Набор реагентов для определения статуса мутаций гена BRAF методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени в пробе геномной ДНК человека из образцов фиксированной в парафине ткани (Тест-BRAF-ткань-5) по ТУ 21.20.23-003-25226389-2020 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 ---
УТВЕРЖДАЮ
^неральный директор
ООО «Л-Сфера»
\____Р. Р. Халилов
’|«21» марта 2022 г.
ч\ ИНСТРУКЦИЯ
Ф реагентов для определения статуса мутаций
а методом аллель-специфической ПЦР
:име реального времени в пробе геномной ДНК
)века из образцов фиксированной в парафине
ткани (Тест-ВКАК-ткань-5)
по ТУ 21.20.23-003-25226389-2020
^ от 21.03.2022
--- стр. 2 ---
Содержание
Версия 3 от 21.03.2022
введение.....................................................................................................4
. Назначение..............................................................................................8
Принцип метода....................................................................................9
>. Состав набора реагентов....................................................................12
к Характеристики набора реагентов ...................................................13
). Перечень рисков, связанных с применением набора реагентов
<Тест-ВКАР-ткань-5».............................................................................14
'Меры предосторожности при работе с набором ............................18
^Оборудование и материалы, необходимые при работе с набором
......................................................................................................................................20
к Анализируемые образцы ...................................................................22
). Подготовка компонентов набора для исследования ....................27
10. Проведение анализа..........................................................................27
11. Регистрация и интерпретация результатов..................................30
12. Условия хранения, транспортирования и эксплуатации набора
33
13. Утилизация........................................................................................34
14. Гарантийные обязательства, контакты........................................35
1риложение А .........................................................................................37
--- стр. 3 ---
Введение Мутация BRAF выявляется примерно у 50 % больных
Целевой аналит — ген BRAF, исследуемый при диагностик^®^^^^^™^^^^’^*^^ меланомой кожи и играет важную роль в пути
пациентов с диагнозом «метастатическая меланома II1-IV стадии'^^^^ (RAS-RAF-MEK-ERK).
и проведении молекулярно-генетического исследования дл ® соответствии с Клиническими рекомендациям «Меланома
качественного определения статуса мутаций V600E, V600,‘°^^ ^ слизистых оболочек» С43, С51, С60.9, С63.2, С69.0, СОО-
complex (обнаруживает мутации V600E, V600E complex, но и-^б, С30-С32, С52. С53, С77. С78, С79, D03.0-D03.09. Взрослые,
различает их) и V600K гена '020 (Разработчики: Ассоциация онкологов России, Ассоциация
Материалом для проведения исследования служат проблемам меланомы, Общероссий-ская
геномной ДНК человека из образцов фиксированной в парафин’^*^^^^®*^^^^^ организация «Российское общество клинической
ткани. )нкологии». Одобрено Научно-практическим советом Минздрава
Научная обоснованность. ^*)-
Меланома — наиболее опасное злокачественное заболевани «Рекомендуется пациентам с меланомой кожи, если
кожи человека с высоким риском метастазировани>^из™остированы или заподозрены регионарные и отдаленные
Метастазирующая меланома прогностически крайи.-^е^^^тазы меланомы, и при метастазах меланомы без выявлен-ного
неблагоприятна и резистентна ко всем видам традиционно|'®Р®^^*”°‘^ очага ^ выполнить молекулярно-генетическое
химиотерапии и биологическим препаратам. В последнее ® ^
достигнуты значительные успехи в понимании патогенеза ранее удаленных лимфатических узлов, или первичной
лечении меланомы' шухоли (если материал удовлетворяет требованиям лаборатории
В 2002 году рядом ученых была выявлена высокая частот:^^ достоверного определения наличия или отеутствия
BRAF онкогенных мутаций при меланоме: от 62% до 72 изменений)) - это может повлиять на
при ранней стадии заболевания мутации BRAF отмечены только таргетного агента (ингибитора протеинкиназы) в лечении
10 % случаев, что позволило предположить, что BRAF мутации процесса».
могут участвовать в инициации большинства меланом, н. ^ выявляется нуклеотидная замена Т1799А в
отражают прогрессирование заболевания, что может иметь важно.'5’“ ^кзоне BRAF, приводящая к замене валина на глутаминовую
прогностическое значение.^ « ‘=^°ту в кодоне 600 (V600E)'. Второй по частоте является
Ген BRAF (7q34) кодирует серин-треониновую ^бООК - е е частота может достигать 5-10%.
мутации в активирующем домене которой вызывают стабильнув^ 2002 г., когда была открыта мутация BRAF V6D0E,
' ||^стигнут значительный прогресс в изучении молекулярных
механизмов канцерогенеза меланомы. Это привело к созданию
принципиально новых лекарственных веществ, молекулярно-
чаправленных (таргетных) препаратов дабрафениб
'Регистрационное удостоверение № ЛП-004295 от 17.05.2017 г.,
•------------------------------------- Торговое наименование: Тафинлар Комбо), вемурафениб
’ Мазуренко Н.Н. Генетические особенности и маркерьг меланомы кожи / Н.Н.
Мазуренко // Успехи молекулярной онкологии. - 2014. - вып. 2. - С. 26-35.
каскадную гиперактивацию
протеинкиназ МЕК и ERK'.
митоген-активированнь?
Проценко С.А. Таргетная терапия при меланоме, гастроинтестинальных Вемурафениб в лечении больных меланомой с метастазами в головной мозг /
стромальных опухолях, дерматофибросаркоме протуберанс / С.А. Проценко // Д-Р- Насхлеташвили [и др.] // Опухоли головы и шеи. - 2016. - Т. 6, вып. 4 - С.
