Набор реагентов "PARalleleTM HLA solution v3" для типирования генов HLA в высоком разрешении методом высокопроизводительного секвенирования по ТУ 21.20.23-007-39429653-2020 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 2 --- ООО «ПАРСЕК ЛАБ; PARallele™ HLA solution vB # £?rSeq Инструкция по применению Общие сведения о наборе реагентов и лабораторный протокол Страница 2 из 55 Каталожный номер HLA-v3a HLA-v3b Символы IVD Медицинское изделие для диагностики in vitro • Обратитесь к инструкции по применению ш1 Изготовитель AvT Дата изготовления LOT Код серии REF Номер по каталогу - Использовать до .... 1 Температурный диапазон V Содержимого достаточно для проведения n-количества тестов Значок «коробка» для обозначения комплекта в составе изделия PARallele ™ - товарный знак, правообладатель ООО «ПАРСЕК ЛАБ» RU № 803655). --- стр. 3 --- ООО «ПАРСЕК ЛАБ» PARaliele™ HLA solution v3 ,, Общие сведения о наборе реагентов иИнструкция по применению _ w лабораторный протокол # P 0 ?rSG q ОГЛАВЛЕНИЕ 1. ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................................................................................4 1.1. НАЗНАЧЕНИЕ НАБОРА РЕАГЕНТОВ...........................................................................................................................4 1.2. НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ............................................................................................................................................5 1.3. МЕДИЦИНСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ...............................................................................................................................6 1.4. ПОКАЗАНИЯ И ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ............................................................................7 1.5. ОПИСАНИЕ............................................................................................................................................................................7 1.6. ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ...................................................................................................................................8 1.7. СОСТАВ НАБОРА РЕАГЕНТОВ.......................................................................................................................................9 1.8. ОБЩАЯ СХЕМА ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА................................................................................................. ..........12 1.9. ИНТЕРФЕРИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА.............................................................................................................................13 1.10. ОБОРУДОВАНИЕ, МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ....................................................................................................15 1.11. ТРЕБОВАНИЯ К ОБРАЗЦУ.............................................................................................................................................17 1.12. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ...................................................................................................................................17 1.13. РЕКОМЕНДУЕМЫЕ ПРАКТИКИ РАБОТЫ.................................................................................................... 18 1.14. РИСКИ, СВЯЗАННЫЕ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИЗДЕЛИЯ........................................................................................20 2. ПРОТОКОЛ..................................................................................................................................................................................21 2.1. ТАРГЕТНОЕ ОБОГАЩЕНИЕ...........................................................................................................................................22 2.2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ БИБЛИОТЕК.................................................................................................................................26 2.3. РАЗВЕДЕНИЕ И ДЕНАТУРАЦИЯ...................................................................................................................... 33 2.4. СЕКВЕНИРОВАНИЕ..........................................................................................................................................................35 2.4.1. Планирование запуска..................................................................................................................................................35 2.4.2. Комплект для секвенирования..................................................................................................................................45 2.4.3. Включение секвенатора...............................................................................................................................................45 2.4.4. Разморозка картриджа для секвенирования....................................................................................................45 2.4.5. Загрузка библиотек........................................................................................................................................................46 2.4.6. Очистка ячейки.................................................................................................................................................................46 2.4.7. Настройка запуска секвенирования......................................................................................................................47 2.4.8. Загрузка ячейки................................................................................................................................................................47 2.4.9. Загрузка раствора и проверка бутыли для сбора отходов.........................................................................48 2.4.10. Загрузка картриджа с реактивами................................................................................................................48 2.4.11. Выбор sample sheet........................................................................................................................ 48 2.4.12. Запуск секвенирования.....................................................................................................................................49 2.4.13. Мониторинг секвенирования..........................................................................................................................49 2.4.14. Контроль плотности кластеров.....................................................................................................................49 3. ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ................................................................................................................. 51 4. УКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ............................................................................................................................................51 5. БЕЗОПАСНАЯ УТИЛИЗАЦИЯ.............................................................................................................................................52 6. ГАРАНТИЙНЫЕ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА....................................................................................................................................52 7. ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ..............................................................................................................................................52 8. КОНТАКТЫ ПРОИЗВОДИТЕЛЯ............................................................................................................................... 55 --- стр. 4 --- ООО «ПАРСЕК ЛАБ: PARallele™ HLA solution v3 # £Геч Инструкция по применению Общие сведения о наборе реагентов и лабораторный протокол Страница из 55 1. ВВЕДЕНИЕ При первом применении Набора реагентов необходимо обратиться к производителю для настройки оборудования и программного обеспечения. Набор реагентов «PARallele™ HLA solution v3» является усовершенствованной версией медицинского изделия «VariFind™ HLA solution IL-v2» (№ РЗН 2019/8988) со следующими улучшениями относительной предыдущей версии: • новый упрощенный протокол с сокращением числа стадий; • возможность определения генотипа в разрешении 3 поля (3 fields); • идентификация новых аллелей; • отсутствие количественной оценки и этапов нормализации образцов и библиотек; • новое программное обеспечение с графическим интерфейсом. 1.1.НАЗНАЧЕНИЕ НАБОРА РЕАГЕНТОВ Набор реагентов «PARallele™ HLA solution v3» предназначен для качественного определения аллелей HLA-генов (HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DQB1) в разрешении 3 поля (3 fields) в образцах дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), выделенных из цельной крови или лейкоцитарной массы человека, обогащенных методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) длинных фрагментов с последующим высокопроизводительным секвенированием на генетическом секвенаторе MiSeq (lllumina Inc.) (РУ №РЗН 2014/1568 от 29.04.2014) и генотипированием с целью определения тканевой специфичности донора и/или реципиента для создания регистров и трансплантации органов и тканей. Набор реагентов «PARallele™ HLA solution v3» предназначен для клинической лабораторной диагностики in vitro. Набор реагентов предназначен для обследования всех групп населения без градации по демографическому или популяционному признаку. Набор реагентов предназначен только для профессионального применения. Исследования с использованием Набора реагентов могут выполнять специалисты с высшим медицинским, биологическим или биотехнологическим образованием: биолог, молекулярный биолог, биотехнолог, инженер-технолог, медицинский лабораторный техник, лаборант, врач клинической лабораторной диагностики. --- стр. 7 --- ООО «ПАРСЕК ЛАБ^ porseq Lab PARallele™ HLA solution v3 Инструкция по применению Общие сведения о наборе реагентов и лабораторный протокол Страница 7 из 55 1.4.ПОКАЗАНИЯ И ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ Показания к применению: HLA-типирование с целью создания регистров доноров ГСК и банков биологических материалов; HLA-типирование с целью трансплантации ГСК и солидных органов. Противопоказания к применению: Набор реагентов не имеет противопоказаний к применению. 1.5.ОПИСАНИЕ Набор реагентов «PARallele™ HLA solution v3» позволяет подготовить образец для проведения высокопроизводительного секвенирования с последующим типированием по 5 генам HLA-локуса. На первом этапе для каждого образца ДНК проводится реакция таргетного обогащения методом мультиплексной ПЦР длинных фрагментов (long range PCR, LR-PCR) для наработки специфичных продуктов по каждому из 5 анализируемых локусов HLA (5 локусов амплифицируются в одной пробирке). На следующем этапе проводится фрагментация с одновременным восстановлением концов. Затем осуществляется этап лигирования, в ходе которого к фрагментам сразу пришиваются уникальные баркодированные адаптеры, после чего образцы пулируются и производится очистка пула магнитными частицами. После очистки пул библиотек разводится до целевой концентрации и секвенируется. Секвенирование осуществляется на генетическом секвенаторе MiSeq (lllumina Inc.) (РУ №РЗН 2014/1568 от 29.04.2014). Метод секвенирования lllumina использует технологию секвенирования путем синтеза, параллельно детектируя присоединение флуоресцентно меченого нуклеотида к синтезируемой цепи ДНК в множестве молекулярных кластеров. Анализ данных осуществляется с помощью программного обеспечения (ПО) «PARallele™ HLA software» (ООО «ПАРСЕК ЛАБ», свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ №2020615630). В программное обеспечение импортируются результаты секвенирования и метаданные запуска, после чего автоматически запускается выравнивание прочтений, оценка качества и определение HLA-генотипа образца. После просмотра результатов пользователь экспортирует отчет. Подробнее см. Том 2. Анализ данных и Том 3. Программное обеспечение «PARallele ™ HLA software». --- стр. 8 --- ООО «ПАРСЕК ЛАБ: PARallele™ HLA solution v3 .. Общие сведения о наборе реагентов иИнструкция по применению - „ лабораторный протокол # g ?™*4 Набор реагентов рассчитан на проведение анализа 192 образцов ДНК, включая контрольный образец, входящий в состав набора. 1.6.0СН0ВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ • Набор реагентов позволяет определять HLA-генотип с разрешением 3 поля (3 fields) по целевым локусам HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1 и HLA-DRB1. Таргетные регионы локусов приведены в таблице 1. Таблица № 1. Локус Регионы Размер, т.п.н. HLA-A Весь ген (все экзоны и интроны) 3,2 HLA-B Весь ген (все экзоны и интроны) 4,6 HLA-C Весь ген (все экзоны и интроны) 3 HLA-DQB1 1 -5 экзоны 6,1 HLA-DRB1 2-4 экзоны 4,3 • Набор реагентов идентифицирует аллели, входящие в базу данных IPD/IMGT-HLA актуальной версии, и позволяет идентифицировать новые аллели. Подробнее см. Том 2. Анализ данных. • Аналитическая чувствительность (предел обнаружения) Набора реагентов составляет 5 нг/мкл в объеме 10 мкл геномной ДНК человека. • Диапазон рабочих концентраций: 5-100 нг/мкл. • Аналитическая специфичность Набора реагентов по целевым локусам составляет 100% . (определена как способность набора реагентов идентифицировать генотип (пару аллелей) только целевых HLA-локусов среди гомологичных локусов в исследуемом образце). Локус Аналитическая специфичность 95% ДИ HLA-A 100% 99,65-100,00% HLA-B 100% 99,65-100,00% HLA-C 100% 99,65-100,00% HLA-DQB1 100% 99,65-100,00% --- стр. 9 --- ООО «ПАРСЕК ЛАБ: PARallele™ HLA solution v3 # e ? rseq Инструкция no применению Общие сведения о наборе реагентов и лабораторный протокол Страница 9 из 55 HLA-DRB1 100% 99,65-100,00% • Диагностическая чувствительность - 100% в отношении каждого из целевых локусов. (установлена как доля истинноположительных аллелей, определенных по базе данных IPD/IMGT-HLA на репрезентативной выборке образцов). Локус Диагностическая чувствительность 95% ДИ HLA-A 100% 99,87-100,00% HLA-B 100% 99,87-100,00% HLA-C 100% 99,87-100,00% HLA-DQB1 100% 99,87-100,00% HLA-DRB1 100% 99,87-100,00% • Диагностическая специфичность - 100% в отношении каждого из целевых локусов. (установлена как доля истинноотрицательных аллелей, определенных по базе данных IPD/IMGT-HLA на репрезентативной выборке образцов). Локус Диагностическая специфичность 95% ДИ HLA-A 100% 100,00-100,00% HLA-B 100% 100,00-100,00% HLA-C 100% 100,00-100,00% HLA-DQB1 100% 100,00-100,00% HLA-DRB1 100% 100,00-100,00% • Повторяемость результатов в пределах запуска составляет 100% (ДИ 95%: 90,11%- 100,00%). • Воспроизводимость результатов составляет 100% (95% ДИ: 90,36%-100,00%). • Набор реагентов идентифицирует контаминированные образцы. • Анализ данных и HLA-типирование осуществляется с помощью входящего в состав набора программного обеспечения «PARallele™ HLA software» версия 1 и алгоритма mercury-pipeline версия 1. Подробнее см. Том 2. Анализ данных и Том 3. Программное обеспечение «PARallele ™ HLA software». 