Масс-спектрометр microflex с принадлежностями — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 26 ---
э т о т м о м е н т с н о в а В К И 104aeTCfl OTKIIOHfiiOll.lee nolle, TOilbKO Y>f{e С npOTIIIBOnOilO}l{HO
nOilflpHOCTblO.TaKOpe}l{l/IM n p i i i B O A I I I T К K0MneHCa411 1 1 1 1 4а С Т 1114Н О Ю OTKIIOHeHI/lfl, 1/1Me10111ero MeCTO
n p l l l nonaAaHI/llll IIIOHOB В О б П а С Т Ш Н а o6ei/IX nepeAHIIIX rpaHfiX З П е К Т Р О А О В . С п о с о б п О З В О И А е Т
npiMMeHfiTb 111С К 111041/1Т е 11Ь Н О К О р О Т К 1/1е В р е М е Н а С е 1 1 е К 4 1 11111 IIIOHOB, 4 Т 0 OnfiTb } 1 { е n p i i i B O A I I I T К
yny4weH11110 pa3pewa10111eenoco6Hoa111.
I I
+HV
ov
llo J io jiU K a u u e
-H V
--- стр. 27 ---
Рисунок 3-8 Принцип действия селектора родительских ионов
3.1.4 Рефлектор
Главной задачей рефлектора является нормализация времен полета ионов с разными
энергиями.
Метастабильный распад ионов обуславливается избыточной энергией, получаемой во время
сложного процесса MALDI. Поскольку родительские и фрагментные ионы продолжают
двигаться с той же скоростью, они одновременно ударяют линейный детектор, таким
образом, сливаясь в единый пик и не давая спектра фрагментных ионов. Для разделения
фрагментных ионов в масс-спектрометр встраивается рефлектор. Ионы, обладающие
различными массами, имеют разную кинетическую энергию, и проникают в разные места
электрического поля; затем они отражаются и ударяют в рефлекторный детектор в разное
время.
Для получения хороших масс-спектров с разумным соотношением сигнал-шум, геометрия
рефлектрона должна отвечать особым требованиям по электричеству и размерам, главным
образом относительно размеров трубы дрейфа, а также типа и размера используемого
рефлекторного детектора.
Прибор microflex и другие времяпролетные масс-спектрометры серии “flex” используют
безрешеточный рефлектор с ионными линзами (Рис. 3-9). Фрагментные ионы, которые могут
появиться внутри рефлектора, а не во время полета в области дрейфа, будут формировать
нежелательный вьюокий химический фон.
Для минимизации времени пребывания ионов внутри рефлектора, рефлектор имеет два
отделения, в первом из которых сила поля гораздо выше. В результате рефлектор
становится короче, и длина бесполевого области дрейфа становится длиннее, по сравнению
с времяпролетными рефлекторами с одним отделением. Благодаря этой конструкции все
маленькие фрагментные ионы отклоняются, что позволяет снизить уровень шума. Кроме
того, безрешеточная входная линза рефлектора создает эффект пространственной
фокусировки, что позволяет повьюить чувствительность.
Рефлектор работает при потенциале, превосходящем ускоряющее напряжение источника
ионов приблизительно на два кВ.
--- стр. 28 ---
юземлсння
И о н н ы й И С Т О Ч Н И К
Безрешеточный рефлектор
с двумя отсеками
Рисунок 3-9 Распределение потенциальной энергии внутри безрешеточного рефлектора с
двумя отделениями
3.1.5 Детектор
Детектор преобразует ионный ток в электрический, который затем оцифровывается и
обрабатывается персональным компьютером.
Современные детекторы, используемые во времяпролетных масс-спектрометрах, созданы
на основе пластин с микроканалами (см. Рис. 3-10), т.е. твердых пористых пластин с
миллионами маленьких каналов ( =5-10 мкм, длина = 0.5-0.8 мм), покрытых изнутри
полупроводниковым слоем. Каждый из каналов работает как электронный умножитель,
независимый от соседних микроканалов. Для достижения максимального выхода электронов
все эти каналы элеетрически соединены параллельно.
Процесс умножения, происходящий в канале, изображен ниже.