Практическая онкология. - 2010. - Т. 11, №3 - С. 162-170. 30-34.
4 5
--- стр. 6 ---
ПЦР в режиме реального времени в пробе геномной ДНК человекЕанализируемой ДНК, выраженная в отношении оптических
из образцов фиксированной в парафине ткани включает в себя Tpi-плотностей (А260/280нм), необходимая для проведения
этапа: исследования, должна составлять не менее 1,6-1,8. Концентрация
1) подготовку ПЦР; ДНК, достаточная для проведения исследования должна составлять
2) ПЦР-амплификацию ДНК и гибридизационно-не менее 5 нг/мкл.
флуоресцентная детекцию продуктов амплификации в режиме Ткань опухоли не является гомогенной, в связи с этим
результаты анализа, полученные из образца ткани, могут не
совпадать с результатами других секций той же самой опухоли.
образцогКроме того, образцы опухоли могут содержать и нормальную
реакци^/неопухолевую ткань). При использовании пробы геномной ДНК,
«реального времени»;
3) интерпретацию результатов.
С пробами геномной ДНК человека из
фиксированной в парафине ткани проводятся иД^нсо
амплификации участков гена BRAF в реакционном буфере пр^йделенной из ткани, не содержащей опухоль, набор «Тест-BRAF-
помощи специфичных к этим участкам ДНК праймеров и фермента ткань-5» не сможет выявить мутации гена BRAF.
Taq-полимеразы. В составе реакционной смеси для амплификаци!^ Минимальное содержание опухоли в образце для проведения
присутствуют аллель-специфичные флуоресцентно-меченыстеста - 20% по результатам морфологического исследования
олигонуклеотидные зонды, которые гибридизуются сопухолевого материала врачом-гистологом.
комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени \ Метод ПЦР крайне чувствителен к контаминации,
разрушаются Taq-полимеразой, в результате чего происходи 1Соблюдайте осторожность, чтобы избежать контаминации
нарастание интенсивности флуоресценции. Это позволяеюбразцов исследуемой ДНК и реакционных смесей содержимым из
регистрировать накопление специфического продуктшробирки ПКО или продуктами ПЦР.
амплификации путем измерения интенсивности флуоресцентной Набор реагентов «Тсст-ВРАР-ткань-5» не может
сигнала. Детекция флуоресцентного сигнала осуществляетсшспользоваться для диагностики какой-либо патологии. Набор
непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора среагентов «Тест-ВНЛР-ткань-5» предназначен только для
системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реальногскачественного определения статуса мутаций V600E, V600E
времени». complex (обнаруживает мутации V600E, V600E complex, но не
Продукты ПЦР исследуемого гена BRAF идентифицируюторазличает их) и V600K гена BRAF.
в 5'-экзонуклеазной реакции с помощью зондов, меченных FAM г
HEX. Общее время проведения анализа составляет 2-2,5 ч.
По каналу, соответствующему флуорофору НЕ?ф
детектируется продукт амплификации ДНК нормального варианта
гена BRAF, по каналу, соответствующему флуорофору FAM
детектируется продукт амплификации ДНК мутантных варианто!
гена BRAF.
Ограничения метода
Обнаружение мутаций зависит от целостности образца ^
количества амплифицируемой ДНК, присутствующей в образце
Минимальное количество ДНК, которое необходимо д;п
проведения анализа — 60 нг (30 нг ДНК на реакцию). Чистот.'
10 11
--- стр. 7 ---
3. Состав набора реагентов
Набор реагентов
«Тест-ВЯАР-ткань-5».
содержит реагенты, рассчитанные
определений.
раздел 11 «Регистрация и интерпретация результатов»). Это
контроль эффективности экстракции ДНК и возможного наличия
выпускается в 1 форме комплектации ^ ингибиторов в пробе, присутствие которых может привести к
Каждый набор «Тест-ВКЛР-ткань-5»_южноотрицательным результатам.
В составе набора отсутствуют лекарственные средства для
медицинского применения, вещества человеческого или животного
происхождения.
на проведение анализа 5
Состав набора
Набор реагентов «Тест-ВКАР-ткань-5» включает:
Таблица 1 - Состав набора реагентов «Тест-ВКАР-ткань-5»
№
пп
Название
реагента
Описание
Количество
пробирок,
объём, мкл
1 ПЦР-смесь
V600E/EC
Прозрачная бесцветная
жидкость, может иметь
оттенок розового цвета
1 пробирка
(60 мкл)
2 ПЦР-смесь
V600K
Прозрачная бесцветная
жидкость, может иметь
оттенок розового цвета
1 пробирка
(60 мкл)
3 ПКО Прозрачная бесцветная
жидкость
1 пробирка
(60 мкл)
4 ОКО Прозрачная бесцветная
жидкость
1 прюбирка
(60 мкл)
5 Taq-
полимераза
Прозрачная бесцветная
жидкость
1 пробирка
(300 мкл)
4. Характеристики набора реагентов
4.1 Технические и функциональные характеристики
Таблица 2 - Технические и функциональные характеристики
набора реагентов «Тест-ВКАР-ткань-5» _____
Наименование показателя Характеристики и нормы
1. Технические характеристики
1.1 Внешний вид
ПЦР-смесь V600E/EC
ПЦР-смесь V600K
ПКО
ОКО
Taq-полимераза
Положительный контрольный образец (ПКО) готов
использованию и представляет собой смесь геномной ДНК
1.2. Комплектность
И'й
В соответствии с п. 4 ТУ 21.20.23-
003-25226389-2020
культуры клеток человека линии Jurkat в концентрации 400 копиМ.З. Маркировка
гена BRAF в 1 мкл и искусственно синтезированной вставк!^^ _______________________
размером 300 п.н., содержащей эквимолярную смесь мутациП.4. Упаковка
V600E/V600E complex и V600K, в плазмидный вектор pAL-TA i_______________________
концентрацией 20 копий гена BRAF в 1 мкл раствора ДНК^ ____________2. Функциональные характеристики
Прозрачная бесцветная жидкость,
может иметь оттенок розового цвета
Прозрачная бесцветная жидкость,
может иметь оттенок розового цвета
Прозрачная бесцветная
жидкость
Прозрачная бесцветная
жидкость
Прозрачная бесцветная
жидкость
В соответствии с п. 1.4 ТУ 21.20.23-
003-25226389-2020
В соответствии с п. 5 ТУ 21.20.23-
003-25226389-2020
Содержит 5% мутантных и 95% нормальных копий ДНК.
