Набор реагентов "Диагностикум клещевого энцефалита сухой для РТГА, РСК, РРГ" по ТУ 21.10.60-071-20401675-2019 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 --- «СОГЛАСОВАНО» Директор ФГБНУ Н им. И. «УТВЕРЖДАЮ» Начальни per и А « / / г у > ИНСТРУКЦИЯ по применению набора реагентов Диагностикум клещевого энцефалита сухой для РТГА, РСК, РРГ по ТУ 21.10.60-071-20401675-2019 Регистрационное удостоверение Nq ФСР 2008/03138 --- стр. 2 --- t I НАЗНАЧЕНИЕ Изделие для диагаостики in vitro предназначено для выявления антител к вирусу клещевого энцефалита (КЭ) в образцах сьшоротки (плазмы) крови человека в реакции торможения ге- магтлютинации (РТГА), реакции связьшания комплемента (РСК) и реакции радиального гемо лиза в геле (РРГ). Функциональное назначение - вспомогательное средство в диагностике клещевого энцефа лита. Показания к применению изделия в соответствии с его назначением. Противопоказания при применении изделия согласно инструкции - отсутствуют. ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗДЕЛИЯ Состав медицинского изделия: 1 .Диагностикум КЭ инактивированный - 10 амп. по 1 мл; 2. }С РТГА - 2 амп. по 1 мл; 3. К" РТГА - 2 амп. по 1 мл; 4.1C РСК - 2 амп. по 0,5 мл; 5. К“ РСК - 2 амп. по 0,5 мл; 6. Смесь солей для приготовления ББР - 3 пакета по 1 табл.; 7. Смесь солей для приготовления ФБР - 2 пакета по 4 табл.; 8. Смесь солей для приготовления раствора Альсевера - 1 пакет, 5 табл.; 9. Каолин - 1 стакан, 60 г. Комплектация: компоненты изделия в коробке из картона вместе с инструкцией по при менению, паспорт (в комплекте поставки). Характеристика компонентов изделия. 1. Диагностикум клещевого энцефалита (диагностикум КЭ) - антиген вируса КЭ, полу ченный из мозга нелинейных белых мышей, инфицированных вирусом КЭ, методом боратно- солевой экстракции, очищенный протамина сульфатом или фреоном (хладоном-113), инактиви рованный бета-пропиолактоном, лиофилизованный - аморфный порошок кремового цвета, после растворения - прозрачная жидкость светло-желтого цвета, вьшускаемый в комплекте с реагентами для постановки РТГА, РСК и РРГ. Титр специфических гемагглютининов не ниже чем 1:160, комплементсвязывающих антигенов - не ниже чем 1:32. 2. Положительный контрольный образец для РТГА (К^ РТГА) - асцитная жидкость крыс, иммунизированных вирусом КЭ в виде 10 % вируссодержащей суспензии мозга крысят- сосунков с последующим введением в брюшную полость крыс клеток опухоли яичника крысы для индукции асцита, обработанная хлороформом, каолином и гусиными эритроцитами, --- стр. 3 --- лиофилизированная - пористая масса кремового или коричневого цвета, после растворения - прозрачная жидкость от светло-желтого до светло-коричневого цвета. Титр антигемагтлютини- рующих антител - не ниже чем 1:160. 3. Отрицательный контрольный образец для РТГА (К‘ РТГА) - асцитная жидкость не им мунизированных крыс, индуцированная путем введения клеток опухоли яичника крысы, обра ботанная хлороформом, каолином и гусиньаш эритроцитами, лиофилизированная - пористая масса кремового или коричневого цвета, после растворения - прозрачная жидкость от светло- желтого до светло-коричневого цвета. 4. Положительный контрольный образец д м РСК (К^ РСК) - асцитная жидкость крыс, иммунизированных вирусом КЭ (как описано для 1C РТГА), обработанная хлороформом, лио филизированная - пористая масса кремового или коричневого цвета, после растворения - про зрачная жидкость от желтого до коричневого цвета. Титр комплементсвязываюпщх антител не ниже чем 1:32. 5. Отрицательный контрольный образец для РСК (К" РСК) - асцитная жидкость не имму низированных крыс, обработанная хлороформом, лиофилизированная - пористая масса кремо вого или коричневого цвета, после растворения - прозрачная жидкость от желтого до коричне вого цвета. 6. Смесь солей для приготовления боратного буферного раствора (ББР) pH 9,00±0,05 - таблетка белого цвета массой 1,05±0,02 г, в состав которой входят: натрия хло рид, кислота борная, кальция стеарат (наполнитель). 1 пакет (1 таблетка) рассчитан для приго товления 100 мл раствора ББР. 7. Смесь солей для приготовления фосфатного буферного раствора (ФБР) pH 6,20±0,05 - таблетки белого цвета общей массой 4,12±0,08 г, в состав которых входят: натрия хлорид, динатрия гидрофосфат додекагидрат/натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный, натрия дигидрофосфат дигидрат/натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный, кальция стеарат. 