Набор реагентов для создания "библиотеки" нуклеиновых кислот ИВД TruSeqТМ Custom Amplicon Kit Dx — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 3 ---
illumina
Набор реагентов для создания «библиотеки» нуклеиновых
кислот ИВД TruSeqTM Custom Amplicon Kit Dx в вариантах
исполнения
t
только для ДИАГНОСТИКИ IN VITRO
Кат. № 20005718: 1-4 использования, до 96 библиотек
Кат. № 20006259; 1-4 использования, до 48 образцов
Назначение
Набор реагентов для создания «библиотеки» нуклеиновых кислот ИВД TruSeq^*^ Custom
Amplicon Kit Dx в вариантах исполнения, компании Иллюмина (Illumina) предназначен для
приготовления образцов библиотек из ДНК, выделенной из периферической цельной крови
и тканей, фиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE) и оценки качества
образцов ДНК (только для образцов выделенных из FFPE). Полученные библиотеки
предназначены для секвенирования на высокопроизводительном секвенаторе ДНК фирмы
Иллюмина (Illumina) секвенатор нуклеиновых кислот NextSeq™ 550Dx, методом
секвенирования нового поколения (NGS).
(Далее по тексту Набор реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx).
Принципы процедуры
Набор реагентов TruSeq’^’^ Custom Amplicon Kit Dx применятся при ручном способе
получения библиотек для секвенирования ДНК, выделенной из образцов периферической
цельной крови и тканей, фиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE). При
использовании реагентов набора реагентов TruSeq’*'^ Custom Amplicon Kit Dx c помощью
специфичных олигонуклеотидов амплифицируются целевые участки геномной ДНК
каждого образца, также в процессе работы добавляются индексные последовательности и
последовательности, необходимые для захвата проточной ячейкой амплифицированных
продуктов. При анализе ДНК из цельной крови используют протокол для анализа
герминальных вариантов, а для ДНК из ткани FFPE - протокол для соматических вариантов.
Полученные библиотеки применяются для секвенирования на высокопроизводительном
секвенаторе ДНК фирмы Illumina и для анализа с помощью программных модулей прибора
для герминальных или соматических вариантов.
Набор реагентов для оценки качества геномной ДНК, вьщеленной из образцов тканей,
фиксированных в формалине, и заключенных в парафиновые блоки TruSeq'*"'^ Custom
Amplicon Dx FFPE QC Kit (далее no тексту Набор реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Dx
FFPE QC Kit) применяется для оценки качества образцов ДНК, вьщеленной из ткани FFPE,
для определения их пригодности при использовании с набором реагентов TruSeq™ Custom
Amplicon Kit Dx. Набор применяется для количественной ПЦР в режиме реального времени
(кПЦР), которую можно проводить с использованием стандартных инструментов.
Количественная ПЦР определяет потенциал амплификации ДНК, вьщеленной из образцов
FFPE.
Требования к количеству вносимой гДНК выделенной из FFPE для подготовки библиотек
основаны на дельта количественном цикле (dCq), определяемой с помощью набора. dCq -
это разница между циклами при которых образец и контроль проходят линию порогового
значения. Реагенты, входящие в состав набора реагентов TruSeq^’^ Custom Amplicon Dx
FFPE QC Kit, избирательно амплифицируют повторяющиеся области по всему геному.
Количество библиотек зависит от количества амплифицируемой гДНК, выделенной из
образцов FFPE. Чем выше dCq образцов, тем меньще количество амплифицируемой гДНК
и тем большее количество ДНК требуется для внесения в процессе приготовления
библиотеки.
Октябрь 2020 г. Документ № 1000000029772 v05 | 1
--- стр. 4 ---
В состав набора входят все реагенты, за исключением специфических олигонуклеотидов,
разработанных пользователем.
Процесс получения библиотек состоит из 4 основных этапов: гибридизация, элонгация-
лигирование, ПЦР-амплификация и нормализация.
Процесс приготовления библиотек
• Гибридизация - связывание специфичных для областей интереса олигонуклеотидов, с
геномной ДНК. После гибридизации следует трехэтапная процедура отмывки на
фильтре, в результате которой удаляются короткие фрагменты ДНК, в том числе и
несвязавшиеся олигонуклеотиды.
• Элонгация-лигирование - достройка цепи и соединение участков, связавшихся
олигонуклеотидами. ДНК-полимераза синтезирует комплементарную ДНК области-
мишени с последуюш,им лигированием с 5'-концом олигонуклеотида ДНК-лигазой.
Результатом этого является образование последовательностей, содержащих
последовательность, которую фланкируют олигонуклеотиды и последовательность для
амплификации.
• ПЦР-амплификация - увеличение количества продуктов, полученных в результате
этапа элонгации-лигирования с использованием праймеров, которые содержат
индексные последовательности, предназначенные для мультиплексирования образцов и
последовательности, необходимые для захвата проточной ячейкой для генерирования
кластеров во время работы на секвенаторе фирмы Illumina. Далее следует процедура
очистки продуктов ПЦР (библиотеки).
• Нормализация библиотеки - процесс получения библиотек равной представленности
в конечном образце объединенной библиотеки. В конце этого процесса образец
объединенных библиотек загружают в картридж с реагентами для секвенирования SBS
(от sequencing by synthesis - секвенирование путем синтеза) и секвенируют на приборе
фирмы Illumina.
Ограничения процедуры
1. Для использования в диагностике in vitro.
2. Программное обеспечение (ПО) метода не выравнивает прочтения с инделами (инсерции,
делеции или их комбинации) при их длине > 25 пар оснований (п. о.). Соответственно, ПО
метода не выявляет инделы длиной > 25 п. о.
3. Система проверена для выявления вариантов с заменой одиночных нуклеотидов (SNV) и
делеций до 25 п.о. и 24 п.о. при анализе герминальных и соматических вариантов. Для
оценки качества анализа соматических вариантов с частотой 0,05 использовались образцы
с делециями 25 п.о. и инсерциями 18 п.о.
4. Программное обеспечение метода может не выравнивать прочтения для ампликонов со
сложным составом, в результате чего область будет расценена как дикий тип. Под сложным
составом подразумевают:
- Прочтения с более тремя инделами.
- Прочтения длиной как минимум 30 п.о. е содержанием однонуклеотидного варианта
(SNV) > 4% от общей целевой длины ампликона (исключая области зондов).
- Прочтения длиной <30 п.о. с содержанием SNV > 10% от общей длины ампликона
(включая области зондов).
5. Большие вариации, включая многонуклеотидные варианты (MNV) и длинные инделы, в
файле результатов VCF могут быть указаны как отдельные меньшие варианты.
6. Варианты с делециями могут быть отфильтрованы или пропущены, если делеция
находятся в области перекрывания ампликонов, если при этом длина делеции превышает
или равна длине области перекрывания этих ампликонов.
--- стр. 5 ---
7. He определяютея инделы, еели они находятся в регионе, который прилегает к региону
фланкируемому праймером и нет перекрывающего ампликона. В участках, которым
соответствуют перекрывающиеся ампликоны программное обеспечение для анализа
данных не позволяет обнаружить делеции, если участок перекрытия меньше размера
обнаруживаемой делеции. Например, если участок перекрытия между двумя соседними
ампликонами составляет два основания, анализ не позволит обнаружить какие-либо
делеции, включая оба этих основания. Делецию размером в один нуклеотид можно
обнаружить в любой из этих двух позиций.
8. Как и при любом протоколе приготовления библиотеки на основе гибридизации,
имеющийся полиморфизм, мутации, инсерции или делеции в олигонуклеотид-
связывающих областях могут влиять на исследуемые аллели и, следовательно, на
распознавание при секвенировании. Например:
- Вариант в фазе с вариантом в области праймера может не амплифицироваться, что
приводит к ложноотрицательному результату.
- Варианты в области праймера могут предотвращать амплификацию референтного аллеля,
что приводит к неправильному распознаванию варианта как гомозиготного.
- Варианты с инделами в области праймера могут приводить к ложноположительному
распознаванию в конце участка считывания, смежного с праймером.
9. Инделы могут быть отфильтрованы из-за положения в цепи ДНК (strand bias), если они
расположены в конце одного прочтения и не учитываются при выравнивании.
10. Малые MNV не валидированы. Небольшие MNVs не были проверены и представлены
только в модуле для соматических вариантов (Somatic Variant Module).
11. Поиск вариантов изменения числа копий гена или структурных вариантов слияния генов
или транслокаций не проверен.
12. Ограничения, специфичные для герминальных вариантов:
- Модуль программного обеспечения для определения герминальных вариантов (Germline
Variant Module), разработан для получения качественных результатов при определении
герминальных вариантов (например, гомозиготный, гетерозиготный, дикий тип).
- При использовании модуля для герминальных вариантов минимальное покрытие на
ампликон, необходимое для точного определения варианта, составляет 15 Ох.
Соответственно, требуется 150 фрагментов ДНК, что эквивалентно 300 перекрывающимся
парным прочтениям. Число образцов и общее число анализируемых оснований влияют на
покрытие. GC-состав и другие характеристики геномного состава влияют на покрытие.
- Вариация числа копий может влиять на идентификацию варианта как гомозиготный или
гетерозиготный.
- Варианты в определенном повторяющемся контексте отфильтровываются в файлах VCF.
Фильтр повторов RMxN используется для фильтрации вариантов, если вся или часть
последовательности варианта неоднократно присутствует в референтном геноме рядом с
позицией варианта. При распознавании герминального варианта требуется фильтрация как
минимум девяти повторов в референтном геноме. Учитываются только повторы длиной до
5 п.о. (R5x9).
13. Ограничения, специфичные для соматических вариантов:
- Модуль программного обеспечения для определения соматических вариантов (Somatic
Variant Module), предназначен для получения качественных результатов при определении
соматических вариантов (например, присутствие соматического варианта с частотой
варианта больше или равной 0,026 с пределом обнаружения 0,05).
- При использовании модуля для соматических вариантов минимальное покрытие на
ампликон, необходимое для точного распознавания варианта, составляет 45 Ох на один
набор олигонуклеотидов. Соответственно, требуется 450 фрагментов ДНК на набор
олигонуклеотидов, что эквивалентно 900 перекрывающимся парным прочтениям. Число
--- стр. 6 ---
образцов и общее число анализируемых оснований влияют на покрытие. GC-состав и
другие характеристики геномного состава влияют на покрытие.
- Варианты в регионе повторяющихся последовательностей ДНК отфильтровываются в
файлах VCF. Фильтр RMxN используется для фильтрации вариантов, если вся или часть
последовательности варианта неоднократно присутствует в референсном геноме рядом с
позицией варианта. При распознавании соматического варианта требуется фильтрация как
минимум 6 повторов в референсноом геноме, учитываются только повторы длиной до 3 п.о.
(R3x6).
- Модуль для соматических вариантов не позволяет различать герминальные и
соматические варианты. Модуль предназначен для обнаружения вариантов в диапазоне
частот вариантов, но частоту вариантов нельзя использовать для дифференциации
соматических и герминальных вариантов.
- Нормальные ткани в образце влияют на обнаружение вариантов. Указанный предел
обнаружения основан на частоте варианта относительно общей ДНК, выделенной из
опухоли и из нормальной ткани.
Компоненты продукта
Набор реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx в вариантах исполнения, компании
Иллюмина (Illumina) содержит еледующее:
Комплектация 1
• Набор реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx (кат. № 20005718)
• Набор реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit (кат. № 20006259)
Комплектация 2
• Набор реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx (кат. № 20005718)
Набор реагентов для еоздания «библиотеки» нуклеиновых кислот ИВД TruSeq^''^
Custom Amplicon Kit Dx в вариантах исполнения:
Комплектация 1.
Набор реагентов для создания «библиотеки» нуклеиновых кислот ИВД TruSeq^'^
Custom Amplicon Kit Dx, в составе:
I. Реагенты, для этапа пре- и пост- амплификации TruSeq^''^ Custom Amplicon Kit Dx,
коробка 1:
Реагенты для этапа пре-амплификации (Pre-Amp Reagents), коробка 1А:
1.1. Буфер для гибридизации (Hybridization Buffer) - 1 пробирка (4,32 мл/пробирка).
1.2. Смесь для удлиннения-лигирования (Extension-Ligation Mix) - 1 пробирка (4,8
мл/пробирка).
1.3. Праймеры индексированные А (А501) - Н (А508) (Index Primers А (А501) - Н (А508))
- 1 пробирка для каждого праймера (192 мкл/пробирка).
1.4. Праймеры индексированные 1 (А701) -12 (А712) (Index Primers 1 (А701) - 12 (А712)) -
1 пробирка для каждого праймера (128 мкл/пробирка).
1.5. ПЦР полимераза (PCR Polymerase) - 1 пробирка (56 мкл/пробирка)
1.6. Смесь для ПЦР (PCR Master Mix) - 1 пробирка (2,8 мл/пробирка).
Реагенты для этапа пост-амплификации (Post-Amp Reagents) коробка 1В:
1.1. Разбавитель для разведения библиотек при нормализации (Library Normalization
Diluent) - 1 пробирка (4,6 мл/пробирка).
1.2. Буфер для разведения библиотек (Library Dilution Buffer) - 1 пробирка (4,5
мл/пробирка).
1.3. Контроль внутренний РЫХ (РЫХ Internal Control) - 1 пробирка (10 мкл/пробирка).
II. Реагенты, для этапа пре- и пост-амплификации TruSeq^” '^ Custom Amplicon Kit Dx,
коробка 2:
--- стр. 7 ---
Реагенты для этапа пре-амплификации (Pre-Amp Reagents):
2.1 .Планшетфильтровальный TruSeq™ Custom Amplicon Dx (TruSeq™ Custom Amplicon Dx
Filter Plate) - 4 шт.
Реагенты для этапа пост-амплификации (Post-Amp Reagents):
2.2. Буфер для элюции (Elution Buffer) - 1 пробирка (4,8 мл/пробирка).
2.3. Буфер для хранения библиотек (Library Storage Buffer) - 1 пробирка (3,5 мл/пробирка).
III. Реагенты, для этапа пре- и пост-амплификации TruSeq^*^ Custom Amplicon
Kit Dx, коробка 3:
Реагенты для этапа пре-амплификации (Pre-Amp Reagents), коробка ЗА:
3.1. Буфер для интенсивной отмывки (Stringent Wash Buffer) - 1 флакон (24 мл/флакон).
3.2. Буфер универсальный, промывочный (Universal Wash Buffer) - 1 пробирка (4,8
мл/пробирка).
Реагенты для этапа пост-амплификации (Post-Amp Reagents) коробка ЗВ:
3.1. Микрочастицы для очистки ПЦР-продуктов (PCR Clean-Up Beads) - 1 пробирка (5
мл/пробирка).
3.2. Раствор промывочный для нормализации библиотек (Library Normalization
Wash) - 2 пробирки (4,8 мл/пробирка).
3.3. Микрочастицы для библиотеки (Library Beads) - 1 пробирка (1,2 мл/пробирка).
IV. Набор реагентов для оценки качества геномной ДНК, выделенной из образцов
тканей, фиксированных в формалине, и заключенных в парафиновые блоки TruSeq^*^
Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit, в составе:
4.1. Смесь для количественной ПЦР (qPCR Master Mix) - 2 пробирки (1 мл/пробирка).
4.2. Праймеры контрольные для проверки качества (QC Primers) - 4 пробирки (75
мкл/пробирка).
V. Инструкция по применению - 1 шт.
Комплектация 2.
Набор реагентов для создания «библиотеки» нуклеиновых кислот ИВД TruSeq^” ^
Custom Amplicon Kit Dx, в составе:
I. Реагенты, для этапа пре- и пост- амплификации TruSeq^'^^ Custom Amplicon Kit Dx,
коробка 1:
Реагенты для этапа пре-амплификации (Pre-Amp Reagents), коробка 1А:
1.1. Буфер для гибридизации (Hybridization Buffer) - 1 пробирка (4,32 мл/пробирка).
1.2. Смесь для удлиннения-лигирования (Extension-Ligation Mix) - 1 пробирка (4,8
мл/пробирка).
1.3. Праймеры индексированные А (А501) - Н (А508) (Index Primers А (А501) - Н (А508))
- 1 пробирка для каждого праймера (192 мкл/пробирка).
1.4. Праймеры индексированные 1 (А701) -12 (А712) (Index Primers 1 (А701) - 12 (А712)) -
1 пробирка для каждого праймера (128 мкл/пробирка).
1.5. ПЦР полимераза (PCR Polymerase) - 1 пробирка (56 мкл/пробирка).
1.6. Смесь для ПЦР (PCR Master Mix) - 1 пробирка (2,8 мл/пробирка).
Реагенты для этапа пост-амплификации (Post-Amp Reagents) коробка 1В:
1.1. Разбавитель для разведения библиотек при нормализации (Library Normalization
Diluent) - 1 пробирка (4,6 мл/пробирка).
1.2. Буфер для разведения библиотек (Library Dilution Buffer) - 1 пробирка (4,5
мл/пробирка).
1.3. Контроль внутренний РЫХ (PhiX Internal Control) - 1 пробирка (10 мкл/пробирка).
II. Реагенты, для этапа пре- и пост-амплификации TruSeq^''^ Custom Amplicon Kit Dx,
коробка 2:
Реагенты для этапа пре-амплификации (Pre-Amp Reagents):
2.1. Планшет фильтровальный TruSeq™ Custom Amplicon Dx (TruSeq™ Custom Amplicon
Dx Filter Plate) - 4 шт.
--- стр. 8 ---
Реагенты для этапа пост-амплификации (Post-Amp Reagents):
2.2. Буфер для элюции (Elution Buffer) - 1 пробирка (4,8 мл/пробирка).
2.3. Буфер для хранения библиотек (Library Storage Buffer) - 1 пробирка (3,5 мл/пробирка).
III. Реагенты, для этапа пре- и пост-амплификации TruSeq^''^ Custom Amplicon
Kit Dx, коробка 3:
Реагенты для этапа пре-амплификации (Pre-Amp Reagents), коробка ЗА:
3.1. Буфер для интенеивной отмывки (Stringent Wash Buffer) - 1 флакон (24 мл/флакон).
3.2. Буфер универсальный, промывочный (Universal Wash Buffer) - 1 пробирка (4,8
мл/пробирка).
Реагенты для этапа пост-амплификации (Post-Amp Reagents) коробка ЗВ:
3.1. Микрочастицы для очистки ПЦР-продуктов (PCR Clean-Up Beads) - 1 пробирка (5
мл/пробирка).
3.2. Раствор промывочный для нормализации библиотек (Library Normalization
Wash) - 2 пробирки (4,8 мл/пробирка).
3.3. Микрочастицы для библиотеки (Library Beads) - 1 пробирка (1,2 мл/пробирка).
IV. Инструкция по применению - 1 шт.
Реагенты
Реагенты, поставляемые в составе набора
Набор реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx предназначен для подготовки до 96
библиотек за одно использование (96 образцов по протоколу для герминальных вариантов
и 40 образцов по протоколу для соматических вариантов [для каждого образца требуется 2
библиотеки)). Возможно использовать набор 4 раза для приготовления 24 библиотек за
одно использование по протоколу для герминальных вариантов и 20 библиотек за одно
использование по протоколу для соматических вариантов.
Набор реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit предназначен для анализа 48
образцов. Набор можно использовать четыре раза, по 12 образцов за один раз.