--- стр. 29 ---
H V
С т е к л я н н а я / с т е н к а к а н а л а
П о л у п р о в о д н и к о в ы
В т о р и ч н ы е э л е к т р о н ы
Э л е к т р о н ы н а в ы х о д е
Рисунок 3-10 Принцип действия микроканала
Для нормального функционирования на микроканалы накладывается разность потенциалов
до 1000 Вольт. Это приводит к протеканию тока через полупроводниковый слой,
поставляющего электроны, необходимые для процесса умножения электронов.
Другим параметром, влияющим на производительность, является время отклика детектора.
Оно важно для предотвращения ухудшения разрешения пиков. Детекторы на основе пластин
с микроканалами производят выходное напряжение с десятикратно меньшим временем
нарастания сигнала (< 1 не) по сравнению с другими конфигурациями детекторов, такими,
как канальные электронные или дискретные динодные умножители.
--- стр. 30 ---
Каждый детектор microflex содержит две соединенные между собой пластины с
микроканалами. Линейный детектор оборудован опцией селекции пропускания “gating”^
позволяющей избежать возникновения эффектов насыщения, которые могут возникать в
связи с попаданием в детектор матричного вещества.
3.1.6 Цифровой преобразователь
После лазерного удара цифровой преобразователь начинает записывать входящие
аналоговые сигналы с детекторов и преобразовывать их в цифровую информацию.
Цифровая карта может работать со скоростью до 2 GS/sec. Это устройство вмонтировано в
ПК. Установки прибора соответствуют параметрам, заданным на странице D e t e c t o r
программы flexControl.
3.1.7 Лазерная система
Лазерная система работает с максимальной частотой следования импульсов 20 Гц. Она
поставляет пульсирующее лазерное излучение к маленькому пятну на мишени. Лазерная
система состоит из импульсного УФ-лазера^, регулятора усиления, позволяющего точно
настроить лазерный поток, системы линз для фокусировки лазерного луча, и системы зеркал
для направления лазерного луча в ионный источник на планшет мишени. Настройки прибора
задаются в программе flexControl.
3.1.8 Камера
Камера передает изображение пятна образца в сегмент по управлению мишенью Target
Manipulation Segment графического пользовательского интерфейса программы flexControl.
3.2 Конфигурация ПК
ПК управляет масс-спектрометром, а также собирает и хранит данные. Конфигурация
компьютера должна отвечать конфигурации при поставке, т.е., например, следующим
требованиям:
18-дюймовый жидкокристаллический дисплей, разрешение 1280 х 1024, True Color;
лазерный принтер:
операционная система Windows 2000;
^ Пожалуйста, обратитесь к Руководству Пользователя flexControl. “Gating” - это
дополнительная возможность системы, позволяющая детекгировать только те ионы,
которые представляют интерес. Все остальные ионы во избежание насыщения линейного
детектора подавляются, включая нейтральные осколки.
^ Обычно используют азотный лазер с длиной волны 337 нм (и энергией импульса 150 мкДж)
и шириной импульса 3 не для компонентов матрицы, поглощающих свет на этой длине
волны (класс опасности III В).
--- стр. 31 ---
программные наборы flexControl / flexAnalysis.
3.3 В озм ож ность удаленного сер ви сн о го обслуж ивания
http;//bdal.webex.com
щ " т
У д аленн ое
се р в и сн о е
о б сл уж и ван и е ш Д
\= п.........-
Клиент Служ ба се р в и са
Bruker D altonics
Рисунок 3-11 Принцип удаленного сервисного обслуживания
Для наиболее оперативного функционирования прибора microflex он имеет возможность
удаленного сервисного обслуживания (Рис. 3-11). Это позволяет выявлять неисправности
через Интернет. Таким образом, часто можно эффективно решить проблемы с помощью
персонального компьютера клиента, полностью управляемого службой сервиса Вгикег
Daltonics. Например, с помощью этой возможности можно обновлять программное и
аппаратное обеспечение.
Кроме того, за счет такой возможности значительно ускоряется процесс сервиса, поскольку
сервисный инженер после удаленной диагностики приедет к Вам уже с подходящей запасной
деталью.
Необходимое условие: 1Слиент должен иметь доступ в Интернет с управляющего
компьютера microflex.