1 пакет (4 таблетки) рассчитан для приготовления 100 мл раствора ФБР. 8. Смесь солей для приготовления раствора Альсевера - таблетки белого цвета общей массой 5,30+0,10 г, в состав которых входят: кислота лимонная моногидрат, натрия цитрат мо- ногидрат/натрий лимоннокислый 5,5-водный, декстрозы моногидрат, казьция стеарат. 1 пакет (5 таблеток) рассчитан для получения 100 мл раствора. 9. Каолин (белая глина) - белый порошок с сероватым, желтоватым или зеленоватым от тенком, для обработки исследуемых образцов перед анализом. --- стр. 4 --- ПРИНЦИП МЕТОДА И ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ Специфическим компонентом набора является диагностикум КЭ, который способен выяв лять антитела к вирусу клещевого энцефалита в сьшоротках (плазме) крови человека в РТГА, РСКиРРГ. Принцип РТГА: диагностикум КЭ (антиген вируса клещевого энцефалита) способен вы зывать агглютинацию взвеси гусиных эритроцитов в зоне слабокислых значений pH. В присут ствии сьшоротки, содержащей антитела к вирусу клещевого энцефалита, агглютинация тормо зится (подавляется), благодаря блокировке антителами к вирусу КЭ ответственного за этот фе номен антигена - гемагтлютинина (ГА), обычно располагающегося на поверхности вириона. Принцип РСК: комплекс антиген-антитело обладает способностью связьшать комплемент. В реакции участвуют две системы антиген+антитело: специфическая (диагностикум КЭ + сы- воротка/плазма крови человека) и индикаторная (эритроциты барана + гемолизин). После взаи модействия (на первом этапе реакции) вирусных антигенов КЭ с антителами из сыворот- ки/плазмы, с комплексом антиген-антитело связывается комплемент, и он уже не может быть использован для лизиса эритроцитов (которые в смеси с гемолизином добавляют на втором эта пе реакции). Таким образом, отсутствие лизиса эритрогрггов говорит о положительном резуль тате реакции (наличии антител к вирусу КЭ в исследуемом образце). Принцип РРГ: при взаимодействии с антителами сенсибилизированных вирусным антиге ном эритроцитов барана в присутствии комплемента происходит реакция лизиса эритроцитов. Суспензию бараньих эритроцитов обрабатывают диагностикумом КЭ, отмывают и вносят в расплавленный агарозный гель, одновременно добавляя туда комплемент. После перемешива ния гель тонким слоем наливают на стеклянную пластину и после затвердения вырезают в нем лунки диаметром 2 мм. В лунки наливают по 5 мкл исследуемой сыворотки/плазмы (предвари тельно прогретой для удаления содержащегося в них комплемента). Диффундируя через гель, антитела образзтот комплекс с антигеном и комплементом на поверхности эритроцитов, след ствием чего является лизис. Вокруг лунок образуется прозрачная зона гемолиза, диаметр кото рой пропорционален концентрации специфических антител к вирусу КЭ. ОСНОВНЫЕ ПОТРЕБИТЕЛЬСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Изделие предназначено для лабораторной диагностики, для однократного применения по назначению. Изделие является нестерильным. Вид аналита - полуколичественный. Целевой аналит - антитела к вирусу КЭ. Изделие ремонту и обслуживанию не подлежит. Монтаж, наладка, калибровка и прочие операции, необходимые для ввода МИ в эксплуатацию и его правильной эксплуатации не тре буются. --- стр. 5 --- ПРИНЦИП МЕТОДА И ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ Специфическим компонентом набора является диагностикум КЭ, который способен выяв лять антитела к вирусу клещевого энцефалита в сыворотках (плазме) крови человека в РТГА, РСК и РРГ. Принцип РТГА: диагностикум КЭ (антиген вируса клещевого энцефалита) способен вы зывать агглютинацию взвеси гусиных эритроцитов в зоне слабокислых значений pH. В присут ствии сьгооротки, содержащей антитела к вирусу клещевого энцефалита, агглютинация тормо зится (подавляется), благодаря блокировке антителами к вирусу КЭ ответственного за этот фе номен антигена - гемагглютинина (ГА), обычно располагающегося на поверхности вириона. Принцип РСК: комплекс антиген-антитело обладает способностью связывать комплемент. В реакции участвуют две системы антиген+антитело: специфическая (диагностикум КЭ + сы- воротка/плазма крови человека) и индикаторная (эритроциты барана + гемолизин). После взаи модействия (на первом этапе реакции) вирусных антигенов КЭ с антителами из сьгоорот- ки/плазмы, с комплексом антиген-антитело связывается комплемент, и он уже не может быть использован для лизиса эритроцитов (которые в смеси с гемолизином добавляют на втором эта пе реакции). Таким образом, отсутствие лизиса эритроцитов говорит о положительном резуль тате реакции (наличии антител к вирусу КЭ в исследуемом образце). Принцип РРГ: при взаимодействии с антителами сенсибилизированных