В качестве ОКО используют воду деионизованную. Положительный результат
Все ПЦР-смеси содержат праймеры и зонды к внутреннем.'с ПКО
контрольному образцу (ВКО). Зонды к ВКО помечены HEX (см ____________________
Регистрация роста сигнала
флуоресценции с Ct< 35 в
пробирках с ПКО по канала.м РАМ
и HEX
12 13
--- стр. 8 ---
Наименование показателя Характеристики и нормы
Отрицательный результат с
ОКО
Отсутствие роста сигнала
флуоресценции в пробирках с ОКО
по каналам РАМ и HEX
- СОП-ПКО-М, представляющий собой смесь плазмидных
ДНК с синтетическими вставками амплифицируемых фрагментов
ДНК - специфические фрагменты с гомозиготным содержанием
мутаций в гене BRAF - мутации V600E, V600E complex и V600K,
заключенных в плазмидный вектор рА1-ТА с концентрацией 10 000
коп плазмидной ДНК в 1 мкл в ТЕ буфере (10 мМ Трис. 1 мМ
ЭДТА). Содержит 100% мутантных копий ДНК.
Для оценки прецизионности в условиях повторяемости
4.2 Характеристики аналитической эффективности
4.2.1 Аналитическая специфичность
Специфичен по отношению к мутации V600E, V600E complex
(обнаруживает мутации V600E, V600E complex, но не различает их контрольные образцы были исследованы в 10 повторах,
и V600K гена BRAF. Данные по повторяемости получают внутри лаборатории для
Список определяемых мутаций с указанием ID мутаци^нкретного оборудования и внутри конкретной партии набора
представлен в таблице 3.
Таблица 3 - Список определяемых мутаций с указанием ID
мутации
Набор мутаций,
определяемых с
помощью «Тест-
BRAF-TK3Hb-5»
Изменения в
нуклеотидах
Изменения в
аминокислотах
COSMIC 1
ID*
V600E complex
c.l799_1800TG>AA
(Complex) P.V600E 475
V600E с.1799Т>А P.V600E 476
V600K С.1798 1799GT>AA P.V600K 473 1
реагентов.
Для оценки прецизионности в условиях повторяемости
рассчитывают среднее арифметическое выборки, дисперсию,
среднеквадратическое отклонение и коэффициент вариации по
полученным значениям в повторах контрольных образцов.
Результаты исследования показали, что коэффициент
вариации в условиях повторяемости набора составляет: 1) для
мутантных вариантов гена BRAF не более 3%; 2) для нормальных
вариантов гена BRAF не более 3%.
4.2.4. Прецизионность в условиях воспроизводимости
Оценку воспроизводимости тест-системы проводят
согласно аналогично расчёту прецизионности в условиях повторяемости,* идентификационный номер мутации
международной базе соматических мутаций при раковы>однако для тестирования используют различные партии набора
заболеваниях COSMIC (Catalog of Somatic Mutations in Cancer). реагентов, реакции ставят в разных лабораториях, разные
4.2.2 Аналитическая чувствительность операторы, в разные дни, на разных ПЦР-амплификаторах (Блок
10 копий гена в 1 мкл раствора ДНК. воспроизводимости 1, Блок воспроизводимости 2, Блок
4.2.3 Прецизионность в условиях повторяемости ^спроизводимости 3, Блок воспроизводимости 4).
Для оценки прецизионности в условиях повторяемости были Результаты исследования показали, что коэффициент
проведены последовательные исследования следующих образцов: вариации в уеловиях воспроизводимости набора составляет: 1) для
- СОП-ПКО-N, представляющий собой смесь плазмидны>мутантных вариантов гена BRAF не более 3%; 2) для нормальных
ДНК с синтетическими вставками амплифицируемых фрагментоРвариантов гена не более 3%.
ДНК - нормальные варианты гена BRAF, заключённых \ 4,2.5 Минимальное содержание опухоли для проведения
плазмидный вектор рА1-ТА с концентрацией 10 000 коп в 1 мкл ТЬанализа — 20 % по результатам морфологического исследования
буфера. (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА). Содержит 100% нopмaльны^oпyxoлeвoгo материала врачом-гистологом.
копий ДНК (образец «дикого типа»).
14 15
--- стр. 9 ---
4.2.6 Предел обнаружения (LoD), как наименьшая частота реестр средств измерений, имеет Свидетельство об утверждении
заявленных аллелей в образце в гене BRAF, которое способно средств измерений US.С.31.004.А Х253590.
выявить изделие-5 %. 4.2.10. Информация об интерферирующих веществах
4.2.7 Подтверждена специфичность изделия в отношении указана в разделе «8.2 Интерферирующие вещества и ограничения
микрофлоры кожи в максимальной концентрации патогена. При по использованию анализируемого материала».
