Набор реагентов «ОРВИ-монитор» для дифференциального выявления нуклеиновых кислот 12 респираторных вирусов (вирусов гриппа А и В, вирусов парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусов, бокавирусов, респираторно-синцитиального вируса, риновирусов, энтеровирусов и коронавирусов) в клиническом материале методом мультиплексной обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени по ТУ 9398-001-57992145-2011 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 ---
УТВЕРЖДЕНА
Приказом Росздравнадзора
от №
«УТВЕРЖДАЮ»
Директор Учреждения
Российской академии наук
Инновационно
центр «Б И О Л ;
соедин
скии
РАН
ИНСТРУКЦИЯ
по применению набора реагентов «ОРВИ-Монитор»
для дифференциального выявления нуклеиновых кислот 12 респираторных
вирусов (вирусов гриппа А и В, вирусов парагриппа 1, 2, 3, 4 типов,
аденовирусов, бокавирусов, респираторно-синцитиального вируса,
риновирусов, энтеровирусов и коронавирусов) в клиническом материале
методом мультиплексной обратной транскрипции и полимеразной цепной
реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени
Москва 2011
--- стр. 2 ---
1. НАЗНАЧЕНИЕ
1.1. Набор реагентов предназначен для выявления в клинических образцах нуклеиновых
кислот (НК) основных возбудителей респираторных вирусных инфекций человека - вирусов
гриппа А и В (ВГА и ВГВ), вирусов парагриппа 1, 2, 3, 4 типов (В П П -4), аденовирусов (АДВ),
бокавирусов (БВ), респираторно-синцитиального вируса (РСВ), риновирусов (РВ), энтеровирусов
(ЭВ) и коронавирусов (КВ) в присутствии внутреннего положительного контроля (ВПК).
1.2. Область применения набора реагентов - лабораторная диагностика вирусных
инфекций, эпидемиологический надзор, научные исследования. Набор реагентов «ОРВИ-
Монитор» может быть использован в учреждениях медицины и здравоохранения, в том числе в
диагностических лабораториях инфекционных больниц и других лечебно-профилактических
учреждений, вирусологических лабораториях Центров гигиены и санитарии Роспотребнадзора, в
эпидемиологических службах для быстрой расшифровки вспышек ОРВИ и для мониторинга
эпидемиологической обстановки в регионах.
2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА
2.1. Принцип действия
Набор реагентов основан на использовании двух последовательных полимеразных реакций:
мультиплексной реакции обратной транскрипции (ОТ) на матрице вирусной РНК для получения
кДНК (комплементарная ДНК) и мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) для
амплификации полученной кДНК матрицы (либо вирусной ДНК в случае аденовирусов и
бокавирусов, имеющих ДНК-геном). Обе реакции проводятся последовательно в одной ПЦР-
пробирке, что сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации и
возможность ошибки при переносе кДНК в другую пробирку для постановки ПЦР.
Мультиплексный формат постановки ПЦР подразумевает наличие в реакционной смеси
нескольких наборов праймеров и меченных различными флуоресцентными красителями зондов
разной специфичности, что позволяет выявлять в одной пробирке до 4 возбудителей ОРВИ.
Детекция продуктов амплификации осуществляется в режиме реального времени с
использованием принципа выщепления 5' концевой метки).
2.2. Состав набора
Набор состоит из комплекта реагентов для проведения обратной транскрипции и
мультиплексной ПЦР-РВ (комплект № 1) и комплекта контрольных образцов (комплект № 2).
--- стр. 3 ---
Комплект для проведения обратной транскрипции и ПЦР (комплект №1)
Комплект рассчитан на анализ 110 клинических образцов (включая контрольные образцы)
четырьмя наборами олигодезоксинуклеотидов на наличие НК 12 групп респираторных вирусов
методами ОТ и ПЦР-РВ.
№
пробирк
и
Состав комплекта Описание
Объем,
мкл
Кол-во
1
Смесь праймеров для обратной
транскрипции, ОТ
прозрачная бесцветная
жидкость
1150 2
2
Реакционная смесь для проведения
обратной транскрипции, ОТ-смесь
прозрачная бесцветная
жидкость
1200 4
3
Смесь для проведения ПЦР №1,
ПЦР-1
прозрачная бесцветная
жидкость
1450 2
4
Смесь для проведения ПЦР №2,
ПЦР-2
прозрачная бесцветная
жидкость
1450 2
5
Смесь для проведения ПЦР №3,
ПЦР-3
прозрачная бесцветная
жидкость
1450 2
6
Смесь для проведения ПЦР №4,
ПЦР-4
прозрачная бесцветная
жидкость
1450 2
7
Обратная транскриптаза (50 ед/мкл),
M-MuLV
прозрачная бесцветная
жидкость
280 1
8
ДНК Полимераза с антителами,
ингибирующими активность
фермента (5 ед/мкл), Taq ДНК-
полимераза
прозрачная бесцветная
жидкость
230 1
Комплект контрольных образцов (комплект №2)
1
Образец внутреннего
положительного контроля, ВПК
сухое вещество белого
цвета
1 мг 10
2
Раствор для разбавления ВПК, ВПК-
разбавитель
прозрачная бесцветная
жидкость
900 2
3
Отрицательный контрольный
образец, ОКО
прозрачная бесцветная
жидкость
900 2
4 Пул положительных контрольных сухое вещество белого 0,2 мг 10
--- стр. 4 ---
образов №1, ПКО-1 цвета
Пул положительных контрольных
образов №2, ПКО-2
сухое вещество белого
цвета
0,2 мг 10
Пул положительных контрольных
образов №3, ПКО-3
сухое вещество белого
цвета
0,2 мг 10
Пул положительных контрольных
образов №4, ПКО-4
сухое вещество белого
цвета
0,2 мг 10
Раствор для рабавления ПКО, ПКО-
разбавитель
прозрачная бесцветная
жидкость
900
В набор не входят реактивы для вьщеления вирусных НК. Для вьвделения вирусных НК
рекомендуется применять коммерческие наборы QIAamp Viral RNA Kit («QIAGEN», Германия,
кат. № 52904, 52906), ZR Viral RNA Kit™ (Zymo Research, CIIIA) или аналогичные.