вирусным антиге ном эритроцитов барана в присутствии комплемента происходит реакция лизиса эритроцитов. Суспензию бараньих эритроцитов обрабатывают диагностикумом КЭ, отмывают и вносят в расплавленный агарозный гель, одновременно добавляя туда комплемент. После перемешива ния гель тонким слоем наливают на стеклянную пластину и после затвердения вырезают в нем лунки диаметром 2 мм. В лунки наливают по 5 мкл исследуемой сыворотки/плазмы (предвари тельно прогретой для удаления содержащегося в них комплемента). Диффундируя через гель, антитела образуют комплекс с антигеном и комплементом на поверхности эритроцитов, след ствием чего является лизис. Вокруг лунок образуется прозрачная зона гемолиза, диаметр кото рой пропорционален концентрации специфических антител к вирусу КЭ. ОСНОВНЫЕ ПОТРЕБИТЕЛЬСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Изделие предназначено для лабораторной диагностики, для однократного применения по назначению. Изделие является нестерильным. Вид аналита - полуколичественный. Целевой аналит - антитела к вирусу КЭ. Изделие ремонту и обслуживанию не подлежит. Монтаж, наладка, калибровка и прочие операции, необходимые для ввода МИ в эксплуатацию и его правильной эксплуатации не тре буются. --- стр. 6 --- Набор реагентов рассчитан на исследование 200 образцов одновременно в трех тестах: РТГА, РСК, РРГ. Пользователями изделия могут быть медицинские специалисты по лабораторной диагно стике с высшим и средним специальным образованием, прошедшие специальную подготовку и допущенные к работе с патогенными микроорганизмами в соответствии с СП 1.3.2322-08 (без выделения возбудителя). ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РТГА является высокочувствительным анализом. Для флавивирусов (к которым относится вирус КЭ) РТГА дает группоспецифический ответ (т.е. может выявлять антитела как к видоспе цифичным, так и группоспецифичным антигенным детерминантам флавивирусов). В частности, могут наблюдаться перекрестные реакции с сыворотками, содержащими антитела против виру сов комплекса КЭ и комплекса японского энцефалита, но на уровне значительно ниже, чем с гомологичным антигеном. РСК относится к числу малочувствительных методов (выявляет антитела, когда их много), при этом наряду с видоспецифичньпли могут обнаруживаться (в меньшей степени) и группо специфичные антитела флавивирусов. При анализе в РСК могут наблюдаться также перекрест ные реакции с сыворотками, содержащими антитела к антигенам мозговой ткани мьппей. Обна ружение специфических комплементсвязывающих антител свидетельствует о недавно перене сенной инфекции. РРГ обладает чувствительностью на уровне не ниже, чем в РТГА. В данной реакции IgG- антитела выявляются даже спустя годы после заболевания. При анализе исследуемых образцов положительным результатом в РТГА следует считать титр не ниже 1:20, в РСК - не ниже 1:4, в РРГ - зону гемолиза не менее 4 мм. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С ИЗДЕЛИЕМ Класс потенциального риска применения набора - 26. Медицинское изделие является безопасным при транспортировании, хранении и примене нии и не приносит вреда окружающей природной среде и здоровью человека. Изделие специ фически безопасно (не содержит материалов, которые могут инфицировать персонал во время анализа). Диагностикум КЭ и положительные контрольные образцы для РТГА и РСК комплек туются в набор только после подтверждения специфической безопасности. Однако при работе с исследуемым материалом следует соблюдать правила техники без опасности в соответствии с ГОСТ Р 52905-2007 «Лаборатории медицинские. Требования без опасности», исследования без выделения возбудителя могут проводиться в лабораториях, име ющих разрешительные документы на работу с микроорганизмами III - IV групп патогенности в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп пато --- стр. 7 --- X у генности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» с дополнениями СП 1.3.2518-09 и СП 1.3.2885-11. Необходимо: - работать с применением индивидуальных средств защиты (защитной одежды, одноразо вых резиновых перчаток, шапочки, защитного экрана или очков); - использовать автоматические пипетки (дозаторы) с одноразовыми пластиковыми нако нечниками; - оборудование, находившееся в контакте с исследуемыми образцами, следует дезинфи цировать 70 % этиловым спиртом; - все использованные материалы, сточные растворы, одноразовую лабораторную посуду перед утилизацией следует обеззараживать, как потенциально инфицированный материал, фи зическими или химическими методами по режимам в