Пример проведения удаленного сервисного обслуживания в Европе:
1. Зайдите на сайт http://bdal.webex.com. Появится окно, изображенное на Рис. 3-12.
2. На данной веб-странице выберите Join. Появится окно, изображенное на Рис. 3-13.
--- стр. 35 ---
Состав изделия масс-спектрометр microflex в следующих вариантах
исполнения: microflex LT/SH, microflex LRF:
1. Системный блок.
2. Монитор.
3. Устройство для печати.
4. Программное обеспечение специальное медицинское.
5. DVD-диск с программным обеспечением для управления, сбора и обработки данных.
6. DVD-диск с поисковым программным обеспечением для протеомики.
7. DVD-диск с программным обеспечением для управления прибором, выполнения
измерений и обработки спектров, для автоматизации измерений и обработки спектров,
для одновременного управления системой жидкостной хроматографии и масс-
спектрометром.
8. DVD-диск с программным обеспечением для интерпретации MS и MS/MS спектров
пептидов с возможностью поиска в глобальных протеомных базах данных.
9. DVD-диск с программным обеспечением для поиска в протеомных базах данных и
установленными протеомными базами данных (MSDB, NCBI, Swissprot) для
идентификации белков по MS и MSMS спектрам.
10. DVD-диск с программным обеспечением для поиска неизвестных соединений.
11. DVD-диск с программным обеспечением для статистической обработки получающегося
массива данных.
12. DVD-диск с программным обеспечением для исследования синтетических полимерных
структур.
13. DVD-диск с программным обеспечением для исследования структур сополимеров.
14. DVD-диск с программным обеспечением для исследования SNP-геномодификаций.
15. DVD-диск с программным обеспечением для определения качества олигонуклиотидов.
16. DVD-диск с программным обеспечением для масс-спектрометрического типирования
микроорганизмов по масс-спектрам специфичных белков с использованием входящей в
комплект базы данных.
17. База данных на DVD для масс-спектрометрического типирования микроорганизмов по
масс-спектрам специфичных белков.
18. DVD-диск с программным обеспечением для интегральной обработки массива
спектров.
19. DVD-диск с программным обеспечением для управления протеомными проектами,
хранения и обработки протеомных данных, включая системы поиска про протеомным и
базам данных пост-трансляционных модификаций белков и пептидов.
20. Серверная станция с предустановленным программным обеспечением для управления
протеомными проектами, хранения и обработки протеомных данных, включая системы
поиска про протеомным и базам данных пост-трансляционных модификаций белков и
пептидов.
21. Серверная станция с предустановленными белковыми поисковыми базами данных.
22. Набор для обслуживания масс-спектрометра:
- воздушный фильтр -1 шт.;
- входной фильтр -1 шт.;
- прокладки для диафрагмового насоса.
23. Форвакуумный мембранный насос.
24. Мишень для анализа образцов из нержавеющей стали.
25. Мишень для анализа образцов из полированной нержавеющей стали.
26. Мишень для анализа образцов из нержавеющей стали со структурированной
поверхностью.
27. Адаптер для крепления мишеней для анализа образцов в масс-спектрометре.
28. Набор мишеней для анализа образцов с предварительно нанесенной матрицей с 96
точками (10 шт. в комплекте).
29. Адаптер для мишеней для анализа образцов с предварительно нанесенной матрицей в
масс-спектрометре.
30. Набор мишеней для анализа низкомолекулярных соединений (NALDI) (5 шт. в
комплекте).
--- стр. 36 ---
31. Адаптер для мишеней для анализа низкомолекулярных соединений.
32. Калибровочная мишень.
33. Калибровочный стандарт для калибровки масс-спектрометра в низком пептидном
диапазоне (5 пробирок в комплекте).
34. Калибровочный стандарт для калибровки масс-спектрометра в высоком пептидном
диапазоне (5 пробирок в комплекте).
35. Калибровочный стандарт для калибровки масс-спектрометра в низком белковом
диапазоне (5 пробирок в комплекте).
36. Калибровочный стандарт для калибровки масс-спектрометра в высоком белковом
диапазоне (5 пробирок в комплекте).
37. Бактериальный калибровочный стандарт (5 пробирок в комплекте).
38. Калибровочный стандарт для калибровки масс-спектрометра анализа
олигонуклиотидов в низком массовом диапазоне (5 пробирок в комплекте).