1.7.СОСТАВ НАБОРА РЕАГЕНТОВ Состав изделия с каталожным номером HLA-v3a: --- стр. 34 --- ООО «ПАРСЕК ЛАБ: PARallele™ HLA solution v3 .. Общие сведения о наборе реагентов иИнструкция по применению - „ лабораторный протокол # Е Г 94 Страница 34 из 55 Объем оперативной памяти: 4 ГБ и более; Объем дискового накопителя: 500 ГБ и более; МАТЕРИАЛЫ Наконечники с фильтром в штативах для дозаторов объемом до 10 мкл, 20 мкл, 100 мкл, любой 300 мкл, 1000 мкл Пробирки LoBind™ объемом 1,5 мл Eppendorf ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ РЕАГЕНТЫ NaOH, класс чистоты: для молекулярной биологии любой Вода I типа, 18MQ любой 022431021 Денатурация пула библиотек 1. Начните разморозку картриджа для секвенирования и разморозьте реагент HT1 из Комплекта для секвенирования. 2. Приготовьте свежий 0,2М NaOH, объединив 800 мкл воды 1 типа и 200 мкл 1М NaOH. Полученный раствор представляет собой 1 мл 0,2М NaOH. Не храните 0,2М NaOH более 1 недели. 3. В 1,5 мл пробирке LoBind™ приготовьте следующую смесь для проведения денатурации: Компонент Объем, мкл Пул библиотек 20 0,2М NaOH 20 Итого 40 4. Вортексируйте и центрифугируйте в импульсном режиме. 5. Инкубируйте смесь 5 минут при комнатной температуре. 6. К 40 мкл денатурированного пула библиотек добавьте 20 мкл Нейтрализующего буфера (Н). 7. Вортексируйте и центрифугируйте в импульсном режиме. 8. К 60 мкл денатурированного пула библиотек из пункта б добавьте 940 мкл реагента НТ1 (входит в состав Комплекта для секвенирования). 9. Вортексируйте и центрифугируйте в импульсном режиме. --- стр. 35 --- PARallele™ HLA solution v3 # !T seq ООО «ПАРСЕК ЛАБ » Инструкция по применению Общие сведения о наборе реагентов и лабораторный протокол Страница 35 из 55 10. В картридж при секвенировании на приборе MiSeq загружается 600 мкл из 1000 мкл полученного раствора. 2.4.СЕКВЕНИРОВАНИЕ Реагенты для секвенирования, входящие в Набор, проходят контроль качества в составе медицинского изделия и отвечают установленным производителем техническим требованиям. Секвенирование следует осуществлять на генетическом секвенаторе MiSeq с использованием Комплекта для секвенирования. При работе с оборудованием следует руководствоваться соответствующей эксплуатационной документацией. 2.4.1. Планирование запуска Под планированием запуска понимается создание конфигурации запуска с основными параметрами: • тип индексирования образцов (одинарное/двойное); • режим прочтений (парноконцевое/непарноконцевое чтение); • количество циклов для прочтений и индексов; • последовательности адаптеров; • протокол анализа данных (генерация «сырых» прочтений, выравнивание и т.п.); • перечень образцов и соответствующих пар индексов. Для секвенирования с настоящим набором реагентов требуется установить следующие параметры запуска: Параметр Значение Тип индексирования Двойное индексирование (Dual Index sequencing) Режим прочтений Парноконцевое чтение (Paired-end sequencing) Количество циклов (flows) • Прямые прочтения: 151 • Обратные прочтения: 151 • Индекс i7: 8 • Индекс i5: 8 Последовательность адаптера • Прямые прочтения: --- стр. 36 --- ООО «ПАРСЕК ЛАБ: PARallele™ HLA solution v3 ,, Общие сведения о наборе реагентов иИнструкция по применению . „лабораторный протокол # K?rseq Страница 36 из 55 AG AT CGG AAG AGCACACGT СТ G AACT CCAGTCA • Обратные прочтения: AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT Протокол анализа данных Генерация сырых прочтений (GenerateFASTQ) Перечень пар индексов для варианта комплектации HLAvBa: Лунка Название индекса i7 Последовательность индекса \1 Название индекса i5 Последовательность индекса i5 Планшет для молекулярного баркодирования БА1 А1 1 ATTACTCG A TATAGCCT В1 1 ATTACTCG В ATAGAGGC С1 1 ATTACTCG C CCTATCCT D1 1 ATTACTCG D GGCTCTGA Е1 1 ATTACTCG E AGGCGAAG F1 1 ATTACTCG F TAATCTTA G1 1 ATTACTCG G CAGGACGT Н1 1 ATTACTCG H GTACTGAC А2 2х GCTACGCT A TATAGCCT В2 2х GCTACGCT В ATAGAGGC С2 2х GCTACGCT C CCTATCCT D2 2х GCTACGCT D GGCTCTGA Е2 2х GCTACGCT E AGGCGAAG F2 2х GCTACGCT F TAATCTTA G2 2х GCTACGCT G CAGGACGT Н2 2х GCTACGCT H GTACTGAC АЗ 3 CGCTCATT A TATAGCCT вз 3 CGCTCATT В ATAGAGGC СЗ 3 CGCTCATT C CCTATCCT D3 3 CGCTCATT D GGCTCTGA ЕЗ 3 CGCTCATT E AGGCGAAG F3 3 CGCTCATT F TAATCTTA G3 3 CGCTCATT G CAGGACGT НЗ 3 CGCTCATT H GTACTGAC А4 4 GAGATTCC A TATAGCCT В4 4 GAGATTCC В ATAGAGGC С 4 4 GAGATTCC C CCTATCCT D4 4 GAGATTCC D GGCTCTGA Е4 4 GAGATTCC E AGGCGAAG F4 4 GAGATTCC F TAATCTTA G4 4 GAGATTCC G CAGGACGT Н4 4 GAGATTCC H GTACTGAC А5 5х CGAGGCTG A TATAGCCT --- стр. 43 --- ООО «ПАРСЕК ЛАБ» PARallele™ HLA solution v3gfrporseq Lab Инструкция по применению Общие сведения о наборе реагентов и лабораторный протокол Страница 43 из 55 F2 S2 ACAGTGGT SN GTGCGATA G2 S2 ACAGTGGT SO CCAACAGA Н2 S2 ACAGTGGT SP TTGGTGAG АЗ S3 CAGATCCA SI AGCGCTAG ВЗ S3 CAGATCCA SJ GATATCGA сэ Г А Г Л Т Г Г А С1/ Г П Г Л Г А Г ГJ J J l\ D3 S3 CAGATCCA SL TATGAGTA ЕЗ S3 CAGATCCA SM ACATAGCG F3 S3 CAGATCCA SN GTGCGATA G3 S3 CAGATCCA SO CCAACAGA НЗ S3 CAGATCCA SP TTGGTGAG А4 S4 AACCCCTC SI AGCGCTAG В4 S4 AACCCCTC SJ GATATCGA С4 S4 AACCCCTC SK CGCAGACG D4 S4 AACCCCTC SL TATGAGTA Е4 S4 AACCCCTC SM ACATAGCG F4 S4 AACCCCTC SN GTGCGATA G4 S4 AACCCCTC SO CCAACAGA Н4 S4 AACCCCTC SP TTGGTGAG А5 S5 CCCAACCT SI AGCGCTAG В5 S5 CCCAACCT SJ GATATCGA С5 S5 CCCAACCT SK CGCAGACG D5 S5 CCCAACCT SL TATGAGTA Е5 S5 CCCAACCT SM ACATAGCG F5 S5 CCCAACCT SN GTGCGATA G5 S5 CCCAACCT SO CCAACAGA Н5 S5 CCCAACCT SP TTGGTGAG А6 S6 GAAACCCA SI AGCGCTAG Вб S6 GAAACCCA SJ GATATCGA С6 S6 GAAACCCA SK CGCAGACG D6 S6 GAAACCCA SL TATGAGTA Е6 S6 GAAACCCA SM ACATAGCG F6 S6 GAAACCCA SN GTGCGATA G6 S6 GAAACCCA SO CCAACAGA Нб S6 GAAACCCA SP TTGGTGAG А7 S7 AGGGTCAA SI AGCGCTAG В7 S7 AGGGTCAA SJ GATATCGA С7 S7 AGGGTCAA SK CGCAGACG D7 S7 AGGGTCAA SL TATGAGTA Е7 S7 AGGGTCAA SM ACATAGCG F7 S7 AGGGTCAA SN GTGCGATA G7 S7 AGGGTCAA SO CCAACAGA Н7 S7 AGGGTCAA SP TTGGTGAG А8 S8 AGGAGTGG SI AGCGCTAG В8 S8 AGGAGTGG SJ GATATCGA С8 S8 AGGAGTGG SK CGCAGACG --- стр. 44 --- # po?r s e q ООО «ПАРСЕК ЛАБ» PARallele™ HLA solution v3 Инструкция по применению Общие сведения о наборе реагентов и лабораторный протокол Страница 44 из 55 D8 S8 AGGAGTGG SL TATGAGTA Е8 S8 AGGAGTGG SM ACATAGCG F8 S8 AGGAGTGG SN GTGCGATA G8 S8 AGGAGTGG SO CCAACAGA Н8 S8 AGGAGTGG SP TTGGTGAG ДО ЬУ LCj IAL I ACj SI AGCGCTAG В9 S9 CGTACTAG SJ GATATCGA С9 S9 CGTACTAG SK CGCAGACG D9 S9 CGTACTAG SL TATGAGTA Е9 S9 CGTACTAG SM ACATAGCG F9 S9 CGTACTAG SN GTGCGATA G9 S9 CGTACTAG SO CCAACAGA Н9 S9 CGTACTAG SP TTGGTGAG А10 S10 GGACTCCT SI AGCGCTAG В10 S10 GGACTCCT SJ GATATCGA СЮ S10 GGACTCCT SK CGCAGACG D10 S10 GGACTCCT SL TATGAGTA ЕЮ S10 GGACTCCT SM ACATAGCG F10 S10 GGACTCCT SN GTGCGATA G10 