Набор реагентов для выявления микобактерий туберкулеза и определения их лекарственной чувствительности к рифампицину и изониазиду методом гибридизации на биологическом микрочипе (ТБ-Биочип-1) по ТУ 9398-001-02699501-2010 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 6 ---
аизуалыю .
8.3.1.2.2. О хладить расплав до тем пературы +45-55 °С и добавить 1,7 м кл раствора
Э тнд Б р ом .
8.3.1.2.3. Тщ ательно перемеш ать расплав и залить в ф орму для электроф орезного
геля с гребенкой для образования л ун о к. Д альнейш ие операции с гелем проводить только
после его осты вания при ко м на тно й температуре (+18-25 П С).
8.3.2. П ро веде и ие эле ктр оф о р е за.
8.3.2.1. Заполнить электрофоре ш у ю камеру буфером для проведения
электрофореза.
8.3.2.2. И звлечь электроф орезны й гель из формы (см п. 8.3.1.2.3) и пом естить его в
электрофоре ш у ю камеру.
8.3.2.3. В отдельные лун геи % -лупочиого планшета перенести из П ЦР-пробирок по 9 мкл
К-*- и К-, а также исследуемых образцов, и добавить к ним по 1 мкл З Б -2. В отдельную лунку
поместить 2 мкл молекулярного маркера Lad d er, добавить к нему 7 мкл дистиллированной
воды и 1 мкл )Ь~2
8.3.2.4. Приготовленные смеси перемешать и перенести по 8 мкл в отдельные лунки
электрофорезного геля.
8.3.2.5. Провести электрофорез при 10 В /см в течение 10 мин.
8.3.2.6. В ы клю чить прибор для проведения электрофореза и извлечь из него
э лектро форез н ый гель.
8.3.2.7. Просмотреть гель в проходящем ультрафиолетовом свете на
трансиллюминаторе. При необходимости полученные результаты можно документировать с
помощью пленочного или цифрового фотоаппарата с оранжевым светофильтром, либо
используя специализированную систему гель-документации.
8.4. Учет результатов 1 этапа ПЦР.
8.4.1. Проверка отрицательного контроля.
В дорожке, содержащей отрицательный контро:а> «К-», светящиеся полосы должны
отсутствовать. Если в отрицательном контроле присутствует одна или несколько светящихся полос,
эго свидетельствует о контаминации раствора/ов продуктами амплификации или Д Н К
положительного контроля. При наличии светящихся полос в отрицательном контроле результаты
ПЦР признаются недействительными.
8.4.2. Проверка положит ельного контроля.
В дорожке с положительным контролем «К+» должен выявляться набор полос следующего
размера: 309 п.н. (1S611Ö), 212 п.п. {гроН\ 166 п.и. (ka/G), 133 п.н. {inh A \ 126 п.н. {акрС). Если в
положительном контроле отсутствуют светящиеся полосы, то такой результат свидетельствует о том,
что реакция не прошла. Эго может- быть вызвано потерей активности фермента, либо тем; что не
добавлен один из компонентов реакции, либо произошел сбой в работе амплификатора
(неисправность прибора, неверно задана программа, произошло кратковременное отключение
питания прибора и т.п.). При отсутствии вышеуказанных полос в положительном контроле
результаты ПЦР признаются недействительными.
8.4.3. Учет результатов анализа образцов.
В дорожках с исследуемыми образцами Д Н К Микобактерий туберкулеза должен выявляться
шюор полос следующего размера: 309 п.н. (IS6110). 212 п.н. {гроН\ 166 п.н. (kafG), 133 п.н. 126
ям. (ahpC). Наличие амплифицированного фрагмента Д Н К в виде светящейся полосы в дорожке с
исследуемым образцом мокроты, соответствующей 309 п.н.. свидетельству tri' о присутствии в образце
Д Н К Микобактерий туберкулеза. Если данная полоса не выявляется, то считается, что в данном
образце Микобактерии туберкулеза отсутствуют, при этом П этап ПЦР и гибридизация на чипе не
проводятся.