39. Калибровочный стандарт для калибровки масс-спектрометра анализа
олигонуклиотидов в высоком массовом диапазоне (5 пробирок в комплекте).
40. Масс-спектрометрическая матрица НССА (5 пробирок по 200 мг в комплекте).
41. Масс-спектрометрическая матрица 3-НРА (5 пробирок по 200 мг в комплекте).
42. Масс-спектрометрическая матрица 2,5-DHAP (5 пробирок по 200 мг в комплекте).
43. Масс-спектрометрическая матрица SA (5 пробирок по 200 мг в комплекте).
44. Масс-спектрометрическая матрица 2,5-DHB (5 пробирок по 200 мг в комплекте).
45. Масс-спектрометрическая матрица SDHB (5 пробирок по 1 г в комплекте).
46. Масс-спектрометрическая матрица 2,3,4-ТНАР (5 пробирок по 200 мг в комплекте).
47. Масс-спектрометрическая матрица 2,4,6-ТНАР (5 пробирок по 200 мг в комплекте).
48. Масс-спектрометрическая матрица DIT (5 пробирок по 200 мг в комплекте).
49. Масс-спектрометрическая матрица IAA (5 пробирок по 200 мг в комплекте).
50. Система предварительного разделения образцов на основе ВЭЖХ с нано-потоками.
51. Колонки хроматографические.
52. Виалы.
53. Крышки для виал.
54. Септы для виал.
55. Стандартный образец (5 пробирок по 500 пмоль вещества/пробирке).
56. Набор для обслуживания ВЭЖХ с нано-потоками:
-3 капилляра с пластиковыми или металлическими ферулами и гайка;
-3 капилляра от дегазатора до автосемлера;
-2 капилляра с фильтром и фитингом;
-1 комплект (нанолитровый тройник с нулевым мертвым объемом (1/32 дюйма диаметр
трубки);
-10 трубок с диаметром 360 мкм;
-1 петля на 20 мкл;
- 2 комплекта подачи жидкостей (пластиковый тройник с 3 фитингами, 3 ферулами и 2
капиллярами);
-1 набор (плоские фильтры 2 шт.);
-1 линия смешения жидкостей (пластиковый тройник, 5 пластиковых ферул, 5
пластиковых фитинга, 3 капилляра, 1 стальная ферула, 1 стальной фитинг);
-1 игла для автосемплера;
-1 капилляр для выходы с колонки с фитингом, фильтром и ферулой;
-1 линия сброса избытка растворителя (капилляр фитингом и ферулой);
-1 трубка с фитингом и ферулой.
57. Набор для запуска ВЭЖХ с нано-потоками;
-1 игла для автосемплера;
-1 комплект плунжерных шайб (4 шт. в комплекте);
-1 прокладка для клапана;
-1 капилляр для выходы с колонки с фитингом, фильтром и ферулой;
-1 линия сброса избытка растворителя (капилляр фитингом и ферулой);
-1 капилляр с пластиковыми или металлическими ферулами и гайка;
-1 набор предконок (3 шт. в комплекте);
-1 колонка;
--- стр. 37 ---
-1 набор капилляров (2 см, 1/32 диаметр, 30 шт.).
58. Система автоматического нанесения образцов на базе роботизированного комплекса
пробоподготовки ВЭЖХ-MALDl, обеспечивающий сбор фракций от жидкостного
капиллярного или нано-хроматографа и нанесение их на мишени для масс-
спектрометра.
59. Источник бесперебойного питания.
