Упаковка В соответствии с п. 5 ТУ 21.20.23- 004-25226389-2020 2. Функциональные характеристики Положительный результат с ПКО Ре1истрация роста сигнал флуоресценции с Ct< 35 в реакция «del» и «L858R» с ПКО по канала* РАМ и HEX Аналитическая специфичность Специфичен по отношению к мутации L858R и 27 делециям (del)* в 19 экзоне гена EGFR Аналитическая чувствительность 10 копий гена EGFR в 1 мкл раствора ДНК обнаруживает наличие любой из 27 делеций, но не различает их Список определяемых делений с указанием ID делеции представлен в таблице 4. Таблица 4 - Список определяемых делеций с указанием ID делеции Набор делеций. определяемых с помощью набора реагентов «Тест- ЕСРК-ткань-5» COSMIC ID** 2235_2249dell5 6223 2235_2252>ААТ (complex) 13551 2236_2253dell8 12728 2237_2251dell5 12678 2237_2254dell8 12367 2237_2255>T (complex) 12384 2236_2250delI5 6225 2238_2255dell8 6220 10 --- стр. 7 --- Набор делений, определяемых с помощью набора реагентов «Тест- ЕСГК-ткань-5» COSMIC ID** 2238_2248>GC (complex) 12422 2238_2252>GCA (complex) 12419 2239_2247del9 6218 2239_2253delI5 6254 2239_2256dell8 6255 2239_2248TTAAGAGAAG>C 12382 2239_2258>CA (complex) 12387 2240J25Idell2 6210 2240_2257delI8 12370 2240J254dell5 12369 2239_2251>C (complex) 12383 2236_2252>AT (complex) 26680 2236_225I>T (complex) 26513 2238_2252dell5 23571 2237^2252>T (complex) 12386 2235_2255>GGT (complex) 85797 c.2235_2246dell2 28517 2235_2251>AG (complex) 13549 2236_2253>CAA (complex) 22999 комплементарными участками ампликонов (специфических продуктов амплификации), что исключает перекрестные реакции. 5. Перечень рисков, связанных с применением набора реагентов «Тест-ЕСГК-ткань-5» В пограничную зону риска вошли опасности: 1. потеря функциональных свойств реагентов, входящих в набор, из-за транспортирования, хранения или эксплуатации в несоответствующих условиях; 2. контаминация реакционных смесей с образцами исследуемой ДНК содержимым из пробирки ПКО или продуктами ПЦР; 3. проведение анализа с использованием пробы ДНК низкого качества (низкая концентрация и/или плохая очистка); 4. невыполнение требований по пробоподготовке. проведению анализов и утилизации вследствие работы с набором неквалифицированным персоналом; 5. использование непригодного для применения набора (использование по истечению срока годности или при нарушении упаковки). В области недопустимой зоны риски нс выявлены. Совокупный остаточный риск применения медицинского изделия «Набор реагентов для определения статуса мутаций гена EGFR методом ПЦР-РВ в пробе геномной ДНК человека из образцов фиксированной в парафине ткани (Тест-ЕОРК-ткань-5) по ТУ 21.20.23-004-25226389-2020, производства ООО «Л-Сфера» является допустимым, польза от его применения превышает риск. 6. Меры предосторожностн при работе с набором ♦* идентификационный номер мутации согласно международно' Класс в зависимости от потенциального риска применения - базе соматических мутаций при раковых заболеваниях COSMl(26 в соответствии с номенклатурной классификацией медицинских (Catalog of Somatic Mutations in Cancer). изделий, утверждаемой приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 06.06.2012 N 4н. Специфичность анализа определяется олигонуклеотидным Все составные части и реагенты, входящие в состав набора затравками (праймерами), подобранными к гомологичным участка реагентов «Тест-ЕОРК-ткань-5», относятся к 4 классу опасности генов, а также специфичными флуоресцентным(вещества малоопасные) в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 «ССБТ. олигонуклеотидными зондами для гибридизации Вредные вещества. Классификация и общие требования “ 12 --- стр. 8 --- безопасности». Меры предосторожности против любы: специальных, несвойственных экологических рисков npi использовании или реализации изделия не предусмотрены. Реагенты, входящие в набор «Тест-ЕОРК-ткань-5», обладаю низкой упругостью пара, и исключают возможное! ингаляционного отравления. Реагенты, входящие в набор «Тест-ЕСРК-ткань-5» п токсичны, поскольку готовятся путём смешивания