3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Аналитическая чувствительность набора реагентов «ОРВИ-Монитор» - не более 1x10'*
ГЭ/мл для ВГА, ВГВ, ВПГ 1, 2, 3, 4 типов, РСВ, РВ, ЭВ, КВ и не более 5x10^ ГЭ/мл для АДВ и БВ.
Аналитическая специфичность доказана при исследовании следующих референтньк
штаммов:
Вирус Вирус, название штамма, подтип
Вирус гриппа А А/Соломоновы Острова/3/06 (H1N1), А/Калифорния/7/04 (H3N2),
А/Техас/1/77 (H3N2), А/Брисбан/59/07 (H1N1), А/Брисбан/10/07
(H3N2), А/Москва/80/08 (H1N1), А/Владивосток/6/08 (H3N2),
А/Рапата/2007/99 (H3N2), А /Ленинград/549/80 (H2N2), A/PR/8/34
(H1N1), А/Миссисипи/1/85 (H3N2), А/Сингапур/1/57 (H2N2),
А/Ленинград/134/57 (H2N2), А/Краснодар/101/5 9 (H2N2),
А/Чили/1/83 (H1N1), А/Рязань/6103/86 (H3N2),
Вирус гриппа В В/Малайзия/2506/04, В/Флорида/7/04, В/Владимир/25/08,
В/Ленинград/179/86
Энтеровирусы ECHO 3, 6, 7, 30 типов
Коксаки В (не типирован);
Полиовирусы 1,2, 3 типов (вакцинные штаммы Сэбина)
Респираторно
синцитиальный
РСВ, штамм Long
--- стр. 5 ---
Вирусы
парагриппа
вирус
ВПГ 1 типа (штамм С-39), ВПГ 2 типа, ВПГ 3 типа, ВПГ 4 типа
(штамм ПГ-4В)
Аденовирусы Аденовирусы 2, 3, 5, 7, 8 типов
Риновирусы Риновирусы 2, 8,14,15,16,17, 20, 59, 70, 72, 86 типов
Коронавирусы Коронавирусы 229Е, ОС43, NL63
Бокавирусы Клинические образцы, содержащие бокавирусы человека
Показано отсутствие неспецифических реакций компонентов набора в отношении
кДНК/ДНК других вирусов: гепатита А (HAS-15), ортореовирусов 1-3 типов, вирусов герпеса
простого 1 и 2 типов, ротавирусов группы А, норовирусов, метапневмовирусов, а также к
нормальной микрофлоре полости носа и ротоглотки человека и ДНК человека.
4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
4.1. Потенциальный риск применения набора - класс 2а. Исследования материала на наличие
вирусов, вызывающих острые респираторные заболевания методом ПЦР-РВ, проводят в
учреждениях, имеющих разрешение на работу с возбудителями III-IV группы патогенности.
4.2. Необходимо строго соблюдать Методические указания МУ 1.3. 2569 -09 «Организация
работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе
с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности», Москва, 2009 и
«Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии,
противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях,
отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы здравоохранения СССР»,
Москва, 1981 г.
4.3. При работе с набором и анализируемыми образцами следует надевать одноразовые
резиновые перчатки. Использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники
для автоматических пипеток с аэрозольным барьером. Одноразовая пластиковая посуда
(пробирки, наконечники) должна сбрасываться в специальный контейнер, содержащий
дезинфицирующий 0,2% раствор ДП-2Т.
4.4. При использовании набора, для предотвращения контаминации, основные виды работ
(подготовка анализируемых проб, проведение ОТ-ПЦР) должны быгь физически
изолированы друг от друга, т.е. размещены в разных помещениях или боксах.
4.5. Все лабораторное оборудование, в том числе пипетки, штативы, лабораторная посуда и др., а
также рабочие растворы должны быть строго стационарными. Запрещается их перемещение
из одного помещения (бокса), в другое.
--- стр. 6 ---
4.6. Поверхности рабочих столов, а также помещения, в которых проводится постановка ОТ-
ПЦР, обязательно должны до начала и после проведения работ облучаться УФ светом в
течение 30 минут. Также после окончания работ рекомендуется обрабатывать рабочие
поверхности и использованные штативы 0,2% раствора препарата ДП-2Т.
5. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
5.1. Для выделения НК из клинического материала требуется:
- настольный бокс с бактерицидной лампой или стерильный ламинарный шкаф;
- твердотельный термостат для пробирок типа «Эппендорф» на 1,5 мл (диапазон температур
-25-100°С);
- микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 14 тыс. об/мин;
- вортекс;
- набор автоматических пипеток переменного объема до 200 и 1000 мкл;
- одноразовые полипропиленовые пробирки на 1,5 мл;
одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 200
и 1000 мкл в штативах;
- перчатки медицинские неопудренные латексные;
- штативы для микропробирок на 1,5-2 мл;
емкость с дезинфицирующим средством;
- холодильник бытовой на 2-8°С и на минус 20°С;
- халат;
- набор для вьщеления НК (см. пункт 2.2).
5.2. Для проведения НЦР-РВ анализа требуется:
- амплификатор для ПЦР-РВ;
- настольный бокс с бактерицидной лампой или стерильный ламинарный шкаф;
- микроцентрифуга-вортекс;
- программируемый твердотельный термостат на 96 пробирок по 0,2 мл ;
- холодильник бьгговой на 2-8°С и на минус 20°С;
- пипетки автоматические одноканальные с переменным объемом на 20, 200 и 1000 мкл;
- одноразовые наконечники для пипеток переменного объема до 20, 200 и 1000 мкл с
аэрозольным барьером в штативах;
- одноразовые полипропиленовые пробирки на 0,2, 0,5 и 1,0 мл;
- штативы для микропробирок на 0,2, 0,5 и 1,0 мл;
- перчатки медицинские неопудренные латексные;
--- стр. 7 ---
- халат.
При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые стерильные
пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку «RNase-free»,
«DNase-free».
6. АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ
В качестве образцов для диагностики респираторных инфекций методом ПЦР могут быгь
использованы мазки из носа, горла, носоглотки, носоглоточные аспираты, назальные смьшы,
мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, культуральные образцы.
7. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Анализ с помощью набора реагентов методом ПЦР-РВ состоит из четьфех этапов:
вьвделение НК;
- проведение реакции ОТ;
- проведение ПЦР-РВ;
- учет результатов анализа.
Примечание. ПЦР-РВ проводится в той же пробирке, что и реакция ОТ.
7.1. Выделение НК
1. Перед началом вьщеления НК взять 1 или 2 пробирки ВПК (1 пробирка рассчитана на 14
образцов), добавить в каждую пробирку 150 мкл ВПК-разбавителя, тщательно перемешать и
сбросить капли на дно пробирки с помощью кратковременного центрифугирования.
2. В заранее подготовленные пробирки объемом 1,5 мл внести по 10 мкл ВПК,
незамедлительно внести необходимое количество лизирующего реагента, после чего добавить в
пробирки исследуемые образцы (по инструкции к набору для вьщеления НК). Кроме того, в
дополнительную пробирку внести ОКО в объеме согласно инструкции к набору для вьщеления НК
(ОКО-В). Вьщелить НК из исследуемых и контрольных образцов согласно протоколу
производителя набора для вьщеления НК.
7.2. Подготовка и проведение реакции обратной транскрипции (ОТ)
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем РНК-пробы -10 мкл.
При планировании эксперимента следует учитывать, что один исследуемый образец
анализируется при помощи четырех реакционных смесей на наличие НК 12 респираторных
вирусов. Качество каждой реакционной смеси контролируют соответствующим ПКО (1, 2, 3 или
4), ОКО-В и ОКО. Например, для того чтобы проанализировать 10 клинических образцов
протокол анализа будет выглядеть следующим образом (см. табл. 1). На стадии ОТ нужно будет
--- стр. 8 ---
использовать 52 пробирки - по 13 на каждую реакционную смесь (10 исследуемых образцов,
соответствующий ПКО, ОКО-В и ОКО).
Таблица 1 - Схема протокола анализа 10 клинических образцов.
Образцы 10 ПКО
-1
ПКО
-2
ПКО
-3
ПКО
-4
ОКО
-В
ок
о
1 смесь 10 11 12 13
2 смесь 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
3 смесь 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
4 смесь 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
1. Взять по 1 пробирке каждого ПКО (ПК01, ПК02, ПКОЗ, ПК04), добавить в каждую 20
мкл ПКО-разбавителя, тщательно перемешать, и сбросить капли на дно пробирки с помощью
кратковременного центрифугирования.
2. В заранее пронумерованные согласно протоколу анализа пробирки (стрипы) для ПЦР-РВ
(по 0,2 мл) разнести смесь праймеров для ОТ (пробирка ОТ) по 5 мкл. Перед использованием
необходимо тщательно перемешать смеси праймеров для ОТ и сбросить капли на дно пробирки с
помощью кратковременного центрифугирования.
3. Добавить 10 мкл вьщеленной НК в соответствующую пробирку со смесью праймеров
для ОТ согласно протоколу. Подготовленные пробирки прогреть при 65°С в течение 5 минут в
твердотельном термостате и охладить при комнатной температуре. Кратковременным
центрифугированием сбросить капли конденсата с крышек и стенок пробирок.
Примечание. Каждый исследуемый образец РНК вносится согласно протоколу в 4 пробирки
(например, см. таблицу 1)
4. Приготовить реакционную смесь на N образцов (включая 3 контрольных образца - ПКО,
ОКО-В и ОКО), согласно протоколу. Для этого отобрать 37,6x(N+l) мкл раствора «ОТ-смесь»
(заранее размороженную и тщательно перемешанную), внести 2,4x(N+l) мкл «М-MuLV»
обратной транскриптазы. Тщательно перемешать готовую смесь пипетированием и разнести по 10
мкл в каждую пробирку.
5. Реакцию обратной транскрипции проводят в многоканальном программируемом
амплификаторе или твердотельном программируемом термостате. Программа для ОТ: 42°С-30
минут, 95°С-5 минут.
6. После окончания реакции обратной транскрипции кратковременным
центрифугированием сбросить капли конденсата с крышек и стенок пробирок.
кДНК можно хранить при температуре не выше минус 16°С в течение 1 нед. или при
температуре не выше минус 68°С в течение года.
--- стр. 9 ---
7.3. Подготовка образцов к проведению мультиплексной ПЦР-РВ
Общий объем реакционной смеси - 50 мкл, объем кДНК-пробы - 25 мкл.
1. Разморозить смеси для ПЦР (ПЦР-1, ПЦР-2, ПЦР-3 и ПЦР-4), отобрать в четыре 1,5 мл
пробирки из расчета N образцов (включая 3 контрольных образца - ПКО, ОКО-В и ОКО) по
24,5x(N+l) мкл каждой из ПЦР смесей (подписать пробирки «ПЦР-1», «ПЦР-2», «ПЦР-3»,
«ПЦР-4») и внести в каждую по 0,5x(N+l) мкл Taq ДНК-полимеразы.
2. Перемешать смеси на вортексе и сбросить капли кратковременным
центрифугированием. Разнести согласно протоколу по 25 мкл реакционных смесей в пробирки с
кДНК, полученной на стадии ОТ.
Примечания. ПЦР-смеси 1, 2, 3 и 4 вносятся в пробирки с кДНК согласно протоколу
(например, см. таблицу 1). ПЦР-РВ проводится в тех же пробирках, что и реакция ОТ!
3. Кратковременным центрифугированием сбросить капли со стенок пробирок.
4. Установить пробирки в реакционный модуль прибора для ПЦР-РВ в соответствии с
протоколом анализа, запрограммировать прибор для выполнения программы амплификации.
7.4. Проведение реакции ПЦР-РВ
Реакцию ПЦР-РВ проводят согласно инструкции по эксплуатации прибора для ПЦР-РВ.