--- стр. 38 ---
А Л Ф А В И Т Н Ы М У К А З А Т Е Л Ь
А
Анкерная технология AnchorChip 23
Б
Блок управления 15
В
Вакуумная система 19
Включение и выключение прибора 32
Входы и выходы 13
Д
Детектор 27
3
Задняя панель компьютера 14
Знаки безопасности 7
К
Камера 29
Л
Лазерная продукция класса опасности I I I 18
Лазерная система 29
М
Меры предосторожности при управлении прибором 8
Н
Наладка 12
Нормативы 9
О
Отклоняющее напряжение/подавление матрицы 24
П
Планшеты Micro SCOUT 23
Прибор 5
Проверка готовности прибора 32
С
Селектор родительских ионов, PCIS 24
Селекция пропускания 29
Схема ионного источника 20
Схема прибора 15
Соблюдение законодательных требований 9
Т
Текстовые обозначения и символы 8
--- стр. 40 ---
П Р И М Е Р Ы И С П О Л Ь З О В А Н И Я М А С С - С П Е К Т Р О М Е Т Р О В
M A L D I - T O F
Ячейки с гидрофильными центрами связывания: высокопроизводительная
идентификация белков на субфемтомолярном уровне
Показано, что использование пластин мишеней с маленькими гидрофильными центрами
связывания (анкерами) на гидрофорбном покрытии (AnchorChip™ ) приводит к 10- и 100-
кратному увеличению чувствительности в M ALDI-TOF и тандемной масс-спектрометрии
по сравнению с т радиционными стальными мишенями [М. Schurenberg et al., Prestructured
MALDI-MS Sample Supports, Anal. Chem. 72 (2000) 3436ff.].
S t e e l T a r g e t A n c h o r C h i p
u C ?'
'
^
' ^ ’ « ' V * .< »
Для приготовления
пластин AnchorChip на
гидрофильный центр
ячейки - анкер - наносят
крупную каплю (0,5-3 мкл),
содержащую матрицу и
анализируемое вещество.
После высушивания она
стягивается до размера
этого центра, ограничивая,
таким образом, площадь
образования кристаллов
матрицы до точно
определенных размеров
(Фиг. 1). В результате
такого высушивания, в
отличие от обычного
процесса «высушивания
Ф иг. 1: П р и н ц и п п о д го т о в к и A n c h o rC h ip .
капель», концентрация
Т о гд а ка к н а с т а н д а р т н ы х с т а л ь н ы х м и ш е н я х к а п л и , с о д е р ж а щ и е м а т р и ц у и
а н а л и з и р у е м о е в е щ е с т в о , п р и в ы с у ш и в а н и и з а н и м а ю т д о в о л ь н о б о л ь ш о е анализируемого вещеСТВа
п р о с т р а н с т в о (з д е с ь п о к а з а н п р и м е р в с л у ч а е DHB), н а м и ш е н я х A n c h o rC h ip повышается на
о н и с т я ги в а ю т с я , и о б р а з у е м ы е к р и с т а л л ы з а н и м а ю т т о ч н о о п р е д е л е н н у ю коэффициент, зависящий
п л о щ а д ь . размера гидрофильного
центра.
Материалы и методы
1 2 mm I
--- стр. 41 ---
Для пробоподготовки использовали восьмиканальный робот-пипетатор (тар11/8^“, Bruker
Daltonics, 15 мин/мишень). На ряды гидрофильных анкеров (AnchorChip, диаметр 600 мкм) и
на стандартные стальныеAnchorChip Steel Target
25 amol
125 amol
250 amol
500 amol
2.5 fmol
25 fmol
O n i B u lla t- o n * u m p l« .
383 M m p le s - one target.
Oreen: (denttfied
VeHow: UiicvrtHin
Red; Unidentified
Grey; no pealcs
мишени наносили гидролизат
белка (трипсиновый
гидролизат бычьего
сывороточного альбумина),
используя различные
количества образца. Для
проведения каждой серии
анализов использовали 383
образца с одинаковым
количеством вещества, а
также одну пептидную смесь
для внешней калибровки.
Для подготовки мишеней
AnchorChip на анкеры
наносили 2,25 мкл матрицы
( -циано-4-
гидроксициннамовая кислота
{ -cyano-4-hydroxycinnamic
acid, НССА), 0,2 г/л в смеси
этанол:ацетон 4:1) и 0,25 мкл
образца (трипсиновый
гидролизат белка при
различном разбавлении). Для
подготовки стандартных
Фиг. 2: Результаты серийного поиска для различных количеств образца. Стальных МИШенеЙ наносили
0,75 мкл матрицы (НССА, 5 г/л в 30% ацетонитриле с добавкой 0,1% трифторуксусной
кислоты). Использовали условия пробоподготовки «DD», с соответствующими
соотношениями образец/матрица. Автоматический сбор спектров осуществлялся на приборе
BIFLEX 1 !!^ “ (Вгикег Daltonics). Скорость сбора данных составляла 30-60 сек./образец и
зависела от качества образца. Для одного образца собирали 200 масс-спектров.