отдельны нетоксичных компонентов. Работа должна проводиться в лаборатории, выполняюще молекулярно-биологические (ПЦР) исследования клиническог материала с соблюдением санитарно-эпидемических прави 2. допускать к работе с набором только специально обученный персонал (специалист с высшим медицинским или биологическим образованием, прошедший обучение на лицензированных курсах специализации по работе с ПБА111- IV групп патогенности и по ПЦР-диагностике, а также со средним специальным медицинским образованием); 3. не использовать набор по истечении срока годности; 4. избрать контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой. При контакте немедленно промыть поражённое место водой и обратиться за медицинской помощью. При контакте немедленно промыть пораженное место водой и СанПиН 2.1.3684-21 от 28.01.2021 "Санитарно-эпидемиологически ^ п о м о щ ь ю , требования к содержанию территорий городских и сельски Необходимых мер предосторожности в отношении влияния поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевомвнешних электрических воздействий, водоснабжению населения, атмосферному воздуху, почвам, разрядов, давления или перепадов давления, помещениям, эксплуатации производственных, общественны •перегрузки, источников взрыва или возгорания не предусмотрено помещений. организации и проведению санитарнс противоэпидемических (профилактических) мероприятий Следовать рекомендациям, изложенным в МУ 287-113. "Радосторожности против 1 3 2569 09 любых специальных, несвойственных рисков при использовании При работе всегда следует выполнять следующие требовани?^^ реализации изделия не предусмотрены. - Удалять неиспользованные реактивы в соответствии В составе набора отсутствуют вещества человеческого или животного происхождения, обладающие потенциальной СанПиН 2.1.3684-21 от 28.01.2021 "Санитарно-эпидемиологически требования к содержанию территорий городских и сельски поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевом водоснабжению населения, атмосферному воздуху, почвам, жилы помещениям, эксплуатации производственных помещений, организации и проведению санитарж 1. Оборудование и материалы, необходимые при работе с набором Оборудование: 1. ПЦР-бокс (типа «БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», «Ламинарные ‘V*"" ........." системы», Россия). щественны ^ Вдртекс (типа «ТЭТА-2», «Биоком», Россия). . , . .. 3. Набор электронных или автоматических дозаторовпротивоэпидемических (профилактических) мероприятии. ^ / i- . г т- ^п > г V переменного объема (типа «Еррепаогг», Германия).ВНИМАНИЕ! При удалении отходов после амплификаци ^ ^ -, ^ ^ ^ rrfir .4 4. Холодильник от 2 до 8°С с морозильной камерой не выше(пробирок, содержащих продукты ПЦР) недопустимо открываш \сос пробирок и разбрызгивание содержимого, поскольку это мож 1 с к а . \ л.н н 5. Амплификатор' с флуоресцентной детекцией в режимепривести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зонг ,iipriDvwir U р -S Г Г эеального времени по каналам, соответствующим флуорофорам оборудования и реагентов. 1. применять набор строго по назначению, согласно даннг инструкции; 13 Амплификэторы должны обслуживаться, калиброваться и использоваться в соответствии с рекомендациями производителя. Использование данного набора 14 --- стр. 9 --- FAM/Green, HEX/Yeiiow, ROX/Orange, Cy5/Rad, Cy5.5/Crimsor например, CFX96 (BioRad, США), «ДТпрайм», «ДТлайт» («ДНК- Технология», Россия), Rotor-Gene Q («Qiagen», Германия), Rotor Gene 3000 или 6000 («Corbett Research», Австралия), QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США). Материалы и реагенты, не входящие в состав изделия: ВНИМАНИЕ! При работе с ДНК необходимо использован только одноразовые стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку «DNase-free». 1. Одноразовые наконечники с аэрозольным барьером до 20( мкл, до 100 мкл, до 20 и до 10 мкл. (например, «Axygen», США). 2. Штативы для наконечников (например, «Axygen», США) i микропробирок на 0,5 (0,2) мл (например, «ИнтерЛабСервис>| Россия). 