исследовании ДНК штаммов: 4.3, Характеристики клинической эффективности
- из коллекции «ГКПМ-ОБОЛЕНСК»: Staphylococcus aureus В ходе проведения клинических испытаний было отобрано 53
Wood 46 АТСС 10832 (номер штамма В-4442), Staphylococcus образца фиксированной в парафине ткани, от пациентов с
epidermidis АТСС 14990 (номер штамма В-4510), диагнозом метастатическая меланома ИМV стадии.
- из коллекции «Thermo Fisher Scientific» (США)^ Каждый образец был протестирован в двух сериях с
Streptococcus pyogenes КХСС \96\5?YJ5 {r o t . 25\02%), Помощью исследуемого набора реагентов «Тест-ВКАР-ткань-5»,
- из коллекции «Microbiologies» (США): Streptococcus производства ООО «Л-сфера».
Group В АТСС 13813 (кат. № 0370) Для проведения ПЦР-исследования были использованы
в концентрации 10^ клеток на мл неспецифических реакций амплификаторы. рекомендуемые производителем исследуемого
выявлено не было. Данные микроорганизмы не оказывают влияние набора реагентов:
на способность набора реагентов «Тест-ВКАР-ткань-5» различать - Амплификатор детектирующий ДТпрайм (ООО «НПО ДНК-
мутантные и нормальные варианты гена BRAF. Технология». Россия);
4.2.8. Проведено тестирование изделия на гомологичных
генах BRAF - ARAF, RAFI. Набор реагентов «Тест-ВКАР-ткань-5»
не дает перекрестный реакций с гомологичными генами BRAF -
ARAF. RAFI.
4.2.9 Минимальное количество ДНК, которое необходимо
для проведения анализа - 60 h i (30 нг ДНК на реакцию).
- Амплификатор CFX 96 («Bio-Rad», США);
- Амплификатор Rotor-Gene Q («Qiagen», Германия);
- Амплификатор QuantStudio 5 («Thermo Fisher Scientific»,
США).
Воспроизводимость результатов 100%. Результаты изучения
диагностических характеристик исследуемого медицинского
Набор рекомендован для работы
концентрацией не менее 5 нг/мкл.
Дополнительно рекомендуется для оценки степени чистоть
с образцами ДНК с изделия по отношению к каждой выявляемой мутации в гене BRAF
приведены в таблице 4.
выделенного образца ДНК из парафиновых блоков использовать.
значение соотношения оптических плотностей растворЯ
выделенной ДНК на длинах волн 260 нм и 280 нм (А260/280).
Рекомендуемое значение соотношения - не менее 1.6-1.8.
Проверку чистоты выделения нуклеиновых кислот
выраженную в отношении оптических плотностей раствора
выделенной ДНК (А260/280нм), и концентрации выделенной ДНК
рекомендуется проводить с помощью спектрофотометра NanoDrop
2000с (производства Thermo Scientific, США) с диапазоноу
излучения 220-350 нм. Спектрофотометр Nanodrop 2000^
(производства Thermo Scientific, США) внесён в Государственный
16
Таблица 4
Мутации
Ко.'1ичество
наб.тю-
.геннй с
Л 0 .1 0 Ж Н -
те.1ьнымн
п р о б а м и
Ко.1ичество
наб.тю-
д«ний с
отрица-
Т & 1 Ь М Ы М Н
п р о б а м и
Диагностическая
чувстви-
те.1ьность с
.юверите.пьной
вероятностью 95
%
Дна 1 ностн-
ческая
специфичность
с довсритс.тьной
вероятностью 95
%
V600E/
V600EC 44 62 100%(95%ДИ:
91.96%-100%)
100%(95%ДИ:
94Д2%-100%)
V600K 50 56 100%(95%ДИ:
92,89%-100%)
100%(95%ДИ:
93.62%-100%)
17
а
--- стр. 10 ---
5. Перечень рисков, связанных с применением набора
pcai'CHTOB «Тест-ВПАЬ'-ткань-5»
В пограничную зону риска вошли опасности:
приспециальных, несвойственных экологических рисков
использовании или реализации изделия не предусмотрены.
Реагенты, входящие в набор «Тест-ВРАР-ткань-5», обладают
1. исключают возможность
2 .
потеря функциональных свойств реагентов, входящих в низкой упругостью пара,
набор, из-за транспортирования, хранения или эксплуатации ингаляционного отравления.
в несоответствующих условиях; Реагенты, входящие в набор «Тест-ВРЛР-ткань-5» не
контаминация реакционных смесей с образцами токсичны, поскольку готовятся путём смешивания отдельных
исследуемой ДНК содержимым из пробирки ПКО или компонентов.
продуктами ПЦР; Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей
3. проведение анализа с использованием пробы ДНК низког^^®-^®*^У'’’*‘Р”^^"^^^о-^ог'ические (ПЦР) исследования клинического
качества (низкая концентрация и/или плохая очистка); Материала с соблюдением санитарно-эпидемических правил
4. невыполнение требований по пробоподготовке. проведениюСанПиН 2.1.3684-21 от 28.01.2021 "Санитарно-
анализов и утилизации вследствие работы с набором эпидемиологические требования к содержанию территорий
неквалифицированным персоналом; городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой
использование непригодного для применения набора ^ питьевому водоснабжению населения, атмосферному5.
(использование по истечению срока годности или при воздуху, почвам, жилым помещениям. эксплуатации
нарушении упаковки). производственных, общественных помещений, организации и
В области недопустимой зоны риски не выявлены. проведению санитарно-противоэпидемических
Совокупный остаточный риск применения медицинскогс (профилактических) мероприятий . Следовать рекомендациям,
изделия «Набор реагентов для определения статуса мутаций гене изложенным в МУ 287-113, МУ 1.3.2569-09.
методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального При работе всегда следует выполнять следующие требования:
времени в пробе геномной ДНК человека из образцов^, " Удалять неиспользованные реактивы в соответствии с
фиксированной в парафине ткани (Тест-ВКАР-ткань-5) по TV анПиН 2.1.3684-21 от 28.01.2021 «Санитарно-
21.20.23-003-25226389-2020». производства ООО «Л-сфергу требования к содержанию территорий
является допустимым, польза от его применения превышает риск. и сельских поселений, к водным объектам, питьевой
воде и питьевому водоснабжению населения, атмосферному
6. Меры предосторожности при работе с набором воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации
Производственных, общественных помещений, организации и Класс в зависимости от потенциального риска применения ■ ^ проведению санитарно-противоэпидемических26 в соответствии с номенклатурной классификацией “адицинских^^ мероприятий».
изделий, утверждаемой приказом Министерства здравоохранение ВНИМАНИЕ! При удалении отходов после амплификации
Российской Федеоации ОТОо.бо.2U12 N 4н. , с- i-itir»\^ - (пробирок, содержащих продукты ПЦР) недопустимо открываниеВсе составные части и реагенты, входящие в состав набора ^ tzL.VV wviaonoiv -i«v р , м к цробирок И разбрызгивзнис содержимого, поскольку это может
реагентов «Тест-ВКАР-ткань-5», относятся к 4 классу опасность птш с: -привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны,(вещества малоопасные) в соответствии с ГОСТ 12.1.007-7t
«ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие требование
безопасности». Меры предосторожности против любы>
оборудования и реагентов.
18
I. применять набор строго по назначению, согласно данной
инструкции;
19
--- стр. 11 ---
2. допускать к работе с набором только специально обученный fAM/Green, HEX/Yeliow, ROX/Orange, Cy5/Rad, Cy5.5/Crimson:
персонал (специалист с высшим медицинским или CFX96 (BioRad, США), «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК-
биологическим образованием, прошедший обучение на Технология», Россия), Rotor-Gene Q («Qiagcn», Германия),
лицензированных курсах специализации по работе с ПБА QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США).
Ш-IV групп патогенности и по ПЦР-диагностике, а также со 6. Спектрофотометр NanoDrop 2000с (производства Thermo
средним специальным медицинским образованием); Scientific, США) с диапазоном излучения 220-350 нм. Внесён в
3. не использовать набор по истечении срока годности; Государственный реестр средств измерений, имеет Свидетельство
4. избегать контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой, об утверждении средств измерений US.C.31.004.A Х«53590.
При контакте немедленно промыть поражённое место водой
и обратиться за медицинской помощью. Материалы и реагенты, не входящие в состав изделия:
При контакте немедленно промыть пораженное место водой Щ ВНИМАНИЕ! При работе с ДНК необходимо использовать
обратиться за медицинской помощью. только одноразовые стерильные пластиковые расходные
Необходимых мер предосторожности в отношении влияния материалы, имеющие специальную маркировку «DNase-free»,
магнитных полей, внешних электрических воздействий. 1. Одноразовые наконечники с аэрозольным барьером до 200
электростатических разрядов, давления или перепадов давления, мкл, до 100 мкл, до 20 и до 10 мкл. (например, «Axygen», США),
перегрузки, источников взрыва или возгорания не предусмотрено. 2. Штативы для наконечников (например, «Axygen», США) и
В составе набора отсутствуют вещества человеческого илимикропробирок на 0.5 (0,2) мл (например, «ИнтерЛабСервис»,
животного происхождения, обладающие потенциальнойРоссия).
инфекционной природой, поэтому меры предосторожности против 3. Отдельный халат и одноразовые перчатки.
любых специальных, несвойственных рисков при использовании 4. Емкость с крышкой для дезинфицирующего раствора.
или реализации изделия не предусмотрены. 5. Одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР:
а) на 0,2 мл (плоская крышка, нестрипованные), (например
7, Оборудование и материалы, необходимые при работе с ;<Axygen», США) для постановки в ротор на 36 пробирок - для
набором приборов для ПЦР в реальном времени с детекцией через дно
Оборудование: пробирки (например, «Rotor-Gene»).
1. ПЦР-бокс (типа «БАВ-ПЦР-«Ламинар-С», «Ламинарньк б) на 0,2 мл (куполообразная крышка) (например, «Axygen»,
системы». Россия). ГША) - для приборов для ПЦР в реальном времени с детекцией
2. Вортекс (типа «ТЭТА-2», «Биоком», Россия). fcpes крышку (например, «CFX96». «ДТ-Прайм»).
3. Набор электронных или автоматических дозаторог 6. ПЦР-планшеты (могут использоваться вместо пробирок,
переменного объема (типа «Eppendorf», Германия). /казанных в пункте 5).
4. Холодильник от 2 до 8°С с морозильной камерой не выше 7. Оптически прозрачная пленка для заклеивания планшетов,
минус 16 °С. 8. Для выделения пробы геномной ДНК человека из
5. Амплификатор^ с флуоресцентной детекцией в режимфиксированной в парафине ткани, необходимой для проведения
реального времени по каналам, соответствующим флуорофора>
® Амплификаторы должны обслуживаться, калиброваться и использоваться в ^еоткалиброванном приборе может оказать влияние на рабочие
соответствии с рекомендациями производителя. Использование данного наборг^Р^ктеристики теста.