Порядок работы на приборе АНК-32 изложен в приложении 1, приборе ДТ-96 - в приложении 2,
приборе RotorGene 6000 - в приложении 3.
1. Параметры температурно-временного режима амплификации установить согласно
таблице 2.
Таблица 2 - Температурно-временной режим амплификации
№ п/п Температурно-временной режим Число циклов
1 9 5 °С -9 0 с 1
2 9 5 °С -2 0 с 453 5 7 °С -4 0 с
2. В соответствии с инструкцией к прибору активируют окна приема сигналов
флуоресценции по всем четырем каналам (1-FAM, 2-R6G (HEX, JOE), 3-ROX и 4-Су5). Наличие
положительной динамики в какой-либо лунке свидетельствует о наличии в реакционной смеси
специфических фрагментов НК вируса и позволяет дать предварительное положительное
заключение о наличии вирусных НК в соответствующем образце.
3. После завершения программы проводят расчет и сохранение значений пороговых циклов
для всех четьфех каналов.
4. Отработанные пробирки утилизируют в соответствии с рекомендациями по организации
ПЦР лаборатории.
9
--- стр. 10 ---
8. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА
8.1. Образец считается положительным, если наблюдается рост сигнала флуоресценции на
соответствующем канале амплификатора (см. таблицу 3) со значением порогового цикла не более
38, при этом образец ОКО-В и ОКО отрицательные.
8.2. Если образец определяется на 38 цикле или позже - он считается спорным и должен
бьггь проанализирован повторно, начиная со стадии вьщеления НК. Если при повторной
постановке наблюдается схожий результат - образец считается положительным.
Таблица - 3. Распределение вирусспецифических праймеров и зондов по реакционным смесям
в мультиплексной ПЦР-РВ.
Флуоресцентный
краситель
Длина волны
макс. поглощения,
нм/макс.
флуоресценции, нм
Реакционная смесь
№1 №2 № 3 №4
РАМ 490/520 АДВ - ВПГ4 ВГА
R6G (HEX, JOE) 520/550 - вгв ВПГЗ ЭВ
ROX 580/610 БВ РСВ ВПГ2 КВ
Су5 645/670 ВПК РВ ВП П -
8.3. Образец считается отрицательным, если не наблюдается рост специфического сигнала
на соответствующем канале амплификатора, при этом все значения ПКО и ВПК находятся в
пределах нормы (см. п. 8.4.).
8.4. Следует обращать внимание на значения пороговых циклов для ПКО. В состав ПКО
входят смеси НК респираторных вирусов, разведенные до определенной концентрации так, чтобы
в мультиплексной ПЦР-РВ они определялись на 26-32 цикле. В случае отсутствия роста
интенсивности флуоресценции по какому-либо из каналов в ПКО-1, 2, 3 и 4 результаты не
подлежат учету. В таких случаях необходимо полностью переставить анализ.
8.5. В случае регистрации прибором роста сигнала для ОКО-В и (или) ОКО по любому из
каналов, результаты не подлежат учету.
8.6. ВПК при отсутствии ингибиторов должен определяться не позднее 30-33 цикла. Если
при постановке ПЦР-РВ наблюдается задержка в значениях пороговых циклов ВПК, например, он
определяется позднее 33 цикла, либо не определяется совсем и роста интенсивности
флуоресценции по другим каналам (смесям) не происходит - это указывает на возможное
присутствие ингибиторов в пробе(ах), которые снизили чувствительность анализа, или на ошибки
при постановке реакции. Такой образец(цы) должен быть проанализирован повторно.
10
--- стр. 11 ---
8.7. В случае, когда ВПК отрицательный или слабоположительный, а рост интенсивности
флуоресценции, указывающий на положительный результат по АДВ и БВ (смесь ПЦР-1)
наблюдается, - такой образец считать положительным по соответствующему вирусу.
8.8. При интерпретации результатов выявления РНК риновирусов и энтеровирусов
следует пользоваться следующими правилами. Если отмечается нарастание соответствующего
сигнала в обеих пробирках (в реакционных смесях №2 и №4 для детекции рино- и энтеровирусов,
соответственно), либо только в пробирке с праймерами и зондом для выявления РНК
энтеровирусов, то такой образец считать положительным по энтеровирусу. В случаях, когда рост
флуоресцентного сигнала наблюдается только в смеси для выявления риновирусов (смесь №2), -
такой образец считать положительным по риновирусу.
9. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНРШ
Транспортирование набора «ОРВИ-Монитор» должно производиться в соответствии с СП
3.3.2.1248-03 всеми видами крытого транспорта при температуре -20°С.
10. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ
После получения набор «ОРВИ-Монитор» следует хранить при температуре минус 18-20°С в
течение всего срока годности набора.
11. СРОК ГОДНОСТИ
Срок годности набора реагентов «ОРВИ-Монитор» 12 месяцев. Набор с истекшим сроком
годности применению не подлежит.
11
--- стр. 12 ---
Порядок работы, учета и интерпретации результатов анализа на приборе
АНК-32 (Россия)
Подготовка к работе
В случае первого использования прибора АНК-32 или переустановки программы
необходимо создать протокол с названием «ОРВИ Тест».
1. Открьггь программу «ПЦР» для прибора АНК-32.
2. Выбрать Режим работы «Циклический».
Приложение 1
П р о г р а м м а д л я П Ц Р ( 3 2 ) 5 Ы 0 5 0 6 1 0 [ З м у л я ц и я ]
Файл Вид Режимы рвботы Настройки Окно Справка
Прием О
Просмотр Данных Изотермический Ц и к ;
4 . . НочнойАктивация Плавление режим
3. в появившемся окне в соответствии с инструкцией к прибору задать программу
амплификатора со следующими параметрами:
Номер
ступени
Температура Время Кол-во
циклов
Метки
циклов
1 95 90 1
2 95 20 45 Начало
3 57 40 45 Конец
т ш ..
Номер Температура
ступени (градусы)
Время
(секуипы)
Количество
циклов
Метки
циклов
1 Э5.0 90 1
2 95.0 20 45 ; Начало
57.0 " 1 П " . 45 ' ■ ь t П Н И !
!