»оеомово
--- стр. 42 ---
Сочетание автоматического сбора масс-спектров и серийного поиска по базам данных
(biotools™/Bruker Daltonics; MSDB, Mascot/Matrix Science) показали увеличение
чувствительности, достигаемое с помощью анкерной технологии. Результаты поиска по
базам данных быстро оценивались алгоритмом с гибким регулятором. В основном эта
оценка основывалась на покрывающей способности базы данных в отношении
последовательностей и индекса Моуза. После перенесения отчетов об оценке поиска в
Microsoft Excel проводился статистический анализ для сравнения результатов поиска по
обоим типам мишени.
Результаты и их обсуждение
Samples Identified ("Green Bullets") Average Score (IVIowse)
1 М % -
...................
' •...............
8 0 % -A n c tio iC h Ip
« 0 % .
/ /
4 « % .
/ S tM l T a rg e t
2 0 % - • /
0 % . • . . •
O.lknol K m ot lOfmol
Sample amount per preparation Sample amount per preparation
Фиг. 3: Статистика серийных поисков. Слева: Сравнение относительного количества надежно проведенных
идентификаций на стальных мишенях и на AnchorChip. Оценка надежности производилась алгоритмом
BioTools. Справа: Сравнение средних индексов Моуза для пробоподготовки на стальных мишенях и на
AnchorChip, полученная Mascot на основе серийного поиска по базам данных.
Все демонстрируемые результаты были получены при использовании полностью
автоматизированных процедур; пробоподготовки, сбора данных, аннотирования с
использованием поисков Mascot. Вручную задавались только параметры самого
анализа.
--- стр. 43 ---
е
Ч Я
SocHiMlP |т«|кЕ(Яо(|ОимуР<
S c o ih e P « « M lir №
90% идентификаций на AnchorChip
проводились на уровне 200 амоль
вещества, тогда как на стальных
пластинах эта величина
составляла 10 фмоль (получена в
результате интерполяции).
Независимо от количества
образца, AnchorChip всегда давал
лучшие результаты поиска, чем
стальные мишени; индекс Моуза
для AnchorChip всегда был по
меньшей мере на 50 единиц выше.
(Фиг. 2, 3).
Еще более высоких величин
индекса 1 \/1 о уза можно достичь при
использовании более сложной
процедуры пробоподготовки,
используя 64 позиции для внешней
калибровки соответствующих
окружающих данную ячейку
образцов (Фиг. 4). Таким образом,
средний индекс Моуза может быть
Ф иг. 4: К а л и б р о в к а по б л и ж а й ш е м у с о с е д у .
повышен с 84 (500 амоль, для
Д л я это го э к с п е р и м е н т а б ы л а в ы б р а н а б о л е е с л о ж н а я
к р у п н о ф о р м а т н а я т а б л и ц а (с в е р х у ). Д л я а в т о м а т и ч е с к о й к а л и б р о в к и одноточечной калибровки М И Ш е н и )
п р и б о р а б ы л а в ы б р а н а о д н а к а л и б р о в о ч н а я с м е с ь (н а р и с у н к е с н и зу до 148 (500 амоль, калибровка П О
о н а о б о з н а ч е н а б е л ы м и к р у ж к а м и ). К а л и б р о в к а по д а н н о м у п я тн у ближайшей СОСеднеЙ ТОЧКе С
и с п о л ь з о в а л а с ь д л я о к р у ж а ю щ и х е г о о б р а з ц о в (5 0 0 а м о л ь в е щ е с т в а ,
сильно
н а н е с е н н о го н а A n c h o rC h ip ). П о л у ч е н н ы й с р е д н и й и н д е к с М о у з а (1 4 8 )
бы л с у щ е с т в е н н о в ы ш е , ч е м д л я м и ш е н е й , к а л и б р о в а н н ы х т о л ь к о по Отклонением при поиске ПО базам
о д н о й п о зи ц и и . данных).