Набор реагентов TruSeq’^ ’ '* Custom Amplicon Kit Dx, коробка 1
1'аблипа 1 Ко
Компонент
юбка 1А - р
Количество
гагенты для эта
Номинальный
объем
1па пре-амплификации
Действующие вещества Хранение
Буфер для
гибридизации
(Hybridization
Buffer)
1 пробирка 4,32 мл Забуференный водный раствор,
содержащий соли и формамид
от -25 °С до
-15 °С
Смесь для
удлиннения-
лигирования
(Extension-
Ligation Mix)
1 пробирка 4,8 мл Забуференный водный раствор,
содержащий ДНК-полимеразы
собственного производства, ДНК-
лигазу и dNTP
от -25 °С до
-15 °С
Праймеры
индексированные
А(А501)-Н
(А508) (Index
Primers А (А501)
- Н (А508))
1 пробирка
на праймер
192 мкл Праймеры для ПЦР с индексными
последовательностями и
адаптерами для секвенирования
от -25 °С до
-15 °С
--- стр. 9 ---
Компонент Количество Номинальный
объем Действующие вещества Хранение
Праймеры
индексированные
1 (А701)-12
(А712) (Index
Primers 1 (А701) -
12 (А712))
1 пробирка
на праймер
128 мкл Праймеры для ПЦР с индексными
последовательностями и
адаптерами для секвенирования
от -25 °С до
-15 °С
ПЦР полимераза
(PCR Polymerase)
1 пробирка 56 мкл ДНК-полимераза собственного
изготовления
от -25 °С до
-15 °С
Смесь для ПЦР
(PCR Master Mix)
1 пробирка 2.8 мл Забуференный водный раствор,
содержащий соли и dNTP
от -25 °С до
-15 °С
Габлица 2
Компонент
Коробка IB
Количество
- реагенты для
Номинальный
объем
этапа пост-амплификации
Действующие вещества Хранение
Разбавитель
для
разведения
библиотек
при
нормализации
(Library
Normalization
Diluent)
1 пробирка 4,6 мл Забуференный водный раствор,
содержащий соли, 2-меркаптоэтанол и
формамид
от -25 °С до -
15 °С
Буфер для
разведения
библиотек
(Library
Dilution
Buffer)
1 пробирка 4,5 мл Забуференный водный раствор от -25 °С до -
15 °С
Контроль
внутренний
PhiX (PhiX
Internal
Control)
1 пробирка 10 мкл Забуференный водный раствор,
содержащий PhiX гДНК
от -25 °С до -
15 °С
Набор реагентов TruSeq’^ '^ Custom Amplicon Kit Dx, коробка 2
Таблица 3 Реагенты для этапа пре-амплификации
Компонент Количество Номинальный
объем Содержание Хранение
Планщет
фильтровальный
TruSeq™ Custom
Amplicon Dx
(TruSeq™
Custom
Amplicon Dx
Filter Plate)
4 плантета Н/П Полипропиленовый плантет для
микротитрования с мембраной из
модифицированного
полиэфирсульфона
от 15 °С до
30 °С
Габлица 4 Реагенты для этапа пост-амплификации
--- стр. 10 ---
Компонент Количество Номинальный
объем Действующие вещества Хранение
Буфер для
элюции
(Elution
Buffer)
1 пробирка 4,8 мл Забуференный водный раствор от 15 °С до
30 °С
Буфер для
хранения
библиотек
(Library
Storage
Buffer)
1 пробирка 3,5 мл Забуференный водный раствор от 15 °С до
30 °С
ПРИМЕЧАНИЕ
Коробка 2 содержит реагенты для этапов пре- и пост-амплификации в одной
коробке.
Набор реагентов TruSeq^’ '^ Custom Amplicon Kit Dx, коробка 3
Таблица 5 Коробка ЗА - реагенты для этапа пре-амплификации
Компонент Количество Номинальный
объем Действующие вещества Хранение
Буфер для
интенсивной
отмывки
(Stringent Wash
Buffer)
1 флакон 24 мл Забуференный водный раствор,
содержащий соли, 2-меркаптоэтанол
и формамид
от 2 °С до 8
°С
Буфер
универсальный,
промывочный
(Universal Wash
Buffer)
1 пробирка 4,8 мл Забуференный водный раствор,
содержащий соли.
от 2 °С до 8
°С
Таблица 6 Ь
Компонент
Соробка ЗВ -
Количество
реагенты для э
Номинальный
объем
тана пост-амплификации
Действующие вещества Хранение
Микрочастицы
для очистки
ПЦР-
продуктов
(РСК Clean-Up
Beads)
1 пробирка 5 мл Забуференный водный раствор,
содержащий твердофазные
парамагнитные микрочастицы и
полиэтиленгликоль
от 2 °С до 8
°С
Раствор
промывочный
для
нормализации
библиотек
(Library
Normalization
Wash)
2 пробирки 4,8 мл Забуференный водный раствор,
содержащий соли, 2-меркаптоэтанол и
формамид
от 2 °С до 8
°С
Микрочастицы
для
библиотеки
(Library Beads)
1 пробирка 1,2 мл Забуференный водный раствор,
содержащий твердофазные
парамагнитные микрочастицы
от 2 °С до 8
°С
--- стр. 11 ---
Набор реагентов TruSeq^’ '* Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit входит в состав
Комплектации 1
Таблица 7 Коробка 1 - реагенты для этапа пре-амплификации
Компонент Количество Номинальный
объем Действующие вещества Хранение
Смесь для 2 пробирки 1 мл Забуференный водный раствор. от -25 °С до -
количественной содержащий соли, dNTP, ДНК- 15 °С
ПЦР (qPCR полимеразу, пассивный стандарт и
Master Mix) зеленый флуоресцентный краситель
(SYBR)
Праймеры 4 пробирки 75 мкл Забуференный водный раствор. от -25 °С до -
контрольные содержащий олигонуклеотиды 15 °С
для проверки (праймеры) для количественного
качества (QC
Primers)
определения ДНК в образце
Необходимые реагенты, поставляемые отдельно
Пользовательский набор олигонуклеотидов
Специфичные для анализируемого материала олигонуклеотиды не включены в набор для
приготовления библиотек, они должны быть разработаны пользователем. Принципы
дизайна пользовательеких олигонуклеотидов показаны на риеунке 1. Олигонуклеотиды
должны удовлетворять еледующим требованиям:
• По протоколу для герминальных вариантов для каждого ампликона должна быть
разработана одна пара пользовательских олигонуклеотидов: один пользовательский
зонд 1 (вышерасположенный локус-специфичный олигонуклеотид [ULSO]) и один
пользовательский зонд 2 (нижерасположенный локус-специфичный олигонуклеотид
[DLSO]).
• По протоколу для соматических вариантов для каждого ампликона должны быть
разработаны две пары пользовательских олигонуклеотидов. Каждая пара состоит из
одного пользовательского зонда 1 (вышерасположенный локус-специфичный
олигонуклеотид [ULSO]) и одного пользовательского зонда 2 (нижерасположенный
локус-специфичный олигонуклеотид [DLSO]). Одна пара к положительной цепи, другая
- к отрицательной.
• Пользовательские олигонуклеотиды должны граничить с областью интереса. Длина
области интереса может составлять от 150 до 250 п.н., чтобы обеспечить полное
секвенирование фрагмента при прогоне 2x150 циклов.
• Оба олигонуклеотида должны связываться с одной и той же цепью ДНК.
• Пользовательские олигонуклеотиды должны содержать специфичные для Illumina
адаптеры, чтобы во время ПЦР можно было добавлять к последовательности индексы и
сиквенсовые адаптеры.
- Адаптер 1 (5'- CAACGATCGTCGAAATTCGC-3') должен располагаться на 5'-конце
пользовательского зонда 1 (ULSO).
- Адаптер 2 (5'- AGATCGGAAGAGCGTCGTGTA-3') должен располагаться на 3'-
конце пользовательского зонда 2 (DLSO).
• Пользовательский зонд 2 (DLSO) фосфорилирован по 5'-концу для возможности
лигирования после элонгации пользовательского зонда 1 (ULSO).
--- стр. 12 ---
f’ncvHOK 1 Дизайн олигонуклеотидов для набора реагентов TruSeq^'^ Custom Amplicon Kit
Dx
5’ „ „ 3’
Адаптер 1
Пользователь
ский зонд 1 , i, Р -
Пользователь
,,ский зонд 2
Адаптер 2
Мишень - область интереса
• Рекомендации для дизайна олигонуклеотидов следующие:
- Длина - от 22 до 30 нуклеотидов (геноспецифичная область).
- Общая длина ампликона - от 190 до 290 пар оснований, включая адаптеры по
протоколу для герминальных вариантов, или от 160 до 250 пар оснований, включая
адаптеры, по протоколу для соматических вариантов.
- Рекомендуемый GC-состав праймеров может варьироваться от 25 % до 70 %.
- Рекомендуемый диапазон Тт - от 55 °С до 70 °С.
- Концентрация каждого олигонуклеотида в наборе должна составлять 15 нМ.
- Дополнительной очистки олигонуклеотидов после синтеза не требуется.
Рекомендуется очистка от солей.
- Олигонуклеотиды можно разводить в буфере ТЕ.
- Число ампликонов для образца может варьироваться от 16 до 384.
- Дизайн олигонуклеотидов необходимо выполнять таким образом, чтобы оставить
дополнительные основания между концом праймера и областью интереса, это
необходимо для обеспечения возможности обнаружения инсерции и делеции на
границе области интереса (см. в разделе Ограничения процедуры).
- Если для покрытия всей области интереса необходимо несколько перекрывающихся
ампликонов, то область перекрывания между сайтами связывания соседних пар
зондов должна быть на 1 п.о. больше, чем размер определяемой делеции. Например,
для обнаружения делеции 3 п.о. область перекрывания соседних пар зондов должна
быть > 4 п.о. Соседние пары зондов следует разрабатывать на альтернативные цепи,
чтобы избежать взаимного влияния.
Информацию о минимальном размере зоны перекрывания ампликонов, необходимом для
выявления вариантов, см. в разделе О граничения процедуры . Число образцов для прогона
следует рассчитывать на основании минимального покрытия, требуемого для
секвенирования на приборе, оно зависит от общей длины и однородности покрытия
пользовательского(их) набора(ов) олигонуклеотидов.
Для каждого пользовательского набора олигонуклеотидов следует создать манифестный
файл. Манифест-файл представляет собой текстовый файл, который содержит информацию
о целевых областях генома и необходим для проведения анализа на приборе. Шаблон
манифестного файла можно загрузить на веб-сайте компании Иллюмина (lllumina).
Реагенты для этапа пре-амплификации
• 10 N NaOH (приготовьте из таблеток или используйте стандартный раствор)
• Буфер ТЕ
• Вода очищенная от РНКаз/ДНКаз
• IX буфер ТЕ (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0) (Комплектация 1)
Реагенты для этапа пост-амплификации
• 10 N NaOH (приготовьте из таблеток или используйте стандартный раствор)
• Этанол, для молекулярной биологии
• Буфер ТЕ
--- стр. 13 ---
• Вода очищенная от РНКаз/ДНКаз
Хранение и обращение
1 Комнатная температура - температура от 15 °С до 30 °С.
2 Следующие реагенты поставляются в замороженном виде и стабильны при хранении
при температуре от -25 °С до -15 °С до указанной даты истечения срока годности.
- Буфер для гибридизации (Hybridization Buffer)
- Смесь для элонгации-лигирования (Extension-Ligation Mix)
- Праймеры индексированные А (А501) - Н (А508) (Index Primers А (А501) - Н (А508))
- Праймеры индексированные 1 (А701) -12 (А712) (Index Primers 1 (А701) - 12 (А712))
- ПЦР полимераза (PCR Polymerase)
- Смесь для ПЦР (PCR Master Mix)
- Разбавитель для разведения библиотек при нормализации (Library Normalization
Diluent)
- Буфер для разведения библиотек (Library Dilution Buffer)
- Контроль внутренний PhiX (PhiX Internal Control)
- Смесь для количественной ПЦР (qPCR Master Mix)
- Праймеры контрольные для проверки качества (QC Primers)
Реагенты стабильны в течение максимум шести циклов замораживания-оттаивания,
которые проводят до указанной даты истечения срока годности.
3 Следующие реагенты поставляются в охлажденном виде и стабильны при хранении при
температуре от 2 °С до 8 °С до указанной даты истечения срока годности.
- Буфер для интенсивной отмывки (Stringent Wash Buffer)
- Буфер универсальный, промывочный (Universal Wash Buffer)
- Микрочастицы для очистки ПЦР-продуктов (PCR Clean-Up Beads)
- Микрочастицы для библиотеки (Library Beads)
- Раствор промывочный для нормализации библиотек (Library Normalization
- Wash)
4 Следующие реагенты поставляются при температуре окружающей среды и стабильны
при хранении при комнатной температуре до указанной даты истечения срока годности.
- Буфер для элюции (Elution Buffer)
- Планшет фильтровальный TruSeq™ Custom Amplicon Dx (TruSeq™ Custom
Amplicon Dx Filter Plate)
- Буфер для хранения библиотек (Library Storage Buffer)
5 Изменения внешнего вида поставленных реагентов могут указывать на потерю их
качества. При изменении внешнего вида (например, очевидные изменения цвета
реагента или его помутнение, что происходит в случае контаминации
микроорганизмами), реагенты не следует использовать.
6 Буфер для гибридизации, буфер для интенсивной отмывки и разбавитель для разведения
библиотек при нормализации могут образовывать видимые осадки или кристаллы.
Перед использованием интенсивно перемешайте их на вортексе, а затем осмотрите,
чтобы убедиться в отсутствии преципитатов.
7 При работе с микрочастицами для очистки ПЦР-продуктов и микрочастицами для
библиотеки придерживайтесь следующих рекомендаций:
- Микрочастицы не следует замораживать.
- Доведите температуру микрочастиц до комнатной.
- Непосредственно перед использованием перемешайте микрочастицы на вортексе до
тех пор, пока они не будут хорошо перемешаны и цвет не станет однородным.
--- стр. 14 ---
- Поеле добавления микрочастиц к образцу тщательно перемешайте образец
пипетированием вверх-вниз 10 раз. Для тщательного перемешивания образцов
можно использовать шейкер.
- Инкубируйте смесь микрочастицы/образец при комнатной температуре в течение
указанного периода времени.
- При использовании магнитного штатива следуйте инструкциям. Перед набором в
пипетку дождитесь, пока раствор станет прозрачным. При медленном отборе
супернатанта плашка должна находиться на магнитном штативе, старайтесь не
нарушать слой микрочастиц.
8 ПЦР плашка может оставаться в термоциклере в течение ночи или храниться при любых
перечисленных ниже условиях. До хранения заклейте плашку клейкой пленкой.
- от 2 °С до 8 °С до 2 дней
- от -25 °С до -15 °С до 1 недели
9 Если микрочастицы не используются немедленно, не перемещайте их в холодильник и
не смешивайте их с разбавителем для разведения библиотек при нормализации.
I о Готовую плашку для нормализации библиотек (LNP) можно хранить при температуре
от 2 °С до 8 °С до 3 часов или от -25 °С до -15 °С до 1 недели.
II Плашку для хранения (SGP) можно хранить при температуре от -25 °С до -15 °С до 48
часов.
12 Разведенную библиотеку ампликонов (DAL) можно хранить при температуре от -25 °С
до -15 °С до 84 дней.
13 Внесите разведенный пул ампликонов в специальную лунку картриджа с реагентами
сразу после денатурации.
Оборудование и материалы
Оборудование и материалы, поставляемые отдельно
1 Прибор для высокопроизводительного секвенирования ДНК фирмы Illumina и
расходные материалы для секвенирования
2 Набор адаптеров для 96-луночных планшетов и индексных пробирок TruSeq^'^*
(TruSeq^''* Index Plate Fixture Kit), кат. № FC-130-1005
3 Комплект функциональных штативов для плашки и адаптеров для
центрифугирования TruSeq^'^ (TruSeq^''* Index Plate Fixture & Collar Kit), кат. №
FC-130-1007
4 Крышки запасные для индексных адаптеров (Index Adapter Replacement Caps), кат.
№DX-502-1003
Необходимое оборудование и материалы, поставляемые отдельно
Оборудование и материалы для этапа пре-амплификации
1 Термоблок - требуется один термоблок для 96-луночной плашки. Термоблок должен
иметь следующие характеристики:
- Нагреваемая крышка
- Диапазон температуры: диапазон рабочих температур от +5 °С до 99 °С
- Регулировка температуры: ±0,1 °С при 37 °С; ±0,4 °С при 60 °С
2 Термостат для образцов - требуется один термостат (гибридизационная печь)
Термостат должен иметь следующие характеристики.
- Температурный диапазон: от 10 °С до 100 °С
- Регулировка температуры: ±0,2 °С
--- стр. 15 ---
7
8
9
Настольная центрифуга - одна настольная центрифуга (для лабораторной зоны
постамплификации требуется отдельная центрифуга). Центрифуга должна иметь
следующие характеристики.
- Может поддерживать температуру 20 °С
- Позволяет использовать 96- и 384-луночные плашки с фильтром
- Позволяет использовать 5 мл пробирки
- Обеспечивает скорость от 280 до 2400 х g
Термозапаиватель - рекомендуется для гибридизации в течение ночи, чтобы
предотвратить испарение во время инкубации при 40 °С.
Высокоточные дозаторы - требуется один набор. (Для лабораторной зоны
постамплификации требуется отдельный набор.) Обеспечивается точность объема
добавляемых реагентов и образцов. Можно использовать одноканальные или
многоканальные дозаторы, если их регулярно калибруют и их точность находится в
пределах 5 % от заявленного объема.
Расходные материалы - требуются следующие расходные материалы.
- 96- или 384-луночные плашки для ПЦР с юбкой, 0,2 мл, полипропилен, или
эквивалент
- 96-луночные плашки для хранения, 0,8 мл (плашки MIDI)
- Лоток для растворов, ПВХ, свободный от ДНКаз и РНКаз (кювета)
- Клейкая пленка из алюминиевой фолъги (выдерживает температуру в диапазоне,
включающем 95 °С) или пленки, совместимые с термозапаивателем
- Клейкая пленка, совместимая с термоциклером для ПЦР и с приборами для кПЦР
(Комплектация I)
- Наконечники для дозаторов с аэрозолъным фильтром
- 1,5 мл или 2 мл пробирки (Комплектация 1)
- Стрипы с 8 пробирками с крышками (Комплектация 1)
Микроцентрифуга (Комплектация 1)
Вортекс (Комплектация 1)
Контроль качества ДНК - высокомолекулярная двухцепочечная ДНК человека от
коммерческих поставщиков или выделенная из крови человека (Комплектация 1)
Оборудование и материалы для этапа постамплификации
1 Термоциклер - требуется один термоциклер. Термоциклер должен иметь нагреваемую
крышку и иметь следующие характеристики:
- Диапазон контроля температуры: от 4 °С до 99 °С
- Точность контроля: ±0,25 °С в диапазоне от 35 °С до 99 °С
2 Шейкер для микроплашек - в лабораторной зоне для постамплификации требуется
один шейкер для микроплашек. Шейкер для микроплашек должен иметь следующие
характеристики:
- Максимальная скорость смешивания: 3000 об/мин
- Диапазон скорости смешивания: от 200 до 3000 об/мин
3 Настольная центрифуга - требуется одна настольная центрифуга (для лабораторной
зоны преамплификации требуется отдельная центрифуга). Центрифуга должна иметь
следующие характеристики.
- Может поддерживать температуру 20 °С
- Позволяет использовать 96-луночные плашки MIDI
- Позволяет использовать 5 мл пробирки
- Обеспечивает скорость от 280 до 2400 х g
--- стр. 16 ---
4 Термоблок - требуется один термоблок для пробирок объемом 1,5-2 мл. Термоблок
должен иметь следующие характеристики:
- Диапазон температуры: диапазон рабочих температур от +5 °С до 99 °С
- Регулировка температуры: ±0,1 °С при 37 °С; ±0,4 °С при 60 °С
5 Магнитный штатив - требуется один магнитный штатив для 96-луночной плашки.
