Набор реагентов для определения статуса мутаций гена KRAS методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени в пробе геномной ДНК человека из образцов фиксированной в парафине ткани (Тест-KRAS-ткань-5) по ТУ 21.20.23-001-25226389-2020 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 --- УТВЕРЖДАЮ Генеральный директор ООО «Л-сфера» Р.Р. Халилов «12» января 2022 г. И Н СТРУКЦ И Я Набор реагентов для определения статуса мутаций гена K R A S методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени в пробе геномной ДНК человека из образцов фиксированной в парафине ткани (Тест-ККА8-ткань-5) по ТУ 21.20.23-001-25226389-2020 --- стр. 2 --- Содержание Введение....................................................................................................4 1. Назначение.............................................................................................6 2. Принцип метода....................................................................................8 3. Состав набора реагентов ...................................................................10 4. Характеристики набора реагентов...................................................12 5. Перечень рисков, связанных с применением набора реагентов «Тест-КЯА8-ткань-5».............................................................................18 6. РПеры предосторожности при работе с набором............................18 07. Оборудование и материалы, необходимые при работе с набором .....................................................................................................20 8. Анализируемые пробы......................................................................22 9. Подготовка компонентов набора для исследования ....................26 10. Проведение анализа .........................................................................27 11. Регистрация и интерпретация результатов .................................31 12. Информация о стабильности медицинского изделия .................33 13. Условия хранения, транспортирования........................................33 и эксплуатации набора ..........................................................................33 14. Утилизация........................................................................................35 15. Гарантийные обязательства, контакты.........................................35 Ф (О --- стр. 3 --- Введение Целевой аналит - ген KRAS, исследуемый при диагностике пациентов с диагнозом «метастатический рак прямой кишки» при проведении молекулярно-генетического исследования для качественного определения статуса шести мутаций двенадцатого кодона (Glyl2Asp, Glyl2Ala, Glyl2Arg, Glyl2Val, Glyl2Ser, Glyl2Cys) и одной мутации тринадцатого кодона (Glyl3Asp) гена KRAS. Материалом для проведения исследования служат пробы геномной ДНК человека из образцов фиксированной в парафине ткани. Научная обоснованность. В соответствии с из Клиническими рекомендациями «Рак прямой кишки» С 20. Взрослые. 2020': «Рекомендуется пациентам с метастатическим раком прямой кишки выполнять молекулярно-генетическое исследование мутаций в гене KRAS, NRAS, BRAF и определение микросателлитных повторов ДНК в биопсийном (операционном) материале методом ПЦР, если диагностированы отдаленные метастазы, что может повлиять на выбор таргетного агента в лечении .метастатического процесса». В состав семейства белков Ras входят H-Ras, K-Ras, N-Ras, R- Ras и другие гомологичные белки. Каскадная последовательность реакций сигнального пути Ras действует как включатель, определяющий регуляцию генной экспрессии, требующуюся для решения клетки делиться или дифференцироваться. Постоянная активация Ras ведет к злокачественному перерождению клеток. ^ Характерный механизм перерождения - точечные активирующие w мутации. Наиболее известными онкогенными мутациями являются мутации в генах KRAS и NRAS в 12, 13 кодонах (2 экзон), 59, 61 кодонах (3 экзон), 117, 146 кодонах (4 экзон). Мутации KRAS, NRAS приводят к постоянной активации белка и передаче митотического сигнала независи.мо от стимуляции и медикаментозного ингибирования EGFR, поэтому у больных с мутированным геном KRAS терапия ингибиторами EGFR и тирозинкиназ неэффективна^. Мутации KRAS обнаружены у 30-40% больных метастатическим КРР^ В настоящее время для лечения метастатического КРР при.меняют таргетные препараты на основе моноклональных Щ антител - ингибиторы EGFR цетуксимаб (cetuximab) и панитумумаб (panitumumab). Связывание антител с EGFR приводит к угнетению инвазии опухолевых клеток в нормальные ткани, препятствуя распространению опухоли в другие органы. У пациентов с диким типом гена KRAS анти-EGFR препараты достоверно увеличивают медиану выживаемости''. Мутации гена KRAS определяют агрессивное поведение опухоли: КРР развивается в кратчайшие сроки, быстро метастазирует и плохо поддается химиотерапии. Поэтому было рекомендовано определять мутации в гене KRAS у всех больных метастатическим КРР для решения вопроса об анти- EGFR терапии. Область при.менения набора реагентов - клиническая лабораторная диагностика, онкология. Показания и противопоказания к применению Показания к применению: набор реагентов «Тест-KRAS- ткань-5» рекомендуется к применению при диагностике пациентов с диагнозом «метастатический рак прямой кишки» при проведении ^ Клиническими рекомендациями: «Рак прямой кишки» С 20. Взрослые. 2020 (Разработчики: Общероссийский национальный союз «Ассоциация онкологов России», Общероссийская общественная организация «Российское общество клинической онкологии», Общероссийская общественная организация «Российское общество специалистов по колоректальному раку», Общероссийская общественная организация «Ассоциация колопроктологов России» (Одобрено на заседании научного совета Министерства здравоохранения Российской Федерации 22.11.2019 г). ^ Молекулярно-генетические исследования в практике онкологической клиники / Н.