- Демонстрируемые данные были получены для модельного гидролизата. Реальные
образцы могут содержать посторонние вещества, осложняющие кристаллизацию
матрицы на мишенях AnchorChip. 1 \ / 1 ы установили, что решить эту проблемы такого
рода можно, используя автоматизированные процедуры промывки мишени и
перекристаллизации (см. документ «Система 1 \/1 Т -6 0 серии flex: области применения»).
Однако для реальных образцов необходимо индивидуально оптимизировать
соседней
снижающимся
точке
массовым
--- стр. 63 ---
проанализированы методом MALDI-TOF масс-спектрометрии, после чего определение
генотипов проводили с использованием программы genotools. Автоматическое измерение и
распознавание аллелей с высокой степенью надежностью были проведены в 90% образцов.
Автоматизированные анализы характеризовались вьюокой производительностью и
приводили к однозначному определению генетических вариаций. Статистическое
распределение соответствует результатам недавно опубликованного клинического
исследования [4], где ДНК-анализ проводили секвенированием Сэнгера. В
противоположность той длительной и дорогой процедуре, с помощью простого масс-
спектрометрического анализа, в сочетании с автоматизацией, можно бьютро получить
эквивалентные вьюоконадежные результаты. При этом постановка анализа и
пробоподготовка просты в исполнении, и процедура строго нацелена на анализ
определенного интересующего нас SNP. Поскольку условия ПЦР для амплификации SNP,
содержащих геномные области, строго определены, за один день можно проанализировать
до 192 образцов, получить результаты и интерпретировать их.
В заключении мы показали, что MALDI-TOF масс-спектрометрия в сочетании с простыми
средствами для автоматизации является прекрасным инструментом для лабораторий,
занимающихся генотипированием. В зависимости от степени автоматизации MALD1-T0F
прибора могут быть удовлетворены все требования для подходов к SNP генотипированию
как для низкопроизводительных аналитических исследований (<192 образцов в день), так и
для проведения широкомасштабных геномных скринингов с производительностью более
10000 образцов в день.
Материалы и методы
Приготовление человеческих геномных ДНК
Геномные Д Н К получали из крови, используя комплект QIAmp m ini kit (Qiagen, Германия) в
соответствии с инструкциями производителя.
ПЦР
Геномные участки, содержащие полиморф, амплифицировали методом ПЦР. Все реакции
удлинения праймера и ПЦР проводили в термоциклизаторе MJ РТС 225 Tetrad (MJ
Research, США).
В качестве праймеров и для ПЦР, и для аллель-специфичного удлинения праймера
использовали регулярные 2 ’-дезоксиолигонуклеотиды ('МИ/G Biotech, Германия) и
перечислены ниже в направлении от 5' к 3'. Праймерами для ПЦР-амплификации были:
AG CAG TCATTATG G CG AACCTи GAAAGATGGTGAAAACAGGAAGA.
Термоциклирование проводили на 96-ячеечной микропластине (Biozym, Германия) при
общем реакционном объеме 10 мкл. Д ля ПЦР совместно использовали 0,5 U полимеразы
Tag DNA (Qiagen, Германия), 100 мкМ dNTPs (Рготеда, Германия) и 2,5 пмоль каждого
--- стр. 64 ---
праймера, а также 5 нг геномной ДНК. Реакции проводили в коммерческом реакционном
буфере, содержащем раст вор Q (Qiagen, Германия) и 1.5 мМ МдС1г (финальная
концентрация). Условия проведения ПЦР: 2 мин при 94°С, зат ем 35 следующих циклов: 10 с
при 94°С, 30 с при 58°, 30 с при 72°С, после чего следовало финальное удлинение - 2 мин
при 72°С. Ампликон ПЦР был размером 801 Ьр.
Очистка продуктов ПЦР
Микропластину с 96 ячейками вручную переносили из термоциклизатора в магнитно
шариковую рабочую ст анцию тарН/риге. Д ля очистки ПЦР продуктов использовали
комплект для очистки Д Н К депориге ds фирмы Daltonics на платорме-роботе. Для
очистки образца 96 ПЦР фрагментов использовали параметры «по умолчанию». На одну
ячейку (10 мкл ПЦ Р продукта) использовали 3 мкл магнитных шариков и 12 мкл
связывающего буфера ds, чтобы связать двухцепочечные ДНК-фрагменты на
поверхности шариков. ДНК, иммобилизованные на шариках, несколько раз промывали 50
мкл эфирного промывочного буфера в соответствии с инструкциями производителя.