Т емпература
^ л ' ' г '
Время
Л ГГГ- :.!'(■ ■ - ф т - '
Сведения об образцах...
Редактировать таблицу
Сохранить Загрузить
Закрыть
1 2
--- стр. 13 ---
4. Нажать клавишу «Красители», выбрать в появившемся окне красители FAM, R6G, ROX
и Су5 и нажать «ОК».
K p a a iT e m i
5. Нажать клавишу «Сохранить». В появившемся окне «Сохранить метод Циклический»
нажать клавишу «Создать пользователя», ввести название папки «ОРВИ-Монитор», и нажать
«ОК»:
Всего пользователей: | 2 | Всего данных а пользователя: [
Создать пользователя | Удалеть Сохранить | Закрыть |
Если указанная папка уже сушествует, выбрать ее щелчком мыши.
Нажать клавишу «Сохранить», ввести название протокола «ОРВИ Тест» и нажать «ОК»;
13
--- стр. 14 ---
Всего пользователей: | 2 |
Г о б ш й й
О С С И ^ Г И д а и т о р т
Всогоданных а пользователя: I
Длина не меньше 5 символов
|ОРВИ Тест
Соэаагь пользователя
О К Отмена
Т екуший:
1 1
Удё1Л И Т Ь 1 Сохранить 1 Закрыть 1
6. При дальнейшей работе использовать созданный метод.
Настройка параметров расчета
В программе «ПЦР» для АНК-32 выбрать опцию «Настройки» и затем «Расчет»:
‘ Ч р Прйграимв для ПЦР (32) [cornl]
Hd'.rpofiwi Файл Вид Режимы работы Окно Справка
S j Прием
Просмотр Данных Изот!
На5вание ...
Термо крышка...
Красители...
Компенсация ...
Посмотреть Zero файлы ...
Для настройки ...
Тепловой режим...
Режимною ...
Настройка спящего режима ,.,
Редактируем файл Main.ini
ленив
Привести окно «Расчет» к следующему виду:
1 4
--- стр. 15 ---
Канал 1 Канал 2 Канал 3 Канал 4
Отношение максимум/минимум больше, чем: j i, 400 (1.400 |1.400 11.400
Отношение между соседними точками меньше р Т оо |2.100 |2.100 |2.100
Абсолютный рост по амплитуде больше, чем : jioij |100 |100 jlOO
Порог : jO O O O
ь^асчет П О последним точкам .......................................
Отношение максимумУмимимум больше, чем р ю о |1.100 Jl.lOO |1.100
Уровень jo.oOC|
порогового цикла: * Г ” Включить в расчет
Число точек на полке: 1 3 | j j
1 1 > 1
Применить и Выйти ОК Отмена
Нажать клавишу «ОК».
Проведение анализа
1. Включить прибор в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
2. Запустить программу «ПЦР» для прибора АНК-16/32.
3. Выбрать режим работы «Циклический», нажать клавишу «Загрузить»,
I Файл Вид Режимы работы Настройки Окно Справка
о Ночной^ * Активация
Просмотр Данных Изотермический Циклический Плавление режим-------------------------------------------- ----------------------------------------------------
'.^ Ц и к л и ч е г к и й
^^ремя ^секанды )
Количество
циклов
Метки
циклов
2 Э5.0
3 Б О .О
4 :Э5.0
600
50
20
1
40
.40
Начало
Конец
Т емтерап)рв"
[б о о tjJ J _ d
'Время
----------—
Ж60
Установить параметры циклов
Реаактировэть таблицу
Добавить Заменить Удалить Вставить 1 гг-----
Сохранить 1 1 Эагрвэнть 1
Красители...
1
:тарт 1
С ы й д е н и я о б о б р а з ц а х ,.. Закрьггь I
4. Выбрать папку «ОРВИ-Монитор» и протокол «ОРВИ Тест» и нажать клавишу
«Загрузить».
15
--- стр. 16 ---
Сохранить метод Циклически
Всего пользователей: Всего данных у пользователя:
ОРВИ Тест м ш ш
Т екуший:
2011 01 25 15 44 38,mtd
Создггть пользователя Удалить Сохранить Закрь(ть
5. Начать работу прибора нажатием кнопки «Старт».
6. После загрузки и начала работы прибора в окне «Прием данных» нажать клавишу
«Образцы». В появившемся окне выбрать краситель FAM и последовательно ввести сведения об
образцах;
F A M R6G 1 ROX 1 Cv5 1
|Номер Тип 1 Название или номер
j лунки !
И О ; м :
В Й О 2 - 1 ...........................i
3 О К О ]0К0-В-1 ;
4 П К О П К О -1
5 око ^О К О -1 '
6 ио Ь-2 ’ ;
7 ио |2-2 ' I
8 око ОКО-В-2
9 пко т к о -2
10 око о к о -2
ш шио 1-3
штио 2-3 (
т око"' ,око-в-з
14 пко ПКО-3 !
15 око^ •око-3
ио
пко
ВПК
квпк
к о ?
рр
Задать
-Крагность
---------------------
1 Г 2 Г 3 Г 4
Копировать Вставить Очистить
О К Отмена
7. Используя кнопки «Копировать» и «Вставить» заполнить сведения об образцах для
красителей R6G, ROX и Су5.
8. Зафиксировать в рабочем журнале название файла;
16
--- стр. 19 ---
Приложение 2
Порядок работы, учета и интерпретации результатов анализа на приборе
ДТ-96 (Россия)
Подготовка к работе
В случае первого использования прибора ДТ-96 или переустановки программы необходимо
создать протокол с названием «ORVI-Test».
1. Откройте программу «RealTime PCR» для прибора ДТ-96.
2. В появившемся окне выберите «Работа с прибором».
3. В верхней части окна откройте вкладку «Тест» и «Создать/Редактировать тест»:
Реж им рТеет ) Н астройки П ом ощ и
Создать/Р«да1стиро»ать тест
Копировать группы тесто*
р а м т ампли<№икаиии
Номер протокола: а Имя Оператора:
4. Нажмите на кнопку «Создать новый тест» и введите имя нового теста «ОРВИ-
Монитор»:
а)
Создать/Редактировать тест
i JIfPeaaKB^oeeTb текущ ий TW I |
\т Созда1ы«иый,т»ст J
Кя1фовпы«ц(шм* тест |
, о Удалй1ъ текущ ей тест •
.. Ок..