Е. Торопова [и др.] // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2015. - Т. 17, № 2 (3). - С. 690-696. ^ Имянитов Е.Н. Стандартные и потенциальные маркеры при опухолях желудочно-кищечного тракта/ Е.Н. Имянитов // Практическая онкология. - 2012. -Т. 13, №4. - С. 219-228. Владимирова Л.Ю., Геворкян Ю.А., Абрамова Н.А., Солдаткина Н.В. Оценка эффективности и токсичности моноклонального антитела к EGER панитумумаба при колоректальном раке // Мат. VII съезд онкологов и радиологов стран СНГ. - Астана, 2012. - С. 189. S --- стр. 6 --- Набор реагентов «Тест-КЯА8-ткань-5» не может использоваться для диагностики какой-либо патологии. Набор реагентов «Тест-КЯА8-ткань-5» предназначен только для качественного определения статуса шести мутаций двенадцатого кодона (GIyl2Asp, Glyl2Ala, Glyl2Arg, Glyl2Val, Glyl28er, Glyl2Cys) и одной мутации тринадцатого кодона (GlylSAsp) гена KRAS. Общее вре.мя проведения анализа составляет 2-2,5 ч. 3. Состав набора реагентов Набор реагентов выпускается в 1 форме комплектации - «Тест-ККА8-ткань-5». Каждый набор «Тест-ККА8-ткань-5» содержит реагенты, рассчитанные на проведение 5 определений. Состав набора Набор реагентов «Тест-ККА8-ткань-5» включает: Таблица 1 - Состав набора реагентов «Тест-ККА8-ткань-5» 1 ПЦР-смесь GlylSAsp Прозрачная бесцветная жидкость, может иметь оттенок розового цвета 1 пробирка (60 мкл) 8 ПКО Прозрачная бесцветная жидкость 1 пробирка (210 мкл) 9 ОКО Прозрачная бесцветная жидкость 1 пробирка (210 мют) 10 Taq- полимераза Прозрачная бесцветная жидкость 1 пробирка (1050 мкл) № пп Название реагента Описание Количество пробирок, объём, мкл 1 ПЦР-смесь Glyl2Ser Прозрачная бесцветная жидкость, может иметь оттенок розового цвета 1 пробирка (60 мкл) 2 ПЦР-смесь Glyl2Arg Прозрачная бесцветная жидкость, может иметь оттенок розового цвета 1 пробирка (60 мкл) 3 ПЦР-смесь Glyl2Cys Прозрачная бесцветная жидкость, может иметь оттенок розового цвета 1 пробирка (60 мкл) 4 ЦЦР-смесь Glyl2Asp Прозрачная бесцветная жидкость, может иметь оттенок розового цвета 1 пробирка (60 мкл) 5 ЦЦР-смесь Glyl2Ala Прозрачная бесцветная жидкость, может иметь оттенок розового цвета 1 пробирка (60 мкл) 6 ПЦР-смесь Glyl2Val Прозрачная бесцветная жидкость, может иметь оттенок розового цвета 1 пробирка (60 мкл) Положительный контрольный образец (ПКО) готов к ^ использованию и представляет собой смесь геномной ДНК из ^ культуры клеток человека линии Jurkat в концентрации 400 копий гена KRAS в 1 мкл и искусственно синтезированной вставки размером 300 п.н., содержащей эквимолярную смесь мутаций двенадцатого кодона (Glyl2Asp, Glyl2Ala, Glyl2Arg, Glyl2Val, Glyl28er, Glyl2Cys) и одной мутации тринадцатого кодона (Glyl3Asp) гена KRAS, в плазмидный вектор pAL-TA с концентрацией 20 копий плазмидной ДНК в 1 мкл. Содержит 5% мутантных и 95% нормальных копий ДНК. В качестве ОКО используют воду деионизованную. Все ПЦР-смеси содержат праймеры и зонды к внутреннему контрольному образцу (ВКО). Зонды к ВКО помечены HEX (см. раздел 11 «Регистрация и интерпретация результатов»). Это контроль эффективности экстракции ДНК и возможного наличия ингибиторов в пробе, присутствие которых может привести к ложноотрицательным результатам. В составе набора отсутствуют лекарственные средства для медицинского применения, вещества человеческого или животного происхождения. f --- стр. 7 --- 4. Характеристики набора реагентов 4.1 Технические и функциональные характеристики Таблица 2 - Технические и функциональные характеристики Наименование показателя Характеристики и нормы 1. Технические характеристики I.I Внешний вид ПЦР-смесь GIyI2Ser Прозрачная бесцветная жидкость, может иметь оттенок розового цвета ПЦР-смесь GlyI2Arg Прозрачная бесцветная жидкость, может иметь оттенок розового цвета ПЦР-смесь GIyl2Cys Прозрачная бесцветная жидкость, может иметь оттенок розового цвета ПЦР-смесь GIyl2Asp Прозрачная бесцветная жидкость, может иметь оттенок розового цвета ПЦР-смесь GIyl2Ala Прозрачная бесцветная жидкость, может иметь оттенок розового цвета ПЦР-смесь GlyI2Val Прозрачная бесцветная жидкость, может иметь оттенок розового цвета ПЦР-смесь Glyl3Asp Прозрачная бесцветная жидкость, может иметь оттенок розового цвета ПКО Прозрачная бесцветная жидкость ОКО Прозрачная бесцветная жидкость Taq-полимераза Прозрачная бесцветная жидкость 1.2. Комплектность В соответствии с п. 1.4 ТУ 21.20.23- 001-25226389-2020 1.3. Маркировка В соответствии с п. 4 ТУ 21.20.23- 001-25226389-2020 1.4. Упаковка В соответствии с п. 5 ТУ 21.20.23- 001-25226389-2020 2. Функциональные характеристики ^13аи.менование показателя Характеристики и нормы Положительный результат с ПКО Регистрация роста сигнала флуоресценции с Ct< 35 в реакциях Glyl2Asp, GlyI2Ala, GIyI2Arg, GlyI2VaI, Glyl2Ser, GIyI2Cys, GlyI3Asp c ПКО no каналам FAM и HEX Отрицательный результат с ОКО Отсутствие роста сигнала флуоресценции в реакциях GIyl2Asp, GlyI2Ala, GIyI2Arg, GlyI2VaI, Glyl2Ser, GIyI2Cys, GIyI3Asp c OKO no каналам FAM и HEX 4.2 Характеристики аналитической эффективности 4.2.1 Аналитическая специфичность Специфичен по отношению к шести мутациям двенадцатого кодона (Glyl2Asp, Glyl2Ala, Glyl2Arg, Glyl2Val, Glyl2Ser, Glyl2Cys) и одной мутации тринадцатого кодона (GlylSAsp) гена KRAS Список определяемых мутаций с указанием ID мутации представлен в таблице 3. Таблица 3 - Список определяемых мутаций с указанием ID мутации Набор мутаций, определяемых с помощью «Тест- ККА8-ткань-5» Изменения в нуклеотидах Изменения в аминокислотах COSMIC ID* GIyI2Asp c.35G>A P.GI2D 521 • GIyl2AIa c.35G>C P.GI2A 522 GlyI2Arg c.34G>C P.GI2R 518 Glyl2Val c.35G>T P.G12V 520 GIyl2Ser c.34G>A P.GI2S 517 GlyI2Cys c.34G>T P.GI2C 516 --- стр. 8 --- Набор .