3. Отдельный халат и одноразовые перчатки. 4. Емкость с крышкой для дезинфицирующего раствора. 5. Одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР: а) на 0,2 мл (плоская крышка, нестрипованные), (наприме[ «Axygen», США) для постановки в ротор на 36 пробирок - дл приборов для ПЦР в реальном времени с детекцией через дн( пробирки (например, «Rotor-Gene»). б) на 0,2 мл (куполообразная крышка) (например, «Axygen> США) - для приборов для ПЦР в реальном времени с детекцис! через крышку (например, «CFX96», «ДТ-Прайм»). 6. ПЦР-планшеты (могут использоваться вместо пpoбиpo^ указанных в пункте 5), 7. Оптически прозрачная пленка для заклеивания планшетов 8. Анализируемые пробы Перед началом работы следует ознакомиться с методическим рекомендациями «Взятие, транспортировка, хранение клиническог в неоткалиброванном приборе может оказать влияние на рабочие характеристики теста. 15 материала для ПЦР-диагностики», разработаг 1ными ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва, 2012 г. Материалом для проведения ПЦР служат пробы геномной ДНК человека из образцов фиксированной в парафине ткани. 8.1 Процедура получения пробы геномной ДНК человека из фиксированной в парафине ткани Для выделения пробы геномной ДНК человека из фиксированной в парафине ткани, необходимой для проведения ПЦР-анализа концентрации и чистоты, рекомендуется использование следующих комплектов реагентов: - Набор реагентов для выделения геномной ДНК человека из фиксированных в формалине и заключенных в парафин тканей (ДНК-Ткань-Ф) по ТУ 21.20.23-009-97638376-2016, производства (ЮО «ТестГен», Россия. Регистрационное удостоверение № РЗН 2018/7772 от 30.10.2018; - Набор реагентов для выделения геномной ДНК человека из фиксированных в формалине и заключенных в парафин тканей "ДНК-Ткань-М" по ТУ 21.20.23-012-97638376-2019, производства ООО «ТестГен», Россия. Регистрационное удостоверение № РЗН 2021/14273 от 06.05.2021 г. или аналогичных, предназначенных для выделения ДНК из фиксированной в формалине и заключенной в парафин ткани и обеспечивающих следующее качество выделенной ДНК - чистота анализируемой ДНК, выраженная в отношении оптических плотностей (А260/280нм), необходимая для проведения исследования, должна составлять не менее 1,4; концентрация ДНК, достаточная для проведения исследования должна составлять 1-100 нг/мкл. Критерии пригодности гистологических препаратов для выделения ДНК для последующего молекулярно-генетического анализа опухолевых клеток • По результатам морфологического исследования опухолевые комплексы должны занимать не менее 60 % площади ткани в срезе с FFPE-блока. 16 --- стр. 10 --- • По результатам морфологического исследования зоны некроза и кровоизлияния в совокупности должны занимать не более \ 5 % площади ткани в срезе с FFPE-блока. В случае, если образец не соответствует хотя бы одному из перечисленных критериев, рекомендуется использовать другой образец. Анализируемый материал не подлежит использованию при нарушении условий хранения и транспортировки (температура, продолжительность, многократное замораживание-оттаивание). При подготовке срезов с парафиновых блоков необходимо минимизировать риск кросс-контаминации образцов, для чего необходимо: • работать в одноразовых неопудренных перчатках; • проводить процедуру в ПЦР-боксе или в ламинарном шкафу; ik • использовать одноразовые лезвия для микротома и г стерильные пинцеты; • первые два среза с каждого блока утилизировать, а для молекулярного исследования использовать срезы начиная с третьего; • не помещать срезы на водяную баню. 8.2 Интерферирующие вещества и ограничения по использованию анализируемого материала Оценка влияния потенциально и^^тepфepиpyюшнx веществ при концентрациях, которые, как ожидается, будут встречаться при нормальном использовании набора реагентов «Tecr-EGFR-ткань- 5», на способность набора реагентов «Тест-ЕСРК-ткань-5» различать мутантные и нормальные варианты гена EGFR, 6i проведена с использованием компонентов набора реагентов для выделения геномной ДНК