б )
Введите имя новогч} теста '
_______L___i___t ___S t .
ОРВИ-Монитор
PI многотестовый режим
Ok Отмена
Нажмите «ОК».
5. Используя инструкцию к прибору, приведите открывшееся окно «Тест» к следующему
виду: 1) поменяйте краситель Hex на R6G и активируйте все красители, кроме Су5,5; 2) создайте
программу амплификации «ORVI-Test» нажав на иконку |Л.
19
--- стр. 20 ---
Тест:
Описание:
л Параметры:
^ 1. Анализ
Тип:
I Метод:
2, Пробирки:
2. Стандарты:
• j РасгигроБка j
TEST
Качественный
Г еометрический (Ср) а
5, Объём рабочей смеси в пробирке
6. Флуорофоры:
50 мкл
i « Обычный
j Нзачный
1^ образец
□ стащсрт
В контроль*
Е контроль-
Количество:. 32 Дайли: 2
! : /Ч|
■ С т й Н !1 а (-П Г _ : 0 ; ■
Ctam«!T_2 "-а; J
.■Стата|?г_"
, 1,тацаарг_4
■'Стй»ед>Ф ^_-
, ; ...0-
. . . у.
С?г*на®?т_£ ■ 0 1
. . . Ст.ач4ла!зт„* ^л а . „
^ R6G;vj 40 Roxiv • C v 5 ,v• Cy5.5i.Vj
' / с V С V С .г : ■
L Критерий аналоа пояимор<?5измое;
t
Г е т е р о в и г с у г а d C p <
Г с м о з н г с г г з < 1 С р ,> .
2.0
5,0
8. Программа амплификации:
4, Контроли:
Положетельный (К+):
Отрицательный (К-): Ж
! O R V I- te s t
1 . Э5,0Т:-01:з2
2. 95,0 *С - 00:20
57,0 X ■ 00:40
3. 10,0 *С • Хранение
И ®
х45
Дополнительно Ок Отмена
6. В редакторе программ амплификации выберите шаблон
«Применить».
7. Используя инструкцию, введите следующую программу амплификации:
и нажмите кнопку
Номер
ступени
Температура Время Кол-во
циклов
1 95 90 1
2 95 20 45
57 40
Я блока Температура " С №1Н
.
сек ! Число циклов 1
1 95 1 30 1
95 1 0 ! _ 2 0
2
5 7 ‘ 0 ' 40
20
--- стр. 21 ---
Нажмите «ОК» и сохраните программу под именем «ORVI-Test». При дальнейшей работе
использовать созданный метод.
Проведение анализа
10. Включите прибор в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
11. Запустите программу «RealTime PCR» для прибора ДТ-96.
12. В появившемся окне выберите «Работа с прибором» и «Добавить тест». В окне
добавления теста выберите «ОРВИ-Монитор».
I R e ^ m ejK R * ш ш ш
1 ^ « ж и м T e a Н ю р а ш т
Запуск программы амплифжаиииПротекол i J Новый протокол ОлфЫТЬ С<яршппь i • Е 2 Просмотр ep e e s
Номер лротакола: О ^ Имя Оператора: Дата; 7 Февраль 2011
Тест ' Т т ‘
^ Добавить т е а
« ^'1ДЗПГ« Г * I -
. ^
Тест:
Описание:
Тил анализа:
ОРВИ-Монитор
Качественный
I ГО вразш : -------
i Количество: ;24 g 1
2. Станаарты:
[Ц Значения стандартов из другого протокола
K o n w e o T B O . |0 р] Д у 'б я и : С _Ш
3. Контрош:
Положителные 5^+):
Отрицательные (К -):
О
, Подробно . Отмена
I
I I |< > Ц |я ь » Я 1 а с 1 |
L . Д вбд.^
[ № ДаДааоьстрокЗ
^ Удалить cpoiQf
X O w ciw b протокой
O i M O H H i b д е й С 1 8 и е
1 2 V 4 '3 : 7: 9' т . ' т 1 2
А
В
С
0'
1
Г
с
н
^ Автозаполнение
i t Порядке заполнения
G С ч Л о д м * s o K c .v u m *
2 ^ 0 4 K C 1 V i T b П й Я » м в т р « л <
П р е » « « » 1 и т ь09^ „ 1
a)ii,0 J5 3 9 В Ш
13. В разделе «1. Образцы» введите количество образцов включая все 3 смеси и все
контрольные образцы. В разделе «3. Контроли» поставьте нули и нажмите «ОК».
14. Пользуясь инструкцией к прибору заполните «Идентификатор пробирки» и «Тип»,
обратите внимание на порядок заполнения. Нажмите кнопку «Применить». (На рисунке приведен
пример заполнения протокола на 5 клинических образцов):
21
--- стр. 22 ---
Ф Re»ITime_PCR
Режим Тест Н к ф о А п Помощь
Протаол Запуск программы амплификации ;D Новый протокол iZ3 Открыть . Содянизь (ijll Просмотр aptuea
Номер протокола: Л л я О п е р а т о р а :
Тест
9 0«разви_1-2
(То 6би 9вц .2-2
О ^ М о к т □
: О =»Н»1а»п; □
0 = в и -м » « < □
О ;о м < а « ц к - j
liRaj;c,sj!Sr|l
: у"
i V
: < / f V ; VfV
T V -✓
• /✓
V
0 ?вИ-М(*«т1 □
а V V \
V T V T1 1 ^ 0 ^ а е ц _ 3 -2
_ 1 ^ 5 б р а ^ «
13 О б р а а ^ И
м" 'O I O - 8 - 2
1 5 '" " ПКО-2
16 0KD-2
0»вИ-М <««п □
: О ’ в и - м о я ж □
17; 0 в р в з ^ 1 -3
18 CKfee3^2-3
19 " О ^ и ^ З - 3
2 0 0 iS p a 3 e 4 .4 -3
О * к »
к-
W W Ы ' VЫ ~ V i V -: V
■ V
1 ✓ IV
■/
iz:
: V"
t V'
1 21 0 « р азеи > 3
1 22 OKD-B-3
ili
24
ПК0-3
0 = B t V M o n n □
^O jw M p ta^ □ J
□ « e n -M » ™ □
.!0 _□
Ш Й И - М 1 1 И 1 » ! K - ~
0 Ю -3
; Q р в И - М а т К *
К -
w w
\ v \ v
■ y - V
:.y W ...V V
iVrv^
✓
V' i
V ;✓ T
✓ T '
: ✓ V T
I V i V " i
: V V":
V
✓ y -
V V "
:e :<
^ f r < n O p T 1 l ^ S l M y f l b T M T B C T j
Д а т а ; 7 Ф е в р а г ъ 2 0 1 1
ХЬбавить
b t» послеЖ , Добавить твст . | ^
? « 0 > Д р б м м п ю ч м д 1
У А М И ^ С Т Р « < ,~ П----------------; # О б ы ч н ы й
OttglWlbnpOTOKOfl
. А i
' в'\
С.