мутаций, определяемых с помощью «Тест- KRAS-TKaHb-5» Изменения в нуклеотидах Изменения в аминокислотах COSMIC ID* Glyl3Asp c.38G>A P.G13D 532 заболеваниях COSMIC (Catalog of Somatic Mutations in Cancer). согласно* идентификационный номер мутации международной базе соматических мутаций при раковых 4.2.2 Аналитическая чувствительность 10 копий гена KRAS в 1 мкл раствора ДНК 4.2.3 Прецизионность в условиях повторяемости Для оценки прецизионности в условиях повторяемости были проведены последовательные исследования следуюгцих образцов: - СОП-ПКО-N, представляющий собой смесь плазмидных ДНК с синтетическими вставками амплифицируемых фрагментов ДНК- нормальные варианты гена KRAS, заключённых в плазмидный вектор pAl-TA с концентрацией 10 000 коп в 1 мкл ТЕ буфера. (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА), производства ООО «Л-сфера». Содержит 100% нормальных копий ДНК (образец «дикого типа»). - СОП-ПКО-М, представляющий собой смесь плазмидных ДНК с синтетическими вставками амплифицируемых фрагментов ДНК - специфический фрагменты с гомозиготны.м содержанием шести мутаций двенадцатого кодона (Glyl2Asp, Glyl2Ala, Glyl2Arg, Glyl2Val, Glyl2Ser, Glyl2Cys) и одной .мутации тринадцатого кодона (Glyl3Asp) гена KRAS, заключенных в плазмидный вектор рА1-ТА с концентрацией 10 000 коп плазмидной ДНК в 1 мкл в ТЕ буфере (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА), производства ООО «Л-сфера». Содержит 100% мутантных копий ДНК. Для оценки прецизионности в условиях повторяемости контрольные образцы были исследованы в 10 повторах. Данные по повторяемости получают внутри лаборатории для конкретного оборудования и внутри конкретной партии набора реагентов. Для оценки прецизионности в условиях повторяемости рассчитывают среднее арифметическое выборки, дисперсию. среднеквадратическое отклонение и коэффициент вариации по полученным значениям в повторах контрольных образцов. Результаты исследования показали, что коэффициент вариации в условиях повторяемости набора составляет; 1) для мутантных вариантов гена KRAS не более 3%; 2) для нормальных вариантов гена KRAS не более 3%. 4.2.4. Прецизионность в условиях воспроизводимости Оценку воспроизводи.мости тест-системы проводят аналогично расчёту прецизионности в условиях повторяемости, однако для тестирования используют различные партии набора реагентов, реакции ставят в разных лабораториях, разные операторы, в разные дни, на разных ПЦР-амплификаторах (Блок воспроизводимости 1, Блок воспроизводимости 2, Блок воспроизводимости 3, Блок воспроизводимости 4). Результаты исследования показали, что коэффициент вариации в условиях воспроизводимости набора составляет: 1) для мутантных вариантов гена KRAS не более 3%; 2) для нормальных вариантов гена KRAS не более 3%. 4.2.5 Минимальное содержание опухоли для проведения анализа - 20 % по результатам морфологического исследования опухолевого материала врачом-гистологом 4.2.6 Предел обнаружения (LoD), как наименьшая частота заявленных аллелей в образце в гене KRAS, которое способно выявить изделие - 5 % 4.2.7 Подтверждена специфичность изделия в отношении микрофлоры ободочной и прямой кишки в максимальной концентрации патогена. При исследовании ДНК штаммов: - из коллекции «ЕКПМ-ОБОЛЕНСК»: Escherichia соИ М- 17(номер штамма В-2929), Shigella sonnei «S-форма» (номер штамма В-4385), Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium 79 (номер штамма В-4376), Shigellaflexneri la 8516 (номер штамма В-4388), Candida albicans NCTC 885-653 (номер штамма В-7940), ~ из коллекции Национального биоресурсного центра «Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ)»: Enterococcus faecium (Streptococcus faecium) (номер штамма В-4954), Lactococcus lactis subsp. lactis (номер 15 / --- стр. 9 --- штамма В-8837), Salmonella typhimurium ТА 102 (номер штамма В-5393). в концентрации от 10*^ до Ю'^ клеток на мл неспецифических реакций выявлено не было. Данные микроорганизмы не оказывают влияние на способность набора реагентов «Тест-ККА8-ткань-5» различать мутантные и нормальные варианты гена KRAS. 4.2.8. Проведено тестирование изделия на гомологичных генах KRAS - NRAS, HRAS. Набор реагентов «Тест-ККА8-ткань-5» не дает перекрестных реакций с гомологичными генами KRAS - NRAS, HRAS 4.2.9 Минимальное количество ДНК, которое необходимо для проведения анализа - 210 иг (30 иг ДНК на реакцию). Набор рекомендован для работы с образцами ДНК с концентрацией не менее 5 нг/мкл. Дополнительно рекомендуется для оценки степени чистоты выделенного образца ДНК из парафиновых блоков использовать значение соотношения оптических плотностей раствора выделенной ДНК на длинах волн 260 нм и 280 нм (А260/280). Рекомендуемое значение соотношения ^ не менее 1.6 — 1.8. Проверку чистоты выделения нуклеиновых кислот, выраженную в отношении оптических плотностей раствора выделенной ДНК (А260/280нм), и концентрации выделенной ДНК рекомендуется проводить с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000с (производства Thermo Scientific, США) с диапазоном излучения 220-350 нм. Спектрофотометр Nanodrop 2000с (производства Thermo Scientific, США) внесён в Государственный реестр средств измерений, имеет Свидетельство об утверждении средств измерений US.С.31.004.А №53590. 4.2.10. Информация об интерферирующих веществах указана в разделе «8.2 Интерферирующие вещества и ограничения по использованию анализируемого материала». 