S10 GGACTCCT SO CCAACAGA НЮ S10 GGACTCCT SP TTGGTGAG А11 S11 TAGGCATG SI AGCGCTAG В11 S11 TAGGCATG SJ GATATCGA С11 S11 TAGGCATG SK CGCAGACG D11 S11 TAGGCATG SL TATGAGTA Е11 S11 TAGGCATG SM ACATAGCG F11 S11 TAGGCATG SN GTGCGATA G11 S11 TAGGCATG SO CCAACAGA Н11 S11 TAGGCATG SP TTGGTGAG А12 S12 CTCTCTAC SI AGCGCTAG В12 S12 CTCTCTAC SJ GATATCGA С12 S12 CTCTCTAC SK CGCAGACG D12 S12 CTCTCTAC SL TATGAGTA Е12 S12 CTCTCTAC SM ACATAGCG F12 S12 CTCTCTAC SN GTGCGATA G12 S12 CTCTCTAC SO CCAACAGA Н12 S12 CTCTCTAC SP TTGGTGAG На заключительном этапе в план запуска вносится перечень образцов в соответствии с использованными при создании библиотек парами индексов. Планирование запуска осуществляется в соответствии с инструкцией производителя секвенатора. Как правило, основные параметры запуска указываются в конфигурационном файле (sample sheet), который может быть создан с помощью ПО, поставляемого с секвенатором. --- стр. 45 --- ООО «ПАРСЕК ЛАБ:^ pcirseq Lob PARallele™ HLA solution v3 Инструкция по применению Общие сведения о наборе реагентов и лабораторный протокол Страница 45 из 55 2.4.2. Комплект для секвенирования Для выполнения секвенирования библиотек HLA на приборе MiSeq требуется одноразовый Комплект для- секвенирования. Для HLA-типирования следует устанавливать режим равных прочтений: 150+150 циклов. Каждый тип комплекта реактивов MiSeq включает в себя тип кюветы для конкретного комплекта и реактивы, требующиеся для выполнения секвенирования. Ячейка и раствор для секвенирования. Ячейка MiSeq представляет собой нанесенный на стеклянную подложку одноразовый субстрат, в котором происходит генерация кластеров и выполняется реакция секвенирования. Реактивы попадают в проточную кювету через входное отверстие, проходят по однодорожечной области визуализации, а затем покидают проточную кювету через выходное отверстие. Отработанная жидкость из проточной кюветы направляется в бутыль для сбора отходов. Перед настройкой цикла библиотеки загружаются в картридж с реактивами, а затем автоматически переносятся в проточную кювету после начала цикла. Картридж для секвенирования. Картридж с реактивами MiSeq представляет собой одноразовый расходный материал, состоящий из емкостей с колпачками из фольги, предварительно заполненных реактивами для кластеризации и секвенирования в количестве, достаточном для секвенирования одной проточной кюветы. Все емкости картриджа с реактивами пронумерованы. Библиотеки образцов загружаются в положение 17 картриджа, отмеченное этикеткой Load Samples. 2.4.3. Включение секвенатора Включите прибор MiSeq, следуйте инструкции производителя. По завершении инициализации откроется главная страница. На главной странице выберите Run Options (Опции цикла). Выберите вкладку Run Settings (Настройки цикла). Выберите Post Run Wash (Послецикловая промывка) или Maintenance Wash (Профилактическая промывка). Промывку прибора требуется выполнять после каждого цикла секвенирования. Программное обеспечение требует, чтобы промывка выполнялась перед настройкой последующего цикла. Послецикловая промывка занимает около 30 минут. Профилактическая промывка занимает около 1 часа. 2.4.4. Разморозка картриджа для секвенирования --- стр. 49 --- PARallele™ HLA solution v3 # Po?rS eq ООО «ПАРСЕК ЛАБ» Инструкция по применению Общие сведения о наборе реагентов и лабораторный протокол Страница 49 из 55 4. Выберите Save and Continue (Сохранить и продолжить). 5. Нажмите Next (Далее). 2.4.42.3апуск секвенирования Перед секвенированием система выполняет проверку всех компонентов цикла, дискового пространства и сетевых соединений перед началом цикла. Если какие-либо позиции не проходят предварительную проверку, на экране появится сообщение об этом и указания относительно того, как исправить ошибку. Если все позиции прошли предварительную проверку, нажмите Start Run (Запуск цикла). Продолжительность цикла секвенирования составляет 24 часа. 2.4.13.Мониторинг секвенирования В процессе секвенирования можно наблюдать за его ходом, интенсивностью и качеством распознавания оснований, используя для этого экран прибора. Q-Score All Cycles (Баллы Q-Score для всех циклов). Служит для отображения средней процентной доли оснований, для которых значение баллов качества Q-Score превышает Q30. Величина Q-score является прогнозом вероятности неправильного распознавания оснований. Баллы Q-Scores вычисляются после 25-го внутреннего цикла. Cluster Density (K/mm2) (Плотность кластеров, К/мм2). Служит для отображения количества кластеров, обнаруженных на квадратном миллиметре во время цикла. Clusters Passing Filter (%) (Кластеры, проходящие фильтр, %). Служит для отображения доли кластеров, проходящих фильтр, на основе фильтра чистоты lllumina, измеряющего качество распознавания. Эти данные появляются только после 25-го цикла. Estimated Yield (Mb) (Ожидаемый выход, в мегабазах). Эта информация отражает количество оснований, распознанных в ходе цикла (единица измерения — мегабаза, 1 млн нуклеотидных оснований). Эти данные появляются только после 25-го цикла. По окончании секвенирования появляется кнопка Next (Далее). Нажмите Next (Далее) для выхода из экрана Sequencing (Секвенирование) и перехода к послецикловой промывке. 2.4.14. Контроль плотности кластеров --- стр. 50 --- ООО «ПАРСЕК ЛАБ: PARaliele™ HLA solution v3 Ф £ ° rseq °°°п№ с Инструкция по применению ЕК ЛАБ» PARaliele™ HLA solution v3 Общие сведения о наборе реагентов и _ ^ лабораторный протокол Для обеспечения эффективной генерации кластеров производитель оборудования для секвенирования lllumina Inc. рекомендует для загрузки на ячейку денатурированный пул библиотек в концентрации 20 пМ (по документу MiSeq System Denature and Dilute Libraries Guide, 15039740 v10). Протокол денатурации и разведения при стандартной концентрации пула библиотек, полученного в ходе пробоподготовки с Набором реагентов, описан в разделе 2.3. РАЗВЕДЕНИЕ И ДЕНАТУРАЦИЯ. Оптимальная плотность кластеров (до фильтрации) составляет 1000-1200 K/mm2. При недостаточной плотности кластеров по результатам секвенирования возможно изменение параметров денатурации и финального разведения. Для достижения нужной плотности кластеров пропорционально увеличьте объемы пула библиотек, 0,2М NaOH и Нейтрализующего буфера (например, в 1,5 или 2 раза) и добавьте реагент НТ1 до объема 1000 мкл. * 2 Для проведения анализа данных следуйте информации в Инструкции пользователя - Том 2. Анализ данных и Том 3. Программное обеспечение «PARaliele ™ HLA software». --- стр. 51 --- ООО «ПАРСЕК ЛАБ: PARallele™ HLA solution v3^ porseq Lob Инструкция по применению Общие сведения о наборе реагентов и лабораторный протокол Страница 51 из 55 3. ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ • Транспортировку Набора реагентов производить крытыми видами транспорта при двух температурах: от минус 22 до минус 18°С, и от плюс 2 до плюс 8°С. Допускается транспортировка с использованием термоконтейнера и хладоэлементов не более 3 суток. Транспортирование изделий должно осуществляться в термоконтейнерах одноразового пользования, содержащих хладоэлементы, или в термоконтейнерах многократного применения с автоматически поддерживаемой температурой или в авторефрижераторах с использованием термоиндикаторов. • Наборы, транспортированные с нарушением температурного режима, применению не подлежат. • Изделие транспортируется на двух температурных режимах в температурных пакетах. Общая упаковка изделия транспортируется вместе с температурным пакетом +2...