человека из фиксированных в формалине! и заключенных в парафин тканей (ДНК-Ткань-Ф) по ТУ 21.20.23 | 009-97638376-2017, производства ООО «ТестГен^ образце, в двух концентрациях (максимальной и минимальной), диапазон которых, как ожидается, будет встречаться при нормальном использовании набора реагентов «Tecr-EGFR-ткань- 5». При применении в соответствии с назначением набора реагентов «Tecr-EGFR-TKaHb-5», материалом для проведения ПЦР служат пробы геномной ДНК человека из образцов фиксированной в парафине ткани. Интерферирующие вещества в данном случае могут Гфоисходить от следующих источников: 1. Вещества, добавляемые во время подготовки образца (консерванты, стабилизаторы) — в данном случае парафин, который используется для приготовления FFPE-блоков. р 2. Вещества, встречающиеся в конкретных видах образцов - в данном случае, загрязнение образца ткани гемоглобином крови может ингибировать ПЦР при недостаточной очистке во время выделения. 3. Компоненты набора для выделения ДНК из ткани. (Для выделения пробы геномной ДНК человека из фиксированной в парафине ткани предполагается использование набора реагентов для выделения геномной ДНК человека из фиксированных в формалине и заключенных в парафин тканей.) Потенциально интерферирующие вещества и их концентрации приведены в таблице 5. Таблица 5 - Потенциазгьно интерферирующие вещества и их Для того, чтобы оценить влияние noTCHHHaabHt Гемоглобин, мг интерферирующих веществ было выполнено исследование пyтe^ анализа воздействия каждого вещества на значения Ct ' качественное определение статуса мутаций в анализируемо' 17 1 Интерферирующие Максимальная Минимальная вещества концентрация (мкл / концентрация (мкл / 200 мкл раствора 200 мкл раствора I ДНК) ДНК) Парафин (в ксилоле) 2,00*10-^ 5,00*10-^ 0,19 мг 0,1 мг 18 --- стр. 12 --- 10. Проведение анализа ПЦР-исследование состоит из следующих этапов: A) Подготовка ПЦР; Б) ПЦР-амплификация ДНК и гибридизационно- флуоресцентная детекция продуктов амплификации в режиме «реального времени»; B) интерпретация результатов (подробно описано в главе 11). А) Подготовка ПЦР (производится в ЗОНЕ пре-ПЦР - помещении для раскапывания реагентов и подготовки к ПЦР-амплификации) Общий объем реакции - 20 мкл. ВНИМАНИЕ! Запрещено изменять объем реакции. При изменении объёма чувствительность метода резко снижается!!! Непосредственно перед проведением анализа необходимо приготовить реакционные смеси (мастермиксы) для анализируемой ДНК, ПКО и ОКО. Для этого в отдельных стерильных пробирках смешать все компоненты исходя из того, что для проведения одной реакции необходимо взять 4 мкл ПНР-смеси и 10 мкл Taq- полимеразы. Обязательно использовать отдельный наконечник с аэрозольным барьером для каждого компонента реакции каждой пробы. Готовить мастермиксы необходимо согласно таблице 6. В таблице учтен запас реактивов (+1 объём каждого вида) для компенсации возможных потерь при раскапывании. ВНИМАНИЕ! При работе с Taq-полимеразой отбирайте из пробирки нужный объем, не опуская наконечник глубоко в реагент, чтобы не взять избыточный объем фермента за счет его попадания на внешнюю поверхность наконечника. Таблица 6 - Приготовление мастермиксов (в расчете на количество анализируемых образцов). 1 16 40 56 2 20 50 70 3 24 60 84 4 28 70 98 5 32 80 М2 * 1. Внести по 14 мкл каждого мастермикса в соответствующие пробирки согласно рекомендованному порядку расположения реакций (см. табл. 7). 2. Внести по 6 мкл ОКО в пробирки «ОКО». 3. Внести по 6 мкл ПКО в пробирки «ПКО». 4. Внести по 6 мкл образцов ДНК в пробирки «О». 5. Заклеить ПЦР-планшет/закрыть пробирки, убедиться, что все крышки или пленка прилегают плотно. 6. Открутить ПЦР-планшет/пробирки на центрифуге, чтобы собрать реакционную смесь на дне лунок, сохраняя правильную ориентацию планшета или серии пробирок. Таблица 7 - Рекомендуемый порядок расположения реакций 96-луночнын планшет 4 5 6 7 8 Количество ПЦР-смесь, Taq, Итого, образцов мкл мкл мкл 21 01 - ДНК, выделенная из анализируемого образца №1 и т.