4.3. Характеристики клинической эффективности В ходе проведения клинических испытаний было отобрано 36 образцов фиксированной в парафине ткани (FFPE-блок), от пациентов с диагнозом «метастатический рак прямой кишки»^ с подтвержденным положительным статусом исследуемых мутаций в гене KRAS. Каждый образец был протестирован в двух сериях с помощью исследуемого набора реагентов «Тест-ККА8-ткань-5», производства ООО «Л-сфера». Для проведения ПЦР-исследования были использованы амплификаторы, рекомендуемые производителем исследуемого набора реагентов: - Амплификатор детектирующий ДТпрайм (ООО «НПО ДНК- Технология», Россия); - Амплификатор CFX 96 («Bio-Rad», США); - Амплификатор Rotor-Gene Q («Qiagen», Германия); - Амплификатор QuantStudio 5 («Thermo Fisher Scientific», США). Воспроизводимость результатов 100%. Результаты изучения диагностических характеристик исследуемого медицинского изделия по отношению к каждой выявляемой мутации в гене KRAS приведены в таблице 4. Таблица 4 Кодон Мутация Количество наблюдений с положи тельными пробами Количество наблюдений с отрица тельными пробами Диагности ческая чувстви тельность с доверительной вероятностью 95 % Диагности ческая специфич-ность с доверительной вероятностью 95 % 12 кодон Glyl2Asp 20 52 100% (95% ДИ: 83Д6%-100%) 100%(95% ДИ: 93,15%-100%) Glyl2Ala 6 66 100% (95% ДИ: 54,07%-100%) 100% (95% ДИ: 94,56%-100%) Glyl2Arg 4 68 100% (95% ДИ: 39,76%-100%) 100% (95% ДИ: 94,72%-100%) Giyl2Val 16 56 100% (95% ДИ: 79,41%-100%) 100% (95% ДИ: 93,62%-100%) Glyl2Ser 6 66 100% (95% ДИ: 54,07%-100%) 100% (95% ДИ: 94,56%-100%) Glyl2Cys 4 68 100% (95% ДИ: 39,76%-100%) 100% (95% ДИ: 94,72%-100%) 13 кодон Glyl3Asp 16 56 100% (95% ДИ: 79,41%-100%) 100% (95% ДИ: 93,62%-100%) --- стр. 10 --- 5. Перечень рисков, связанных с применением набора реагентов «Тест-КПА8-ткань-5» В пограничную зону риска вошли опасности: 1. потеря функциональных свойств реагентов, входящих в набор, из-за транспортирования, хранения или эксплуатации в несоответствующих условиях; 2. контаминация реакционных смесей с образцами исследуемой ДНК содержимым из пробирки ПКО или продуктами ПЦР; 3. проведение анализа с использованием пробы ДНК низкого качества (низкая концентрация и/или плохая очистка); 4. невыполнение требований по пробоподготовке, проведению анализов и утилизации вследствие работы с набором неквалифицированным персоналом; 5. использование непригодного для применения набора (использование по истечению срока годности или при нарушении упаковки). В области недопустимой зоны риски не выявлены. Совокупный остаточный риск применения медицинского изделия «Набор реагентов для определения статуса мутаций гена методом ПЦР-РВ в пробе геномной ДНК человека из образцов фиксированной в парафине ткани (Тест-ККА8-ткань-5) по ТУ 21.20.23-001-25226389-2020», производства ООО «Л-Сфера» является допустимым, польза от его применения превышает риск. 6. Меры предосторожности при работе с набором Класс в зависимости от потенциального риска применения - 26 в соответствии с номенклатурной классификацией медицинских изделий, утверждаемой приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 06.06.2012 N 4н. Все составные части и реагенты, входящие в состав набора реагентов «Тест-ККА8-ткань-5», относятся к 4 классу опасности (вещества малоопасные) в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 «ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности». Меры предосторожности против любых специальных, несвойственных экологических рисков при использовании или реализации изделия не предусмотрены. « Реагенты, входящие в набор «Тест-ККА8-ткань-5», обладают низкой упругостью пара, и исключают возможность ингаляционного отравления. Реагенты, входящие в набор «Тест-ККА8-ткань-5» не токсичны, поскольку готовятся путём смешивания отдельных нетоксичных компонентов. Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно-биологические (ПЦР) исследования клинического материала с соблюдением санитарно-эпидемических правил правил СанПиН 2.1.3684-21 от 28.01.2021 "Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению населения, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно противоэпидемических (профилактических) мероприятий". Следовать рекомендациям, изложенным в МУ 287-113, МУ 1.3.2569-09. При работе всегда следует выполнять следующие требования: - Удалять неиспользованные реактивы в соответствии с СанПиН 2.1.3684-21 от 28.01.2021 "Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению населения, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно противоэпидемических (профилактических) мероприятий. ВНИМАНИЕ! При удалении отходов после амплификации (пробирок, содержащих продукты ПЦР) недопустимо открывание пробирок и разбрызгивание содержимого, поскольку это может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны, оборудования и реагентов. 1. применять набор строго по назначению, согласно данной инструкции; 2. допускать к работе с набором только специально обученный персонал (специалист с высшим медицинским или биологическим образованием, прошедший обучение на 19 /Р --- стр. 11 --- лицензированных курсах специализации по работе с ПБА III- IV групп патогенности и по ПЦР-диагностике, а также со средним специальным медицинским образованием); 3. не использовать набор по истечении срока годности; 4. избегать контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой. При контакте немедленно промыть поражённое место водой и обратиться за медицинской помощью. При контакте немедленно промыть пораженное место водой и обратиться за медицинской помощью. Необходимых мер предосторожности в отношении влияния магнитных полей, внешних электрических воздействий, ^ электростатических разрядов, давления или перепадов давления, перегрузки, источников взрыва или возгорания не предусмотрено. В составе набора отеутствуют вещеетва человеческого или животного происхождения, обладающие потенциальной инфекционной природой, поэтому меры предоеторожности против любых епециальных, несвойственных рисков при использовании или реализации изделия не предуемотрены. 