соответствии с СП 1.3.2322-08 (предпо чтительный и унифицированный режим обеззараживания - автоклавирование при температуре (132 ± 2) °С, 0,2 МПа в течение 45 мин). Утилизация изделий, пришедших в негодность, с истекшим сроком годности и изделий после контакта с биологическими образцами осуществляется в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицин скими отходами». СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ МЕРЫ ПО СНИЖЕНИЮ РИСКОВ ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ИЗДЕЛИЯ. При работе с изделием следует учитывать требования СП 3.1.3.2352-08 «Профилактика клещевого вирусного энцефалита. Санитарно-эпидемиологические правила», СП 3.1.3310-15 «Профилактика инфекций, передающихся иксодовыми клещами. Санитарно- эпидемиологические правила». Требования к персоналу, который проводит исследования, изложено в СП 1.3.2322-08. Объективные результаты анализа гарантируются при вьшолнении следующих условий: - хранение всех реагентов набора осуществлять при температуре от 2 до 8 °С; не использовать реагенты с истекшим сроком годности; - перед использованием набор необходимо вьщержать не менее 30 мин при температуре от 18 до 25 °С; - не использовать реагенты набора при отсутствии на их упаковке соответствующей мар кировки; - для проведения анализа использовать реагенты, входящие в данный набор и преду смотренные настоящей инструкцией. --- стр. 8 --- ОБОРУДОВАНИЕ, РЕАГЕНТЫ И МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ПРИ РАБОТЕ С ИЗДЕЛИЕМ: - рН-метр; - весы торсионные; - часы; “ дозаторы переменного объема (механические или электронные): 8- или 12-канальные с объемом дозирования от 5 до 50 мкл и 1-канальные с объемом дозирования от 1 до 5 (10) мкл, от 10 (20) до 100 (200) мкл, от 100 до 1000 мкл и от 1 до 10 мл; - наконечники, соответствующие дозаторам; - пипетки стеклянные градуированные 2-го класса точности вместимостью 10; 5; 2; 1 мл (ГОСТ 1770); - холодильник бытовой; - водяная баня (аппарат для инактивации сывороток); - термостат; - центрифуга лабораторная (1000-2500 об/мин); - штативы для пробирок; - планшеты для иммунологических реакций; - чашки Петри диаметром 100 мм; - стаканы химические мерные или колбы мерные вместимостью 100 мл, 1000 мл (ГОСТ 1770 или ГОСТ 25336); - пробирки стеклянные вместимостью 10 мл (ГОСТ 25336) или флаконы вместимостью 10-20 мл; - груша резиновая; - шприц вместимостью 10 или 20 мл; - бумага фильтровальная (ГОСТ 12026); - вода очищенная (ФС.2.2.0020.18) или вода дистиллированная (ГОСТ Р 58144), далее -вода; - раствор натрия хлорида 0,9 % (pH 7,2-7,4) стерильный. Другие реактивы и материалы, необходимые для постановки анализов, описаны ниже в разделе «ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА» и в соответствующих подразделах «Подготовка реаген тов для проведения анализа». АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ Для анализа пригодны сыворотки или плазмы крови человека, полученные стандартными лабораторными методами. Возможно использование плазмы с добавлением цитрата, гепарина или этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Все образцы должны быть промаркировны (идентифицированы). --- стр. 9 --- Для проведения анализа не следует использовать мутную, хилезную, гемолизированную сьшоротку/плазму 1фови во избежание ошибочных результатов. Пробы сыворотки/плазмы можно хранить при температуре от 2 до 8 ®С не более 2 недель или при температуре не вьппе минус 20 °С не более 1 года аликвотами (их повторное замораживание и размораживание не рекомендуется). Образцы, содержапще осадок, следует очистить центрифугированием при 1000-1500 об/мин в течение 10 мин. Для РТГА исследуемые образцы перед анализом на антитела к вирусу КЭ обрабатьшают каолином, чтобы удалить неспецифические ингибиторы гемагглютинации (ГА), а затем осво бождают от нормальных гетероагтлютининов, адсорбируя их эритроцитами гуся. Для РСК исследуемые образцы сывороток (плазм) перед анализом прогревают для инак тивации содержащегося в них комплемента. Образцы разводят Разбавителем (приготовление см. п. 2.1.1) 1:4 или 1:8 и прогревают при температуре 57-59 ®С в течение 30 мин. Для подтверждения клинического диагноза у больных с подозрением на клещевой энцефа лит исследуют парные сыворотки, полученные на 5-7 и 14-21 дни заболевания. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА 1. Реакция торможения гемагглютинации. Реакцию ставят микрометодом в общем объеме 0,1 мл. Для постановки реакции исполь зуют многоканальные пипетки с объемом дозирования 5-50 мкл и погрешностью измерения объемов не более 3 % и планшеты для иммунологических реакций по ТУ 64-2-278-79. Реакцию ставят в два этапа. Первый этап опыта - постановка реакции гемагглютинации (РГА) для определения титра диагностикума КЭ и его рабочего разведения; второй этап - постановка РТГА для определения титра исследуемых и контрольных образцов. 1.1. Подготовка реагентов для проведения анализа. 1.1.1. Боратный буферный раствор pH 9,00± 0,05 (ББР). Содержимое пакета со смесью солей (1 таблетка) растворяют в 100 мл воды при темпера туре 18-25 °С в течение 18-20 ч с последующим перемешиванием. При необходимости, для ускорения растворения подогревают на водяной бане при температуре 80-90 °С, перемешивают, охлаждают до температуры 18-25 ®С. Нерастворимый осадок (наполнитель) отделяют фильтро ванием через бумажный фильтр, после чего pH раствора доводят до 9,00±0,05 добавлением 2 -2,2 мл 4 % раствора натрия гидроксида* по ГОСТ 4328, pH определяют потенциометрически. Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 14 сут. *Примечание: 4 % раствор натрия гидроксида хранят при температуре 20-25 ® С в пластиковом флаконе не более 14 сут, в стеклянном флаконе - не более 7 сут. 1.1.2. Фосфатный буферный раствор pH 6,20±0,05 (ФБР). --- стр. 13 --- i ние 30-40 мин. Учет реакции проводят при отсутствии агглютинации в лунках контроля эритроцитов. Ре зультаты учитывают визуально по 4-крестовой системе: плюс 4 (+4) - полная гемагтлютинадия (однородная пленка эритроцитов, покрьша- ющая дно лунки); плюс 3 (+3) - гемагтлютинация меньшей степени интенсивности (одаородная плен ка эритроцитов со следами плотного осадка эритроцитов); плюс 2 (+2) - частичная гемагглютинация (однородная пленка эритроцитов на дне лунки в сочетании с более плотным осадком эритроцитов); плюс 1 (+1) - следы гемагтлютинации (следы однородной пленки эритроцитов на дне лунки в сочетании с плотным осадком эритроцитов); минус (-) - отсутствие гемагглютинации (осевшие эритроциты имеют вид ком пактного осадка). Положительным результатом в РГА считают агглютинацию эритроцитов на +3 и +4. За титр диагностикума КЭ принимают его максимальное разведение, давшее гемагтлютинацию не менее чем на +3. В РТТА диагностикум КЭ используют в рабочем разведении, содержащем 8 гемагглюти- нирующих единиц (ГАЕ). Например, при титре диагностикума 1:320 - в разведении 1:40: к 2 мл диагностикума КЭ в разведении 1:10 добавляют 6 мл ББР. Перед постановкой РТГА приготовленное рабочее разведение диагностикума КЭ контро лируют в РГА. 1.2.2. Контроль рабочего разведения диагностикума КЭ. В 3 ряда лунок вносят по 0,05 мл ББР, затем вносят в первую лунку каждого ряда по 0,05 мл диагностикума КЭ в рабочем разведении (например, 1:40). Раститровывают так, как описано при постановке РГА. Ставят контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию: в 2-3 лунки вносят по 0,05 мл ББР. Во все лунки добавляют по 0,05 мл 0,4 % взвеси эритроци тов. Планшет встряхивают в горизонтальной плоскости и выдерживают при температуре от 18 до 25 °С в течение 30-40 мин. Результаты учитывают при отсутствии агглютинации в лун ках контроля эритроцитов. Рабочее разведение используют для постановки РТГА, если по результатам контроля в нем содержится 8 ГАЕ (наблюдается гемагтлютинация в трех его последовательньгх двукрат- ньгх разведениях не менее чем на +3). Если рабочее разведение диагностикума КЭ по результа там контроля не содержит 8 ГАЕ, то его необходимо приготовить заново, изменив соотношение диагностикума КЭ и разбавителя в зависимости от результата контроля. Контроль рабочего разведения повторяют. 1.3. Проведение анализа РТГА. 1 1 --- стр. 14 --- В РТГА титруют исследуемые образцы (у больных одновременно титруют парные сыво ротки (плазмы)), а также РТГА и К” РТГА. В 4 ряда лунок планшета для иммунологических реакций, начиная со второй в каждом ря ду (внесение ингредиентов в лунки планшета см. Таблицу 1), вносят по 0,025 мл ББР, затем в первые и вторые лунки вносят по 0,025 мл исследуемых и контрольных образцов, соответ ственно маркировке рядов. Перемешивают 8-10 раз при помощи пипетки и последовательно переносят, начиная со второй, во все лунки рядов. Получают разведения исследуемых и кон трольных образцов с коэффициентом 2. В каждую лунку добавляют по 0,025 мл диагностикума КЭ в рабочем разведении (в нашем примере - 1:40). Одновременно ставят контроли: - контроль исследуемых и контрольных образцов на полноту удаления неспецифических гемагглютининов - в лунку вносят по 0,025 мл пробы и ББР; - контроль исследуемых и контрольных образцов на полноту удаления