О
■ F :
.с’ ’
J i y : l A 3 j . 4 . . , о : 6 7^ S 10 11 12
^ “ ’ И
lL * " ’ И
А^тозаполнение
[ Н ] Порядок заполнв«чя
i . ’ С ф с б о < Р » е * " ^ Ф ч х т м я ш *
X ? О ч ж л и т ь п о п е м - щ н ы
ш
П р х и ш ^ IОтмена
20ll,<h5036 op ВЫК.ТЮЧ1Н
15. Появится окно следующего вида:
Р е ^ Tea i4»cipoftcii Пмюшр»
Г ^ т о к о лЗапуск гр о ф а м 4 )1 а м п ш Ф и кви ии , ; D H o e w ftn Сскраи--г?ь I IbecM oip
Имя гфограг«<ы: 0H V 1-T e«t ▼ |. J f O e n > ~ : ! J C o m ™ i I .Ред*$1м ров#И |
О пиеанае:
i х1 I . «
> » « t e " ‘
t - n : ’4'-':v
■ .■- ••• - . T ^ - J .- #5.< rc • • - • : • .• ■ ■ s - r 'v J - tJ f S • ,
••'••'• ‘ • • \ -• • • > • •
■ '"T"4 •'* \ ■ ■ •
- ■ ■
С ;\Р г е ^ R k f l \ l > a T « c h n o k > ^ '> R e a r r i n e . P C R 'A R V I - T e a ( ^ e
i i II
Оператор: ГоС 1ъ
Д в т« : 7 Ф е в р а т 2 0 1 1
1. 9 5 . 0 * С - 0 1 Л )
г 35.0 *С - 00:20
программа: O R M - T e s t
Объ<мребочей снеси: М ^
К Ь м . 1 е 1 1 Т а р 1 й :_______________________
Запуск прогре>»е<ы
С тк р ь :^ € « * : З а к р ы т ь 5 г л < ;
22
--- стр. 23 ---
16. Установить пробирки в реакционный блок согласно порядку заполнения и нажать
кнопку «Запуск программы». В появившемся окне появится название протокола вида:
«Протокол_№_0_20_Январь_14_04». Можно сохранить протокол под предложенным именем
или ввести свое название протокола и «Сохранить».
17. После окончания реакции отработанные пробирки утилизировать в соответствии с
рекомендациями по организации ПЦР лаборатории.
Расчет значений порогового цикла
6. После завершения реакции можно сразу приступить к анализу результатов, либо при
следующей загрузке нажать «Просмотр архива».
7. Далее нажать на иконку с изображением папки и выбрать файл в котором был
сохранен протокол. Выбрать тип анализа «Ct(Cp) для всех каналов». Метод - «Геометрический
(Ср)».
Я Йс|у«р11рс>тог:оп_^‘ '- ’ _0_20_январь-_1*1_04.г9б
Режим Н а с т р о й т Поиошь
Протокол
Протокол О
Комменгвр(А
Аналид orrrtftecKHK измерений
Оператор: А т а
0 RealTitne.PCR
Дета: 20 Я н в ^ 2011,14:04:48
Тип
Мсггоо:
Количестеенный со станаартам и
с SC-ЗfИ5^T^ЧX=5ftOИ ГС-
Отмосигельмый
UTHarirSfbHb5/C.;-K:p:>i
К риеая П лавле^мя
Днал^-з пй.-^«лер4-лг:''ог;. t <.pcs>*3
А нализ полиморф измов. 2 краски
А нализ ПОЛИМОРФИЗМОВ, плавлен ие (а)
А нализ полиморф измов, плавление
HLADRB
1
L
. ,:'i
■ ■ ..г ■ i :
.'.;Г
■ ■ !i ■ ' f- '-J
. \ - ■ ! , ■ ■ ■
Л
1
Гi
/
j у
Ml * р » " у
Результаты [
Fam Hex
Cq Ср внал43
3 4 6 • и113 1 4 1 б 1 8 а 0 а 3 3 4 ' ^ Э 8 3 0 3 Э 3 4 3 б 3 8 4 0 4а4 4
______________________________Номер цикле
11-24,31-5 322 G L osl Y е Л и» « g М аркер | H i t Р е»им ы прос»«1П > «Д »«««1
8. В окне справа отобразятся названия образцов и значения пороговых циклов. Нажать на
fg-
клавишу и привести окно «Параметры анализа» к следующему виду:
23
--- стр. 24 ---
1. Критерий пояожитвльмсгорвза/ьтвгаПЦ Р: G
2. Величина Thfeshold
6 0 %
StO не участке линейного Фитирования
3. Критерии достоверности рвзальтатов:
нижняя граница/порог положительного резцльтага S 5 (F(C p )
верхняя граница/порог нормализации данных ^ RCp)
4. Н Нормализация данных
Дополнительно _ Применить . О тм ен а.
Нажать кнопку «Применить».