7. Оборудование и .материалы, необходимые при работе с набором Оборудование: 1. ПЦР-бокс (типа «БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», «Ламинарные еистемы», Россия). 2. Вортекс (типа «ТЭТА-2», «Биоком», Россия). 3. Набор электронных или автоматических дозаторов переменного объема (типа «Eppendorf», Германия). 4. Холодильник от 2 до 8°С с морозильной камерой не выше .минус 16 °С. 5. Амплификатор^ с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени по каналам, соответствующим флуорофора.м ^ Амплификаторы должны обслуживаться, калиброваться и использоваться в соответствии с рекомендациями производителя. Использование данного набора в неоткалиброванном приборе может оказать влияние на рабочие характеристики теста. рдМ/Green, HEX/Yeliow, ROX/Orange, Cy5/Rad, Cy5.5/Crimson: CFX96 (BioRad, США), «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия), Rotor-Gene Q («Qiagen», Германия), QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США). 6. Спектрофотометр NanoDrop 2000c (производства Thermo Scientific, США) c диапазоном излучения 220-350 нм. Внесён в Государственный реестр средств измерений, имеет Свидетельство об утверждении средств измерений US.C.31.004.A №53590. Материалы и реагенты, не входящие в состав изделия: ВНИМАНИЕ! При работе с ДНК необходимо использовать только одноразовые стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку «DNase-free». 1. Одноразовые наконечники с аэрозольным барьером до 200 мкл, до 100 мкл, до 20 и до 10 мкл. (например, «Axygen», США). 2. Штативы для наконечников (например, «Axygen», США) и микропробирок на 0,5 (0,2) мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия). 3. Отдельный халат и одноразовые перчатки. 4. Емкость с крышкой для дезинфицирующего раствора. 5. Одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР: а) на 0,2 мл (плоская крышка, нестрипованные), (например «Axygen», США) для постановки в ротор на 36 пробирок - для приборов для ПЦР в реальном времени с детекцией через дно пробирки (например, «Rotor-Gene»). б) на 0,2 мл (куполообразная крышка) (например, «Axygen», США) - для приборов для ПЦР в реальном времени с детекцией через крышку (например, «CFX96», «ДТ-Прайм»). 6. ПЦР-планшеты (могут использоваться вместо пробирок, указанных в пункте 5). 7. Оптически прозрачная пленка для заклеивания планшетов. 8. Для выделения пробы геномной ДНК человека из фиксированной в парафине ткани, необходимой для проведения ПЦР-анализа концентрации и чистоты, рекомендуется использование следующих комплектов реагентов: - Набор реагентов для выделения геномной ДНК человека из фиксированных в формалине и заключенных в парафин тканей / / --- стр. 12 --- (ДНК-Ткань-Ф) по ТУ 21.20.23-009-97638376-2016, производства ООО «ТестГен», Россия. Регистрационное удостоверение № РЗН 2018/7772 от 30.10.2018; - Набор реагентов для выделения геномной ДНК человека из фиксированных в формалине и заключенных в парафин тканей "ДНК-Ткань-М" по ТУ 21.20.23-012-97638376-2019, производства ООО «ТестГен», Россия. Регистрационное удостоверение № РЗН 2021/14273 от 06.05.2021 г.» 8. Анализируемые пробы Перед началом работы следует ознакомиться с методическими ф рекомендация.ми «Взятие, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики», разработанными ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва, 2012 г. Материалом для проведения ПЦР служат пробы геномной ДНК человека из образцов фиксированной в парафине ткани. 8.1 Процедура получения пробы геномной ДНК человека из фиксированной в парафине ткани Для выделения пробы геномной ДНК человека из фиксированной в парафине ткани, необходимой для проведения ПЦР-анализа концентрации и чистоты, рекомендуется использование следующих комплектов реагентов: - Набор реагентов для выделения геномной ДНК человека из фиксированных в формалине и заключенных в парафин тканей (ДНК-Ткань-Ф) по ТУ 21.20.23-009-97638376-2016, производства ООО «ТестГен», Россия. Регистрационное удостоверение № РЗН 2018/7772 от 30.10.2018; - Набор реагентов для выделения геномной ДНК человека из фиксированных в формалине и заключенных в парафин тканей "ДНК-Ткань-М" по ТУ 21.20.23-012-97638376-2019, производства ООО «ТестГен», Россия. Регистрационное удостоверение № РЗН 2021/14273 от 06.05.2021 г. Набор рекомендован для работы с образцами ДНК с концентрацией не менее 5 нг/мкл. Минимальная валидированная концентрация ДНК - 5 нг/мкл. Дополнительно реко.мендуется для оценки степени чистоты выделенного образца ДНК из парафиновых блоков использовать значение соотношения оптических плотностей раствора выделенной ДНК на длинах волн 260 нм и 280 нм (А260/280). Рекомендуемое значение соотношения - не менее 1.6-1.8. Проверку чистоты выделения нуклеиновых кислот, выраженную в отношении оптических плотностей раствора выделенной ДНК (А260/280нм), и концентрации выделенной ДНК рекомендуется проводить с по.мощью спектрофотометра NanoDrop 2000с (производства Thermo Scientific, США) с диапазоном излучения 220-350 нм. Спектрофотометр Nanodrop 2000с (производства Thermo Scientific, США) внесён в Государственный реестр средств измерений, имеет Свидетельство об утверждении средств измерений US.C.31.004.