ингибиторов гемагглютинации - 4-5 капель пробы кипятят 1 -3 мин, после чего вносят 0,025 мл в лунку и до бавляют 0,025 мл диагностикума КЭ в рабочем разведении; - контроль рабочего разведения диагностикума КЭ проводят дважды: в день постановки опыта и в день учета результатов (см. п. 1.2.2); - контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию - в 2-3 лунки вносят по 0,05 мл ББР. 12 'I --- стр. 15 --- 13 Внесение ингредиентов в лунки планшета для иммунологических реакций при проведении анализа РТГА Таблица 1 Наименова ние ингреди ентов Номе ра рядов Разведение исследуемьпс и контрольных образцов (в обратных величинах) Контроль Контроль рабо чего разведения диагностикума 10 20 40 80 160 320 640 j j ^ ^ ® 5 S г о S е S ® X с S ± о ев я 5 « X « 2 Я а О S § X Ь X £ 5 ® ё X о X а яг* 3 Ч X X 1 >» л н а 2 о0 X Q , X & 5 о X ь о н § 5 = = «® ев X ^ £5 а X ё . 0 x 2 2 Э R 5^ S S U 6 о . X 2 1 о 5 « S ё ^ • 2 ^ а 5 g § ? f f l 2 ? 5X b я « Р . 2ь ^ О - S о ^ Разведение диа гностикума (в обратных вели чинах) 80 160 320 640 ББР 1-4 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 РТГА 1 0,025 0,025 переносят по 0,025 0,025 0,025* Исследуе мый образец I 2 0,025 0,025 переносят по 0,025 0,025 0,025* Исследуе мый образец II 3 0,025 0,025 переносят по 0,025 0,025 0,025* К- РТГА 4 0,025 0,025 переносят по 0,025 0,025 0,025* Диагности- кум КЭ в ра бочем разве дении (1:40) 1-4 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 Эритроциты 1-4 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 ББР 5-7 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 Диагности- кум КЭ в ра бочем разве дении (1:40) 5-7 0,05 переносят по 0,05 Эритроциты 5-7 0,05 0,05 0,05 о,о; 0,0 5 1 Примечания: указанно количество ингредиентов в мл; * - исследуемый и контрольный образцы, прогретые при температуре 100 °С. После соединения ингредиентов (компонентов смеси) планшет встряхивают в горизон тальной плоскости, выдерживают при температуре от 2 до 8 °С в течение 18-20 ч. Затем во все лунки добавляют по 0,05 мл 0,4 % взвеси эритроцитов, планшет встряхивают в горизонтальной плоскости и выдерживают при температуре от 18 до 25 °С в течение 30-40 мин, после чего учи тывают результаты. 2. Реакция связывания комплемента. Реакцию ставят микрометодом в общем объеме 0,125 мл. Для постановки реакции исполь зуют многоканальные пипетки с объемом дозирования 5-50 мкл, погрешностью измерения объемов не более 5 % и планшеты для иммунологических реакций. --- стр. 23 --- 21 - натрия дигидрофосфат дигидрат /натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный - 1,24 г; - динатрия гидрофосфат додекагидрат /натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный -4,3 г; - вода-до 100 мл. Для приготовления растворов № 1 и № 2 реактивы в указанных количествах растворяют в воде. Для приготовления РР соединяют 10 частей боратного буферного раствора, 8 частей фос фатного буферного раствора № 1 и 2 части фосфатного буферного раствора № 2. pH раствора, контролируемый потенциометрически, должен быть 6,20±0,05. РР стерилизуют в автоклаве при температуре (120±1) ®С и давлении пара (0,10±0,01) МПа в течение 30 мин. Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 14 сут. 3.1.4. Эритроциты барана. Используют свежеприготовленную дефибринированную кровь (см. п. 2.1.8). Эритроциты осаждают и трижды отмьшают в 3-4-кратном объеме раствора натрия хлорида 0,9 % pH 7,2-7,4, центрифугируя при 1800-2000 об/мин в течение 10-15 мин. Готовят 10 % взвесь эритроцитов на растворе натрия хлорида 0,9 %. Взвесь хранят в широкодонных колбах толщиной слоя не более 3 см при температуре от 2 до 8 ®С не более 3 сут. 3.1.5. Комплемент. Для постановки РРГ пригоден «Комплемент сухой» (АО «НПО «Микроген») с активностью не ниже разведения 1:60 (см. постановку РСК). В ампулу вносят раствор натрия хлорида 0,9 % до объема, указанного на ампуле (этикетке). Используют в течение 1 сут. 3.1.6. Диагностикум КЭ. В ампулу с диагностикумом КЭ вносят 1 мл воды. Вьщерживают 1-1,5 ч при температуре от 2 до 8 °С для стабилизации. Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 7 сут. 3.1.7. К-^РСК. В ампулу с 1C РСК вносят 0,5 мл воды. К "^ РСК в количестве 0,1 мл прогревают 30 мин при температуре 59-61 °С. Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 7 сут. 3.1.8. К'РСК. В ампулу с К" РСК вносят 0,5 мл воды. Прогревают и хранят так же, как К^ РСК. 3.1.9. Исследуемые образцы. Нативные сьшоротки (плазмы) крови человека в количестве 0,1 мл прогревают так же, как для РСК (см. раздел «АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ ») без предварительного разведения Раз бавителем. --- стр. 24 --- 22 Хранение: при температуре от 2 до 8 °С не более 14 сут. 3.1.10. Раствор калия метапериодата в концентрации 0,001 М. Навеску 0,023 г калия метапериодата по ТУ 6-09-02-364-83 растворяют в 100 мл РР. Хранение: в темной посуде при температуре от 2 до 8 °С не более 7 сут. 3.1.11. Раствор борной кислоты 1 %. Навеску борной кислоты 1 г растворяют в 100 мл РР. Хранение: при температуре от 2 до 8 °С, срок хранения не ограничен. 3.1.12. Сенсибилизация эритроцитов барана. 1,66 мл 10 % суспензии эритроцитов отмывают один раз в ФБР pH 7,2-7,3. К осадку отмы тых эритроцитов добавляют 1,5 мл РР и 0,7 мл 0,001 М раствора калия метапериодата, переме шивают, выдерживают при температуре от 36 до 38 ®С в течение 10 мин, затем дважды отмы вают в 10-кратном объеме ФБР pH 7,2-7,3. Эритроциты осаждают центрифугированием при 1800-2000 об/мин в течение 10-15 мин, надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 1,5 мл РР. Полученную взвесь эритроцитов смешивают с 0,55 мл диагностикума КЭ, выдержи вают при температуре от 18 до 25 °С в течение 10-15 мин, после чего эритроциты трижды от мывают в ФБР pH 7,2-7,3 так, как описано вьппе. К осадку эритроцитов добавляют 1,5 мл РР и 0,2-0,25 мл комплемента. 3.1.13. Приготовление агарозного геля. Для приготовления агарозного геля в одной чашке Петри диаметром 100 мм необходимо 0,07 г агарозы; 1,66 мл 10 % взвеси эритроцитов; 0,55 мл диагностикума КЭ; 0,20-0,25 мл комплемента; 0,1 мл 1 % раствора борной кислоты. Подготовка агарозы. К 0,07 г агарозы в стакане (флаконе) вместимостью 50-100 мл добавляют 13,8 мл ФБР pH 7,2-7,3 и кипятят на водяной бане 5-7 мин до полного расплавления агарозы. Расплавленную агарозу охлаждают до 42 °С и вносят 0,1 мл 1 % раствора борной кислоты. Заливка чашек Петри. Сенсибилизированные эритроциты, подготовленные так, как описано в п. 3.1.12., вьшива- ют в стакан (флакон) с расплавленной и охлажденной до 42 °С агарозой, смесь немедленно пе ремешивают до однородного состояния и заливают в чашку Петри, установленную горизон тально по уровню. Толщина пласта агарозного геля должна быть 2-3 мм. После застывания геля (через 3-5 мин) чашку закрьшают крьппкой и переворачивают на 30-40 мин для уплотнения ге ля. В застывшем слое агарозы металлической или стеклянной трубкой диаметром (2,00±0,05) мм вырезают 20-40 лунок на расстоянии 13-20 мм друг от друга и отсасьшают гель. Для вьшолнения этих манипуляций может служить игла для взятия крови диаметром 2 мм с от- пиленньпи концом, соединенная с грушей. --- стр. 25 --- 23 3.2. Проведение анализа РРГ. В лунки вносят по 5 мкл исследуемых образцов, а также контрольные образцы: РСК и К" РСК. Чашку закрывают крышкой и вьщерживают при температуре от 2 до 8 °С в течение 18-20 ч, а затем при температуре от 36 до 38 °С в течение 1,5-2,5 ч. Параллельно с основным опытом ставят контрольный опыт на агарозной пластинке с не- сенсибилизированными эритроцитами для исключения неспецифического гемолиза. Подготов ку эритроцитов для контрольного опыта проводят так же, как для основного, но их не соединя ют с диагностикумом КЭ. РЕГИСТРАЦИЯ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ Результаты РТГА, РСК, РРГ учитьшают визуально. Учет результатов в РТГА. После добавления взвеси эритроцитов и экспозиции 30-45 мин учитывают результаты ре акции. При наличии антител к вирусу КЭ в образце происходит торможение гемагглютинации. В этом случае эритроциты оседают на дне «пуговкой». При отрицательных результатах (отсут ствии антител к вирусу КЭ) агглютинированные эритроциты прилипают к стенкам лунок в виде «зонтика». Реакцию учитывают, если: - наблюдается полное оседание эритроцитов (— ) в контролях эритроцитов на спонтанную агглютинацию, контролях исследуемых и контрольных образцов на полноту удаления неспе цифических гемагглютининов; - наблюдается гемагглютинация не менее чем на +3 в контроле рабочего разведения диа- гностикума КЭ в трех последовательных разведениях, а также в контролях исследуемых и кон трольных образцов на полноту удаления ингибиторов гемагглютинации. За титр исследуемого или контрольного образца принимают pix максимальное разведение, даюшее полную (-) задержку гемагглютинации с 8 ГАЕ диагностикума. В Таблице 6 приведен пример результатов РТГА. Титр 1C РТГА- 1:320, исследуемого об разца II - 1:40, исследуемый образец I и К* РТГА не содержат антител к вирусу КЭ, реакция специфична, использовано 8 ГАЕ диагностикума КЭ. Специфическим считают титр антител 1:20 и