Штативы с боковым расположением магнитных элементов, а не снизу, обеспечивают
лучшие рабочие характеристики.
6 Высокоточные дозаторы - требуется один набор (Для лабораторной зоны
преамплификации требуется отдельный набор.) Обеспечивается точность объема
добавляемых реагентов и образцов. Можно использовать одноканальные или
многоканальные дозаторы, если их регулярно калибруют и их точность находится в
пределах 5 % от заявленного объема.
7 Расходные материалы для гель-электрофореза - требуются расходные материалы и
оборудование для гель-электрофореза, а также соответствующего метода окрашивания
для визуализации продуктов ПЦР в геле.
8 Расходные материалы - требуются следующие расходные материалы.
- 96-луночные плашки для ПЦР с юбкой, 0,2 мл, полипропиленовые, или эквивалент
- 96-луночные плашки для хранения, 0,8 мл (плашки MIDI)
ПРИМЕЧАНИЕ
Следует убедиться, что 96-луночная плашка совместима с магнитным штативом.
- Агарозный гель с 2-4 % ТВЕ
- Маркеры молекулярной массы ДНК 100 п.о.
- Краска для нанесения ДНК
- Конические пробирки, 15 мл
- Микроцентрифуга для пробирок типа Eppendorf (рекомендуется использовать с
завинчивающимися крышками)
- Стрипы по 8 пробирок для ПЦР
- Лоток для растворов, ПВХ, свободный от ДНКаз и РНКаз (кювета)
- Клейкая алюминиевая пленка Microseal® 'В' (Bio-Rad) или эквивалент
- Наконечники для дозаторов с аэрозольным фильтром
9 Термоциклер для количественной ПЦР - требуется один прибор для количественной
ПЦР. Прибор должен иметь нагреваемую крышку и иметь возможность обнаружения
красителя SYBR (канал FAM; фильтр возбуждения - -490 нм и фильтр излучения - -520
нм) (Комплектация 1).
Получение, транспортировка и хранение образцов
Протокол для герминальных вариантов
При работе с кровью и ДНК, вьщеленной из крови, следует соблюдать следующие условия.
ВНИМАНИЕ
Со всеми образцами крови следует работать как с потенциально инфекционными
материалами в отношении ВИЧ, ВГВ и других возбудителей, передающихся через
кровь.
1 Можно использовать образцы цельной крови, собранные в пробирки с КгЭДТА.
2 Образцы цельной крови можно хранить не более семи дней при комнатной температуре,
до 30 дней при температуре от 2 °С до 8 °С или до 30 дней в замороженном виде при
температуре от -25 °С до -15 °С.
3 Цельную кровь можно транспортировать не более семи дней при комнатной
температуре, 30 дней при температуре от 2 °С до 8 °С или 30 дней в замороженном виде
при температуре от -25 °С до -15 °С. Транспортировка цельной крови должна
--- стр. 17 ---
еоответствовать национальным, федергшьным, государственным и местным правилам
транспортировки этиологических агентов.
4 Замороженные образцы геномной ДНК стабильны в течение 6 циклов
замораживания/оттаивания.
ПРИМЕЧАНИЕ
При повышенном уровне билирубина, холестерина, гемоглобина, триглицеридов
или ЭДТА отрицательного влияния на эффективность набора при анализе образцов
цельной крови не наблюдалось.
Выделение ДНК (протокол для герминальных вариантов)
Можно использовать любой валидированный метод выделения ДНК.
Протокол для соматических вариантов
При работе с опухолевой тканью и ДНК, выделенной из ткани, следует соблюдать
следующие условия.
1 Ткань опухоли должна быть фиксирована формалином и залита в парафин.
2 Вьщеленную гДНК следует хранить при температуре от 2 °С до 8 °С не более 28 дней
или в замороженном виде при температуре от -25 °С до -15 °С не более 161 дня.
3 Замороженные образцы геномной ДНК стабильны в течение 2 циклов
замораживания/оттаивания.
ПРИМЕЧАНИЕ
При присутствии следовых количеств раствора для депарафинизации, парафинового
воска, ксилола, этанола, протеиназы К, промывочных растворов, гемоглобина или
некротизированной ткани отрицательного влияния на эффективность набора при
анализе тканей FFPE не наблюдалось.
Выделение ДНК (протокол для соматических вариантов)
Компания Иллюмина (Illumina) рекомендует использовать наборы для вьщеления ДНК с
помощью колонок с использованием двойного количества протеиназы К, инкубацией с
протеиназой К в течение ночи с перемешиванием и окончательной элюцией в объеме не
менее 30 мкл. Методы выделения с использованием гранул и способы, в результате которых
получаются только неочищенные экстракты после лизиса клеток, не рекомендуются для
использования с этими реагентами.
Предупреждения и меры предосторожности
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ
Этот набор реагентов содержит потенциально опасные химические вещества. Их
вдыхание, проглатывание, попадание на кожу и в глаза может привести к
повреждениям органов. Используйте защитные средства, включая защитные очки,
перчатки и лабораторный халат, соответствующие риску воздействия. С
использованными реагентами следует обращаться как с химическими отходами и
утилизировать их в соответствии с действующими региональными, национальными
и местными законами и правилами. Для получения дополнительной информации по
вопросам окружающей среды, здоровья и безопасности см. паспорт безопасности
вещества (Safety data sheets, SDS) по адресу support.illumina.com/sds.html.
1 Со всеми образцами крови следует работать как с потенциально инфекционными
материалами в отношении вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса гепатита В
(ВГВ) и других возбудителей, передающихся через кровь (универсальные меры
п редосторожности).
2 Невыполнение описанных процедур может привести к ошибочным результатам или
значительному снижению качества образца.
--- стр. 18 ---
7
8
Следует применять стандартные меры лабораторной безопасности. Не перемешивайте
образец ртом. Не ешьте, не пейте и не курите в предназначенных для работы зонах. При
работе с образцами и реагентами набора следует использовать одноразовые перчатки и
лабораторные халаты. После работы с образцами и реагентами набора следует
тщательно помыть руки.
Не используйте какие-либо компоненты набора после истечения срока годности,
указанного на этикетке коробки с набором. Не заменяйте компоненты набора
компонентами из разных партий наборов. Обратите внимание, что номера партии
набора указаны на этикетке коробки с набором.
Компоненты набора следует хранить при указанной температуре в специально
отведенных пре- и пост-амплификационной зонах.
Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания реагентов. Информацию о
числе использований этого набора см. в разделе П рим ечания по процедуре.
Для предотвращения деградации образца или реагента, до начала выполнения этапов
протокола убедитесь, что пары гипохлорита натрия полностью удалены.
Для предотвращения контаминации реагентов, инструментов и образцов геномной ДНК
продуктами ПЦР, необходимо соблюдать нормы надлежащей лабораторной практики и
надлежащей лабораторной гигиены. Контаминация при проведении ПЦР может
привести к неточным и ненадежным результатам.
9 Для предотвращения контаминации убедитесь, что в зонах для пре- и
постамплификации имеется специальное оборудование (в т.ч. пипетки, наконечники для
пипеток, вортекс и центрифуга).
10 Избегайте кросс-контаминации. Для каждого образца и добавления каждого реагента
используйте новые наконечники для дозаторов. Перемешайте образцы пипетированием
и отцентрифугируйте плашку, если это указано. Не встряхивайте плашки на вортексе.
Использование наконечников с аэрозольным фильтром снижает риск переноса
ампликона и кросс-контаминации образцов.
11 Количественные методы зависят от точности методов пипетирования. Не используйте
пипетки на предельных значениях их объема. Убедитесь в том, что пипетки
откалиброваны.
12 При индексировании образцов следуйте напечатанной схеме плашки. Local Run Manager
автоматически вносит информацию об индексных праймерах, связанных с
наименованиями образцов при внесении в модуль. Пользователю рекомендуется перед
началом прогона проверить индексные праймеры относительно каждого образца.
Несоответствие между списком образцов и схемой плашки приводит к потере
правильной идентификации образца и получению неправильных результатов.
13 Для этапов промывки всегда готовьте свежий 80 % раствор этанола. Этанол может
поглощать воду из воздуха, что влияет на результаты.
14 Убедитесь, что весь этанол удален со дна лунок во время промывок. Остаток этанола
может повлиять на результаты.
15 Придерживайтесь указанного времени сушки после этапа работы с магнитным
штативом, чтобы обеспечить полное испарение. Остаточный этанол может повлиять на
проведение последующих реакций.
16 Не смешивайте пользовательский набор олигонуклеотидов и буфер для гибридизации
при хранении. После смешивания пользовательский набор олигонуклеотидов
становится нестабильным, даже если хранится в замороженном виде.
17 Использование термоциклеров с активным охлаждением (например, Peltier с
термоэлектрическим охлаждением) для этапа гибридизации не рекомендуется. Для
надлежащей гибридизации этап пассивного охлаждения является ключевым.
18 Всегда добавляйте ПЦР-полимеразу в смесь для ПЦР непосредственно перед
использованием. Готовый рабочий раствор не подлежит хранению.
--- стр. 19 ---
19 Ha этапе нормализации библиотек крайне важно полностью ресуспендировать осадок
микрочастиц. Это важно для достижения стабильной плотности кластеров в проточной
ячейке при секвенировании.
20 Придерживайтесь указанного времени инкубации на этапе нормализации библиотек.
Неправильная инкубация может повлиять на представленность библиотеки и плотность
кластеров.
21 В связи с большим числом переносов материала из плашки в плашку и связанной с этой
возможностью контаминации следует соблюдать крайнюю осторожность, чтобы
содержимое лунки полностью оставалось в лунке. Не разбрызгивайте содержимое.
Сокращения
Таблица 8 Сокрашения в описании набора реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx
Сокращение Определение
АМР Плашка для амплификации
(библиотеки)
CLP Плашка для промывки
СОР Пользовательский набор
олигонуклеотидов
DAL Разведенная библиотека ампликонов
FPU Блок плашки для фильтрования
HYB Плашка для гибридизации
LNP Плашка для нормализации библиотек
NTC Отрицательный контроль
PAL Объединенная библиотека ампликонов
POS Положительный контроль
SGP Плашка для хранения
кПЦР Количественная полимеразная цепная
реакция
Примечания по процедуре
1 При работе менее чем с 96 образцами набор можно использовать до четырех раз. При 4
использованиях по протоколу для герминальных вариантов позволяет подготовить 24
библиотеки за одно использование, а по протоколу для соматических вариантов - 20
библиотек за использование, если применяется согласно И нст рукции по прим енению .
2 При работе с изделиями компании Иллюмина (Illumina) необходимо каждый раз
включать 1 положительный контрольный образец ДНК и отрицательный контроль
(контроль без образца. No template control, NTC). Положительный контрольный образец
ДНК должен быть хорошо охарактеризованным, с известными вариантами в области
интереса.
3 Перед началом работы по протоколу набора реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit
Dx, выделите ДНК и определите ее количество.
4 По протоколу для герминальных вариантов количество ДНК определяют с помощью
спектрофотометра. Убедитесь, что А260/А280 образца ДНК > 1,5. Нормализуйте
образец ДНК до концентрации 5 нг/мкл. Для каждого образца требуется 10 мкл
геномной ДНК (всего 50 нг).
5 Рекомендуемое количество 50 нг ДНК по протоколу для герминальных вариантов
позволяет варьировать количеством ДНК; полученное количество библиотек и рабочие
характеристики секвенирования определяются количеством вносимой ДНК.
6 По протоколу для соматических вариантов ДНК оценивают с помощью Набора
реагентов TraSeq™ Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit как описано в И нст рукции по
прим енению . Полученное количество библиотек и рабочие характеристики
--- стр. 20 ---
секвенирования зависят от качества образца, измеренного с помощью Набора реагентов
TruSeq™ Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit.
Количество библиотек
Для набора реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx число библиотек в прогоне может
составлять от 8 до 96 библиотек для Секвенатора нуклеиновых кислот NextSeq™ 550Dx. По
протоколу для соматических вариантов требуется 2 библиотеки для каждого образца.
Индексные праймеры, используемые во время ПЦР-амплификации, следует выбирать
исходя из необходимого числа образцов в одном прогоне, чтобы для каждой библиотеки
использовалась уникальная комбинация индексов.
Последовательности индексных праймеров
Таблица 9 Последовательности индексных праймеров А (А501) - Н (А508)
Индексный праймер Последовательность
Праймер индексированный А (А501) TGAACCTT
Праймер индексированный В (А502) TGCTAAGT
Праймер индексированный С (А503) TGTTCTCT
Праймер индексированный D (А504) TAAGACAC
Праймер индексированный Е (А505) CTAATCGA
Праймер индексированный F (А506) CTAGAACA
Праймер индексированный G (А507) TAAGTTCC
Праймер индексированный Н (А508) TAGACCTA
ПРИМЕЧАНИЕ
При работе с секвенатором нуклеиновых кислот NextSeq™ 550Dx праймеры
индексированные А501-А508 считываются как обратно-комплементарные. При
рассмотрении требований к индексному разнообразию при двухканальном
секвенировании следует использовать обратно-комплементарные
последовательности.
Габлица Н
Праймер индексированный Последовательность
Праймер индексированный 1 (А701) ATCACGAC
Праймер индексированный 2 (А702) ACAGTGGT
Праймер индексированный 3 (А703) CAGATCCA
Праймер индексированный 4 (А704) ACAAACGG
Праймер индексированный 5 (А705) ACCCAGCA
Праймер индексированный 6 (А706) ААССССТС
Праймер индексированный 7 (А707) СССААССТ
Праймер индексированный 8 (А708) САССАСАС
Праймер индексированный 9 (А709) GAAACCCA
Праймер индексированный 10 (А710) TGTGACCA
Праймер индексированный 11 (А711) AGGGTCAA
Праймер индексированный 12 (А712) AGGAGTGG
--- стр. 23 ---
► 95 °C в течение 30 секунд
► 57 °C в течение 30 еекунд
► 72 °С в течение 30 секунд
17 Убедитесь, что прибор захватывает изображения после инкубации при 72 °С пункта 16.
18 Рассчитайте среднее значение Cq трех повторностей реакций для контрольной ДНК,
NTC и каждого образца. Удалите из анализа значения с сильным отклонением, как
указано в П роц едурах конт роля качест ва.
19 Вычтите среднее значение Cq контрольной ДНК из среднего значения Cq каждого
образца (среднее значение Cq образца минус среднее значение Cq контрольной ДНК),
чтобы получить значения dCq для каждого образца. Зарегистрируйте значения dCq, все
повторности, которые были исключены, и коэффициенты разведения образцов. Для
образцов с dCq < -1,5, разведите образец в 16 раз и повторяйте измерения dCq до тех
пор, пока значение не станет >-1,5. Для приготовления библиотек с использованием
набора реагентов TruSeq^’'^ Custom Amplicon Kit Dx следуйте инструкциям по
разведению образца для соответствующей группы:
► -1,5 < dCq < -0,5, образец разводят в 8 раз
► -0,5 < dCq < 0,5, образец разводят в 4 раза
► 0,5 < dCq < 1,5, образец разводят в 2 раза
► 1,5 < dCq < 4, используют неразведенные образцы
► dCq > 4, образец не используют
ТОЧКА БЕЗОПАСНОЙ ОСТАНОВКИ
Значения dCq действительны в течение 28 дней, если образцы ДНК хранятся при
температуре от 2 °С до 8 °С; они действительны в течение 161 дня, если образцы ДНК
хранятся при температуре от -25 °С до -15 °С.
Процедуры контроля качества
• ДНК для контроля качества и отрицательный (без матрицы) контроль включают в
каждый прогон кПЦР. Для нормализации данных кПЦР используют матрицу ДНК для
контроля качества.
• После последнего цикла прибор для кПЦР анализирует образцы количественно. Если
амплификация NTC происходит в пределах 10 циклов от амплификации ДНК для
контроля качества, возможна контаминация образцов и анализ необходимо повторить.
• Убедитесь, что ДНК для контроля качества дает ожидаемые кривые амплификации.
Амплифицируйте ДНК для контроля качества после достижения Cq приблизительно 15-
22 циклов. Из группы трех повторностей исключите повторности, которые отличаются
от остальных в группе на >0,5 Cq.
• Исключите повторности с аномальными кривыми амплификации. В окончательный
расчет для каждого образца должны быть включены как минимум две из трех
повторностей, или процесс для этих образцов должен быть повторен.
• Если необходимо удалить результаты повторностей четырех или более образцов из 10,
процесс следует повторить для всех образцов.
Инструкция цо применению для приготовления образцов библиотек из
ДНК
Схема образцов
Перед подготовкой библиотеки, создайте профиль прогона с помощью Local Run Manager,
программного обеспечения секвенатора. Занесите в профиль информацию об образцах и
выберите манифестный файл. Распечатайте или экспортируйте в виде файла схему
--- стр. 24 ---
образцов для справки при приготовления библиотек. Подробные инструкции см. в
справочном руководстве для конкретного модуля в соответствии с планируемым
протоколом и секвенатором. Информацию об образцах можно вводить в ручном режиме
или импортировать в соответствии с инструкциями в справочном руководстве.
Сравнение инетрукций протоколов для герминальных и соматических вариантов
Набор реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx используется для ручного способа
получения библиотек для секвенирования ДНК, выделенной из образцов периферической
цельной крови и тканей, фиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE). При
использовании реагентов набора реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx c помощью
специфичных олигонуклеотидов амплифицируются целевые участки геномной ДНК
каждого образца, также в процессе работы добавляются индексные последовательности и
последовательности, необходимые для захвата проточной ячейкой амплифицированных
продуктов. При анализе ДНК из цельной крови используют протокол для герминальных
вариантов, а ДНК из ткани FFPE протокол для соматических вариантов.
Полученные библиотеки образцов готовы для работы на приборе для
высокопроизводительного секвенирования фирмы lllumina и анализа с помощью
программных модулей (герминальные или соматические варианты) соответствующих
протоколов прибора.
ПРИМЕЧАНИЕ
Если существуют различия между протоколами для герминальных и соматических
вариантов, они приведены при описании этапа в И нст рукции по прим енению и
обобщены в таблице 12.
1аолица
Этап
Различия в протоколах при анализе герминальных и соматических вариантов
Параметр Протокол -
герминальные
Протокол
соматические
Преаналитический Тип образца ДНК из цельной крови ДНК из ткани FFPE
Преаналитический Количество вносимой
ДНК
50 нг На основании ACq
Преаналитический Метод оценки качества
образца
А260 TSCA Dx FFPE QC
Kit
Гибридизация набора
олигонуклеотидов
Метод гибридизации На одну цепь Ha две цепи
Г ибридизация набора
олигонуклеотидов
Число наборов
олигонуклеотидов
1 2
ПЦР амплификация Объем индексных
праймеров
4 мкл 9 мкл
ПЦР амплификация Объем реакции ПЦР с
индексами [НМ4]
50 мкл 60 мкл
ПЦР амплификация Циклы ПЦР 28 32
Верификация
приготовления
библиотек
Полученное количество
библиотек
По желанию - оценка
методом гель-
электрофореза (продукты
СЕР)
Оценка методом
гель-электрофореза
(АМР продукты)
Очистка продукта ПЦР Объем гранул для
очистки продукта ПЦР
45 мкл 55 мкл
Гибридизация набора олигонуклеотидов (пре-амплификация)
Подготовка
--- стр. 25 ---
3
4
5
Доведите температуру специфичного(ых) набора(ов) олигонуклеотидов, буфера для
гибридизации, образца геномной ДНК и образца положительного контроля до
комнатной.