А №53590. Критерии пригодности гистологических препаратов для выделения ДНК для последующего молекулярно-генетического анализа опухолевых клеток • По результатам морфологического исследования опухолевые комплексы должны занимать не менее 60 % плошади ткани в срезе с FFPE-блока. • По результатам морфологического исследования зоны некроза и кровоизлияния в совокупности должны занимать не более 15 % площади ткани в срезе с FFPE-блока. В случае, если образец не соответствует хотя бы одному из перечисленных критериев, рекомендуется использовать другой образец. Анализируемый материал не подлежит использованию при нарушении условий хранения и транспортировки (температура, продолжительность, многократное замораживание-оттаивание). При подготовке срезов с парафиновых блоков необходимо минимизировать риск кросс-контаминации образцов, для чего необходимо: • работать в одноразовых неопудренных перчатках; • проводить процедуру в ПЦР-боксе или в ламинарном шкафу; • использовать одноразовые лезвия для микротома и стерильные пинцеты; /Л --- стр. 13 --- • первые два среза с каждого блока утилизировать, а для молекулярного исследования использовать срезы начиная с третьего; • не помещать срезы на водяную баню. 8.2 Интерферирующие вещества и ограничения по использованию анализируемого материала Влияние потенциально интерферирующих веществ на работу набора реагентов «Тест-ККА8-ткань-5» было проверено в отнощении потенциально интерферирующих веществ, которые могут происходить от следующих внещних и внутренних источников: 1) вещества, используемые при лечении пациента (например, лекарственные средства); 2) вещества, встречающиеся в конкретных видах образцов - в данном случае, загрязнение образца ткани гемоглобином крови может ингибировать ПЦР при недостаточной очистке при проведении процедуры выделения ДНК. Исследуемые концентрации интерферирующих веществ, которые, как ожидается, будут встречаться при нормальном использовании набора реагентов «Тест-ККА8-ткань-5», приведены в таблице 5. Интерферирующие вещества Максимальная концентрация Эндогенные интерферирующие вещества Гемоглобин 2 мг/мл Экзогенные интерферирующие вещества Препараты, назначаемые для лечения онкологических заболеваний Ропивакаин (обезболивающее средство) 0,004 мг/мл Бевацизумаб (применяется для терапии колоректального рака) 0,02 мг/мл Капецитабин (препарат для лечения колоректального рака) 0,1 мг/мл Цисплатин (противоопухолевое средство) 0,002 мг/мл На основании результатов исследования данные вещества не оказывают интерферирующего воздействия на работу набора и не приводят к ингибированию ПЦР при концентрациях, не превыщающих допустимые. Для снижения количества ингибиторов ПЦР необходимо соблюдать правила взятия клинического материала. В дополнение к исследованию интерферирующих веществ было оценено влияние некротической ткани в образцах опухолей на способность набора реагентов «Тест-ККА8-ткань-5» выдавать достоверные результаты. Исследование влияние некроза было проведено на 9 образцах, которые имели некроз на уровне> 50%, как определено в обзоре патологии. После проведения анализа с помощью набора реагентов «Тест-ККА8-ткань-5» и интерпретации результатов, полученные данные, сравнивались с результатами двунаправленного секвенирования данных образцов по Сэнгеру. В ходе проведения исследования был выявлен 1 ложноотрицательный результат, что может быть связано с недостаточным количеством ДНК. Ограничения по использованию анализируемого материала: - анализируемый материал не подлежит использованию при нарушении условий хранения и транспортировки (температура, продолжительность, многократное замораживание-оттаивание). Анализируемая ДНК должна храниться при температуре от 2 до 8 °С и использоваться для анализа в течение 24 часов. Для хранения более 24 часов раствор ДНК рекомендуется хранить при температуре минус 20 °С. - не допускается использование образцов, загрязнённых посторонним биологическим материалом. - минимальное содержание опухоли в образце для проведения теста - 20% по результатам морфологического исследования опухолевого материала врачом-гистологом. - минимальное количество ДНК, которое необходимо для проведения анализа - 210 нг (30 нг ДНК на реакцию). Чистота анализируемой ДНК, выраженная в отнощении оптических Плотностей (А260/280нм), необходимая для проведения Исследования, должна составлять не менее 1,6-1,8. Концентрация 25 --- стр. 15 --- Количество образцов ПЦР-смесь, мкл Taq, мкл Итого, мкл 3 24 60 84 4 28 70 98 5 32 80 112 Таблица 7 - Рекомендуемый порядок расположения реакций 1. Внести по 14 мкл каждого мастермикса в соответствующие пробирки согласно рекомендованному порядку расположения реакций (см. табл. 7). 2. Внести по 6 мкл ОКО в пробирки «ОКО». 3. Внести по 6 мкл ПКО в пробирки «ПКО». 4. Внести по 6 мкл образцов ДНК в пробирки «О». 5. Заклеить ПЦР-планшет/закрыть пробирки, убедиться, что все крышки или пленка прилегают плотно. 6. Открутить ПЦР-планшет/пробирки на центрифуге, чтобы собрать реакционную смесь на дне лунок, сохраняя правильную ориентацию планшета или серии пробирок. fS О о О О О О О о о О о о о о C V . ON ON ON O' ON. O n о О О О о О о о оо 00 00 00 00 00 00О о о о о о о a s г - г - Г - г - о о о о о о о 00 40 40 40 40 40 40 40о о О О О О о in in ш ш in ш ш н о о о о о о о э VOS о о о о о о о с >Г; СП m m (П 3S о о о о о о о S (N (N (N (N C N (N5 Г * О о о о о о о о S >> с; тo^ о о о о о о о о о о о о о о ь-; с с п: с с с о о о о о о о о о о о о о о Cl, 5S •««« Cl с н Ьо о Xо <N н .ь л (>5 15 01 — ДНК, выделенная из анализируемого образца №1 и т.д. --- стр. 16 --- Б) ПЦР-амплификация ДНК и гибридизационно- флуоресцентная детекция продуктов амплификации в режиме «реального времени» (производится в ЗОНЕ ПЦР - помещении для проведения ПЦР-амплификации) 1. Установить пробирки в реакционный модуль прибора для ПЦР в «реальном времени». Обратите внимание, что приборы для ПЦР в «реальном времени» должны обслуживаться, калиброваться и использоваться в соответствии с рекомендациями производителя. Использование данного набора в неоткалиброванном приборе может оказать влияние на рабочие характеристики теста. 