8.4.4. Для определения лекарственной чувствительности Микобактерий туберкуле:« к
рвфампицииу и изомиазиду необходимо проведение II этапа ПЦР. Для проведения II этапа ПЦР
шхльзуются лишь ге образцы, в которых была выявлена Д Н К Микобактерий туберкулеза на 1 этапе
ПЦР. *
8.5. П роведение И этапа П Ц Р (ко м п л е кт № 2).
--- стр. 7 ---
ф
8.5.]. Приготовить пробирки вместимостью 500 мкл ятя проведения II этапа ПЦР,
пронумеровать и расположить их в штативе соответствующим образом ..«К+», «К-» и исследуемые
образцы после проведения I этапа ПЦР. Реакционную смесь, полученную на 1 этапе амгигификации,
используют в качестве матрицы на (I папе реакции амплификации с праймерами для проведения
второй стадии ПЦР. В качестве отрицательного контроля используют «К-» из комплекта Ж? набора
реагентов.».
8.5.2. Приготовить реакционную смесь для проведения II этапа ГИДР (комплект № 2). В
стерильную пробирку для приготопления реакционной смеси вместимостью 500-1500 мкл в
зависимости от числа анализируемых образцов N (включая «К+» и «К-») внести следующие
компоненты набора в указанных ниже последовательности и количест ве:
Вода деионизованная 3 7 х (N +1) мкл
ПЦР-буф 5,0 х (№ 1) мкл
дНТФ 5,0 х (N + 1) mkj I
ПР-2 1,0 х (N + 1) мкл
Tag ________________ 1,0 х (N +1) мкл
Общий объем 49 х (N+ J} мкл
8.53. Тщательно перемешать смесь и внести по 49 мкл в пробирки, подготовленные для
проведения ПЦР.
8.5.4. !хл и используется амплификатор без подогрева крышки, в каждую пробирку внести по 50
мкл вазелинового масла BIY1 для предохранения реакционной смеси от испарения при амплификации.
8.5.5. Огобрать по I мкл амнлификационной смеси из каждой пробирки после 1 этапа ПЦР и
внести в пробирки со смесыо для проведения II этапа ПЦР. Удалить со стенок пробирок капли смеси
центрифушроанием при комнатной температуре (4-18-25 °С) в течение 10 с при 1000 g.
8.5.6. Поместить пробирки в амплификатор и провести ПЦР по следующей профамме (см
таблицу 2).
Illa r
программы
Температура, "С Время
1 +95 (предварительная денатурация)
2
+95 (денатурация)
+65 (отжиг праймеров)
+72 (удлинение праймеров)
3 +72 (окончательная инкубация)
выдержки
5 мин
20с
3 0 с
20 с ..
5 мин
Количество циклов
_
36
I
8.6. Проведение элекгро(]к>реза после II эта]¡а ПЦР (комплект № 3).
Проводится гак, как это указано в п. 8.3.
8.7. У ч е т результатов И этапа I I I ДР.
8.7.1. Проверка отрицательного контроля.
В дорожке с отрицательным контролем «К-» светящиеся полосы должны отсутствовать. При
наличии светящихся полос в отрицательном когпроле результаты ПЦР признаются
аедейсшителы гыми.
8.7.2. Проверка положительного контроля.
В дорожке с положительным контролем должен наблюдаться набор полек с длинами в
;*шервале от 90 до 140 н.п.
8.7.3. Учет результатов анализа образцов.
В дорожке с исследуемым образцом должен наблюдаться набор полос с длинами в интервате от
90 до 140 н.п. В случае отсутствия вышеуказанных полос результаты 11ЦР считаются
^действительным и.
8.8. Проведение гибридизации (ком плект ы № № 4 и 5)
8.8.1. Перенести 12 мкл реакционной смеси после второй стадии ПЦР в пробирку вместимостью
500 мкл. Если при амплификации использовалось вазелиновое масло В М , следует избегать его
попадания в наконечник пинетки.