Перемешайте пользовательский(ие) набор(ы) олигонуклеотидов и буфер для
гибридизации на вортексе, убедитесь, что осадок полностью растворился, затем
отцентрифугируйте пробирки с набором олигонуклеотидов в течение
непродолжительного времени для осаждения жидкости. Убедитесь, что в буфере для
гибридизации нет преципитата.
Установите 96-луночный термоблок на 95 °С.
Предварительно нагрейте термостат до 37 °С.
С помощью Local Run Manager создайте профиль прогона в соответствии с
распечатанной схемой плашки.
Процедура
1 Подготовьте новую 96-луночную плашку для ПЦР (далее называемая плашкой HYB).
2 Выберите один из следующих протоколов (герминальные или соматические варианты)
в зависимости от цели исследования.
- Протокол - герминальные варианты:
- Добавьте 10 мкл образца или контроля в концентрации 5 нг/мкл (всего 50 нг) в
соответствующие лунки плашки HYB в соответствии со схемой плашки.
- Протокол - соматические варианты:
- Добавьте 10 мкл образца или контроля в соответствии с разделом Инструкция по
применению по протоколу для соматических вариантов ДНК оценивают с помощью
Набора реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit. Образцы или
контроли добавляют в две лунки платки для гибридизации с обоими наборами
олигонуклеотидов в соответствии со схемой плашки.
3 Выберите один из следующих протоколов (герминальные или соматические варианты)
в зависимости от цели исследования.
- Протокол - герминальные варианты:
- Добавьте 10 мкл IX буфера ТЕ в лунку с контролем без образца (NTC). Для
правильного выбора лунок следуйте схеме плашки.
- Протокол - соматические варианты:
- Добавьте 10 мкл IX буфера ТЕ в лунки с контролем без образца (NTC) (2). Для
правильного выбора лунок следуйте схеме плашки.
4 Выберите один из следующих протоколов (для герминальных или соматических
вариантов) в соответствии с целью исследования.
- Протокол - герминальные варианты:
- Добавьте 5 мкл пользовательского набора олигонуклеотидов во все лунки,
содержащие геномную ДНК и NTC, в соответствии со схемой плашки.
- Протокол - соматические варианты:
- Добавьте 5 мкл пользовательского набора олигонуклеотидов А в лунки,
содержащие геномную ДНК и NTC, в соответствии со схемой плашки.
- Добавьте 5 мкл пользовательского набора олигонуклеотидов В в лунки,
содержащие геномную ДНК и NTC, в соответствии со схемой плашки.
Лунки с каждым набором являются взаимоисключающими.
5 Добавьте 40 мкл буфера для гибридизации в каждую лунку с образцом и NTC плашки
HYB. Медленно пипетируйте 3-5 раз для перемешивания.
6 Заклейте планшет и HYB центрифугируйте при 1000 х g при 20 °С в течение 1 минуты.
--- стр. 35 ---
Подготовка к секвенированию на секвенаторе нуклеиновых кислот NextSeq^'^^ 550Dx
1 Иепользуйте одну пробирку DAL для ееквенирования.
2 Подготовьте новую пробирку е завинчивающейся крышкой (далее называемую
пробиркой FDT [Final Dilution Tube]).
Если пробирку DAL хранили в замороженном виде, ее следует полностью разморозить.
Перемешайте содержимое пробирки DAL на вортексе при максимальной скорости.
Центрифугируйте пробирки DAL в течение непродолжительного времени.
Перенесите аликвоту из пробирки DAL в FDT. Объем пробирки DAL, необходимый для
достижения нужной плотности кластеров, зависит от используемого набора
олигонуклеотидов и обычно составляет от 130 до 160 мкл.
Доведите объем в пробирке FDT буфером для разведения библиотек до конечного
объема 1300 мкл.
Перемешайте содержимое пробирки FDT на вортексе при максимальной скорости.
Центрифугируйте пробирку FDT в течение непродолжительного времени.
Инкубируйте пробирки FDT на термоблоке при 96 °С в течение 2 минут.
После инкубации 1-2 раза переверните пробирку FDT для перемешивания, затем
немедленно поместите ее на лед.
12 Инкубируйте пробирку FDT на льду 5 минут.
ВНИМАНИЕ
Термическую денатурацию содержимого пробирки FDT проводите
непосредственно перед внесением образца в картридж с реагентами, чтобы
обеспечить эффективное внесение в проточную ячейку для ееквенирования.
Информацию о подготовке картриджа с реагентами, внесении образца библиотек в
картридж с реагентами и запуске прогона ееквенирования см. в Руководстве по
эксплуатации С еквен ат ор нуклеиновы х кислот N extS eq™ 550D x.
1
8
9
10
11
--- стр. 36 ---
Процедуры контроля качества
Правильной лабораторной практикой считается включение положительного контрольного
образца ДНК и отрицательного контрольного образца (без матрицы) при каждой процедуре
приготовления библиотек. Положительный контрольный образец ДНК должен быть
хорошо охарактеризованным образцом с известными вариантами в области интереса.
В случае протокола для соматических вариантов все библиотеки (включая контрольные
библиотеки) исследуют методом гель-электрофореза, как описано ранее.
Рабочие характеристики
В исследовании герминальных вариантов для приготовления библиотек используют набор
реагентов MiSeqDx Universal Kit 1.0 (выделение ДНК и удаление посторонних веществ)
или набор реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx (количество вносимой ДНК). В двух
наборах используются идентичные реагенты, и имеется только одно различие в протоколе:
количество циклов полимеразной цепной реакции (ПЦР) (28 и 32, соответственно).
Увеличение числа циклов ПЦР позволяет снизить количество вносимой ДНК при работе с
набором реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx (50 нг) по сравнению с набором
реагентов MiSeqDx Universal Kit 1,0 (250 нг), как продемонстрировано в исследовании
количества вносимой ДНК с использованием набора реагентов TruSeq™ Custom Amplicon
Kit Dx. В каждом исследовании указаны используемые для приготовления библиотеки
реагенты и расходные материалы для секвенирования, но все исследования отражают
рабочие характеристики набора реагентов TruSeq^'^ Custom Amplicon Kit Dx в связи с
эквивалентностью с набором реагентов Universal Kit 1.0.
В исследованиях соматических вариантов использовали набор реагентов TruSeq™ Custom
Amplicon Kit Dx.
Для библиотек, приготовленных с использованием набора реагентов MiSeqDx Universal Kit
1.0, рабочие характеристики определяли с использованием расходных материалов для
секвенирования компании Иллюмина (Illumina) версии 1, а для приготовленных с
использованием набора реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx - расходные материалы
для секвенирования версии 3. Секвенирование проводили на приборах MiSeqDx. В
исследованиях с использованием панелей из двух или одного гена в качестве
репрезентативных панелей мутаций использовали специфичные для анализа протоколы и
модули для анализа.
Определения, используемые при расчетах рабочих характеристик
1 Процент согласия положительных результатов (РРА) рассчитывается как доля локусов,
классифицированных референтным методом как варианты, правильно выявленные при
анализе.
- (количество вариантов локусов, правильно выявленных при анализе)/(общее
количество вариантов локусов)
Вариант локуса, выявленный при анализе, соответствует выявленному референтным
методом, является истинно положительным (ТР).
Вариантные локусы, выявленные при анализе как референтные или как другие
варианты, являются ложноотрицательными (FN).
2 Процент согласия отрицательных результатов (NPA) рассчитывается как доля локусов,
классифицированных референтным методом как локусы дикого типа, правильно
выявленных при анализе.
- (количество локусов дикого типа, правильно выявленных метод ом )/(общее
количество локусов дикого типа)
Локусы дикого типа, выявленные при анализе, совпадающие с выявленными
референтным методом, являются истинно отрицательными (TN).
--- стр. 37 ---
Локусы дикого типа, выявленные при анализе как варианты, являются
ложноположительными (FP).
3 Процент обгцего согласия (overall percent agreement - ОРА) рассчитывается как доля
локусов, правильно выявленных при анализе относительно референтного метода.
- ((количество вариантов локусов, правильно выявленных при анализе) + (количество
локусов дикого типа, правильно выявленных при анализе))/((обгцее количество
вариантов локусов) + (общее количество локусов дикого типа))
4 Расчеты РРА, NPA и ОРА не включают в себя нераспознанные основания (вариант или
референтные локусы, не прошедшие один или несколько фильтров качества). В два
исследования специально включали нераспознанные варианты в категорию «%
правильно распознанных», это указано в соответствующих таблицах.
5 Уровень распознанных вариантов рассчитывается как общее число локусов, прошедших
фильтр, деленное на общее число секвенированных или выявленных позиций. Этот
показатель не учитывает соответствия с референтным методом.
Контаминация
Протоколы для герминальных и соматических вариантов включают в себя приготовление
библиотек и секвенирование нескольких образцов и контролей одновременно. Изучение
процесса контаминации провели для оценки влияния переноса образцов на получение
ложноположительньгх результатов, имеется в виду перенос материала (контаминация) из
лунки в лунку во время подготовки библиотек или из прогона в прогон между
последовательными прогонами секвенирования. Использовали соматические варианты, так
как они могут быть обнаружены при более низких частотах аллелей, чем герминальные
варианты.
Образцы состояли из 4 образцов геномной ДНК, выделенной из клеточных линий, каждая
из которых содержала различные мутации в панели из двух генов. Образцы были отобраны
таким образом, чтобы в конкретной позиции в одном образце была мутация, а в другом
образце эта позиция была бы референсной (дикого типа).
Перенос из лунки в лунку определяется как неправильный, потенциально вызванный
ошибками при работе в ручном режиме (пипетирование, смешивание образцов и т.д.). Для
оценки переноса из одной лунки в другую были проведены 2 испытательных прогона;
- Схема в шахматном порядке при добавлении большого количества образца
геномной ДНК, содержашего мутацию в гене 1, при чередовании с добавлением
малого количества образца геномной ДНК, содержащего мутацию в гене 2.
- Схема в шахматном порядке при добавлении большого количества образца
геномной ДНК, содержащего мутацию в гене 2, при чередовании с добавлением
малого количества образца геномной ДНК, содержащего мутацию в гене 1.
В каждом прогоне в отношении ложноположительных результатов оценивали в общей
сложности 12 повторов (т.е. мутация гена 1 была зарегистрирована в лунке, обозначенной
как образец с мутацией в гене 2, или наоборот).
Перенос из прогона в прогон определяется как неправильный, потенциально вызванный
остатком материала от предыдущего прогона секвенирования. Для оценки контаминации
между прогонами секвенирования приготовили 2 плашки, каждая из которых содержала 11
копий уникального образца с большим количеством вносимой геномной ДНК и чистый
образец, их последовательно секвенировали на одном приборе MiSeqDx, далее оценивали
ложноположительные результаты. Первый прогон содержал 11 копий образца с мутацией
в гене 2 и 1 чистый образец. Второй прогон содержал 11 копий образца с мутацией в гене 1
и 1 чистый образец. Сначала секвенировали библиотеку образца с мутацией в гене 2, затем
- библиотеку образца с мутацией в гене 1, а затем - снова библиотеку образца с мутацией в
гене 2. Наличие мутаций гена 2 в прогоне с образцами с мутацией гена 1 и наоборот
свидетельствует о контаминации.
--- стр. 38 ---
Число ложноположительных (0/24, 0 %) ретультатов в связи с кросс-контаминацией при
переносе образцов из лунки в лунку равнялось нулю. Все ожидаемые мутации были
обнаружены. Число ложноположительных (0/24, 0 %) результатов в связи с кросс
контаминацией в связи с ост ат кам и м ат ери ала п реды дущ его п рогон а равнялось нулю. Все
ожидаемые мутации были обнаружены. Число ложноположительных (0/48, 0 %)
результатов в связи с кросс-контаминацией в целом (перенос из лунки в лунку и из прогона
в прогон) равнялось нулю.
Рабочие характеристики протокола для герминальных вариантов
В исследовании количества вносимой ДНК использовали панель из 23 хромосом в качестве
репрезентативной панели мутаций. В других исследованиях в качестве репрезентативной
панели мутаций использовали панель из одного гена.
Выделение ДНК
Оценивали три различных метода вьщеления (с помощью магнитных микрочастиц,
осаждения спиртом и на колонке с силикагелем) из цельной крови с добавлением K 2EDTA.
Библиотеки готовили с использованием набора реагентов MiSeqDx Universal Kit 1.0. В
исследовании использовали 14 уникальных образцов крови, представляющих ряд
генотипов для панели одного гена. Три метода выделения ДНК независимо тестировали два
разных оператора, каждый из которых выполнил 3 прогона секвенирования для каждого
метода вьщеления. Каждое выделение проводилось каждым оператором в разные дни.
Концентрацию ДНК и отношение А260/А280 в выделенных образцах гДНК определяли
спектрофотометрически. Общее количество образцов для каждого метода выделения в этом
исследовании составило 168 (14 образцов х 2 оператора/метод выделения х 3
прогона/оператор х 2 повторности/образец выделенной гДНК). Результаты каждого метода
приведены в таблице 13.
Таблица 13 Точность, уровень определения вариантов и уровень прохождения образцом
Метод экстракции
Число
исследованных
образцов
Уровень
определения
вариантов
Точность*
Уровень
прохождения
образцом протокола^
Преципитация этанолом 168 100% 100% 100%
Выделение с
использованием колонки
для -фильтрации
(силикагель)
168 100 % 100% 100%
Выделение с помощью
магнитных гранул
168 100% 100% 100%
'Точность - процент соотношения с референтным методом тестирования (двунаправленное секвенирование
по Сэнгеру), рассчитанная для тех позиций, основания в которых определены.
^Уровень прохождения образцом протокола - число образцов, которые соответствуют указанному уровню
определения варианта при первом анализе (т.е. без необходимости повторного прогона или дополнительной
обработки) в процентах от общего числа образцов за один прогон секвенирования на Генетическом
секвенаторе MiSeqDx.
Количество вносимой ДНК
Диапазон количества вносимой ДНК для приготовления библиотек (набор реагентов
TruSeq’^^ Custom Amplicon Kit Dx) оценивали в исследовании серийных разведений 13
образцов ДНК при репрезентативном анализе, направленном на множество генов с охватом
12 588 оснований в 23 различных хромосомах. Для исследования использовали набор
реагентов MiSeqDx v3 (MiSeqDx Reagent Kit v3.) для секвенирования нуклеиновых кислот.
--- стр. 39 ---
Bee образцы тестировали в дв}ос повторностях при пяти уровнях вносимой ДНК в диапазоне
от 250 до 12 нг (250 нг, 100 нг, 50 нг, 25 нг и 12 нг). Для определения точности генотипы
образцов сравнивали с данными в Platinum Genomes версии 2016-1.0. Результаты
определяли для каждого количества вносимой ДНК. Значения РРА для каждого типа
вариантов (делеции, инсерции и SNV) приведены в таблице 1; NPA приведены в таблице
15. Точность при всех количествах ДНК была одинаковой. Рекомендуемое количество ДНК
составляет 50 нг, 25 нг и 100 нг - это соответственно нижний и верхний пределы,
обеспечивающие соответствие заявленной точности.
Габлица 14 Результаты РРА для каждого количества внесенной ДНК по типу вариантов
ДНК (нг) Тип
варианта
Ожидаемые
варианты Всего ТР Всего FN Нераспознанные
варианты РРА (%)
12 Деления 552 534 3 15 99,4
25 541 0 11 100
50 542 0 10 100
100 542 0 10 100
250 542 0 10 100
12 Инсерция 588 569 0 19 100
25 572 0 16 100
50 572 0 16 100
100 572 0 16 100
250 572 0 16 100
12 SNV 1752 1725 2 25 99,9
25 1739 3 10 99,8
50 1742 0 10 100
100 1740 0 12 100
250 1735 0 17 100
Габлица 15 NPA для каждого количества вносимой ДНК
Добавленная ДНК
(нг)
Ожидаемые
варианты TN FP
Реф.
число
нераспознанных
оснований
NPA (%)
12 2892 307179 0 3935 100
25 2892 309767 0 1347 100
50 2892 309999 0 1115 100
100 2892 309754 0 1360 100
250 2892 308922 0 2192 100
Влияющие вещества
Для оценки влияния посторонних веществ на процесс получения библиотеки выполнили
анализ одного гена с охватом 11 529 оснований с и без добавления посторонних веществ,
потенциально мешающих проведению анализа. Библиотеки готовили с использованием
набора реагентов Universal Kit 1.0. В исследовании включили 8 образцов цельной крови,
представляющих 8 уникальных генотипов. Четыре эндогенных вещества (билирубин,
холестерин, гемоглобин и триглицериды) тестировали путем добавления их в образцы
крови перед вьщелением ДНК. Для оценки потенциальных помех, возникающих при заборе
крови, в образцы крови добавляли ЭДТА в 2 концентрациях. Диапазоны концентраций всех
веществ приведены в таблице 16. Кроме того, для оценки проблем, возникающих в
результате приготовления образца, к 8 очищенным геномным ДНК добавляли 15%
промывочного буфера. Использовали панель для одного гена. Для всех тестируемых
образцов были достигнуты 1 0 0% уровень определения варианта и 1 0 0% его
воспроизводимость при анализе образцов с или без добавления посторонних веществ.
--- стр. 40 ---
Таблица 16 Уровень определения вариантов для каждого исследуемого вещества
Исследуемое
вещество
Общее число
повторов
Концентрация в крови
(Верхний предел)
Концентрацияв крови
(Нижний предел)
Уровень
определения
варианта
Билирубин 16 684 мкмоль/л 137 ммоль/л 100 %
Холестерин 16 13 ммоль/л 2.6 ммоль/л 100 %
Г емоглобин 16 2 г/л 0,4 г/л 100 %
Триглицериды16 37 ммоль/л 7,4 ммоль/л 100 %
ЭДТА 16 7 мг/мл 2,8 мг/мл 100 %
Рабочие характеристики протокола для соматических вариантов
В исследовании количества вносимой ДНК использовали панель из 26 генов в качестве
репрезентативной панели мутаций. В других исследованиях в качестве репрезентативной
панели мутаций использовали панель из 2 генов.
Количество вносимой ДНК
Для оценки образцов ДНК, выделенных из образцов FFPE девяти различных тканей,
использовали набор реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit. Для каждого
образца измеряли значение Cq и сравнивали с контролем для вычисления значений ACq,
которые варьировались в диапазоне от -1,2 до 6,4. Образцы разводили 1:8, 1:4, 1:2 или
работали без разведения в соответствии с инструкциями набора. Некоторые образцы были
разведены дополнительно (до 1:64) для повышения значений ACq. Два образца, для
которых значения ACq определялись как для разведения 1:8, также не разводились для
исследования количества, превышающего рекомендуемое. Все разведения проводили по
протоколу приготовления библиотек и секвенировали. Определение вариантов при
использовании модуля для соматических вариантов сравнивали с результатами
двунаправленного секвенирования по Сэнгеру, проводимого для определенных генов, в
зависимости от типа ткани. Разведения группировали в один из четырех диапазонов ACq и
анализировали в отношении точности и уровня не определенных вариантов (таблица 17).
Верхний предел ACq составил 2, что было достигнуто путем серийных разведений образцов
с ACq < 2 в соответствии с инструкциями набора. Нижний предел - ACq = 4. Для значений
ACq от 2 до 4 точность одинакова. Для методов, использующих ACq при анализе образцов
FFPE, следует определить необходимую отсечку для достижения желаемой достоверности
и точности.