+8°С. • Компоненты Набора реагентов должны храниться в упаковке предприятия- изготовителя при обозначенной температуре (от минус 22 до минус 18°С, и от плюс 2 до плюс 8°С) в течение всего срока годности набора. Хранение изделий при температуре от плюс 2°С до плюс 8°С и от минус 22 до минус 18°С должно осуществляться в холодильных камерах или в холодильниках, обеспечивающих регламентированный температурный режим. • Набор реагентов рассчитан на однократное применение после вскрытия без возможности повторных заморозок-разморозок и дробных постановок. • Срок годности Набора реагентов 12 месяцев. 4. УКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ • Набор реагентов должен применяться согласно инструкции по применению, утвержденной генеральным директором предприятия-изготовителя. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции. • Не допускается смешивание или одновременное использование компонентов из разных серий Набора реагентов. Реагенты с истекшим сроком годности применению не подлежат. • Набор реагентов рассчитан на однократное применение. Дробные постановки не применимы. • Набор реагентов не подлежит ремонту и обслуживанию. • После подготовки к эксплуатации изделие должно применяться в нормальных климатических условиях: --- стр. 57 --- ООО «ПАРСЕК ЛАБ: PARallele™ HLA solution v3Ш porseq Lob Инструкция по применению Анализ данных Страница 2 из 18 ОГЛАВЛЕНИЕ 1. ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................................................................3 2. МЕТРИКИ КАЧЕСТВА ДАННЫХ....................................................................................................................................3 2.1. Метрики качества запуска..........................................................................................................................................4 2.2. Метрики качества образца.........................................................................................................................................4 2.3. Метрики качества локуса............................................................................................................................................5 2.4. Контаминация......................................................................................................................................................................5 2.5. Качество генотипирования.........................................................................................................................................6 3. НОВЫЕ АЛЛЕЛИ........................................................................................................................................................ б 4. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АННОТАЦИЯ АЛЛЕЛЕЙ....................................................................................................7 5. ИЗВЕСТНЫЕ ОГРАНИЧЕНИЯ..........................................................................................................................................7 5.1. АЛЛЕЛИ С ПОНИЖЕННОЙ АМПЛИФИКАЦИЕЙ..........................................................................................8 5.2. ИЗВЕСТНЫЕ НЕРАЗРЕШИМЫЕ НЕОДНОЗНАЧНОСТИ ПО АЛЛЕЛИ ...............................................8 5.3. ИЗВЕСТНЫЕ НЕРАЗРЕШИМЫЕ НЕОДНОЗНАЧНОСТИ ПО ГЕНОТИПУ..........................................8 6. ФОРМАТЫ ВЫХОДНЫХ ДАННЫХ................................................................................................................................8 6.1. ОТЧЕТ ПО ОБРАЗЦУ.........................................................................................................................................................9 6.2. ОТЧЕТ ПО ЗАПУСКУ............................................................................... 9 6.3. ТАБЛИЦА ГЕНОТИПОВ ПО ОБРАЗЦАМ..........................................................................................................10 7. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОНТРОЛЬНОГО ОБРАЗЦА.............................................................................................11 ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Пример отчета по образцу......................................................................................................13 ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Пример отчета по запуску.......................................................................................................1 5 Для работы с ПО используйте Инструкцию пользователя - Том 3. Программное обеспечение «PARallele ™ HLA software». Доступ к ПО «PARallele™ HLA software» версия 1 и электронной версии Инструкции пользователя предоставляется по адресу https://hla.parseq.pro . --- стр. 58 --- porseq Lob ООО «ПАРСЕК ЛАБ» PARallele™ HLA solution v3 Инструкция по применению Анализ данных Страница 3 из 18 1. ВВЕДЕНИЕ Анализ данных и HLA-генотипирование осуществляются с помощью алгоритма mercury-pipeline версия 7, интегрированного в ПО «PARallele™ HLA software» (далее Алгоритм). Алгоритм выполняет следующие функции: • выравнивание прочтений несколькими независимыми алгоритмами на последовательности базы данных IPD-IMGT/HLA актуальной версии; • оценку качества данных (включая оценку контаминации) с последующей автоматической сортировкой и фильтрацией образцов по качеству; • определение HLA-генотипа с заданным разрешением по анализируемым локусам HLA; • определение новых аллелей Алгоритм представляет собой программный конвейер, принимающий на вход результаты секвенирования и метаданные запуска, и выдающий результаты HLA- типирования соответствующего разрешения. На первом этапе происходит программное отрезание (тримминг) технических последовательностей и концевых оснований с низким качеством прочтения, а также выравнивание на базу данных IPD-IMGT/HLA соответствующей версии. Далее происходит расчет и оценка метрик качества данных, и HLA-генотипирование путем интеграции результатов нескольких независимых алгоритмов определения HLA-аллелей, за счет чего достигаются высокие аналитические характеристики. При обновлении базы данных IPD-IMGT/HLA, Алгоритм проходит внутреннюю верификацию, в ходе которой устанавливаются аналитические характеристики и ограничения Набора реагентов. Обновление выполняется автоматически в виде установки сервисных пакетов (SP), после чего пользователи получают уведомление об изменениях. Обновление базы данных IPD-IMGT/HLA осуществляется не реже, чем один раз в б месяцев, также предусмотрены плановые обновления Алгоритма по мере эксплуатации с целью улучшения аналитических и потребительских характеристик Набора реагентов. Ограничения метода устанавливаются путем in silico анализа базы данных IPD- IMGT/HLA и технических характеристик конкретной версии Набора реагентов для HLA- типирования (разрешение типирования, панель праймеров, размер вставки, алгоритмы HLA-типирования). 