8.8.2. Добавить 24 мкл раствора Г К и перемешат ь на вортексе в течение 5 с.
7
--- стр. 8 ---
8.8.3. Нанести на микрочип 28 мкл полученной смсси через любое из двух отверстий его
гибридизационной камеры, после чего оба отверстия в крышке камеры заклеить гермешзирующей
лентой. При заполнении следует избегать образования воздушных пузырей внутри камеры.
8.8.4. Пронести гибридизацию в закрытом суховоздушном термостате при +37 °С в л ечение 14-
18 ч.
8.8.5. По окончании гибридизации удалить гибридизанионную камеру, используя специальный
клапан сбоку камеры. Нанести 100 мкл буфера МБ-3 на поверхность микрочипа и инкубировать 10 с
при комнатной температуре (+18-25 °С). Удалить буфер с поверхности микрочипа и повторить
операцию промывки один раз, после чего быстро ополоснуть микрочип дистиллированной водой для
предотвращения образования солевых разводов.
8.8.6. Высушить микрочип в струе воздуха до полного исчезновения капель на поверхности
подложки.
8.9. У ч е т результатов гибридизации.
8.9.1. Результаты гибридизации регистрирую т с помощ ью комплекса аппаратно-
пробам много для анализа изображений биологических микрочипов «Чип детектор-03».
И нсталляция и эксплуатация ком пл екса осущ ествляется в соответствии с И нструкц ие й по
пользованию ком пл ексом «Ч ипдетектор-03».
8.9.2. Произвести запуск программы «ТубЛналнз», которая поставляется вместе с
комплексом. При запуске на экране компьютера должна появиться схема микрочипа с
указанием отдельных ячеек и обозначением находящихся в них зондов. Названия зондов
соответствуют детектируемым мугациям (Рис. 1).
8.9.3. Биологический микрочип после проведения гибридизации, удаления
гибридизационной камеры, ополаскивания и высушивания поместить в держатель
«Чипдетектора-03» так, чтобы активная область, содержащая ячейки геля, оказалась сверху и
была ориентированной под оптическую ось прибора (этому соответствует положение
«активная область вглубь «Чип детектора-03 > > ).
8.9.4. Установить экспозицию в миллисекундах (мс) в диалоговом окне в правой части
жрана программы, предварительно переключившись на закладку «Снимок» (выбирается в
пределах 10-10000 мс). В случае пере- или недоэкспозиции программа выдает предупреждение
о необходимости уменьшения/увеличения выдержки.
8.9.5. Нажать курсором мыш и пиктограм м у с надписью «П уск» в верхней части экрана.
При этом происходит освещение ячеек микрочипа светом возбуждающ их лазеров,
автоматический захват изображения и автоматический вывод результата. В случае, если
обнаружена чувствительная к рифампицину и изоииазиду форма туберкулеза, программа
выдает сообщение «Ш тамм чувствителен к рифампицину. Ш тамм чувствителен к изониазиду».
В случае, если обнаружена устойчивая к рифампицину форма туберкулеза, программа выдает
сообщение «Ш тамм устойчив к рифампицину». В случае, если обнаружена устойчивая к
изониазиду форма туберкулеза, программа выдает сообщение «Ш тамм устойчив к изониазиду».
8.9.6. Оператор может визуально проконтролировать флуоресцентное изображение на
биологическом микрочипе. Для этого после завершения процедуры автоматической
интерпретации результатов (см и. 8.9.5) следует переключиться па закладку «Снимок» в правой
части экрана и визуально проконтролировать автоматическое наложение сетки на изображения
ячеек микрочипа (Рис. 2). В случае некорректного наложения сетки следует «протащить»
мышкой левую и правую нижние элементы сетки до соответствующ их ячеек микрочипа. При
этом сетка должна полностью наложиться на изображение микрочипа. После этого следует
переключиться на закладку «Отчет» и снова проверить выдаваемые программой результаты
ГРнс. 3).