9. Для получения сводного отчета по протоколу необходимо нажать кнопку
Щ. Ар/.ИБ,
Режнп Настройки Помощь
Протокол
Протокол:
Комментарий: I
Анализ оптических измерений
Оператор: Дата: 8 Февраль 2011
Тип анализа: Качественный S Ш Ш ^ Ф
Метод: Г еометрический (Ср) 1 - 1 ^ ^ [ Т ] в Fam
10. в верхней части окна нажать клавишу «Печать» или «Сохранить», выбрать расширение
файла, например *.rtf MS Word, далее «Рабочий стол» «ОРВИ» -> «Отчеты» «Год»
«Месяц», в поле «Имя файла» ввести название в форме «год.месяц.число-данные». Нажать
«Сохранить».
24
--- стр. 26 ---
Приложение 3
Порядок работы, учета и интерпретации результатов анализа на приборе RotorGene 6000
(Corbett Research, Австралия)
Подготовка к работе
В случае первого использования прибора RotorGene 6000 или переустановки программы
необходимо создать новый протокол - «ОРВИ-Тест».
1. Открыгь программу «ПЦР» для прибора RotorGene 6000.
2. Выбрать в открывшемся окне «Новый Тест» действие «Пустой шаблон» и нажать
«Новый».
я Новый Тест
Быстрый мастер ^Цетальный мастер |
,'^^Выпош1Г Г ь nocriefltflt’i Тест
Пустой ш аблон
^ Интеркалирующив Красмтвяи
Флуорвсцектные зонды [TaqM ап)
Флуоресцентные зонды с плавлением
Тест. Плавл. с Выс. Разр
Другие ф айлы
Проверка Температуры
Открыгь шаблон из другой папки...
Новый 1
Отмв«лъ j
\
Цсжвзвгь этот экран при запуске програ»»»^
3. В открывшемся окне выбрать необходимый тип ротора поставить галочку в окне
«Кольцо закреплено», нажать «Далее».
Мастер Нового Теста
Добро пожаломть в детальный мастер тестоЫ
гТип ротора-—
72-/чно>**Л ротор
Джмн-аиск(72-лук) ротор
Р 1ч0 л ьц0 э « ф е п л №0.
В ы кс а Далее»
4. В открывшемся окне при необходимости заполнить поля «Оператор», «Замечания», в
окне «Объем реакции» установить значение 50 и нажать «Далее».
--- стр. 27 ---
Мастер Нового Теста
Этот 9K PW отображает смешенные опции для этого тесте Зеполните
поля, межмиге Слво.. когда »ы готоеы перейти на след. стр.
Объём [ 5 0— - d
р е а к ц м 4 ( u L ) ; I ^
К о г^ ю н о екл ~ ■>{
Ввмигеимй
опереторавэтот
тв1«:т-бокс.
Выхад i «Цаэад | Далее» |
5. В открывшемся окне нажать кнопку «Редактор профиля».
редактуфоввтъ
профиль
покамннь«8
прямоугольнике
Имя j И сточник1 Детектор1 Уровень сигнала I
6 ie^ 470nm 5 1 i3 n m 5
Y eioM 530nm 555nm 5
Orange 585nm 6 10ncn 5
Red 625nm 660nm 5
C rim (on 680nm 710hp 7
Ц оеый...
М далигь
А б н » « т »
Qnr. уровня сигк.
«ИаэйА Далее»
6. В новом окне нажать треугольник справа от кнопки «Новый» и выбрать
«Циклирование (по умолчанию)».
Плавление
Цк»;лирование и Плаеп.
Ци<этироваи. после ^мсубации
Н аж мите на цжл ниж е, чтобы измежгь его;
В С Г Щ А 4 Г ^ Г ! Х 0 . . I
< * Редактор Профиля
И гз ■ ■
Н о в ы й
у
C o x p a w iT b к а к
ф
С п р а в к а
■ U lt'.rM pO B S H nevno ^м опч.). |п р е д с тв е я я е т те с т,|М |» р м » д о я ж в н б Ы1Ъ В ьгю д ав« : 1
7. В появившемся окне «Редактор профиля» задать программу амплификации со
следующими параметрами:
27
--- стр. 28 ---
Шаг
Температура,
“ С
Время Детекция
Кол-во
повторов
Удержание
температуры
95 2 мин. Не детектировать 1
Циклирование
95 20 сек. Не детектировать
45
57 40 сек. Детектировать
!* Редактор Профиля
Ш ! , 1 3 U ^ в
Новый Олф. Сохранить как I Справка
Y ест п р о а о л я ^ с я оком Я м и к Г р а ф Н К в т э у п р в а с тм л я е т т е с т, к о г о р ь ^ А олжвп '|£ытъ в ы й л н е н :
^ in fU T iiT lJT m m rirlrL rfifIT lf№
Н аж м ите н а цикл м с ю , чтобы изм ен и ть е г о :
ц и к л и р о е а ж в
В ставить д а .. {
У д ал ить 1
Твмпвргггар»: 95 | грао.
Время: [ T T I mmh. о |< я к.
!Я Редактор Профиля
ш
Н о в ь й О т » 9 .U
Сохраить как
Ф
О равка
Т гй ш о /п м гс я огюло'112 M iiT p a ^ ' внизу л р ш с тм1 1^ к о т Ь ^ должен быть вы ю /м ен:
Н аж м ите на ц и кл н иже, чтобы и зм е н и ть е г о :
Вставить до...
идали ть
Ц и к л rw ro p K T b 45 j pee
Н аж м ите н а ш аг в н изу д ля его и зм ( ниге + ш аг или • ш аг, ч го & 1 д об авить и /м удалить ш аги э то го цикла.
О б ы ч ш й ш аг
й гр а д .
4 0 с
на Q teen. O iange. R ed, V e io w
У длФ 1Ш вг.
Г ' 0 « ж в т ь т е г « *у р у ш а г а
95 гр « 1 на 2 0 сек.
3 3
i l l
8. Для температуры 55°С в окне «Детекция сигнала» выбрать каналы красителей «Green»,
«Orange», «Yellow» и «Red» Нажать кнопку «Да».
28