2. МЕТРИКИ КАЧЕСТВА ДАННЫХ Все метрики качества данных рассчитываются и оцениваются в автоматическом режиме. --- стр. 59 --- ^ pctrseq ООО «ПАРСЕК ЛАБ» PARallele™ HLA solution v3 J) Lab Инструкция по применению Анализ данных Страница 4 из 18 2.1. Метрики качества запуска Основной метрикой качества данных по запуску секвенатора является среднее качество прочтений в образцах запуска. Среднее качество по запуску определяется по минимальному значению среднего качества образца в данном запуске. Среднее качество прочтений по запуску определяется в первую очередь качеством реагентов для секвенирования, соблюдением сроков и условий их ранения, а также соблюдением протокола, в том числе при выборе параметров секвенирования. Среднее качество прочтений по запуску не является блокирующей метрикой при анализе данных, однако при значении ниже заданного порога рекомендуется повторить постановку. 2.2. Метрики качества образца Среднее качество прочтений образца рассчитывается как среднее качество по всем прочитанным нуклеотидам. Качество прочтения отдельных нуклеотидов рассчитывается секвенатором и записывается в файл вместе с последовательностью прочтения. Этот параметр отражает вероятность ошибки, которая для технологии высокопроизводительного секвенирования (next-generation sequencing, NGS) составляет не менее 30, то есть вероятность ошибки составляет 1/1000, или 99,9%. В норме качество несколько снижается к концу прочтения. Среднее качество прочтений по образцу определяется в первую очередь качеством реагентов для секвенирования, соблюдением сроков и условий их ранения, а также соблюдением протокола, в том числе при выборе параметров секвенирования. Среднее качество прочтений по образцу является блокирующей метрикой при анализе данных, то есть при значении ниже заданного порога, образец является непригодным для дальнейшего анализа. Число прочтений на образец - основная метрика качества секвенирования образца - количество прямых и обратных прочтений, полученное для образца. Число прочтений на образец складывается из целевых прочтений (выровненных на анализируемые локусы HLA), гомологичных прочтений (выровненных на гомологи анализируемых локусов HLA), нецелевых прочтений (выровненных на локусы, отличные от HLA) и триммированных по качеству прочтений (под триммингом понимается отсечение с конца прочтений нуклеотидов с качеством ниже заданного; если после этого длина прочтения становится менее заданного значение, такое прочтение удаляется). Число прочтений на образец определяется соблюдением протокола на этапах измерения концентрации готовых библиотек, разведения и пулирования образцов. Число прочтений на образец по образцу является блокирующей метрикой при анализе данных, то есть при значении ниже заданного порога, образец является непригодным для дальнейшего анализа. Превышение рекомендованного значения не способствует повышению качества результата, но при этом негативно влияет на распределение прочтений по другим образцам. Размер вставки — это средняя длина секвенируемых фрагментов, определенная по результатам выравнивания пары прочтений на последовательности аллелей из базы --- стр. 60 --- if parseq Lab Инструкция по применению ООО «ПАРСЕК ЛАБ» PARallele™ HLA solution v3 Анализ данных Страница 5 из 18 данных IPD-IMGT/HLA актуальной версии. Под вставкой понимается длина фрагмента без учета последовательностей адаптеров: 5 3 70 пн 150 пн Адаптер 1 Прочтение 1 70 пн Адаптер 2 , Оставка~ Прочтение 2 150 пн Размер вставки > 300 пн Длина фрагмента >440 пн Размер вставки в основном зависит от точности соблюдения протокола на этапе фрагментации и при очистках магнитными частицами. Низкий размер вставки может привести к невозможности фазирования аллелей и увеличению неоднозначности результатов генотипирования. Повышенное значение размера вставки может привести к неравномерности покрытия внутри локуса. Размер вставки является блокирующей метрикой при контроле качества, то есть при значении ниже заданного порога, образец является непригодным для дальнейшего анализа. 2.3. Метрики качества локуса Основной метрикой качества анализируемого локуса является число прочтений, выровненное на локус (при этом учитываются только те, прочтения в которых оба прочтения из пары выровнялись на данный локус). Каждый локус анализируется независимо от других локусов. Недостаточное покрытие по одному из анализируемых локусов может свидетельствовать о выпадении аллелей (drop out, потеря гетерозиготности), то есть наличии в образце аллелей, которые не могут быть амплифицированы с помощью Набора реагентов. Число прочтений на локус является блокирующей метрикой при анализе данных, то есть при значении ниже заданного порога, локус является непригодным для дальнейшего анализа. Подробнее см. раздел Аллели с пониженной амплификацией. 2.4. Контаминация Контаминация исследуемых образцов посторонней геномной ДНК человека или продуктами её амплификации, идентифицируется автоматически как высокая степень неоднозначности полученных результатов генотипирования, и показывает присутствие третьей аллели с частотой не менее 25% (в формате «обнаружено/не обнаружено»). Идентификация контаминации в образце является блокирующей метрикой при анализе данных, то есть при заданном значении, образец является непригодным для дальнейшего анализа. Образец признается контаминированным, если по 4 из 5 анализируемых локусов наблюдается неоднозначность на уровне первого поля (1 field). При обнаружении --- стр. 61 --- ООО «ПАРСЕК ЛАБ: PARallele™ HLA solution v3 # Е ™ *4 Инструкция по применению Анализ данных Страница 6 из 18 контаминации рекомендуется повторно забрать биоматериал, выделить ДНК и секвенировать образец с помощью Набора реагентов. 2.5. Качество генотипирования После определения наиболее вероятного генотипа по результатам интеграции генотипов, полученных по нескольким независимым алгоритмам, оценивается качество генотипирования путем оценки степени неоднозначности по генотипам и по аллелям. Качество генотипирования по локусу является блокирующей метрикой при анализе данных, то есть при значении выше заданного порога по степени неоднозначности, генотип признается некорректным, и образец автоматически направляется в службу поддержки. При этом неоднозначные генотипы и неоднозначные аллели, входящие в список известных неразрешимых неоднозначностей, не являются некорректным результатом и подлежат выдаче наряду с однозначными генотипами и аллелями. Установленные пороговые значения по метрикам качества представлены в таблице: Метрика Зеленая зона Красная зона Среднее качество (phred) >30 <25 Число прочтений на образец 100 000-300 000 <30 000 Размер вставки (п.н.) 300 - 600 <200 Число прочтений на локус HLA-A 7 000-43 000 < 3 000 Число прочтений на локус HLA-B 3 000 - 22 000 < 2 500 Число прочтений на локус HLA-C 7 000 - 39 000 < 3000 Число прочтений на локус HLA-DQB1 3 000-31 000 < 2 500 Число прочтений на локус HLA-DRB1 7 000 - 43 000 < 3 000 Контаминация Не обнаружено Обнаружено Число генотипов на локус (за исключением известных неразрешимых неоднозначностей по генотипу) 1 >1 Число аллелей на локус (за исключением известных неразрешимых неоднозначностей по аллели) 2 >2 Значения, не попадающие в зеленую и красную зоны, относятся к желтой зоне, соответствующей субоптимальным значениям. 3. НОВЫЕ АЛЛЕЛИ Алгоритм HLA-генотипирования позволяет идентифицировать аллели, не включенные в базу данных IPD-IMGT/HLA актуальной версии. В случае обнаружения такой аллели в образце, алгоритм в автоматическом режиме направит образец в службу --- стр. 62 --- ООО «ПАРСЕК ЛАБ» PARallele™ HLA solution v3 # S ? ™ * 4 Инструкция по применению Анализ данных Страница 7 из 18 поддержки, где новая аллель будет подтверждена и описана специалистами ООО «ПАРСЕК ЛАБ». 4. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АННОТАЦИЯ АЛЛЕЛЕЙ В соответствии с номенклатурой1, аллели могут быть присвоены буквенные суффиксы, отражающие особенности ее экспрессии. В соответствии с п. F1.1.4.1.2 Стандартов Европейской Федерации Иммуногенетики1 2 информация об экспрессии должна быть указана в результатах HLA-типирования. Функциональная аннотация аллели предоставляется программным обеспечением при ее наличии в базе данных IPD- IMGT/HLA. Функциональная аннотация доступна только в том случае, если замена, влияющая на уровень экспрессии, произошла в кодирующей последовательности (в экзоне). Возможные суффиксы и их значения приведены в таблице: Суффикс_________________________________________Значение N Нуль аллель. Белок не экспрессируется. (Null) Аллель имеет низкую экспрессию по сравнению с нормальным уровнем. (Low) ^ Кодируемый аллелью белок экспрессируется в виде секреторной молекулы, отсутствует на клеточной поверхности. (Secreted) Кодируемый аллелью белок присутствует в цитоплазме, но отсутствует на клеточной поверхности. (Cytoplasm) Аберрантная экспрессия. Указывается, когда есть сомнения в том, экспрессируется ли белок. (Aberrant) Уровень экспрессии остается под вопросом, но в аллели обнаружена мутация, которая оказывает влияние на экспрессию. (Questionable) Внимание! Суффикс может быть присвоен алгоритмом только если замена, отражающаяся на экспрессии, произошла в экзоне. Известные нуль аллели и аллели с альтернативной экспрессией, для актуальной версии базы данных IPD-IMGT/HLA, доступны на сайте номенклатурного комитета по HLA- системе Всемирной Организации Здравоохранения по ссылке http://hla.alleles.org/alleles/nulls.html. 5. ИЗВЕСТНЫЕ ОГРАНИЧЕНИЯ 1 Комитета по номенклатуре факторов HLA-системы ВОЗ http://hla.alleles.ora/nomenclature/namina.html. 2 Standards For Histocompatibility & Immunogenetics Testing, version 8. --- стр. 63 --- ООО «ПАРСЕК ЛАБ» PARallele™ HLA solution v3 # g ? ™ * 4 Инструкция по применению Анализ данных Страница 8 из 18 Ограничения метода установлены путем in silico анализа базы данных IPD-IMGT/HLA и технических характеристик конкретной версии набора реагентов для HLA-типирования (разрешение типирования, панель праймеров, размер вставки, алгоритмы HLA- типирования). 5.1. А/1ЛЕЛИ С ПОНИЖЕННОЙ АМПЛИФИКАЦИЕЙ Пониженная амплификация приводит к недостаточному для генотипирования числу прочтений. В случае полного отсутствия прочтений говорят о выпадении аллели. Эффективность амплификации снижается в случае наличия в аллели замены, находящейся в сайте посадки праймера. В редких случаях отдельные аллели групп HLA-DQB1*02, HLA-DQB1*03 и HLA- DQB1*06 могут иметь пониженную амплификацию, вплоть до полного выпадения. Другой причиной пониженной амплификации может являться значительная разница в длине аллелей. Это характерно для аллелей группы HLA-DRB1*04, размер которых примерно на 1 т.п.н. больше, чем размер других аллельных групп. 5.2. ИЗВЕСТНЫЕ НЕРАЗРЕШИМЫЕ НЕОДНОЗНАЧНОСТИ ПО АЛЛЕЛИ Под неоднозначностью по аллели понимается невозможность однозначно установить HLA-аллель, присутствующую в образце, вследствие неполноты покрытия локуса. На уровне 2-го и 3-го поля неоднозначность по аллели возникает в случае, если панель не покрывает полностью один или несколько экзонов гена. Неоднозначными являются аллели, последовательности нуклеотидов которых имеют отличия только в пределах регионов, не покрытых при секвенировании. Поскольку Набор реагентов покрывает гены HLA class I полностью, неразрешимые неоднозначности по аллели характерны только для генов HLA class II. 5.3. ИЗВЕСТНЫЕ НЕРАЗРЕШИМЫЕ НЕОДНОЗНАЧНОСТИ ПО ГЕНОТИПУ Под неоднозначностью по генотипу понимается невозможность однозначно установить пару HLA-аллелей, присутствующую в образце, вследствие невозможности фазирования замен, расположенных в разных экзонах локуса. Неоднозначность по генотипу возникает в случае, когда в генотипе присутствует сочетание аллелей, для каждой из которых известна высокогомологичная аллель, отличающаяся заменой, расположенной на расстоянии, превышающем размер вставки. 6. ФОРМАТЫ ВЫХОДНЫХ ДАННЫХ --- стр. 64 --- ^ pcirseq ООО «ПАРСЕК ЛАБ: PARallele™ HLA solution v3 J) Lob Инструкция по применению Анализ данных Страница 9 из 18 6.1. ОТЧЕТ ПО ОБРАЗЦУ • Пример отчета по образцу приведен в Приложении 1 настоящей Инструкции. • Отчет по образцу состоит из пяти разделов: ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ, МЕТРИКИ КАЧЕСТВА, ОШИБКИ АНАЛИЗА, НОВЫЕ АЛЛЕЛИ и РЕЗУЛЬТАТ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ. • Общая информация включает: сокращенное наименование медицинского изделия, метод анализа, анализируемые локусы, разрешение генотипирования, номер образца, номер запуска, серию, КК контрольного образца, дату секвенирования, номер образца в запуске, имена лаборанта и супервизора, дату анализа, версию базы данных IMGT HLA, название алгоритма анализа данных, название программного обеспечения. • Метрики качества приведены в соответствующем разделе в таблице: показатель, значение. Также в разделе приведена информация о наличии или отсутствии контаминации и статусе образца. • При наличии ошибок анализа они указываются в таблице: показатель и значение. • Информация об аллелях, не включенных в базу данных IPD-IMGT/HLA актуальной версии, указывается в разделе НОВЫЕ АЛЛЕЛИ. • Результат генотипирования представлен в таблице: локус и генотип. • Формат записи генотипа: 'Аллель 1 + Аллель 2', где ND (not determined) - аллель не установлена - обозначает случай определения гомозиготы3. • Неоднозначные генотипы разделены символом «|» и записываются в столбце соответствующего локуса. • Неоднозначные аллели разделены символом «/». • При наличии функциональной аннотации аллели суффикс указывается в круглых скобках рядом с номером аллели: 'Аллель 1 (суффикс) + Аллель 2'. • Формат отчета: PDF. 6.2. ОТЧЕТ ПО ЗАПУСКУ • Пример отчета по запуску приведен в Приложении 2 настоящей Инструкции. • Отчет по запуску включает разделы: ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ ОБ АНАЛИЗЕ, КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА, СТАТУСЫ ОБРАЗЦОВ В ЗАПУСКЕ, ОШИБКИ АНАЛИЗА, НОВЫЕ АЛЛЕЛИ и РЕЗУЛЬТАТ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ. • Общая информация включает: сокращенное наименование медицинского изделия, метод анализа, анализируемые локусы, разрешение генотипирования, номер запуска, серию, КК контрольного образца, дату секвенирования, номер образца в запуске, имена лаборанта и супервизора, дату анализа, версию базы данных IMGT HLA, название алгоритма анализа данных, название программного обеспечения. 3 В соответствии с требованиями Европейской Федерации Иммуногенетики, гомозиготный генотип может указываться только в случае подтверждения аллели у обоих родителей. --- стр. 74 --- ^ porseq Lab ООО «ПАРСЕК ЛАБ» Набор реагентов «PARallele™ HLA solution v3» Инструкция по применению Программное обеспечение «PARallele™ HLA software» версия 1 Страница 1 из 22 УТВЕРЖДАЮ Генеральный директор OPd^RAPCEK ЛАБ» Павлов А.