д. 22 i / i --- стр. 13 --- Б) ПЦР-амплификация ДНК и гибридиэационно- флуоресцентная детекция продуктов амплификации в режиме «реального времени» (производится в ЗОНЕ ПЦР - помещении для проведения ПЦР-амплификации) 1. Установить пробирки в реакционный модуль прибора для Г1ЦР в «реальном времени». Обратите внимание, что приборы для ПЦР в «реальном времени» должны обслуживаться, калиброваться и использоваться в соответствии с рекомендациями производителя. Использование данного набора в неоткалиброванном приборе может оказать влияние на рабочие характеристики теста. 2. Запрограммировать прибор для выполнения соответствующей программы амплификации и детекции флуоресцентного сигнала согласно описанию для данного прибора (см. табл. 8, 9). Таблица 8 - Программа амплификации для приборов производства «ДНК - Технология» Стадия Температура, Время Всею циклов 1 95 2 мин 1 2 95 5 сек 50 3 V ‘ г 64-„Г 15 сек Таблица 9 - Программа амплификации для других приборов Стадия Температура, ®С Время Всего циклов 1 95 2 мин 1 2 95 5 сек 50 3 62-:];- 15 сек 3. Запустить выполнение программы амплификации с детекцией флуоресцентного сигнала на стадии 3. 4. По окончании выполнения программы приступить к анализу результатов. 23 11. Регистрация и интерпретация результатов Регистрацию результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с детекцией в режиме «реального времени». Анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам: — по каналу FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продуктов амплификации ДНК мутантных вариантов гена EGFR и делений в экзоне 19. - по каналу HEX регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продуктов амплификации ДНК нормальных вариантов гена EGFR (выступает в качестве внутреннего контрольного образца - ВКО). Результаты интерпретируются на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции пороговой линии. Принцип интерпретации результатов в исследуемых образцах и контрольных образцах представлен в табл. 10 и табл. 11 соответственно. Таблица 10 - Интерпретация результатов в исследуемых образцах Пробирки Мутантная ДНК гена EGFR обнаружена Мутантная ДНК гена EGFR не обнаружена Сомнительн ый Невалидный del. L858R Канал FAM: Ct<35 Канал HEX: подъём кривой амплификаци и (любой Ct) или отсутствие подъёма кривой. Канал FAM: отсутствие кривой амплификаци и. Канал HEX: Ct<35 Канал FAM: подъём кривой амплификац ИИ, Ct > 35 Канал HEX: Ct<35 Отсутствие кривой амплификац И И по обоим каналам HEX и FAM f 24 ib --- стр. 14 --- Таблица 11 - Интерпретация результатов в контрольных Пробирки Правильный результат Невалидный результат ПКО Канал FAM и HEX: Ct< 35 Отсутствие подъема кривой амплификации по HEX и/или FAM ОКО Канал FAM и HEX: отсутствие лодъема кривой амплификации Подъем кривой амплификации по каналу 1 FAM и/или HEX (любой Ct) Интерпретация результатов в контрольных образцах Набор считают годным при прохождении реакций «del». «L858R» в пробирках с соответствующим ПКО не позднее 35 цикла (канал ТАМ и HEX: Ct< 35). Интерпретация результатов в исследуемых образцах Интерпретацию результатов для исследуемых образцов проводят только при правильных результатах для ОКО и ПКО данной постановки. Интерпретация производится с помощью программного обеспечения используемого прибора. Пороговая линия устанавливается на уровне перехода кривых в экспоненциальную фазу роста. Мутантная ДНК гена EGFR обнаружена, если кривая амплификации по каналу ТАМ поднимается выше установленной пороговой линии, и при этом Ct<35. По каналу HEX подъём кривой амплификации (любой Ct) или отсутствие подъёма кривой. Мутантная ДНК гена EGFR не обнаружена, если кривая амплификации по каналу ТАМ не поднимается выше установленной пороговой линии, а кривая амплификации по каналу HEX. поднимается выше установленной пороговой линии, Ct< 35 (то cctf проходит ВКО). Результат анализа сомнительный, если кривая амплификации по каналу ТАМ поднимается выше установленной пороговой линии, но при этом Ct>35. Кривая амплификации по каналу HEX поднимается выше установленной пороговой линии и Ct<35. 