20 21
--- стр. 12 ---
рекомендуется Набор рекомендован для работы с образцами ДНК с
концентрацией не менее 5 нг/мкл. Минимальная валидированная
ПЦР-анализа концентрации и чистоты,
использование следующих комплектов реагентов:
- Набор реагентов для выделения геномной ДНК человека из концентрация ДНК- 5 нг/мкл
фиксированных в формалине и заключенных в парафин тканей Дополнительно рекомендуется для оценки степени чистоты
(ДНК-Ткань-Ф) по ТУ 21.20.23-009-97638376-2016, производства образца ДНК из парафиновых блоков использовать
ООО «ТестГен», Россия. Регистрационное удостоверение № РЗНз^ачение соотношения оптических плотностей раствора
2018/7772 от 30.10.2018; ^ выделенной ДНК на длинах волн 260 нм и 280 нм (А260/280).
- Набор реагентов для выделения геномной ДНК человека ичрекомендуемое значение соотношения — не менее 1.6—1.8.
фиксированных в формалине и заключенных в парафин тканей Проверку чистоты выделения нуклеиновых кислот,
ДНК-Ткань-М по ТУ 21.20.23-012-97638376-2019, производств^ираженную в отношении оптических плотностей раствора
ООО «ТестГен», Россия. Регистрационное удостоверение № РЗЧ|^еленной ДНК (А260/280нм), и концентрации выделенной ДНК
2021/14273 от 06.05.2021 г.
Перед началом
8. Анализируемые образцы
работы следует ознакомиться
рекомендуется проводить с помощью спектрофотометра NanoDrop
2000с (производства Thermo Scientific, США) с диапазоном
/1злучения 220-350 н.м. Спектрофотометр Nanodrop 2000с
производства Thermo Scientific, США) внесён в Государственный
методическими рекомендациями «Взятие, транспортировказеестр средств измерений, имеет Свидетельство об утверждении
хранение клинического материала для ПЦР-диагностики»:редств измерений US.C.31.004.A №53590
разработанными ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва, 2012 г Критерии пригодности гистологических препаратов для
Материалом для проведения ПЦР служат пробы геномноНыделения ДНК для последующего молекулярно-
ДНК человека из образцов фиксированной в парафине ткани. енетического анализа опухолевых клеток
8.1 Процедура получения пробы геномной ДНК человек; • По результатам морфологического исследования
из фиксированной в парафине ткани >пухолевые комплексы должны занимать не менее 60 % площади
Для выделения пробы геномной ДНК человека и кани в срезе с FFPE-блока.
фиксированной в парафине ткани, необходимой для проведени • По результатам морфологического исследования зоны
ПЦР-анализа концентрации и чистоты. рекомендуетс*екроза и кровоизлияния в совокупности должны занимать не
использование следующих комплектов реагентов: олее 15 % площади ткани в срезе с FFPE-блока.
- Набор реагентов для выделения геномной ДНК человека В случае, если образец не соответствует хотя бы одному из
фиксированных в формалине и заключенных в парафин тканс®Р®^*исленных критериев, рекомендуется использовать другой
(ДНК-Ткань-Ф) по ТУ 21.20.23-009-97638376-2016. производстг^разец.
ООО «ТестГен», Россия. Регистрационное удостоверение № Р31 Анализируемый материал не подлежит использованию при
2018/7772 от 30.10.2018; арушении условий хранения и транспортировки (температура,
- Набор реагентов для выделения геномной ДНК человека продолжительность, многократное замораживание-оттаивание),
фиксированных в формалине и заключенных в парафин тканс При подготовке срезов с парафиновых блоков необходимо
"ДНК-Ткань-М" по ТУ 21.20.23-012-97638376-2019, производстЕИНимизировать риск кросс-контаминации образцов, для чего
ООО «ТестГен», Россия. Регистрационное удостоверение Хе
2021/14273 от 06.05.2021 г. * работать в одноразовых неопудренных перчатках;
22 23
--- стр. 13 ---
• проводить процедуру в ПЦР-боксе или в ламинарном
шкафу;
• использовать одноразовые лезвия для микротома к
стерильные пинцеты;
• первые два среза с каждого блока утилизировать, а дл^
молекулярного исследования использовать срезы начиная с
третьего;
• не помещать срезы на водяную баню.
нерезектабельной или метастатической меланомы)
Котеллик(используется в качестве терапии
неоперабельной или метастатической меланомы с
BRAF V600 мутацией)
0,004 мг/мл
Тецентрик (применяется для лечения меланомы и
ДР.)
0,168 мг/мл
Мекинист (показан при лечении пациентов с
нерезектабельной или метастатической меланомы с
мутацией гена BRAF V600)
0.0001 мг/мл
8.2 Интерферирующие вещества и
использованию анализируемого материала
ограничения П(
ф На основании результатов исследования данные вещества нс
Влияние потенциально интерферирующих веществ на работ^^'^“»®'°'' интерферирующего воздействия на работу набора и не
набора реагентов «Тест-ВКЛР-ткань-5» было проверено .’Риводят к ингибированию ПЦР при концентрациях, не
отношении потенциально интерферирующих веществ, которые’Р®®*’™®'”'^'*’^ допустимые.
могут происходить от следующих внешних и внутренни> ^ ‘снижения количества ингибиторов ПЦР необходимо
ИСТОЧНИКОВ’ соблюдать правила взятия клинического материала.