вьппе, сомнительным - 1:10. У больньк диа гностическим считают нарастание титра антител в парных исследуемых образцах в 4 раза и больше. --- стр. 27 --- 25 За титр исследуемого или контрольного образца при использовании 4 КСЕ диагностикума КЭ принимают его максимальное разведение, давшее интенсивную задержку гемолиза не менее чем на +3. Реакцию считают специфичной, если диагностикум КЭ не выявляет антитела в К“ РСК, а в опыте с К "^ РСК и в контроле 4 КСЕ диагностикума КЭ выявлены титры этих контрольных об разцов, соответственно указанным на ампулах (этикетках), или отличающиеся от них не более чем на одно разведение. В примере (Таблица 8) результаты опыта учитывают, так как по результатам контроля доз комплемента в реакции использовано 1,5 ед. комплемента, титр исследуемого образца I - О, титр исследуемого образца II - 1:16, подтверждены титры К"*" РСК - 1:64 и диагностикума КЭ - 1:32, в К" РСК антитела не выявлены. Реакция специфична. Диагностическим считают нарастание титра антител в парных исследуемых образцах в 4 раза и больше. Исследуемые образцы, в которых по результатам контроля обнаружена антикомплемен- тарность, обрабатывают одним из способов: а) прогревают при температуре на 1-2 °С выше необходимой (см. раздел «АНАЛИЗИРУ ЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ»); б) замораживают при температуре минус (15-20) °С, оттаивают, осадок удаляют центри фугированием при 2000-2500 об/мин в течение 25-30 мин. Затем РСК повторяют с обработанным образцом. При неудовлетворительных результатах повторного контроля данный образец не пригоден для испытания в РСК. Таблица 8 Результаты титрования исследуемых и контрольных образцов (примерный протокол РСК) Ингредиенты i!>о.U .XX « ПР. о£ ь 5 *XО ) S 5 §а Рм С П S л 5 Я S а, о < им йС -. т ed о X Ю ч а Контроль на антикомплементарность Контроль 4 КСЕ диагно стикума КЭ (разведения диагностикума КЭ) коitsсо 2 § * ^ 2 5 0JS ^ ? еXоX ко „tn ^ й S § и X о о о iX« 35 2оS 1 ^ 3S ё 2C J 2оS XОо.+ и0.1 1:8 1:16 1:32 1:64 1 2 3 4 5 6 1 8 9 10 11 12 13 1:4 +2 — Исследуемый 1:8 +2 образец I 1:16 - 1:32 — 1:8 +4 — Исследуемый 1:16 +4 образец П 1:32 +2 1:64 +2 --- стр. 28 --- 26 к* РСК 1:16 1:32 1:64 1:128 +4 +4 +4 +4 +4 +4 +2 К'РСК 1:8 1:16 — — Контроль ди- агностикума КЭ на анти- комплемен- тарность - Контроль ди- агностикума КЭ на гемо токсичность +4 Комплемент 2 ед 1,5 ед 1 ед 0,5 ед +2 +4 Г емсистема +4 Учет результатов в РРГ. Результаты учитьюают визуально, просматривая чашки Петри в проходящем свете при снятой крьппке. Положительный результат, свидетельствуюншй о наличии специфических ан тител в исследуемых образцах и положительном контрольном образце - прозрачная зона гемо лиза диаметром не менее 4 мм вокруг лунки, в центре которой иногда остаются нелизирован- ные эритроциты. Отрицательный результат - полное отсутствие зоны гемолиза вокруг лунки с сывороткой. Реакцию считают специфичной, если в основном опыте 1C РСК дает положительный ре зультат, К“ РСК - отрицательный. При этом в контрольном опыте с несенсибилизированными эритроцитами гемолиза быть не должно. Причиной неспецифического гемолиза может быть обсемененность исследуемых образцов, для исследования таких образцов рекомендуется до бавлять в них 1 % раствор борной кислоты в количестве 1-2 капли на 2-4 мл сыворотки. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ ИЗДЕЛИЯ Транспортирование должно проводиться всеми видами крытого транспорта при темпера туре от 2 до 8 ®С. Замораживание не допускается. Хранение изделия в упаковке изготовителя должно производиться в течение всего срока годности при температуре от 2 до 8 °С. Замораживание не допускается. Хранение компонентов после вскрытия см. раздел «СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ». Срок годности - 3 года со дня приемки. Изделие с истекшим сроком годности использова нию не подлежит. --- стр. 29 --- ГАРАНТИИ ИЗГОТОВИТЕЛЯ Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение настоящей ин струкции по применению. Рекламации по вопросам, касающимся качества и обращения медицинского изделия в тече ние срока годности, с обязательным указанием номера серии и срока годности следует направ лять в адрес Акционерного общества «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген» (АО «НПО «Микроген»): Россия, 115088, г. Москва, 1-я Дубровская ул., д. 15, строение 2, тел. (495) 710-37-87, e-mail: info@microgen.ru и в адрес производства: Россия, 634040, Томская область, г. Томск, ул. Ивановского, д. 8, тел. (3822) 63-37-34. 27 Взамен инструкции утвержденной 25.04. 2018 г.