!'аблица 17 Точность и не определенные варианты по группам ACq
Группа ACq Варианты Позиции дикого типа
Ожидаемо
е значение
ТР FN Варианты не
определены
РР
А
TN ГР Вар
иан
ты
не
опр
еде
лен
ы
NPA
ACqs -1,2 и -0,8 1 1 0 0 100 1387 1 0 99,9
ACqs 1,5-4 19 18 0 1 100 1435
8
1 78 99,9
ACqs -4 19 18 0 1 100 1433
3
1 103 99,9
--- стр. 41 ---
Группа ACq
Ожидаемо
e значение
TP
Варианты
FN Варианты не
определены
РР
А
Позиции дикого типа
TN FP Вар
иан
ты
не
опр
еде
лен
ы
NPA
ACqs ~5 22 20 90,9 1587 439 99,9
Выделение ДНК
Для выделения ДНК и определения влияния на эффективность приготовления библиотек
исследовали 3 коммерческих набора. Наборы, основанные на колоночном методе
вьщеления, включены реагенты для депарафинизации и для реверсии поперечных сшивок,
образующихся при применении формалина и специфичных для тканей FFPЕ. Методы были
модифицированы путем удвоения количества протеиназы К, используемой для одного
образца и увеличения времени инкубации (в течение ночи) с перемешиванием. ДНК
элюировали в меньшем объеме, чем рекомендованный в инструкции для набора или как
минимумЗО мкл. Для исследования каждого набора использовали 10 образцов в двух
повторностях. Все образцы (20/20) соответствовали спецификациям контроля качества
метода. Анализ проводили с использованием панели для двух генов. Для каждого набора
значение РРА составляло 100 % (16/16), NPA - 100 % (1104/1104). В качестве референсного
метода использовали секвенирование по Сэнгеру.
Влияющие вещества
Для оценки влияния веществ, которые потенциально могут изменить результат и
эффективность процесса приготовления библиотек провели исследование. Рабочие
характеристики анализа оценивали в присутствии экзогенных веществ (парафиновый воск,
ксилол, этанол и протеиназа К, растворы для экстракции), а также эндогенных веществ
(некротизированная ткань и гемоглобин).
Экзогенные вещества
Испытуемые экзогенные вещества представляют собой компоненты набора для выделения,
их названия и тестированное количество приведены в таблице 18. Для каждого вещества
тестировали 15 образцов FFPE ткани колоректальной опухоли, результаты сравнивали с
контролями без добавления веществ. Образцы были представлены образцами дикого типа,
не содержащими мутаций гена 1 (5/15 образцов), а также образцами с мутациями (10/15
образцов). Образцы секвенировали при максимальном уровне мультиплексирования; 10
образцов плюс контроли на прогон.
аолица Исследуемые вещества
Влияющее вещество Фактическое количество [мкл/25 мкл элюата]
Депарафинизирующий раствор 1,69 X Ю-04
Парафиновый воск (в ксилене) 2,50 X Ю-05
Ксилен 2,50 X 10 “
Этанол 1,69 X 10 “
Протеиназа К' 3,30 X 10 “
Промывочный раствор^ 6,25 X 10 “
IX промывочный раствор^ 6,25 X 10 °'
Промывочный буфер AWE 6,25 X 10 “
Октябрь 2020 г. Документ № 1000000029772 v05 | 39
--- стр. 42 ---
Влияющее вещество Фактическое количество [мкл/25 мкл элюата]
Промывочный буфер AW2* 6,25 X Ю-о'
'■^Три представленных на рынке набора для колоночного метода выделения ДНК.
Для всех экзогенных веществ все 15 образцов соответствовали заявленным требованиям
(15/15, 1 0 0% уровень прохождения контроля качества) и показали валидный результат
после секвенирования библиотек (15/15, 1 0 0% уровень прохождения образцом протокола).
РРА рассчитывали для каждого образца. ОРА и NPA рассчитывали на одно основание
мутаций; число мутаций на образец составило 56. Все 15 образцов для всех 9 экзогенных
веществ показали соответствие результатов с контрольными условиями (без добавления
вещества) для всех позиций с мутациями (10/10) и без мутаций (830/830). Ни одно из
потенциально влияющих на результаты веществ, оцениваемых в максимальных
концентрациях в процессе выделения геномной ДНК (гДНК) из ткани FFPE, не влияет на
рабочие характеристики набора реагентов TruSeq'*''^ Custom Amplicon Kit Dx.
Эндогенные вещества (гемоглобин)
Пятнадцать (15) образцов FFPE ткани из колоректальной опухоли тестировали в
присутствии или в отсутствие 2 мг/мл гемоглобина, который определен по классификации
CESI как высокий уровень. Образцы включали образцы дикого типа, не содержащие
мутаций (5/15 образцов), а также образцы с наличием мутаций репрезентативной панели
(10/15 образцов). Образцы секвенировали при максимальном уровне мультиплексирования:
10 образцов плюс контроли на прогон. Все 15 образцов соответствовали заявленным
требованиям (15/15, 1 0 0% уровень прохождения контроля качества) и показали валидный
результат после секвенирования библиотек (15/15, 100% уровень прохождения образцом
протокола). Все 15 образцов показали соответствие с контрольными уеловиями (без
добавления вещества) для всех позиций с мутациями (10/10) и без мутаций (830/830).
Гемоглобин в тестированной концентрации не влияет на рабочие характеристики набора
реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx.
Эндогенные вещества (при некрозе тканей)
Для оценки влияния некротизированных тканей иепользовали 15 образцов FFPE ткани
колоректальной опухоли, которые были представлены образцами дикого типа без мутаций
репрезентативной панели (10/15 образцов), а также образцами с мутациями
репрезентативной панели (5/15 образцов), и некротизированные ткани, согласно
патологической оценке некроз соетавлял 10-80 %. Образцы секвенировали при
максимальном уровне мультиплексирования: 10 образцов плюс контроли на прогон. 14/15
образцов показали валидный результат после секвенирования библиотек (уровень
прохождения образцом протокола с первого раза - 93,3%). Процент общего соответствия с
секвенированием по Сэнгеру составил 99,9% (783/784). Значение РРА составляло 100 %
(4/4), NPA - 99,87 % (779/780). Обнаружен 1 ложноположительный результат, вероятно, в
связи с тем, что частота мутации в образце ниже предела обнаружения секвенирования по
Сэнгеру. В целом рабочие характеристики набора реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit
Dx соответствуют заявленным при некротизации ткани 10-80%.
Набор реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit
Рабочие характеристики
В таблице 19 приведены значения Cq для гДНК в концентрации 0,25 нг/мкл от пяти
коммерческих поставщиков (В, С, Р, R и Т) или выделенных из образца цельной крови. Для
сравнения приведены результаты для референтного материала, N1ST, в той же
концентрации. Значения Cq получены тремя независимыми операторами при
использовании трех независимых платформ для кПЦР (А, В, S). Результаты показывают
среднее ± стандартное отклонение. При использовании прибора В значения Cq были
стабильно выше, чем при иепользовании приборов А и S; значения dCq образцов при
--- стр. 43 ---
нормализации c помощью ДНК для контроля качества при использовании различных
приборов были сходными (данные не показаны).
Таблица 19 Значения Cq ДНК для контроля качества, полученной от поставщиков или
вьщеленной из крови_________________________________________________________________
Прибор NIST Поставщик Поставщик Поставщик Поставщик Поставщикдля мужчина В R Экстракция
кПЦР 2372
прибор 18,87 ± 19,14 ±0,14 18,79 ±0,13 19,11 ±0,17 19,07 ±0,12 19,03 ±0,17 18,78 ±0,07
А 0,07 ______________________________________________________
прибор 20,47 ± 20,75 ±0,12 20,43 ±0,12 20,71 ±0,19 20,71 ±0,06 20,69 ±0,15 20,46 ± 0,09
В 0,09
прибор 19,06 ± 19,39 ±0,13 18,99 ±0,14 19,29 ±0,16 19,31 ±0,10 19,24 ±0,15 19,08 ±0,16
S 0,10
--- стр. 44 ---
Патенты и торговые марки
Этот документ и его содержимое являются собственностью lllumina, Inc. и ее филиалов («Illumina») и
предназначены исключительно для использования клиентами согласно договору, в связи с использованием
продукта (ов), описанного (ых) в настоящем документе, и ни для каких-либо других целей. Этот документ и
его содержимое не должны использоваться или распространяться для каких-либо иных целей и/или иным
образом, передаваться, раскрываться или воспроизводиться каким-либо образом без предварительного
письменного согласия Illumina. lllumina не передает какую-либо лицензию на патент, товарные знаки,
авторские права или права общего права или аналогичные права каких-либо третьих сторон.
Инструкции в этом документе должны строго и четко соблюдаться квалифицированным и должным образом
обученным персоналом для обеспечения надлежащего и безопасного использования продуктов, описанных в
данном документе. Все содержимое этого документа должно быть полностью прочитано и понято до
использования этого (их) продукта (ов).
ЧАСТИЧНОЕ ПРОЧТЕНИЕ И НЕТОЧНОЕ ВЫПОЛНЕНИЕ ВСЕХ ИНСТРУКЦИЙ, СОДЕРЖАЩИХСЯ
ЗДЕСЬ, МОЖЕТ ПРИВЕСТИ К ПОРЧЕ ПРОДУКТ А(ОВ), ТРАВМАМ ЛЮДЕЙ, ВКЛЮЧАЯ
ПОЛЬЗОВАТЕЛЯ ИЛИ ДРУГИХ ЛИЦ, И ПОРЧЕ ИМУЩЕСТВА И ПРЕКРАЩАЕТ ДЕЙСТВИЕ
ГАРАНТИЙНЫХ ОБЯЗАТЕЛЬСТВ В ОТНОШЕНИИ ПРОДУКТА (ОВ).
ILLUMINA НЕ НЕСЕТ ОТВЕТСТВЕННОСТИ В СЛУЧАЕ НЕНАДЛЕЖАЩЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
ПРОДУКТА (ОВ), ОПИСАННЫХ ЗДЕСЬ (ВКЛЮЧАЯ ИХ ЧАСТИ ИЛИ ПРОГРАММНОЕ
ОБЕСПЕЧЕНИЕ).
© 2019 Illumina, Inc. All rights reserved.
Все товарные знаки являются собственностью Illumina, Inc. или их соответствующих владельцев. Детальную
информацию о торговых марках см. по ссылке www.illumina.com/company/legal.html .
AMPure, Beckman и Beckman Coulter являются торговыми марками или зарегистрированными торговыми
марками компании Beckman Coulter, Inc.
Контактная информация
Illumina
5200 lllumina Way
San Diego, California 92122
США
+ 1 800 809 ILMN (4566)
+1.858.202.4566 (за пределами
Северной Америки)
techsupport@illumina.com
www.illumina.com
С € IVD
lllumina Netherlands В. V.
Freddy van Riemsdijkweg 15
5657 EE Eindhoven
I he Netherlands (Нидерланды)
Спонсор в Австралии:
lllumina Australia Pty Ltd
Nursing Association Building
Level 3, 535 Elizabeth Street
Melbourne, VIC 3000
Australia (Австралия)
Маркировка продукта
Полный список символов, которые могут находиться на упаковке продукта и маркировке,
см. в описании символов по адресу support.illumina.com во вкладке D ocu m en tation an d
L iteratu re для вашего набора.
Данная инструкция по применению предназначена для Российской Федерации (РФ) и незначительно
отличается от инструкции по применению для Соединенных Штатов Америки (США), различия не
затрагивают назначение и принципы процедуры медицинского изделия.
--- стр. 45 ---
lumina
Набор реагентов для создания «библиотеки»
нуклеиновых кислот ИВД TruSeq Custom Amplicon
Kit Dx в вариантах исполнения
Инструкция по применению
От имени «Иллюмина, Инк.» (Illumina, Inc.)
/Подпись/ Дата 22 октября 2020 г.
Аурелия Браунридж (Aurelia Brownridge)
Старший специалист отдела по вопросам
нормативно-правового обеспечения
«Иллюмина, Инк.»
/Штамп/: КАРА М. ДЕ ЛА КРУС (CARA М. DE LA CRE1Z) * * Нотариус, штат Калифорния
* Округ Сан-Диего * Лицензия № 2333147 * Срок действия моих полномочий истекает 3
сентября 2024 г. * VS11
--- стр. 55 ---
Рисунок: Химия для подготовки библиотеки Набора реагентов TruSeq™ Custom
Amplicon Kit Dx
Область интереса Зонд 2
Выбранные пользователем зонды
гибридизируются с фланкирующими участками
областей интереса нефрагментированной гДНК
Зонд 1 Зонд 2
'1 У
Удлинение/лигирование между выбранными
пользователем зондами в области интереса
'7 /7 7 7 7 /7 Г /? 7 7 //Т /7 /7 7 У У /;,
РГ\ Индекс 1
\\.
ПЦР добавляет индексы и праймеры для
секвенирования
Р7
Библиотека с уникальными метками,
подготовленная к формированию
Индекс! кластеров и секвенированию
/
ДНК FFPE или гДНК смешивают с пулом определенных пользователем
олигонуклеотидных зондов. В каждом зонде есть последовательности, предназначенные
для занятия областей интереса, и адаптерные последовательности для дальнейшей реакции
амплификации. Зонды гибридизируются с ДНК, один на верхнем, а другой на нижнем
конце целевой последовательности ДНК. С помош,ью патентованной реакции удлинения-
лигирования происходит удлинение области интереса, а затем лигирование для соединения
двух зондов. Благодаря этому создается матричная цепь и обеспечивается очень высокая
специфичность аналитического метода. Чтобы иметь возможность анализа множества
образцов одновременно во время одного цикла секвенирования (мультиплексирование),
отдельные библиотеки помечают уникальными идентификаторами или индексами. Эти
уникальные индексы, которые специфичны для каждого образца, добавляют на этапе ПЦР-
амплификации при приготовлении библиотеки. Готовый продукт включает определенные
--- стр. 56 ---
пользователем облаети, адаптеры и индексы, необходимые для секвенирования с помощью
инструмента Illumina Dx.
Способность обнаружению при использовании набора реагентов TruSeq™ Custom
Amplicon показана в таблице: Способность к обнаружению метода анализа
Таблица: Способность к обнаружению метода анализа
Параметр
Герминальный
вариант
Соматический
вариант
Геномный контекст
Содержанир GC 19-78% 19-73%’’
Длина PolyA < 8 < К
Длина РЫуТ > 10 > 10
Длина PolyG < 7 < ь
Длина PolyC < 6 о Ь
Длина динуклеотидиого < И х < 4х
повтора
Длина тринукл 1'‘Отидного < < 1)Х
noiSTopa
Варианты
Да, продол
Однонуклоотидный
Да обнаружения
полиморфная 5%
Длина инсерции S 24 п.о. 1 24 п.о.
Длина делеции < 25 п.о. < 25 п.о.
а. До 7Нт<, с Секр.онатором нуклеиновых кислот Nc'xtSeq’ ■' 550DX
■
7.3 Описание компонентов (блоков) медицинского изделия
Набор реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx, компании Illumina (PN 20005718),
состоит из компонентов, которые указаны ниже в таблице: Компоненты Набора
реагентов TruSeq^” ^ Custom Amplicon Kit.
--- стр. 57 ---
Таблица: Компоненты Набора реагентов TruSeq^'^ Custom Amplicon Kit Dx
Примечание: pH и данные недоступны, если не указано иное.
Номер
компонента/
части (PN)
Фотография Количество,
объем/заполнение и
размеры
высота (Н)
длина (L)
диаметр (D)
Активные
компоненты, pH и
физико
химические
свойства
Копобка 1 -------------------------
Коробка 1А, Реагенты для этапа пре-ампл 1дфикации
Буфер для
гибридизаци
и
(Hybridizatio i J
п Buffer) 1, 111
«1 i|
15035442 ^ 1 ii' ?; 1
Смесь для
удлиннения-
лигирования
(Extension-
Ligation Mix)
20005678
Праймеры
индексирован
ные А (А501)
-Н(А508)
(IndexPrimers
А(А501)-Н
(А508))
От:15035449
До: 15035456
пробирка
Объем: 4,32 мл
Р а з м е р ы :
П р о б и р к а :
Н: 92,0 мм х
D: 15,0 мм± 10%
К р ы ш к а :
Н: 18,0 мм X
D: 17 мм ±10%
Количество: 1
пробирка
Объем: 4,8 мл
Р а з м е р ы :
П р о б и р к а :
Н: 92,0 мм X
D: 15,0 мм± 10%
К р ы ш к а :
Н: 18,5 мм X
D: 17 мм ±10%
1*
p iI S|ii
^11
Количество: 1
пробирка
Объем: 192 мкл
Р а з м е р ы :
П р о б и р к а :
Н: 42,0 мм X
D: 8,7 мм ± 10 %
К р ы ш к а :
водный раствор,
содержащий соли и
формамид
В н е ш н и й в и д :
бесцветная жидкость
Ф и з и ч е с к а я ф о р м а :
жидкость
Ц в е т : бесцветный
З а п а х : без запаха
или со слабым
запахом
Забуференный
водный раствор,
содержащий
патентованную
смесь ДНК-
полимераз, ДНК-
лигазу и dNTP
В н е ш н и й в и д :
бесцветная жидкость
Ф и з и ч е с к а я ф о р м а :
жидкость
Ц в е т : бесцветный
З а п а х : без запаха
Праймеры для ПЦР
с индексными
последовательност
ями и адаптерами
для
секвенирования
В н е ш н и й в и д :
бесцветная жидкость
Ф и з и ч е с к а я ф о р м а :
жидкость
Ц в е т : бесцветный
--- стр. 58 ---
Номер
компонента/
части (PN)
Фотография
Праймеры
индексирован
ные 1 (А701) -
12(А712)
(Index Primers
1 (А701)- 12
(А712))
От:15035457
До:15035468
ПЦР
полимераза
(PCR
Polymerase)
15035469
S Polymer*
M503S469
'20258011
.гв1»04;И
Количество,
объем/заполнение и
размеры
высота (Н)
длина(L)
диаметр (D)
Активные
компоненты, pH и
физико
химические
свойства
Н: 14,1 мм X
D: 8,7 мм± 10%
С и л и к о н о в о е к о л ь ц о :
Н: 4,4 мм X
D: 1,7 мм ±10%_____
Количество: 1
пробирка
Объем: 128 мкл
Р а з м е р ы :
П р о б и р к а :
Н: 42,0 мм X
D: 8,7 мм ± 10 %
К р ы ш к а :
Н: 14,1 мм X
D: 8,7 мм ± 10 %
Количество: 1
пробирка
Объем: 56 мкл
Р а з м е р ы :
П р о б и р к а :
Н: 43,0 мм X
D: 10,0 мм± 10%
К р ы ш к а :
Н: 13,0 мм X
D: 10,0 мм ±10%
З а п а х :без запаха
или со слабым
запахом
Праймеры для ПЦР
с индексными
последовательност
ями и адапторами
для
секвенирования
В н е ш н и й в и д :
желтая жидкость
Ф и з и ч е с к а я ф о р м а :
жидкость
Ц в е т : желтый
З а п а х : без запаха
ДНК-полимераза
собственного
изготовления
В н е ш н и й в и д :
бесцветная жидкость
Ф и з и ч е с к а я ф о р м а :
жидкость
Ц в е т : бесцветный
З а п а х : без запаха
--- стр. 59 ---
Номер
компонента/
части (PN)
Фотография Количество,
объем/заполнение и
размеры
высота (Н)
длина(L)
диаметр(D)
Активные
компоненты, pH и
физико
химические
свойства
Смесь для
ПЦР (PCR
Master Mix)
15035448
1 = 7
3 N ;
«11 1 i-J S S l! " t * ' 5 ; Г
Количество: 1
пробирка
Объем: 2,8 мл
Размеры:
Пробирка:
Н: 92,0 мм X
D: 15,0 мм ±10%
Крышка:
Н: 18,0 мм X
D: 17 мм ±10%
Забуференный
водный раствор,
содержащий соли и
dNTP
Внешний вид:
бесцветная жидкость
Физическая форма:
жидкость
Цвет: бесцветный
Запах: без запаха
Коробка IB, Реагенты для этапа пост-амплификации
Разбавитель Количество: 1 Забуференный
для пробирка водный раствор.