1) вещества, используемые при лечении пациента (например. ^ Дополнение к исследованию интерферирующих веществ
лекарственные средства); оценено влияние некротической ткани в образцах опухолей
2) вещества, встречающиеся в конкретных видах образцов - способность набора реагентов «Тест-ВКАР-ткань-5» выдавать
данном случае, загрязнение образца ткани гемоглобином кров“> ^“^Р»“с Результаты. Исследование влияние некроза было
гттш - (роведено на 9 образцах, которые имели некроз на уровне >50%,может ингибировать ПЦР при недостаточной очистке пр^ ^ к к jt'Titiir -зк определено в обзоре патологии. После проведения анализа спроведении процедуры выделения ДНК. г>г>лг- гп л. омощью набора реагентов «Тест-ВКАР-ткань-5» и интерпретацииИсследуемые концентрации интерферирующих вещест! ^ ^ ^ ^- гт г езультатов, полученные данные сравнивались с результатамикоторые, как ожидается, будут встречаться при нормально ^ А п^ . вунаправленного секвенирования данных образцов по Сэнгеру. Внабора реагентов «Тест-ВкЛг-ткань-5 ^ ^ ^ ,^ оде проведения исследования был выявлен 1
быть
использовании
приведены в таблице 5.
Таблица 5
Интерферирующие вещества
Эндогенные интерферирующие вещества
был
ожноотрицательный результат, что может
-------------------|Достаточным количеством ДНК.Максимальная ' ^ Ограничения по использованиюконцентрация
связано с
Гемоглобин 260 мкг/мл
Экзогенные интерферирующие вещества
Зелбораф (показан при неоперабельной или
метастатической меланоме, болезни Эрдгейма-
Честера (БЭЧ) с BRAF V600 мутацией)
0,048 мг/мл
1 Тафинлар (применяется для лечения 0,01 мг/мл
анализируемого
arepnajia:
* анализируемый материал не подлежит использованию при
арушении условий хранения и транспортировки (температура,
родолжительность, многократное замораживание-оттаивание),
нализируемая ДНК должна храниться при температуре от 2 до 8
- и использоваться для анализа в течение 24 часов. Для хранения
)лее 24 часов раствор ДНК рекомендуется хранить при
мпературе минус 20 °С.
24 25
--- стр. 14 ---
' при температуре минус 70 °С — длительно.
9. Подготовка компонентов набора для исследования
Установка, монтаж, настройка, калибровка медицинского
- не допускается использование образцов, загрязнённы)
посторонним биологическим материалом.
- минимальное содержание опухоли в образце для проведени
теста - 20% по результатам морфологического исследовани
опухолевого материала врачом-гистологом.
минимальное количество ДНК, которое необходимо ДЛ f^здeлия для ввода в эксплуатацию не требуется,
проведения анализа - 60 нг (30 нг ДНК на реакцию). Чистот, Тщательно перемешать содержимое пробирок переворачивая
анализируемой ДНК, выраженная в отношении oптичecки:^з^{дyJO пробирку 10 раз или перемешать на вортексе на низкой
плотностей (А260/280нм), необходимая для проведени:^,,( 0рос-ри g течение 3-5 сек, а затем осадить капли с крышек
исследования, должна составлять не менее 1,6- 1,8. ^^онцентраципро^прок коротким центрифугированием.
ДНК, достаточная для проведения исследования должна составлят^ ВНИМАНИЕ! Не встряхивать Taq-полимеразу на вортексе,
не менее 5 нг/мкл. цак это может инактивировать фермент.
8.3 Усювия воз.можного хранения анализируемы 10. Проведение анализа
образцов ПЦР-исследование состоит из следующих этапов:
Условия хранения пробы геномной ДНК человек; А) Подготовка ПЦР;
выделенной из образцов фиксированной в парафине ткани: Б) ПЦР-амплификация ДНК и гибридизационно-
Полученная ДНК должна храниться при температуре от 2 флуоресцентная детекция продуктов амплификации в режиме
8 ®С и использоваться для анализа в течение 24 часов. Д .реального времени»;
хранения более 24 часов рекомендуется хранить при температу[ В) интерпретация результатов (подробно описано в главе 11).
минус 20 °С.
Условия хранения исходного клинического материала: А) Подготовка ПЦР
Наиболее доступным клиническим материалом д. (производится в ЗОНЕ пре-ПЦР - помещении для
выделения ДНК является ткань, фиксированная в формалине аскапывания реагентов и подготовки к ПЦР-амплификации)
заключенная в парафин (FFPE-блоки). FFPE-блоки мог Общий объем реакции-20 мкл.
храниться при температуре комнатной температуре. ВНИМАНИЕ! Запрещено изменять объем реакции. При
Парафиновые срезы могут храниться при комнатн^зменении объёма чувствительность метода резко снижается!!!
температуре в течение 4 недель до выделения ДИК. ’ Непосредственно перед проведением анализа необходимо
Условия хранения биопсийного материала, предназначеннориготовить реакционные смеси (мастермиксы) для анализируемой
для выделения ДНК^:
- при комнатной температуре — в течение 6 часов;
- при температуре 2-8 ®С — в течение 3 суток;
- при температуре минус 20 °С — в течение 1 недели;
’ МУ 1.3.2569-09 Организация работы лабораторий, использующих методы
амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим
микроорганизмы T-IV групп патогенности
26
КК, ПКО и ОКО. Для этого в отдельных стерильных пробирках
1ешать все компоненты исходя из того, что для проведения одной
:акции необходимо взять 4 мкл ПЦР-смеси и 10 мкл Taq-
)лимеразы. Обязательно использовать отдельный наконечник с
розольным барьером для каждого компонента реакции каждой
>обы.
27
--- стр. 15 ---
Готовить мастермиксы необходимо согласно таблице 6. I
таблице учтен запас реактивов (+1 объём каждого вида) дл
компенсации возможных потерь при раскапывании.
ВНИМАНИЕ! При работе с Taq-полимеразой отбирайте и
пробирки нужный объем, не опуская наконечник глубоко
реагент, чтобы не взять избыточный объем фермента за счет ег
попадания на внешнюю поверхность наконечника.