25 Результат анализа невалидный, если кривые амплификации не поднимаются ни по каналу РАМ, ни по каналу HEX выше установленной пороговой линии. Это свидетельствует о том, что не прошли реакции ни на нормальную ДНК, ни на мутантную. Если для пробы получен невалидный результат, требуется повторить ПЦР-исследование соответствующего исследуемого образца, начиная с повторного выделения ДНК из образца ткани или отвергнуть образец, как непригодный для данного вида анализа. Если получен сомнительный результат, требуется повторить ПЦР-исследование соответствующего образца, начиная с повторного выделения ДНК из образца ткани. Набор непригоден к дальнейшему использованию, если кривые амплификации по каналам РАМ и HEX в пробирках ПКО ниже установленной пороговой линии и этот результат устойчиво воспроизводится. 12. Информация о стабильности медицинского изделия Срок годности набора. 12 месяцев. Срок годности набора после вскрытия. 12 месяцев. 13. Условия хранения, транспортирования и эксплуатации набора Хранение. Набор реагентов «Тест-ЕОТК-ткань-5» в упаковке предприятия-изготовителя должен храниться при температуре от 2 до 8 °С в течение всего срока годности набора. После вскрытия упаковки компоненты набора следует хранить при следующих условиях: - компоненты набора следует хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение всего срока годности набора; - ПЦР-смеси del, L858R следует хранить в защищённом от света месте в течение всего срока годности набора. Набор реагентов, хранившийся с нарушением регламентированного режима, применению не подлежит. Транспортирование. 26 --- стр. 15 --- Транспортировать набор реагентов «Тест-ЕСРК-ткань-5» следует транспортом всех видов в крытых транспортных средствах в соответствии с правилами перевозок, действующими на транспорте данного вида. Набор реагентов транспортировать при температуре от минус 20 до 8°С в течение всего срока годности набора. Допускается транспортировка при комнатной температуре (15-25°С) не более пяти суток. Атмосферное давление не контролируется, т.к. не влияет на качество изделия. Для обеспечения соблюдения условий транспортирования на протяжении всего срока транспортирования набор реагентов помещается в термоконтейнер пенополиуретановый многоразового i использования для временного хранения и транспортирования с ^ подготовленными хладоэлементами. Тип, объём и количество хладоэлементов, закладываемых в термоконтейнер с транспортируемыми наборами реаЕ'ентов, а также объём термоконтейнера подбираются в зависимости от продолжительности и условий транспортирования. Наборы реагентов, транспортированные с нарушением температурного режима, применению не подлежат. Срок годности. Срок годности набора «Тест-ЕОРК-ткань-5>> 12 месяцев со дня приемки ОТК предприятия-изготовителя при соблюдении всех условий транспортирования, хранения и эксплуатации. Набор реагентов с истекшим сроком годности применению не подлежит. Срок годности вскрытых компонентов набора. 12 месяцев при условии хранения при температуре от 2 до 8 °С. Срок годности приготовленных для работы компонентов В соответствии с классификацией медицинских отходов наборы относятся к классу А (эпидемиологически безопасные отходы, приближенные по составу к твёрдым бытовым отходам). Неиспользованные реактивы в соответствии с СанПиНом 2.1 3684 21 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами» собираются в одноразовую маркированную упаковку любого цвета (кроме жёлтого и красного). Оставшиеся после выполнения работ пробирки и материалы утилизируют в соответствии с МУ 287-113 (Методические указания по дезинфекции, предстерилизационной очистке и стерилизации изделий медицинского назначения). Жидкие компоненты (реагенты, реактивы) уничтожаются сливом в канализацию с предварительным разбавлением реагента водопроводной водой 1:100 и вывозом остатка упаковок как производственный или бытовой мусор. Потребительская упаковка набора реагентов «Тест-EGFR- ткань-5» подлежит механическому разрушению с вывозом остатков как производственного или бытового мусора. Персонал, осуществляющий уничтожение набора реагентов, должен соблюдать правила безопасности проведения того или иного способа уничтожения. 