разведения
библиотек при
Объем: 4,6 мл содержащий соли,
2-меркаптоэтанол и
нормализации
(Library i 1
формамид
Normalization
Ш |!=aS = t
Размеры: Внешний вид:
Diluent) Пробирка: бесцветная жидкость
|BS| |: Н: 92,0 мм X Физическая форма:
15035473 D: 15,0 мм± 10%
Крышка:
Н: 18,0 мм X
D:1 7 мм ±10%
жидкость
Цвет: бесцветный
Запах: содержит 2-
меркаптоэтанол
Буфер для Количество: 2 Забуференный
разведения
библиотек
(Library
пробирки
Объем: 4,5 мл
водный раствор
Dilution i i - Размеры: Внешний вид:
Buffer) Пробирка: бесцветная жидкость
Н; 92,0 мм X Физическая форма:
20004095 D: 15,0 мм ± 10%
Крышка:
Н: 18,0 мм X
D: 17 мм ±10%
жидкость
Цвет: бесцветный
Запах: без запаха
или со слабым
запахом
pH: 8.5
--- стр. 60 ---
Номер
компонента/
части (PN)
Фотография Количество,
объем/заполнение и
размеры
высота (Н)
Коробка 2
Активные
компоненты, pH и
физико
химические
длина(L) свойства
диаметр (D)
Контроль Количество: 1 Забуференный
внутренний пробирка водный раствор,
РЫХ (PhiX Объем: 10 мкл содержащий РЫХ
Internal гДНК
Control)
iX Internal Размеры: Внешний вид:
15036574 < §1503657» Пробирка: бесцветная жидкость
§202580! » Н; 46,0 мм X Физическая форма:
e. - D: 10,8 мм± 10% жидкость
1 ^irnria «f Крышка: Цвет: бесцветный
Н: 13,0 мм X Запах: без запаха
D: 12,0 мм ± 10%
Планшет Количество: 4 Полипропиленовы
фильтровальн планшета й планшет для
ый TruSeq^'^ _ i i i Объем: н/п микротитрования е
Custom » ^ S мембраной
Amplicon Dx из
(TruSeq^^ Ъ модифицированног
Custom 1 }
1. i i i
I 1 ill I
llMSiai 1 i.
О
Amplicon Dx
Filter полиэфирсульфона
Plate)
t | Внешний вид: н/н
20012590 L: 128,0 мм х
Физическая форма:
Н: 86,0 мм X Цвет: н/пD; 18,0мм± 10% Запах: н/п
Реагенты для этапа пост-амплификации
--- стр. 61 ---
Номер
компонента/
чаети (PN)
Буфер
для
элюции
(Elution
Buffer)
20004093
Фотография
Буфер для
хранения
библиотек
(Library
Storage Buffer)
20004094
Коробка 3
Коробка ЗА, Реагенты для этапа пре-ампл 1зфикации
I P
Ik.11»
Количество,
объем/заполнение и
размеры
высота (Н)
длина(L)
диаметр (D)_________
Количество: 1
пробирка
Объем: 4,8 мл
Размеры
Пробирка:
Н: 92,0 мм X
D: 15,0 мм± 10%
Крышка:
Н: 18,0 мм X
D: 17 мм ±10%
Количество: 1
пробирка
Объем: 3,5 мл
Размеры
Пробирка:
Н; 92,0 мм X
D: 15,0 мм± 10%
Крышка:
Н: 18,0 мм X
D: 17 мм ±10%
Буфер для
интенсивной
отмывки
(Stringent
Wash Buffer)
15035443
флакон
Объем: 24 мл
Размеры:
Флакон:
Н: 82,0 мм X
D: 37,0 мм ±10%
Крышка:
Н: 15,0 мм X
D: 26,0 мм ±10%
Активные
компоненты, pH и
физико
химические
свойства
Забуференный
водный раствор
Внешний вид:
бесцветная жидкость
Физическая форма:
жидкость
Цвет: бесцветный
Запах: без запаха
Забуференный
водный раетвор
Внешний вид:
бесцветная жидкость
Физическая форма:
жидкость
Цвет: бесцветный
Запах: без запаха
водный раствор,
содержащий соли,
2-меркаптоэтанол и
формамид
Внешний вид:
бесцветная жидкость
Физическая форма:
жидкость
Цвет: бесцветный
Запах: содержит 2-
меркаптоэтанол
--- стр. 62 ---
Номер
компонента/
части (PN)
Буфер
универсальны
й,
промывочный
(Universal
Wash Buffer)
20004092
Фотография Количество,
объем/заполнение и
размеры
высота (Н)
длина(L)
диаметр (D)_________
Количество: 1
пробирка
Объем: 4,8 мл
Р а з м е р ы :
П р о б и р к а :
Н; 92,0 мм X
D: 15,0 мм ±10%
К р ы ш к а :
Н: 18,0 мм X
D: 17 мм ±10%
Коробка ЗВ, Реагенты для этапа пост-амплификации
Микрочастиц
ы для очистки
ПЦР-
продуктов
(PCR Clean-
Up Beads)
15036674
т
— г fi'jh
Количество: 1
пробирка
Объем: 5 мл
Р а з м е р ы :
П р о б и р к а :
Н: 92,0 мм X
D: 15,0 мм ±10%
К р ы ш к а :
Н: 18,0 мм X
D: 17 мм ±10%
Активные
компоненты, pH и
физико
химические
свойства
Забуференный
водный раствор,
содержащий соли,
В н е ш н и й в и д :
бесцветная жидкость
Ф и з и ч е с к а я ф о р м а :
жидкость
Ц в е т : бесцветный
З а п а х :без запаха
Забуференный
водный раствор,
содержащий
твердофазные
парамагнитные
микрочастицы и
полиэтиленгликоль
В н е ш н и й в и д :
коричневая жидкость
Ф и з и ч е с к а я ф о р м а :
жидкость
Ц в е т : коричневый
З а п а х : без запаха
р П : 8,5
--- стр. 63 ---
Номер
компонента/
части (PN)
Фотография Количество,
объем/заполнение и
размеры
высота (Н)
длина(L)
диаметр (D)
Активные
компоненты, pH и
физико
химические
свойства
Раствор Количество: 2 Забуференный
промывочный пробирки водный раствор,
для Объем: 4,8 мл содержащий соли.
нормализации Щ Щ щ 2-меркаптоэтанол и
библиотек формамид
(Library t i !
Normalization Р а з м е р ы : В н е ш н и й в и д :
Wash) S! ! П р о б и р к а : жидкость, цвет от
iSSj 3i Н: 92,0 мм X светло-коричневого
15035446 Ш ? ^ D: 15,0 мм± 10% до бесцветного
anil ii^ S :ii К р ы ш к а : Ф и з и ч е с к а я ф о р м а :
= i |!1H; Н: 18,0 мм X жидкость
D: 17 мм ±10% Ц в е т : светло-
коричневая
З а п а х : содержит 2-
меркантоэтанол
Микрочастиц Количество: 1 Забуференный
ы для пробирка водный раствор.
библиотеки Объем: 1,2 мл содержащий
(Library твердофазные
Beads) парамагнитные
ж , ,д микрочастицы
20017098
Р а з м е р ы : Р а с т в о р :
П р о б и р к а : В н е ш н и й в и д :
Н;42,0 мм X бесцветная жидкость
D: 11,0 мм ±10% Физическая
B S S ^ H К р ы ш к а : форма: жидкость
Н: 14,1 мм X Цвет: бесцветный
D: 11,0 мм ± 10 % Запах: без запаха
М и к р о ч а с т и ц ы :
В н е ш н и й в и д :
коричневые
микрочастицы
Физическая
форма:
микрочастицы
Цвет: коричневый
Запах: без запаха
--- стр. 64 ---
Набор реагентов TruSeq^'^ Custom Amplicon Dx FFPE OC Kit:
Набор реагентов TruSeq^'^ Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit, компании Иллюмина
(Illumina) (PN 20006259), состоит из компонентов, которые указаны ниже в таблице:
Компоненты Набора реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit.
Таблица: Компоненты Набора реагентов TruSeq’^ '^ Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit
Номер
компонента/
части (PN)
Фотография Количество,
объем/заполнение
и размеры
высота (Н)
длина(L)
диаметр (D)
Активные компоненты,
pH и
физико-химические
свойства
Коробка 1
Коробка 1, Реагенты для этапа пре-амплификации
Смесь для
количественной
ПЦР (qPCR Master
Mix)
20004098
Праймеры
контрольные для
проверки качества
(QC Primers)
20004096
Количество: 2
пробирки
Объем: 1 мл
Размеры
Пробирка:
Н: 46,0 мм X
D: 10,5 мм ±10%
Крышка:
Н; 13,0 мм X
D: 12,0 мм ±10%
Количество: 4
пробирки
Объем: 75 мкл
Размеры
Пробирка:
Н: 46,0 мм X
D: 10,5 мм ±10%
Крышка:
Н: 13,0 мм X
D: 12,0 мм ±10%
Забуференный водный
раствор, содержащий соли,
dNTP,
ДНК-полимеразу,
пассивный стандарт и
зеленый флуоресцентный
краситель
(SYBR)
Внешний вид: бесцветная
жидкость
Физическая форма:
жидкость
Цвет: бесцветный
Запах: без запаха
Забуференный водный
раствор, содержащий
олигонуклеотиды
(праймеры) для
количественного
определения ДЕ1К в образце
Внешний вид: бесцветная
жидкость
Физическая форма:
жидкость
Цвет: бесцветный
Запах: без запаха
--- стр. 65 ---
Компонент Функциональное назначение
Набор реагентов TruSeq^’ '* Custom Amplicon Kit Dx
Буфер для гибридизации
(Hybridization Buffer)
Забуференный водный раствор, содержащий соли и
денатурирующие вещества (формамид), используется для
гибридизации олигонуклеотидов к геномной ДНК.
Смееь для удлинения-
лигирования (Extension-
Ligation Mix)
Забуференный водный раствор, содержащий ДНК-
полимеразы собственного производства, ДНК-лигазу и
dNTP, которые катализируют соединение верхнего и
нижнего локус-специфических олигонуклеотидов.
Праймеры
индексированные А (А501)
- Н (А508) (Index Primers А
(А501)-Н(А508))
Праймеры для ПЦР с индексными последовательностями и
адаптерами для секвенирования. В составе этих праймеров
имеются специфические для образцов маркерные
последовательности. В составе этих праймеров также есть
последовательности Р5 и Р7, которые комплементарны
последовательностям захвата олигонуклеотидов,
фиксированных в проточной ячейке.
Праймеры
индексированные 1 (А701)
-12 (А712) (Index Primers 1
(А701)- 12(А712))
ПЦР-полимераза (PCR
Polymerase)
ДНК-полимераза собственного изготовления, которая
используется на этапе ПЦР.
Смесь для ПЦР (PCR
Master Mix)
Забуференный водный раствор, содержащий соли и dNTP,
необходимый на этапе ПЦР-амплификации.
Разбавитель для
разведения библиотек при
нормализации (Library
Normalization Diluent)
Забуференный водный раствор, содержащий соли, 2-
меркаптоэтанол и формамид, который используется для
разведения библиотек с микрочастицами перед
проведением нормализации образцов на микрочастицах.
Буфер для разведения
библиотек (Library Dilution
Buffer)
Забуференный водный раствор, который используется для
разведения библиотек образцов перед их загрузкой в
картридж с реагентами.
Контроль внутренний РЫХ
(PhiX Internal Control)
Забуференный водный раствор, содержащий PhiX гДНК
(готовая к применению библиотека), которые вносят в
нормализированные библиотеки образцов перед их
загрузкой в картридж с реагентами. Используется для
поиска и устранения неисправностей в ходе прогона
секвенирования.
Планшет фильтровальный
TruSeq™ Custom Amplicon
Dx (TruSeq'*’'^ Custom
Amplicon Dx Filter Plate)
Полипропиленовый планшет д.г 1я микротитрования с
мембраной из модифицированного полиэфирсульфона.
Используется для удаления негибридизированньк
олигонуклеотидов и проведения реакции удлинения-
лигирования.
Буфер для элюции (Elution
Buffer)
Забуференный водный раствор, который используется для
элюции продуктов ПЦР с микрочастиц для очистки ПЦР-
продуктов после ее завершения.
Буфер для хранения
библиотек
(Library Storage Buffer)
Забуференный водный раствор, использующийся для
хранения нормализированных библиотек образцов.
--- стр. 71 ---
Выделение ДНК (протокол для герминальных вариантов)
Можно использовать любой валидированный метод выделения ДНК.
Протокол для соматических вариантов;
При работе с опухолевой тканью и ДНК, выделенной из ткани, еледует еоблюдать
следующие условия.
1 Ткань опухоли должна быть фиксирована формалином и залита в парафин.
2 Выделенную гДНК следует хранить при температуре от 2 °С до 8 °С не более 28 дней
или в замороженном виде при температуре от -25 °С до -15 °С не более 161 дня.
3 Замороженные образцы геномной ДНК стабильны в течение 2 циклов
замораживания/оттаивания.
ПРИМЕЧАНИЕ
При присутетвии следовых количеств раствора для депарафинизации, парафинового
воека, ксилола, этанола, протеиназы К, промывочных растворов, гемоглобина или
некротизированной ткани отрицательного влияния на эффективность набора при
анализе тканей FFPE не наблюдалось.
10. Способ применения
См. Инструкцию по применению, раздел «Инструкция по применению»
11. Процедуры контроля качеетва
Правильной лабораторной практикой ечитается включение положительного контрольного
образца ДНК и отрицательного контрольного образца (без матрицы) при каждой процедуре
приготовления библиотек. Положительный контрольный образец ДНК должен быть
хорошо охарактеризованным образцом е известными вариантами в области интереса.
В случае протокола для соматичееких вариантов вее библиотеки (включая контрольные
библиотеки) исследуют методом гель-электрофореза, как описано ранее.
1. При работе менее чем е 96 образцами набор можно использовать до 4 раз. При 4
использованиях по протоколу для герминальных вариантов позволяет подготовить
24 библиотеки за одно использование, а по протоколу для еоматических вариантов -
20 библиотек за иепользование, если применяется согласно Инструкции по
применению.
2. При работе е изделиями компании Иллюмина (lllumina) необходимо каждый раз
включать 1 положительный контрольный образец ДНК и отрицательный контроль
(контроль без образца. No template control, NTC). Положительный контрольный
образец ДНК должен быть хорошо охарактеризованным, е известными вариантами
в области интереса.
3. Перед началом работы по протоколу набора реагентов TruSeq™ Custom Amplicon
Kit Dx, выделите ДНК и определите ее количество.
По протоколу для герминальных вариантов количество ДНК определяют с помощью
епектрофотометра. Убедитесь, что А260/А280 образца ДНК >1,5. Нормализуйте
образец ДНК до концентрации 5 нг/мкл. Для каждого образца требуется 10 мкл
геномной ДНК (веего 50 нг).
5. Рекомендуемое количество 50 нг ДНК по протоколу для герминальных вариантов
позволяет варьировать количеством ДНК; полученное количеетво библиотек и
рабочие характериетики секвенирования определяютея количеством вносимой
ДНК.
4.
--- стр. 72 ---
т
6. По протоколу для соматических вариантов ДНК оценивают с помощью набора
реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Dx FFPE QC. Полученное количество
библиотек и рабочие характеристики секвенирования зависят от качества образца,
измеренного с помощью FFPE QC.
Пропускная способность при обработке образца
Пропускная способность набора реагентов TruSeq^”^ Custom Amplicon Kit Dx, компании
Иллюмина (Illumina), при обработке библиотек для прогона секвенирования может
варьироваться от 8 до 96 библиотек с Секвенатором нуклеиновых кислот NextSeq™ 550Dx.
По протоколу для соматических вариантов на каждый образец должно приходиться по 2
библиотеки.
Выбирать индексированные праймеры, которые будут использованы при проведении П1ДР-
амплификации, необходимо с учетом желаемой итоговой пропускной способности
обработки образца, чтобы в каждой библиотеке использовалась уникальная комбинация
индексов.
12. Методы выделения ДНК:
Выделение ДНК (протокол для герминальных вариантов):
Можно использовать любые валидированные методы выделения ДНК.
Методы выделения ДНК: с помощью осаждения сорбентом или другого метода, с
использованием зарегистрированных в установленном порядке наборов реагентов для
выделения ДНК, которые обеспечивают качество выделения ДНК (соотнощение А
260/280).
Выделение ДНК (протокол для соматических вариантов):
Компани Иллюмина (Illumina) рекомендует использовать наборы для выделения ДНК с
помощью колонок, с двойным количеством Протеиназы К, инкубировать с Протеиназой К
на протяжении ночи с перемещиванием и итоговой элюцией в объеме как минимум 30 мкл.
Использовать методы выделения с поверхности микрочастиц и методы на основе лизиса
экстрактов неочищенных клеток вместе с данными реагентами не рекомендуется.
13. Описание принадлежностей, медицинских изделий и немедицинских изделий,
которые должны использоваться в сочетании с конкретным медицинским изделием
Необходимые реагенты, поставляемые отдельно:
Пользовательский набор олигонуклеотидов:
Специфичные для анализируемого материала олигонуклеотиды не включены в набор для
приготовления библиотек, они должны быть разработаны пользователем. Принципы
дизайна пользовательских олигонуклеотидов показаны на рисунке 1. Олигонуклеотиды
должны удовлетворять следующим требованиям:
• По протоколу длягерминальных вариантов для каждого ампликона должна быть
разработана одна пара пользовательских олигонуклеотидов: один пользовательский
зонд 1 (вышерасположенный локус-специфичный олигонуклеотид [ULSO]) и один
пользовательский зонд 2 (нижерасположенный локус-специфичный олигонуклеотид
[DLSO]).
• По протоколу для соматических вариантов для каждого ампликона должны быть
разработаны две пары пользовательских олигонуклеотидов. Каждая пара состоит из
одного пользовательского зонда 1 (вышерасположенный локус-специфичный
--- стр. 73 ---
олигонуклеотид [ULSO]) и одного пользовательского зонда 2 (нижерасположенный
локус-специфичный олигонуклеотид [DLSO]). Одна пара к положительной цепи, другая
- к отрицательной.
Пользовательские олигонуклеотиды должны граничить с областью интереса. Длина
области интереса может составлять от 150 до 250 и.и., чтобы обеспечить полное
секвенирование фрагмента при прогоне 2 х 150 циклов.
Оба олигонуклеотида должны связываться с одной и той же цепью ДНК.
Пользовательские олигонуклеотиды должны содержать специфичные для Illumina
адаптеры, чтобы во время ПЦР можно было добавлять к последовательности индексы и
сиквенсовые адаптеры.
- Адаптер 1 (5'- CAACGATCGTCGAAATTCGC-3') должен располагаться на 5’-конце
пользовательского зонда 1 (ULSO).
- Адаптер 2 (5'- AGATCGGAAGAGCGTCGTGTA-3') должен располагаться на 3’-
конце пользовательского зонда 2 (DLSO).