После промывания шарики высушивали и использовали непосредственно в качестве
темплатов для последующ ей реакции удлинения праймера.
Аллель-специфичная реакция удлинения праймера
Использовали 10 пмоль удлиняемого праймера, по 100 мкл dG TP (Рготеда, Германия),
ddATP и ddTTP (Biolog, Германия) и 1,0 U Термосеквеназы (Amersham Phanriacia) в
коммерческом реакционном буфере. Общий реакционный объем составлял 20 мкл.
Реакционные смеси для удлинения праймера распределялись автоматически 8-игловым
робот ом из смеси, нанесенной на 8-ячеечных полосах. После распределения реагентов
микропластину вручную переносили в термоциклизатор. Условия термоциклирования
были следующими: 2 мин при 94°С, зат ем 30 следующих циклов: 10 с при 94°С, 30 с при 55°
и 60 с при 72°С. Удлиняемый праймер: GGGGCCTTGGCGGCTAC.
Очистка продуктой аллель-специфичного удлинения праймера
М икропластину с 96 ячейками, опять же, переносили на плат форму станции тарИ/риге.
Для очистки одноцепочечных Д Н К использовали комплект для очистки Д Н К депориге оНдо
фирмы Daltonics, контролируемый соответствующей программой. Д ля очистки 96
образцов использовали параметры «по умолчанию». На одну ячейку (20 мкл образца)
использовали 5 мкл магнитных шариков и 50 мкл связывающего буфера оНдо, чтобы
связать одноцепочечные ДНК-ф рагмент ы на поверхности шариков. ДНК,
иммобилизованные на шариках, несколько раз промывали 50 мкл эфирного промывочного
буфера в соответствии с инструкциями производителя. После высушивания шариков
Д Н К извлекали в 10 мкл элюирующего буфера.
Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа
--- стр. 65 ---
3-Гидроксипиколиновую кислот у (3-НСА) концентрацией 10 мг/мл, содержащую 1 мг/мл
гидроцитрата диаммония, использовали в качестве матрицы. Матричный раствор
объемом 1 мкл наносили робот ом тарН/риге в предварительно выбранном 96-ячеечном
формате на M ALDI мишень AnchorChip 400 фирмы Вгикег (диаметр анкера 400 мкм).
Пятна матрицы ост авляли при комнатной температуре до высушивания. На
высушенную мат рицу с помощью 8-игольного пипетатора наносили 1 мкл элюированного
продукта аллель-специфичной реакции удлинения праймера. После высушивания образцов
приготовленную MALDI мишень вручную переносили во времяпролетный масс-
спектрометр biflexlll с ионным источником scoutMTP.
Автоматическое измерение, сбор данных и распознавание аллелей
Автоматические измерения контролировались программным комплектом для
автоматизации AutoXecute 4.0. Автоматическое распознавание аллелей производилось
программным модулем genotools 1.0, работающим в среде программы по обработке
данных xM ass 5.1.
Литература
[1] СоШпде J, Sidle KCL et al. Nature 1996; (383): 685-690.
[2] Ironside JW. Arch Virol SuppI 2000; (16): 143-51.
[3]A g u zziA , Montrasio F, Kaeser PS. NatRevMol Cell Biol. 2001 Feb; 2(2): 118-26.
[4] Alperovitch A, Z e n -le t al. The Lancet 1999; 353(9165): 1673-1674.
[5] Palm er MS, Dryden A J et al. Nature 1991; (352): 340-341.
[6] Sauer S, Lechner D et al. Nucleic Acids Res. 2000. 28: elOO.
[7] Sauer S, Lechner D et al. Nucleic Acids Res. 2000. 28: e13.
[8] Bruker Daltonics Application Note MT-56.
[9]P usch W, K ra u te rK e t al. Biotechniques 2001; (30): 210-215.
Томас Фрёлич, Дирк Питерс, Жаклин Биммлер, Стефани Гагнер, Томас Вензел, Маркус
Кострзева
Вгикег Saxonia Analytic GmbH/ Bruker Daltonics GmbH
--- стр. 66 ---
Пронумеровано и
прошнуровано С лист(ов)а