Ес
V600K око ПКО 01 ■г
02 I 03 I 04 05 I Об 07 08 I 09 , О10
± Г L
01 - ДНК, выделенная из анализируемого образца №1 и т.д.
Б) ПЦР-амплификация ДНК и гибридизационно>
флуоресцентная детекция продуктов амплификации в режиме
Таблица 6 - Приготовление мастермиксов {в расчете на количестве времени»
анализируемых образцов). (производится в ЗОНЕ ПЦР — помещении для проведения
АЦР-амплификации)
I. Установить пробирки в реакционный модуль прибора для
ПЦР в «реальном времени». Обратите внимание, что приборы для
ПЦР в «реальном времени» должны обслуживаться, калиброваться
и использоваться в соответствии с рекомендациями производителя.
Использование данного набора в неоткалиброванном приборе
может оказать влияние на рабочие характеристики теста.
2. Запрограммировать прибор для выполнения
^соответствующей программы амплификации и детекции
1. Внести по 14 мкл каждого мастермикса в соответствующи(’'^°Р«‘'''®»™°™ согласно описанию для данного прибора
СМ. табл. 8, 9).
Количество
образцов
ПЦР-смесь,
мкл
Taq,
мкл
Итого,
мкл
1 16 40 56
2 20 50 70
3 24 60 84
4 28 70 98
5 32 80 112
пробирки согласно рекомендованному порядку расположения
реакций (см. табл. 7).
2. Внести по 6 мкл ОКО в пробирки «ОКО».
3. Внести по 6 мкл ПКО в пробирки «ПКО».
4. Внести по 6 мкл образцов ДНК в пробирки «О».
5. Заклеить ПЦР-планшет/закрыть пробирки, убедиться, ч
Таблица 8 - Программа амплификации
тр^вврдства «ДНК - Технолог ия»
для приборов
Стадия
все крышки или пленка прилегают плотно.
6. Открутить ПЦР-планшет/пробирки на центрифуге, m t o oJ"
собрать реакционную смесь на дне лунок, сохраняя правильну
ориентацию планшета или серии пробирок.
Температура, °С
95
95
64-е
Время
2 мин
5 сек
15 сек
Всего циклов
50
Таблица 7 - Рекомендуемый порядок расположения Таблица 9 - Программа амплификации для других приборов
Jpeaкций ^
ft, - ■ Стадия9 6 > л у н п ч н м и п л а н ш е т Температура, °С Время Всего циклов
Тест ; 1 2 ^ 3 4 ! 5 , 6 7 8 9 . 10 , 11 | 1 95 2 мин 1
У600Е/\жо ПКО ,0 1 02 03 04 ^ 05 1 Об ! 07 08 ^ 09 | (
28 29
--- стр. 16 ---
2 95 5 сек
3 62-; 15 сек
50
3. Запустить выполнение программы амплификации
детекцией флуоресцентного сигнала на стадии 3.
4. По окончании выполнения программы приступить
анализу результатов.
11. Регистрация и интерпретация результатов
обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР
детекцией в режиме «реального времени». Анализируют кривы
накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам:
— по каналу ГАМ регистрируется си
Таблица 11 - Интерпретация результатов в контрольных
мутантных вариантов гена BRAF.
- по каналу HEX регистрируется сигнал, свидетельствуюиц-
о накоплении продуктов амплификации ДНК нормальны
вариантов гена BRAF (выступает в качестве внутре
контрольного образца - ВКО).
Результаты интерпретируются на основании наличия (и;
; Пивбирки Правильный результат Невалидный результат
, ПКО Канал ГАМ и HEX: Ct< 35 Отсутствие подъема кривой
амплификации по HEX и/или
ГАМ
о ко Канал ГАМ и HEX:
отсутствие подъема кривой
амплификации |
Подъем кривой
амплификации по каналу
ГАМ и/или HEX (любой Ct)
Интерпретация результатов в контрольных образцах
отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установление Результат ПЦР-исследования считается достоверным, при
на соответствующем уровне пороговой линией, что определяе^^р^^,^^^^^^^^^ реакций V600E/Ec, V600K в пробирках с ПКО по
при отсутствииналичие (или отсутствие) для данной пробы ДНК значен}^^;^^^^ не позднее 35 цикла и
соответствующей графе впорогового цикла «Ci» в
результатов.
Принцип интерпретации результатов в исследуемых образи:
и контрольных образцах представлен в табл. 10 и табл,
соответственно.
Таблица 10 - Интерпретация результатов в исследуем
Пробирки Мутантная Мутантная Сомнительн
ДНК гена ДНК гена ый
BRAF BRAF не
табли1^|0д^^1^2кривой амплификации в пробирках с ОКО по каналам
|Ш иНЕХ.
Интерпретация результатов в исследуемых образцах
Интерпретацию результатов для исследуемых образцов
проводят только при правильных результатах для ОКО и ПКО
данной постановки.
Интерпретация производится с помощью программного
используемого прибора. Пороговая линия
устанавливается на уровне перехода кривых в экспоненциальную
4>азу роста.
30 31
обнаружена обнаружена
V600E/Ec,
" V600K
§
Канал ГАМ:
Ct<35
Канал HEX:
подъём
кривой
амплификаци
и (любой Ct)
или
отсутствие
подъёма
кривой.
Канал ГАМ:
отсутствие
кривой
амплификаци
и.
Канал HEX:
Ct<35
Канал ГАМ:
подъём
кривой
амплификац
ИИ, Ct > 35
Канал HEX:
Ct<35
Канал FAM:
отсутствие
кривой
амплификац
ИИ,
Канал HEX:
отсутствие
кривой
амплификац
ИИ или Ct>
35.