Пользовательский зонд 2 (DLSO) фосфорилирован по 5'-концу для возможности
лигирования после элонгации пользовательского зонда 1 (ULSO).
игуно' 1 Дизайн олигонуклеотидов для набора реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit
Dx
5’ „ .. 3'
Адаптер 1
Пользовате
льский зонд 3’
Мользоватсл
р ьский зонд 2 5
-->■------------ Адаптер 2 * •
Мишень - область интереса
• Рекомендации для дизайна олигонуклеотидов следующие:
- Длина - от 22 до 30 нуклеотидов (геноспецифичная область).
- Общая длина ампликона - от 190 до 290 пар оснований, включая адаптеры по
протоколу для герминальных вариантов, или от 160 до 250 пар оснований, включая
адаптеры, по протоколу для соматических вариантов.
- Рекомендуемый GC-состав праймеров может варьироваться от 25 % до 70 %.
- Рекомендуемый диапазон Тт - от 55 °С до 70 °С.
- Концентрация каждого олигонуклеотида в наборе должна составлять 15 нМ.
- Дополнительной очистки олигонуклеотидов после синтеза не требуется.
Рекомендуется очистка от солей.
- Олигонуклеотиды можно разводить в буфере ТЕ.
- Число ампликонов для образца может варьироваться от 16 до 384.
- Дизайн олигонуклеотидов необходимо выполнять таким образом, чтобы оставить
дополнительные основания между концом праймера и областью интереса, это
необходимо для обеспечения возможности обнаружения инсерции и делении на
границе области интереса (см. раздел Ограничения процедуры).
- Если для покрытия всей области интереса необходимо несколько перекрывающихся
ампликонов, то область перекрывания между сайтами связывания соседних пар
зондов должна быть на 1 п.о. больше, чем размер определяемой делении. Например,
для обнаружения делении 3 п.о. область перекрывания соседних пар зондов должна
быть > 4 п.о. Соседние пары зондов следует разрабатывать на альтернативные цепи,
чтобы избежать взаимного влияния.
Информацию о минимальном размере зоны перекрывания ампликонов, необходимом для
выявления вариантов, см. в разделе О граничения процедуры . Число образцов для прогона
следует рассчитывать на основании минимального покрытия, требуемого для
секвенирования на приборе, оно зависит от общей длины и однородности покрытия
пользовательского(их) набора(ов) олигонуклеотидов.
--- стр. 74 ---
Для каждого пользовательского набора олигонуклеотидов следует создать манифестный
файл. Манифест-файл представляет собой текстовый файл, который содержит информацию
о целевых областях генома и необходим для проведения анализа на приборе. Шаблон
манифестного файла можно загрузить на веб-сайте компании Иллюмина (lllumina).
Реагенты для этапа пре-амплификации
• 10 N NaOH (приготовьте из таблеток или используйте стандартный раствор)
• Буфер ТЕ
• Вода очигценная от РНКаз/ДНКаз
• IX буфер ТЕ (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0)
Реагенты для этапа пост-амплификации
• 1 о N NaOH (приготовьте из таблеток или используйте стандартный раствор)
• Этанол, для молекулярной биологии. Этиловый спирт ЛСР-009896/09 от 04.12.2009
• Буфер ТЕ
• Вода очищенная от РНКаз/ДНКаз
Наборы реагентов для выделения ДНК
Выделение ДНК (протокол для герминальных вариантов):
Можно использовать любые валидированные методы выделения ДНК.
Методы выделения ДНК: с помощью осаждения сорбентом или другого метода, с
использованием зарегистрированных в установленном порядке наборов реагентов для
выделения ДНК, которые обеспечивают качество выделения ДНК (соотногпение А
260/280).
Комплект реагентов для выделения ДНК из клинического материала «ДНК-сорб-В» по ТУ
9398-003-01897593-2009 №ру фСР 2009/05220 от 05.03.2019 г.
Выделение ДНК (протокол для соматических вариантов)
Компания Иллюмина (lllumina) рекомендует использовать наборы для выделения ДНК с
помощью колонок с использованием двойного количества нротеиназы К, инкубацией с
протеиназой К в течение ночи с перемещиванием и окончательной элюцией в объеме не
менее 30 мкл. Методы выделения с использованием гранул и способы, в результате которых
получаются только неочищенные экстракты после лизиса клеток, не рекомендуются для
использования с этими реагентами.
Набор реагентов для выделения геномной ДНК человека из фиксированных в формалине и
заключенных в парафин тканей (ДНК-Ткань-Ф) по ТУ 21.20.23-009-97638376-2016 в
варианте исполнения: II. "ДНК-Ткань-Ф" на 100 выделений, в составе согласно РУ № РЗН
2018/7772 от 30.10.2018 г.
Оборудование и материалы, поставляемые отдельно
1 Прибор для высокопроизводительного секвенирования ДНК фирмы lllumina и
расходные материалы для секвенирования. Секвенатор нуклеиновых кислот NextSeq™
550Dx, методом секвенирования нового поколения (NGS).
2 Набор адаптеров для 96-луночных планшетов и индексных пробирок TruSeq^'^
(TruSeqT’ ^ Index Plate Fixture Kit), кат. № FC-130-1005. Входит в состав секвенатора
нуклеиновых кислот NextSeq™ 550Dx, методом секвенирования нового поколения
(NGS).
3 Комплект функциональных штативов для плашки и адаптеров для
центрифугирования TruSeq^'^ (TruSeq^''* Index Plate Fixture & Collar Kit), кат. №
I
--- стр. 75 ---
FC-130-1007. Входит в состав секвенатора нуклеиновых кислот NextSeq™ 550Dx,
методом секвенирования нового поколения (NGS).
4 Крышки запасные для индексных адаптеров (Index Adapter Replacement Caps), кат.
№ DX-502-1003. Входят в состав секвенатора нуклеиновых кислот NextSeq™ 550Dx,
методом секвенирования нового поколения (NGS).
Необходимое оборудование и материалы, поставляемые отдельно
Оборудование и материалы для этапа пре-амплификации
1 Термоблок - требуется один термоблок для 96-луночной плашки. Термоблок должен
иметь следующие характеристики:
- Нагреваемая крышка
- Диапазон температуры: диапазон рабочих температур от +5 °С до 99 °С
- Регулировка температуры: ±0,1 °С при 37 °С; ±0,4 °С при 60 °С
Термостат твердотельный программируемый малогабаритный ТТ-1-"ДНК-Техн." по ТУ
9452-003-46482062-2002 РУ № ФСР 2012/13646 от 29.06.2012 г.
2 Термостат для образцов - требуется один термостат (гибридизационная печь)
'Гермостат должен иметь следующие характеристики.
- Температурный диапазон: от 10 °С до 100 °С
- Регулировка температуры: ±0,2 °С
Суховоздушный шкаф-стерилизатор, вариант исполнения: Шкаф с принудительной
конвекцией: FD53. РУ № ФСЗ 2010/08132 от 26.10.2010 г.
3 Настольная центрифуга - одна настольная центрифуга (для лабораторной зоны
постамплификации требуется отдельная центрифуга). Центрифуга должна иметь
следующие характеристики.
- Может поддерживать температуру 20 °С
- Позволяет использовать 96- и 384-луночные плашки с фильтром
- Позволяет использовать 5 мл пробирки
- Обеспечивает скорость от 280 до 2400 х g
Центрифуга лабораторная с охлаждением LMC-4200R с принадлежностями, РУ № ФСЗ
2011/10117 от 11.07.2011г.
Термозапаиватель - рекомендуется для гибридизации в течение ночи, чтобы
предотвратить испарение во время инкубации при 40 °С. (при необходимости). При
использовании самоклеящейся пленки термозапаиватель не требуется. Использовать
только зарегистрированные в установленном порядке на территории РФ медицинские
изделия. Используется самоклеящейся пленка Наборы реагентов и расходные
материалы для анализатора LightCycler 480-11 Расходные материалы: 9. Покровная
плёнка (LightCycler 480 Sealing Foil), РУ № ФСЗ 2009/04711 от 14.08.2018 г.
4 Высокоточные дозаторы - требуется один набор. (Для лабораторной зоны
постамплификации требуется отдельный набор.) Обеспечивается точность объема
добавляемых реагентов и образцов. Можно использовать одноканальные или
многоканальные дозаторы, если их регулярно калибруют и их точность находится в
пределах 5 % от заявленного объема.
Дозаторы пипеточные переменного объема Eppendorf Research® Plus, вариант
исполнении: 1. Дозаторы механические переменного объема одноканальные, РУ № ФСЗ
2011/11028 от 15.11.2011 г.
5 Расходные материалы - требуются следующие расходные материалы.
- 96- или 384-луночные плашки для ПЦР с юбкой, 0,2 мл, полипропилен, или
эквивалент
Плашки реакционные оптические 96-луночные Micro Amp для ПЦР с штрих-кодом, РУ
№ ФСЗ 2010/07007 от 14.10.2016 г.
- Лоток для растворов, ПВХ, свободный от ДНКаз и РНКаз (кювета)
--- стр. 76 ---
Изделия медицинские полимерные для лабораторных исследований in vitro Резервуары
для реагентов, ФСЗ 2009/05024 08.06.2018 г.
- Клейкая пленка из алюминиевой фольги (выдерживает температуру в диапазоне,
включающем 95 °С) или пленки, совместимые с термозапаивателем
Изделия медицинские полимерные для лабораторных исследований in vitro Пленки для
ПЦР плашек алюминизированные, РУ № ФСЗ 2009/05024 08.06.2018 г.
- Клейкая пленка, совместимая с термоциклером для ПЦР
Наборы реагентов и расходные материалы для анализатора LightCycler 480-11
Расходные материалы: 9. Покровная плёнка (LightCycler 480 Sealing Foil), РУ № ФСЗ
2009/04711 от 14.08.2018 г.
- Наконечники для дозаторов с аэрозольным фильтром
Посуда из полимерных материалов для лабораторных исследований in vitro
Наконечники универсальные с фильтром, для лабораторных дозаторов, объемом от 0,1
мкл до 10 мл (а именно: 10 мкл), стерильные , упакованные в пакеты и штативы, РУ №
ФСЗ 2011/10287 от 11.04.2017 г.; Посуда из полимерных материалов для лабораторных
исследований in vitro Наконечники универсальные с фильтром, для лабораторных
дозаторов, объемом от 0,1 мкл до 10 мл (а именно: 100 мкл), стерильные , упакованные
в пакеты и штативы, РУ № ФСЗ 2011/10287 от 11.04.2017 г.; Посуда из полимерных
материалов для лабораторных исследований in vitro Наконечники универсальные с
фильтром, для лабораторных дозаторов, объемом от 0,1 мкл до 10 мл (а именно: 200
мкл), стерилъные , упакованные в пакеты и штативы, РУ № ФСЗ 2011/10287 от
11.04.2017 г.
- 1,5 мл или 2 мл пробирки
Посуда из полимерных материалов для лабораторных исследований in vitro: 5.
Пробирки микроцентрифужные объемом от 0,2 мл до 2,0 мл, с крышками и без крышек,
стерилъные и нестерилъные, градуированные и неградуированные, упакованные в
пакеты и герметичные коробки, РУ № ФСЗ 2011/10287 от 11.04.2017 г.; Посуда из
полимерных материалов для лабораторных исследований in vitro: 4. Пробирки объемом
от 0,2 мл до 2,0 мл для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР-диагностики),
индивидуальные и в стрипах по 8 и 12 штук, с крышками и без крышек, стерильные и
нестерильные, упакованные в пакеты, РУ № ФСЗ 2011/10287 от 11.04.2017 г.; Изделия
медицинские вспомогательные для лабораторных исследований и взятия
биоматериалов: 26. Микропробирки полипропиленовые конические с колпачком типа
Эппендорф (Polypropylene micro conical test tube with cap Eppendorf type), РУ № ФСЗ
2010/06000 от 06.06.2016 г.
- Стрипы с 8 пробирками с крышками
Изделия медицинские полимерные для лаборагорпых исследований in vitro Пробирки
объемом 0,2 мл в стрипах но 8 штук. РУ № ФСЗ 2012/11892 от 26.08.14 г.
- Микроцентрифуга
Лабораторные микроцентрифуги MiniSpin с принадлежноегями I. Лабораторные
центрифуги MiniSpin. варианты исполнения: 1. MiniSpin. РУ № ФСЗ 2012/13316 от
05.12.2012 г.
- Вортекс
Вортекс персональный V-1 plus, РУ № ФСЗ 2011/09797 от 25.05.2011 г.
- Контроль качества ДНК - высокомолекулярная двухцепочечная ДНК человека от
коммерческих поставщиков или выделенная из крови человека.
Оборудование и материалы для этапа постамплификации
1 Термоциклер - требуется один термоциклер. Термоциклер должен иметь нагреваемую
крышку и иметь следующие характеристики:
- Диапазон контроля температуры: от 4 °С до 99 °С
--- стр. 77 ---
- Точность контроля: ±0,25 °С в диапазоне от 35 °С до 99 °С
Термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот 1000, исполнение: С1000 в
комплекте с принадлежностями: Модуль реакционный оптический CFX96 (Optical
Reaction Module CFX96), РУ № ФСЗ 2008/03399 от 21.06.2016 г.
Шейкер для микроплашек - в лабораторной зоне для пост-амплификации требуется
один шейкер для микроплашек. Шейкер для микроплашек должен иметь следуюшие
характеристики:
- Максимальная скорость смешивания: 3000 об/мин
- Диапазон скорости смешивания: от 200 до 3000 об/мин
Миксер лабораторный «Eppendorf» MixMate, с принадлежностями, РУ № ФСЗ
2009/04410 от 03.06.2009 г.
Настольная центрифуга - требуется одна настольная центрифуга (для лабораторной
зоны преамплификации требуется отдельная центрифуга). 1Дентрифуга должна иметь
следующие характеристики.
- Может поддерживать температуру 20 °С
- Позволяет использовать 96-луночные плашки MIDI
- Позволяет использовать 5 мл пробирки
- Обеспечивает скорость от 280 до 2400 х g
Центрифуги лабораторные многофункциональные серии 58 вариант исполнения: 5810
R, с принадлежностями, РУ № РЗН 2013/757 от 21.06.2013 г.
Термоблок - требуется один термоблок для пробирок объемом 1,5-2 мл. Термоблок
должен иметь следующие характеристики:
- Диапазон температуры: диапазон рабочих температур от ±5 °С до 99 °С
- Регулировка температуры: ±0,1 °С при 37 °С; ±0,4 °С при 60 °С
Суховоздушный шкаф-стерилизатор, вариант исполнения: Шкаф с принудительной
конвекцией: FD53, РУ № ФСЗ 2010/08132 от 26.10.2010 г.
Магнитный штатив - требуется один магнитный штатив для 96-луночной плашки.
Штативы с боковым расположением магнитных элементов, а не снизу, обеспечивают
лучшие рабочие характеристики.
Высокоточные дозаторы - требуется один набор (Для лабораторной зоны
преамплификации требуется отдельный набор.) Обеспечивается точность объема
добавляемых реагентов и образцов. Можно использоватъ одноканалъные или
многоканалъные дозаторы, если их регулярно калибруют и их точностъ находится в
пределах 5 % от заявленного объема.
Дозаторы пипеточные переменного объема Eppendorf Research® Plus, вариант
исполнении: 1. Дозаторы механические переменного объема одноканальные, РУ № ФСЗ
2011/11028 от 15.11.2011 г.
Расходные материалы - требуются следующие расходные материалы.
- 96-луночные плашки для ПЦР с юбкой, 0,2 мл, полипропиленовые, или эквивалент
Плашки реакционные оптические 96-луночные MicroAmp для ПЦР с штрих-кодом, РУ
№ ФСЗ 2010/07007 от 14.10.2016 г.
ПРИМЕЧАНИЕ
Следует убедиться, что 96-луночная плашка совместима с магнитным штативом.
- Конические пробирки, 15 мл
Изделия медицинские полимерные для лабораторных исследований in vitro Пробирки с
винтовой горловинной крышкой объемом от 5 мл до 50 мл. РУ № ФСЗ 2012/11892 от
26.08.2014 г.
- Микроцентрифуга для пробирок типа Eppendorf (рекомендуется исполъзоватъ с
завинчивающимися крышками)
Лабораторные микроцентрифуги MiniSpin с принадлежностями 1. Лабораторные
центрифуги MiniSpin, варианты исполнения: 1. MiniSpin. РУ № ФСЗ 2012/13316 от
05.12.2012 г.
--- стр. 78 ---
- Стрипы по 8 пробирок для ПЦР
Изделия медицинские полимерные для лабораторных исследований in vitro Пробирки
объемом 0,2 мл в стрипах по 8 штук, РУ № ФСЗ 2012/11892 от 26.08.14 г.
- Лоток для растворов, ПВХ, свободный от ДНКаз и РНКаз (кювета)
Изделия медицинские полимерные для лабораторных исследований in vitro Резервуары
для реагентов, РУ № ФСЗ 2009/05024 08.06.2018 г.
- Клейкая алюминиевая пленка Microseal® 'В' (Bio-Rad) или эквивалент
Изделия медицинские полимерные для лабораторных исследований in vitro Пленки для
ПЦР плашек алюминизированные, РУ № ФСЗ 2009/05024 08.06.2018 г.
- Наконечники для дозаторов с аэрозольным фильтром
Посуда из полимерных материалов для лабораторных исследований in vitro
Наконечники универсальные с фильтром, для лабораторных дозаторов, объемом от 0,1
мкл до 10 мл (а именно: 10 мкл), стерильные , упакованные в пакеты и штативы, РУ №
ФСЗ 2011/10287 от 11.04.2017 г.; Посуда из полимерных материалов для лабораторных
исследований in vitro Наконечники универсальные с фильтром, для лабораторных
дозаторов, объемом от 0,1 мкл до 10 мл (а именно: 100 мкл), стерильные , упакованные
в пакеты и штативы, РУ № ФСЗ 2011/10287 от 11.04.2017 г.; Посуда из полимерных
материалов для лабораторных исследований in vitro Наконечники универсальные с
фильтром, для лабораторных дозаторов, объемом от 0,1 мкл до 10 мл (а именно: 200
мкл), стерильные , упакованные в пакеты и штативы, РУ № ФСЗ 2011/10287 от
11.04.2017 г.
- Термоциклер для количественной ПЦР - требуется один прибор для
количественной ПЦР. Прибор должен иметь нагреваемую крышку и иметь возможность
обнаружения красителя SYBR (канал РАМ; фильтр возбуждения —490 нм и фильтр
излучения - ~520 нм).
Термоциклер для амплификации нуклеиновых кислот 1000, исполнение: С1000 в
комплекте с принадлежностями: Модуль реакционный оптический CFX96 (Optical
Reaction Module CFX96), РУ № ФСЗ 2008/03399 от 21.06.2016 г.
14. Список и описание содержащихся в медицинском изделии материалов, которые
непосредственно или опосредовано контактируют с организмом пациента
Пе применимо.
15. Информация об упаковке - Маркировка и упаковка медицинского изделия
15.1. Транспортная упаковка
Транспортная упаковка содержит следующую информацию:
- торговое и полное наименование изделия;
- наименование и адрес изготовителя изделия;
- товарный знак
- требования к условиям хранения и транспортирования изделия;
- номер партии;
- предупреждения и меры предосторожности в отношении изделия, которые необходимо
исполнять, манипуляционные надписи;
- число единиц потребительской упаковки изделий в групповой упаковке, многооборотной
таре или транспортной таре;
- масса нетто и масса брутто на групповой упаковке изделий, многооборотной таре или
транспортной таре;
--- стр. 79 ---
номер заказа;
масса нетто сухого льда (для коробок с сухим льдом).