15. Гарантийные обязательства, контакты Предприятие-изготовитель гарантирует соответствие набора «TecT-EGFR-TKaHb-5» требованиям технических условий при соблюдении условий транспортирования, хранения и эксплуатации, установленных техническими условиями. Организация-производитель:набора. ! час при соблюдении условий, препятствующих^^^ _ ^ !^|^ИОощество с Ограниченной Ответственностью «Л-сфера» (ООО «Л-сфера»),высыханию компонентов, а биологическим материалом. также контаминации посторонни\1 14. Утилизация Наборы реагентов, пришедшие в непригодность, в том числе в связи с истечением срока годности, подлежат утилизации в соответствии с требованиями СанПиН 2.1 3684 21. 27 432072 г. Ульяновск, Инженерный 44-й проезд, дом 9, помещение 69 Тел.: +7 (903)320-00-84 E-mail: info@l-sfera.com 28 /Т --- стр. 16 --- Наименование, юридический, (фактический) адрес и контактные данные (телефон, факс, электронная почта) уполномоченного предсэавнтеля производителя на территории Российской Федерации: Общество с Ограниченной Ответственностью «ТестГен» (ООО «ТестГен»), 432072 Россия г. Ульяновск, Инженерный 44-й проезд, дом 9, офис 13 Тел.:+7 499 705-03-75 www.testgen.ru Служба технической поддержки: Тел.:+7 927 981 58 81 E-mail: help@testaen.ru Наименование и контактные данные (телефон, факс, электронная почта) организации, принимающей, претензии (предложения) по медицинскому изделию для диагностики in vitro от потребителей на территории Российской Федерации: Общество с Ограниченной Ответственностью «ТестГен» (ООО «ТестГен»), 432072 Россия г. Ульяновск, Инженерный 44-й проезд, дом 9, офис 13 Тел.; +7 499 705-03-75 www.testgen.ru Служба технической поддержки: Тел.:+7 927 981 58 81 E-mail: help@testgen.ru 29 При.юженне А Перечень применяемых национальных стандартов ГОСТ ISO 14971-2011 Изделия медицинские. Применение менеджмента риска к медицинским изделиям. ГОСТ Р 15.309-98 Система разработки и постановки продукции на производство. Испытания и приёмка выпускаемой продукции. Основные положения. ГОСТ Р 51088-2013 Медицинские изделия для диагностики ин витро. Реагенты, наборы реагентов, тест-системы, контрольные материалы, питательные среды. Требования к изделиям и поддерживающей документации. ГОСТ Р 51352-2013 Медицинские изделия для диагностики ин витро. Методы испытаний. ГОСТ Р ЕН 13612-2010 «Оценка функциональных характеристик медицинских изделий для диагностики in vitro»; ГОСТ Р 56894-2016 «Сводный комплект технической документации для демонстрации соответствия общим принципам обеспечения безопасности и основных функциональных характеристик медицинских изделий для диагностики in vitro»; ГОСТ Р ИСО 18113-1-2015 Медицинские изделия для диагностики in vitro. Информация, предоставляемая изготовителем (маркировка). Часть 1. Термины, определения и общие требования. ГОСТ Р ИСО I81I3-2-20I5 Медицинские изделия для диагностики in vitro. Информация, предоставляемая изготовителем (маркировка). Часть 2. Реагенты для диагностики in vitro для профессионального применения. ГОСТ Р ИСО 23640-2015 Изделия медицинские для диагностики in vitro. Оценка стабильности реа 1ентов для диагностики in vitro. ГОСТ Р ИСО 15223-1-2014 Изделия медицинские. Символы, рименяемые при маркировании на медицинских изделиях, этикетках и в сопроводительной документации. Ч.Г Основные требования. ГОСТ ISO 13485-2017 «Изделия медицинские. Системы менеджмента качества. Требования для целей регулирования». 30 Уй --- стр. 17 --- Примечание - Указанные выше стандарты были действующими на момент утверждения инструкции по применению. В дальнейшем, при пользовании документом, целесообразно проверить действие ссылочных нормативных документов на текущий момент. Если ссылочный документ заменён или изменён, то при применении настоящего документа следует пользоваться заменённым (изменённым) документом. 31