2. Запрограммировать прибор для выполнения соответствующей програм.мы амплификации и детекции флуоресцентного сигнала согласно описанию для данного прибора (см. табл. 8, 9). Таблица 8 - Программа амплификации для приборов Стадия Температура, °C Время Всего циклов 1 95 2 мин 1 2 95 5 сек 50 3 64-: 15 еек Таблица 9 - Программа амплификации для других приборов Стадия Температура, °С Время Всего циклов 1 95 2 мин 1 2 95 5 сек 50 3 62-:':- 15 сек 4. По окончании выполнения програ.ммы приступить к анализу результатов. 11. Регистрация и интерпретация результатов Регистрацию результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с детекцией в режиме «реального времени». Анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам: - по каналу FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о.накоплении продуктов амплификации ДНК мутантных вариантов Щ кшККА8. - по каналу HEX регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продуктов амплификации ДНК нормальных вариантов гена KRAS (выступает в качестве внутреннего контрольного образца - ВКО). Результаты интерпретируются на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции пороговой линии. Принцип интерпретации результатов в исследуемых образцах и контрольных образцах представлен в табл. 10 и табл. 11 соответственно. Таблица 10 - Интерпретация результатов в исследуемых образцах ‘1 Пробирки 3. Запустить выполнение программы амплификации с детекцией флуоресцентного сигнала на стадии 3. Glyl2Asp, Glyl2Ala, Glyl2Arg, Glyl2Val, Glyl2Ser, Glyl2Cys, Glyl3Asp Мутантная ДНК гена KRAS обнаружена Мутантная ДНК гена KRAS не обнаружена Сомнительн ый Невалидный Канал FAM: Канал FAM: Канал FAM: Отсутствие Ct<35 отсутствие подъём кривой Канал HEX: кривой кривой амплификац подъём амплификаци амплификац ИИ по обоим кривой И. ИИ, Ct > 35 каналам амплификаци Канал HEX: Канал HEX: HEX и и (любой Ct) Ct<35 Ct<35 FAM или отсутствие подъёма кривой. --- стр. 17 --- Таблица 11 - Интерпретация результатов в контрольных Ct<35. Пробирки Правильный результат Невалидный результат ПКО Канал FAM и HEX: Ct< 35 Отсутствие подъема кривой амплификации по HEX и/или FAM око Канал FAM и HEX: Подъем кривой отсутствие подъема кривой амплификации амплификации по каналу FAM и/или HEX (любой Ct) Интерпретация результатов в контрольных образцах Результат ПЦР-исследования можно учитывать при подъеме кривых амплификации Glyl2Asp, Glyl2Ala, Glyl2Arg, Glyl2Val, Glyl2Ser, GIyl2Cys, Glyl3Asp в пробирках e еоответетвующими ПКО не позднее 35 цикла и при отсутствии подъема кривой амплификации в пробирках с ОКО. Интерпретация результатов в исследуемых образцах Интерпретацию результатов для исследуемых образцов проводят только при правильных результатах для ОКО и ПКО данной постановки. Интерпретация производится с помощью программного обеспечения используемого прибора. Пороговая линия устанавливается на уровне перехода кривых в экспоненциальную фазу роста Мутантная ДНК гена KRAS обнаружена, если кривая амплификации по каналу FAM поднимается выше установленной пороговой линии, и при этом Ct<35. По каналу HEX подъём кривой амплификации (любой Ct) или отсутствие подъёма кривой. Мутантная ДНК гена KRAS не обнаружена, если кривая амплификации по каналу FAM не поднимается выше установленной пороговой линии, а кривая амплификации по каналу HEX поднимается выше установленной пороговой линии, Ct< 35 (то есть проходит ВКО). Результат анализа сомнительный, если кривая амплификации по каналу FAM поднимается выше установленной пороговой линии, но при этом Ct>35. Кривая амплификации по каналу HEX поднимается выше установленной пороговой линии и Результат анализа невалидный, если кривые амплификации не поднимаются ни по каналу FAM, ни по каналу HEX выше установленной пороговой линии. Это свидетельствует о том, что не прошли реакции ни на нормальную ДНК, ни на мутантную. Если для пробы получен невалидный результат, требуется повторить ПЦР-исследование соответствующего исследуемого образца, начиная с повторного выделения ДНК из образца ткани или отвергнуть образец, как непригодный для данного вида анализа. Если получен сомнительный результат, требуется повторить ПЦР-исследование соответствующего образца, начиная с повторного выделения ДНК из образца ткани. Набор непригоден к дальнейшему использованию, если кривые амплификации по каналам FAM и HEX в пробирках ПКО ниже установленной пороговой линии и этот результат устойчиво воспроизводится. 12. Информация о стабильности медицинского изделия Срок годности набора. 12 месяцев. Срок годности набора после вскрытия. 12 месяцев. 13. Условия хранения, транспортирования и эксплуатации набора Хранение. Набор реагентов «Тест-ККА8-ткань-5» в упаковке предприятия-изготовителя должен храниться при температуре от 2 ^до 8 °С в течение всего срока годности набора. После вскрытия упаковки компоненты набора следует хранить при следующих условиях: - компоненты набора следует хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение всего срока годности набора; - ПЦР-смеси Glyl2Asp, Glyl2Ala, Glyl2Arg, Glyl2Val, Glyl2Ser, Glyl2Cys, Glyl3Asp следует хранить в защищённом от света месте в течение всего срока годности набора. Набор реагентов, хранившийся с нарушением регламентированного режима, применению не подлежит. --- стр. 18 --- Транспортирование. Транспортировать набор реагентов «Тест-ККА8-ткань-5» следует транспортом всех видов в крытых транспортных средствах в соответствии с правилами перевозок, действующими на транспорте данного вида. Набор реагентов транспортировать при температуре от минус 20 до 8°С в течение всего ерока годноети набора. Допускаетея транспортировка при комнатной температуре (15-25°С) не более пяти еуток. Атмосферное давление не контролируется, т.