Е. 2021 г. Инструкция по применению медицинского изделия для диагностики in vitro Набор реагентов «PARallele™ HLA solution v3» для типирования генов HLA в высоком разрешении методом высокопроизводительного секвенирования ТОМ 3 ив 3 Программное обеспечение «PARallele™ HLA software» по ТУ 21.20.23-007-39429653-2020 --- стр. 75 --- ООО «ПАРСЕК ЛАБ: Набор реагентов «PARallele™ HLA solution v3^ porseq Lab Инструкция no применению Программное обеспечение «PARallele™ HLA software» версия 1 Страница 2 из 22 ОГЛАВЛЕНИЕ 1. ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................................................................................3 1.1. ТРЕБУЕМЫЕ ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПК..................................................................................3 2. ДОСТУП К ПО.........................................................................................................................................................................3 3. РОЛЕВАЯ СИСТЕМА.., .....„ ...... ..................... ,_.._..._4 4. ПРИЛОЖЕНИЯ И РАБОЧИЙ ПРОЦЕСС..................................................................................................................5 4.1. СТРАНИЦА ВХОДА............................................................................................................................................................5 4.2. СХЕМА АНАЛИЗА ОБРАЗЦА.......................................................................................................................................6 4.3. ИМПОРТ ДАННЫХ............................................................................................................................................................8 4.4. ЛАБ. КК...................................................................................................................................................................................11 4.5. УТВЕРЖДЕНИЕ........................................................................................................................................................ 14 4.6. ОДОБРЕНИЕ........................................................................................................................................................................15 4.7. ОБРАЗЦЫ..............................................................................................................................................................................16 4.8. ЭКСПОРТ ДАННЫХ.........................................................................................................................................................17 5. КАРТОЧКА ОБРАЗЦА........................................................................................................................................................18 6. НОВЫЕ АЛЛЕЛИ........................................................................................................................................................ 21 7. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОНТРОЛЬНОГО ОБРАЗЦА ............................................................................................22 8. ТЕХНИЧЕСКАЯ ПОДДЕРЖКА.......................................................................................................................................22 --- стр. 76 --- ООО «ПАРСЕК ЛАБ: # e ? rse q Набор реагентов «PARallele™ HLA solution v3» ,, Программное обеспечение ' _Инструкция по применению „ , ™ ,м „ ^ „ Страница 3 из 22у «PARallele™ HLA software» версия 1 r 1. ВВЕДЕНИЕ Программное обеспечение «PARallele™ HLA software» версия 1 (далее ПО) предназначено для анализа данных высокопроизводительного секвенирования, полученных с помощью набора реагентов для типирования генов HLA в высоком разрешении методом высокопроизводительного секвенирования (производства ООО «ПАРСЕК ЛАБ»), далее набор реагентов. ПО обеспечивает следующие возможности: • импорт "сырых" прочтений и метаданных секвенирования; • анализ загруженных прочтений различными алгоритмами с целью определения HLA-генотипа с разрешением 3 поля (3 fields) по локусам: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1 и HLA-DRB1; • визуализацию и оценку качества результатов типирования; • экспорт результатов типирования; • встроенный канал взаимодействия со службой поддержки; • разделение пользователей по ролям; • анализ и хранение данных осуществляются в "облачной" вычислительной инфраструктуре. Потоковые исследования по HLA-генотипированию требуют высокой производительности, надежности и воспроизводимости результатов, ПО назначает генотипы в полностью автоматическом режиме, ручное назначение генотипов пользователем ПО не предусмотрено. В случае невозможности автоматического назначения HLA-генотипа хотя бы по одному из локусов, образец автоматически направляется в службу поддержки. Обновление ПО для актуализации компонентов выполняется автоматически в виде установки сервисных пакетов (SP), после чего пользователи получают уведомление об изменениях. Персональные данные пациентов и добровольцев (доноров), прошедших процедуру HLA-типирования, не передаются и не хранятся в ПО. Полученные данные не используются производителем для создания регистров. 1.1. ТРЕБУЕМЫЕ ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПК • Скорость доступа в сеть Интернет не менее 50 Мбит/с. • Браузер Google Chrome версии 80 и выше. • Разрешение экрана - 1920x1080 пикселей. 2. ДОСТУП К ПО --- стр. 77 --- ООО «ПАРСЕК ЛАБ: Набор реагентов «PARallele™ HLA solution v3: # РГSeC| Инструкция по применению Программное обеспечение «PARallele™ HLA software» версия 1 Страница 4 из 22 Программное обеспечение «PARallele™ HLA software» используется исключительно для работы с Набором реагентов «PARallele™ HLA solution v3» для типирования генов HLA в высоком разрешении методом высокопроизводительного секвенирования (производства ООО «ПАРСЕК ЛАБ»). Доступ к программному обеспечению осуществляется путем авторизации на сайте https://hla.parseq.pro , после принятия лицензионного соглашения. Учетные данные пользователя указываются в сопроводительных документах к договору на поставку Набора реагентов. 3. РОЛЕВАЯ СИСТЕМА Рабочий процесс предполагает разделение пользователей на специалиста, выполняющего постановку в лаборатории, и руководителя, осуществляющего утверждение генотипов образцов. В ПО реализовано соответствующее разграничение прав доступа. Предусмотрены следующие роли: Лаборант - выполняет загрузку данных в приложение и оценивает качество запусков. Супервизор - осуществляет утверждение генотипов образцов и экспорт результатов. В соответствии с п. ЕЗ «Computer assisted analysis» руководства «Standards for Histocompatibility & Immunogenetics Testing», версия 8 (EFI, 2020), руководитель должен просмотреть, утвердить и подписать HLA-генотип, определенный автоматически с помощью ПО. Свое согласие с генотипом, установленным автоматически, Супервизор выражает путем нажатия на кнопку «Утвердить». Работа начинается с выбора приложения для работы. Список доступных приложений находится в навигационной панели. Доступность приложений по пользовательским ролям: | Приложение Описание Лаборант Супервизо| Лаб. КК Оценка лабораторных метрик качества запусков ч / ч / Импорт данных Загрузка результатов секвенирования в ПО ч / ч / Образцы Просмотр статусов и результатов генотипирования всех образцов, загруженных в аккаунт, экспорт результатов для выбранных образцов ч / ч /