к. не влияет на качество изделия. ^ Для обеепечения соблюдения условий транспортирования на протяжении всего срока транспортирования набор реагентов помещается в термоконтейнер пенополиуретановый многоразового использования для временного хранения и транепортирования с подготовленными хладоэлементами. Тип, объём и количество хладоэлементов, закладываемых в термоконтейнер с транепортируемыми наборами реагентов, а также объём термоконтейнера подбираются в зависимости от продолжительности и условий транспортирования. Наборы реагентов, транепортированные е нарушением температурного режима, применению не подлежат. Срок годности. Срок годности набора «Тест-ККА8-ткань-5» 12 месяцев ео дня приемки ОТК предприятия-изготовителя при соблюдении всех условий транспортирования, хранения и эксплуатации. Набор реагентов с истекшим ероком годности применению не подлежит. Срок годности вскрытых компонентов набора. 12 месяцев || ео дня приемки ОТК предприятия-изготовителя при условии хранения при температуре от 2 до 8 °С. Срок годности приготовленных для работы компонентов набора. 1 чае при соблюдении условий, препятствующих высыханию компонентов, а также контаминации посторонним биологическим материалом. 14. Утилизация Наборы реагентов, пришедшие в непригодность, в том числе в связи с истечением срока годности, подлежат утилизации в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.3684-21. В соответствии с классификацией медицинских отходов наборы относятся к классу А (эпидемиологически безопасные отходы, приближенные по составу к твёрдым бытовым отходам). Неиспользованные реактивы в соответствии с СанПиНом 2.1.3684- 21 "Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, ^ питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно- противоэпиде.мических (профилактических) мероприятий" собираются в одноразовую маркированную упаковку любого цвета (кроме жёлтого и красного). Оставшиеся после выполнения работ пробирки и материалы утилизируют в соответствии с МУ 287-113 (Методические указания по дезинфекции, предстерилизационной очистке и стерилизации изделий медицинского назначения). Жидкие компоненты (реагенты, реактивы) уничтожаются сливом в канализацию с предварительным разбавлением реагента водопроводной водой 1:100 и вывозом остатка упаковок как производственный или бытовой мусор. Потребительская упаковка набора реагентов «Тест-ККА8- ткань-5» подлежит механическому разрушению с вывозом остатков как производственного или бытового мусора. * Персонал, осуществляющий уничтожение набора реагентов, должен соблюдать правила безопасности проведения того или иного способа уничтожения. 15. Гарантийные обязательства, контакты Предприятие-изготовитель гарантирует соответствие набора «Тест-ККА8-ткань-5» требованиям технических условий при соблюдении условий транспортирования, хранения и эксплуатации, установленных техническими условиями. --- стр. 19 --- Организация-производитель: Общество с Ограниченной Ответственностью «Л-Сфера» (ООО «Л-Сфера»), 432072 г. Ульяновск, Инженерный 44-й проезд, дом 9, помещение 69 Тел.: +7 (903)320-00-84 E-mail: info@l-sfera.com Наименование, юридический, (фактический) адрес и контактные данные (телефон, факс, электронная почта) уполномоченного представителя производителя на территории Российской Федерации; Общество с Ограниченной Ответственностью «ТестГен» (ООО «ТестГен»), 432072 Россия г. Ульяновск, Инженерный 44-й проезд, дом 9, офис 13 Тел.: +7 499 705-03-75 www.testgen.ru Служба технической поддержки: Тел.:+7 927 981 58 81 E-mail: help@testgen.ru Наименование и контактные данные (телефон, факс, электронная почта) организации, принимающей, претензии (предложения) по медицинскому изделию для диагностики in vitro от потребителей на территории Российской Федерации: Общество с Ограниченной Ответственностью «ТестГен» (ООО «ТестГен»), 432072 Россия г. Ульяновск, Инженерный 44-й проезд, дом 9, офис 13 Тел.: +7 499 705-03-75 www.testgen.ru Служба технической поддержки: Тел.: +7 927 981 58 81 E-mail: help@testgen.ru Пр иложение А I Перечень применяемых национальных стандартов ГОСТ ISO 14971-2011 Изделия медицинские. Применение менеджмента риска к медицинским изделиям. ГОСТ Р 15.309-98 Система разработки и постановки продукции на производство. Испытания и приёмка выпускаемой продукции. Основные положения. ГОСТ Р 51088-2013 Медицинские изделия для диагностики ин витро. Реагенты, наборы реагентов, тест-системы, контрольные материалы, питательные среды. Требования к изделиям и поддерживающей документации. ГОСТ Р 51352-2013 Медицинские изделия для диагностики ин витро. Методы испытаний. ГОСТ Р ЕН 13612-2010 «Оценка функциональных характеристик медицинских изделий для диагностики in vitro»; ГОСТ Р ИСО 18113-2-2015 Медицинские изделия для диагностики in vitro. Информация, предоставляемая изготовителем (маркировка). Часть 2. Реагенты для диагностики in vitro для профессионального применения. ГОСТ Р ИСО 23640-2015 Изделия медицинские для диагностики in vitro. Оценка стабильности реагентов для диагностики in vitro. ГОСТ Р ИСО 15223-1-2020 Изделия медицинские. Символы, применяемые при маркировании на медицинских изделиях, этикетках и в сопроводительной документации. 4.1. Основные требования. ГОСТ ISO 13485-2017 «Изделия медицинские. Системы менеджмента качества. Требования для целей регулирования». При.мечание - Указанные выще стандарты были действующими на момент утверждения инструкции по применению. В дальнейшем, при пользовании документом, целесообразно проверить действие ссылочных нормативных документов на текущий момент. Если ссылочный документ заменён или изменён, то при применении настоящего документа следует пользоваться заменённым (изменённым) документом. --- стр. 20 --- т Версия 3 от 12.01.2022 JP