Коробка Описание Фотографии
Коробки
при
условии
хранения:
(-25 °С
до
-15 °С)
Коробки помещаются в
контейнер с сухим льдом (Dry
Ice) и контейнер помещается в
коробку из гофрированного
картона.
Коробки
при
условии
хранения:
от2°С
до8°С
Коробки
при
условии
хранения:
(15°С до
30°С)
Коробки помещаются в
гофрированную картонную
коробку с синими упаковками
охлаждающего льда/геля (Blue
Ice/Gel).
Коробки, хранящиеся при
комнатной температуре и не
требующие хранения в холоде,
помещены в коробку из
гофрированного картона.
--- стр. 80 ---
Маркировка:
Маркировка номера заказа:
ORDER NUMBER:
NUMBER OF PIECES :
TOTAL GROSS WEIGHT :
Маркировка для транспортной коробки с сухим льдом:
Интерпретация символов
Символ Интерпретация
Верх
Хрупкое, обращаться осторожно
Беречь от влаги
--- стр. 81 ---
О
Хранить замороженным
ф 1
Класс 9. Прочие опасные вещества и изделия
Температрный диапазон
Illumina® Логотип компании
15.2. Вторичная упаковка
Коробка I Риеунок Размеры и маееа коробки
I Набор реагентов TruSeq^''* Custom Amplicon Kit Dx
Коробка 1
Г ^ ^
'J trojbxi* СиМвт AwiiMrctg Оч у/з
Ш ' !.«« Ш£Р »*п* J
Ш t- .■ : Ц ЩV ^ ' 1 Г-,- iff t- ‘fhmrttfvt
Размеры:
Длина: 14,5 см х
Ширина: 9,65 см х
Высота: 10,67 см
± 10%
Масса: 0,303 кг± 10%
Коробка lA Размеры:
Длина: 8,9 см х
Ширина: 6,6 см х
Высота: 10,16 см
± 10%
Масса: 0,113 кг± 10%
--- стр. 82 ---
Коробка
Коробка 1В
Коробка 2
II
Коробка 3
Коробка ЗА
Рисунок Размеры и масса коробки
Размеры:
Длина: 8,9 см х
Ширина: 6,6 см х
Высота: 10,16 см
± 10%
Масса: 0,079 кг ± 10%
Размеры:
Длина: 15,75 см х
Ширина: 11,68 см х
Высота: 13,46 см
± 10%
Масса: 0,310 кг± 10%
Размеры:
Длина: 18,29 см х
Ширина: 9,4 см х
Высота: 10,92 см
± 10%
Масса: 0,300 кг ± 10%
Размеры:
Длина: 10,92 см х
Ширина: 8,89 см х
Высота: 9,91 см
± 10%
Масса: 0,139 кг± 10%
--- стр. 83 ---
Коробка Рисунок Размеры и масса коробки
Коробка ЗВ Размеры:
Длина: 8,89 см х
Ширина: 6,6 см х
Высота: 10,16 см
± 10%
Масса: 0,091 кг± 10%
Набоп иеагентов TruSeq’^ ’ ^ Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit
Коробка 1 Размеры:
Длина: 8,64 см х
Ширина: 6,35 см х
Высота: 5,33 см
± 10%
Масса: 0,067 кг± 10%
15.3. Маркировка вторичной упаковки
Этикетки или упаковочные этикетки показаны в таблице: Этикетки набора реагентов
TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx
--- стр. 84 ---
Набор реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx, PN 20005718
Описание/ PN
Набор реагентов
TruSeq™ Custom
Amplicon Kit Dx 1/3
PN 20003227
Этикетка
TruSeq'" Custom Amplicon Kit Dx 1/3
Ш\ 20003227
гсооэг
Io t] A100000 l!llllllllllllllllllll!l
A 100000
m il i i i i i i i i iRGT7374U4?
^ 2019 -06-30 у -15'С
Щ Hiuw^a. HK
ta r D («90 CA 121Э2 USA
-25*c4
C€(ei)Cet1<37Oe7«0S7
ttritid is e
HO)A10SO0Q ока ! fr»40r *a* Аа^в!*ч4^в
| l V D
Pae*r«t WWW com pattnu
MADE IN USA
}I>OC417?0)
iliumina
W W W -
TruSeq’" Custom Amplicon Kit Dx 1/3
20003227
[Гот| A100000
^ 2019-06 30
-25’C• c l
lumina'
Маркировка ингредиентов
TruSeq® Custom Amplicon Kit Dx
H yb rid iza tio n B uffer 1 X 4.32 m l
Extension U gation M ix 1 X 4,8 m L
PCR M aster M ix 1 X 2 .8 m l
PCR Pofym erase I x 56 |д1
Index P rim ers A (A 5 0 1 )-H (A 5 0 8 ) l x 192 и!
Index P rim ers 1 (A 7 0 1 )-1 2 (A 7 1 2 ) 1 X 128 \i\
Library N o rm aliza tio n D iluent 1 X 4.6 m l
Library D ilutio n B uffer 1 x 4 .5 m L
PhiX Internal C o n tro l 1 X 1 0 m L
R x O n ly
□s
Label PN: 20004190 0 '
1/3
llumina
1
--- стр. 85 ---
Набор реагентов
TruSeq™ Custom
Amplicon Kit Dx 1A
PN 20003228
TruSeq'“ Custom Amplicon Kit Dk 1A
Pre-PCR I
^reF 20003228
To? A100000
^ 2019-06-30
«J
llililllllA100000
lllinililllllllЙ0Т7Э744Э46
M e
••n0i«9« CA 13127 USA .2 S -J
-15’C
S(01|Mtll77»e7«f»r
е(17)'М «Эв r. { l O l A I O M M
C€
1C O'-" ’•
MTIf IVD
w 4M ><ikjm 'n«eonv‘p«i*nt*
MAOtiKUtA
707О417ЭО7
illumina
TruSeq’" Custom Ampiicon Kit Dx 1A
HEP 20003228
A100000
^ 2019-06-30
-25‘C - i
15‘C
illumina
Маркировка ингредиентов
TruSeq* Custom Amplicon Kit Dx
Hybridiiation Buffer 1 x 4 ,3 2 ml
Extension Ligation Mix 1 X 4,8 ml
PCR Polymerase 1 X 56 pi
PCR M aster Mix 1 x 2 8 mi
index Primers A(A501)-H(A908) 1 X 192 pi
Index Primers 1{A701)-12(A712) l x 128 pi
1A
Rx Only
:.iB »IP N : 2 0 004191.01
lum ina
www.illumina.com
Маркировка e предупреждением об опасности
1
--- стр. 86 ---
DX OHS1
4><!>
DANGER
(Contains l-orrramioe. Sodium Chloride)
May damage fert I ty.
May damage unborn child.
Causes serious eye irritation.
Obtain soecial instructions before use. Do not handle until
all safety precautions have been read and understood. Use
personal protective equipment as required. Wash thoroughly
after handling. Wear protective glovos and eyedace protection.
Ih exposed or concerned Get medical adv ce/attention.
IF IN EYES Rinse cautiously with water for several minutes.
Remove contact lenses, it present and easy to do. Continue
rinsing. If eye irritation persists; Get medical advice'attention.
Store bexed up. Dispose of conlents/conlainer in accordance
wilti local/rogionalmal onal'inte''nalion;j| regulations.
www.i||jmina.com
1-800-809-4566
Label PN; 1b041619.A
Mill
Part Number; PN 15041619
Revision; A
Item Description; LBL,Hazard 1.34x1.34
_DX#AOHS1
PMS Color; PMS 6C (Black)
PMS 179C (Red)
Date; 03.06.2013
Designer; Brandy Schmidt
illumina'
--- стр. 87 ---
Этикетки для вторичной упаковки (внешняя упаковка)
Набор реагентов
TruSeq™ Custom
Amplicon Kit Dx 1В
PN 20003229
I
i
TruSeq’" Custom Amplicon Kit Dx
IIIIIHIIIIIII
1B
Post-PCRI
H fi 20003229
lot]a100000
20003229
^ 9 6
A 1 00000
^ 2019-06-30
IMillllllll
15*C■Kjntiruu me.
l» l DHtgo. CA UtA
R O T 2 3 2 M 3 4 7
-25*c 4
C€
E CЙЕР
» > # « * « * • • Vfrmtt *V ‘ A«-«*J**«*| ti tM’ff
AKinti »*w» ЛишигтА eo«vp*«*nf»
MADE MUSA
LtiM l 30&d4l74 03
IVDI
illumina
>»■<*> • lum r«4 con
TruSeq’" Custom Amplicon Kit Dx 1В
515 20003229
LOT A100000 -25’C {
■ 15’C
2019 06 30
Illumina
Маркировка e предупреждением об опасноети
(CortHins hormamide Sod urn Chb'ide;
May da'tiagt: ferll ty.
May daniago unborn cluld.
Causes serous eye irrdatior.
DANGER
Ob',a П special insTUCtions cefo'e use. По not nanolo untl
a| safety precautions have been read and inrierstncd. Use
personal pmledive equipment as required. VVasn thoroiiqrily
after tianclrg. yVua- protective qlovus ar-d Kye'face protection.
IF exposed Of concernec Ge: meciical acvice/oUentioii.
1= lx EYFS- R nse naudo.isly with water for several r inutes.
Remnve contact lenses if pmserd and easy to do. Cnnlimie
rinsing. I* eye irnla'.ian aersists Gel medical aOvicei'allunlion.
Stofu lodKud uu. Dispose ut coritunlsterjritai"i‘jr in atcofoarico
with bcal'region afr a tionalti ntcmati'jnal 'c g ulatiorts.
w'w.v.dluit'ira.corn
1-b00-&Ce-4666
-abcl PN fb041t)1H.A
--- стр. 88 ---
(I
Этикетки для вторичной упаковки (внешняя упаковка)
Набор реагентов
TruSeq™ Custom
Amplieon Kit Dx
2/3
PN 20003460
Part Number; PN 15041618
Revision; A
Item Description; LBL,Hazard_1.34x1.34
_DX#-LNA1
PMS Color; PMS 6C (Black)
PMS 179C (Red)
Date; 03.06.2013
Designer. Brandy Schmidt
illumina
TruSeq"* Custom Amplieon Kit Dx 2/3
Iref; 20003460
fTorlAI 00000
^96
^ 2019-06-30
>1
tllllllllllll
llllllllllllllllilllll
•lOCOOO
IllllWIIIIil
«wowat. me
$290 Htur<nin« Way
tan 01*94: CA13123 UftA
15■ c 4
30‘C
eeii<4iiia7fl62MS7" (1П1*04Эв C€
5 • V f ...........
^ [tcRiH IVD
t L — * . . . . . . . . . .— ■ *
illuminaPMcnti iwM4i «urntna conVpK*nt*
MADi IN USA
kab*l«N 7000417» 03 .lilumsr* «o»T
TruSeq"* Custom Amplieon Kit Dx 2/3
1M£J 20003460
A100000
^ 2019-06-30
15*C•c i
1/ 30'C
illumina
--- стр. 91 ---
--- стр. 92 ---
TruSeq® Custom Amplicon Kit Dx 3B
PCR Cleanup Beads
Librarv Normalization Wash
Library Beads
1 X S m l
2 x 4 . 8 m L
l x 1.2 m L
«
.
1 .(Rx Only
Lab»l PN: 20004135,01
illumina
WWW. ilium ina.com
Маркировка c предупреждением об опаености
DX LNW1
4 > Ф
DANGER
(Contains Citric AciO Monohydrate
Formamide, Sodium Chloride)
May damagt? fed lity.
May damage unborn child.
Causes serious eye imtation.
Obtain special instructions neforo use. Do not handle until
al safety precautions have been read and understood. Use
personal protective equipment as required. Wasn thoroughly
after handling. Wear orotective gloves and eye.'face protection.
IF exposed or concerned. Get medical advicetaltenlion.
IF IN EYES: Rinse cautiously vrilh water for several rtiinules.
Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue
rinsing. If eye irritation persists: Get modical advice,''attention.
Store locked up. Dispose of contents.''conlainor in accordance
'.vith kical'rogional.'national,''international regulations.
mw.'.ilumina.conn
1-eOO-8'D9-4566
ahel PN- 150416f7.A
nil II
--- стр. 93 ---
Part Number; PN 15041617
Revision: A
Item Description: LBL,Hazard_1.34x1.34
DX#-LNW1
PMS Color: PMS 6C (Black)
PMS 179C (Red)
Date: 03.06.2013
Designer: Brandy Schmidt
illumma
Набор реагентов TruSeq^'^ Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit, PN 20006259
Набор реагентов
TruSeq™ Custom
Amplicon Dx FFPE
QC Kit 1/1
PN:20003464
TruSeq’“ Custom Amplicon Dx
FFPE QC Kit 1/1
@ 20003464
[Гот] Д100000
^ 48
Ш111111Ш11120003464
llllll||lllllllllllll41000&0
^ 2019-06-30
l(lum<ri. Ine
6300 Ilium г tW ty
llllllllllllllllllllilll
riGT21J44144
tin Oi«go C* 62133 OtA JVC .25“C
■15*C
(01)00(16220020064
(17)190630
(lO)AIOOOOO
, tlluiRlna N K h iriiflit ■ V
’ ЯMirtE BlnlliEC ЛЕЕ g lirlE Ei«lh..«n
A itinti vyMW lliumini eom,'pttirti
MADE IN JtA
..ID llPN 20004179 01
llumina'
w w w . i l i u m i n a . c o m
Маркировка ингредиентов
J L
--- стр. 94 ---
i
TruSeq'^ Custom Amplicon Dx
FFPE а с K it
1/1
QC Primers
qPCR Master Mix
4 X 7S ц1
2x1 ml
Rx Onlyi
.-O S
umina
UbsIPN: 20004197,02
www.illumlna.com
15.4. Маркировка первичной упаковки
Маркировка для первичной упаковки
Набор реагентов TruSeq’ ^ '^ Custom Amplicon Kit Dx
Коробка lA
Буфер для
гибридизации
(Hybridization Buffer)
PN 15035442
Смееь для удлиннения-
лигирования
(Extension-Ligation Mix)
PN 20005678
iiiin I iiii— I
Hybridliation Buffer
16036442
6EF 15035442
JLOT 1234567890 '
4.32 ml
M 2016/05/20 ijMee'/eeo'
Л llltimina Inc
M fl San Olego. CA 92123 USA
Label PN 15036581 01
25°Ci
-i5»e
[TVD~
illumina'
l!llll|l|llllillllllllllllll||llllllX2002380-IELM 3DX2
Extension-Ligation Mix
«er 20005678
LOT 1234667890
4 8 ml iililliilifiliFi
-25■ci
15"C
C €
2016/02/26
_ i lllunnina. Inc,
ШШ San Diego. CA 92122 USA
I »b0!l PN 20005782 00 illumina’
Праймеры индексированные A (A501) - H (A508) (Index Primers A (A501) - H (A508))
--- стр. 95 ---
М аркировка для первичной упаковки
Праймер
индексированный А
PN 15035449
Праймер
индексированный В
PN 15035450
Праймер
индексированный С
PN15035451
Праймер
индексированный D
PN 15035452
Праймер
индексированный Е
PN 15035453
ML 15035440
Ж 1234567890
192 и1 ■25*С■п
15*С V
I 2 2016/05/20 I
= Indtx Prlmtr А (А501)
lllllllilllllохгоогввб-АБ01
[Л?1 15035450
[Тот] 1234567890
„192U L . j5 .c4
• IS’C
5 ^ 2016/05/20 IVO
ZО .
1
г= Index Primer В (А502)
0X2003136-А б о г
мд 15035451
Ш П 234567890
192 и1 ■25’С i
•15‘с t:
I ^ 2016/05/20
Z
= Index Primer С (А503)
0X2002702 -А603
Ml 15035452
Ж 1234567890
192 ul ■25’Сс(
IS'C
I 2016/05/20 i
S Index Primer 0 IA504)
l l l i l l i
0X2002706-A 6 0 4
W, 15035453
\ет] 1234567690
£ ^ 2016/05/20
^ Index Primer E (ASOS)
i .....i
--- стр. 96 ---
Маркировка для первичной упаковки
Праймер
индексированный F
PN15035454
Праймер
индексированный G
PN15035455
Праймер
индексированный Н
PN15035456
Ш 150354S4
W 12345е7в!Ю »5'С -
192 и 1 2S‘C-
I II 2016Ф5/20
^ Index Primer F (AS06)
lllllilllll
охг00?711 - АЬОв
-»sx
:»W >' 15035455
[tor] 1234567890
Ф 192 ul .2s*c
£ II 2016/05У20
^ Index Primer G (A507}
I ill
0Х20П2714-А607
Kir 15035458
1111234587890
192 ul 2V C
•15*C
z3.
E 2018(05,-20Э ”
^ Index Primer H (A508)
охгоогт-АБо#
Праймеры индексированные 1 (A701) -12 (A712) (Index Primers 1 (A701) - 12 (A712))
Праймер
индексированный 1 15035457
:^] 1234587880 g
PNl 5035457
Праймер
индексированный 2
PNl 5035458
E || 2018/05(20 4 ^ I
= Index Primer I (A701)
llllllllllllll
DXZ00?770-A701
g;ilM35458 I
Tor) 1234567890 |
Л 128 ul js-c I ^ ^ I
I ^ 2018/05(20 I
Index Primer 2 (A702J
.lillllllil0X2002723-A70?
--- стр. 97 ---
I
Праймер
индексированный 3
PN15035459
Праймер
индексированный 4
PN15035460
Праймер
индексированный 5
PN15035461
Праймер
индексированный 6
PN15035462
Праймер
индексированный 7
PN15035463
ии] lM354Se
"ОТ 1234567880 1«*С S
g 128 ul -is-c 'i ^ __
i 2016,'05/20 ®
■= Index Primer 3 (A703)
lllllllillill
ОХ700?;2в* А70Э
о
Mr] 15035480 1Vot; 1234587890
L- -1 5 Xi
128 ul i t 1
^ 2018/05720 s
1
i
=i Index Primer 4 (A704)
lllllllillllllllilllli
0X200272*-A704
Mr] 15035461 S
ig 1234567800 ^ I
*l28ul . 25*c i ^__$
I 2 2018/05720 1^1
= Index Primer 5 |A705)
lllillll
0X2007737-*706
1^115035462 I
Й»! 1234567890 I
m 128 u l » X i _ _ I
I ^ 2016'05.'20 ® I
3 Index Primer 6 tA706)
0X2002736 - A706
15035483
0
1Чёт) 1234587860 •15‘C
128 ul ( 2
^ 20ie<05/20 Ш \
Index Primer 7 (A707)
lilllilllllil
OX200273e-A707
--- стр. 98 ---
Маркировка для первичной упаковки
Праймер
индексированный 8
PN15035464
«315035464 I
1^1234567890 I1 -iS't 2
128 ul | г
I 201вЮ5/20
^ Index Prlmef 8 (А708)
llillllllllli
0X7007741-4704
Праймер
индексированный 9
PN15035465
is'c i
и* 15035465
лаУ 1234567680
gl28ul ,».c{
g У 20l6.'05/20
^ Index Primer 9 (A709J
i
I
null
0X7007744-470*
Праймер
индексированный 10
PNl 5035466
W r i t 5 0 3 5 4 6 6 I
3^1234567680 I
S 2i aoieiosi'ao |
^ Index Primer 10 {A710)
lllilllilili0X2007747 -4710
i
Праймер
индексированный 11
PN15035467
15*C 2
xip] 15035467
[Тот] 1234567890
128 ul ^ Л
^ 2016/05720 M I
Index Primer 11 (A711)
I I I ill
0X2002750-4711
Праймер
индексированный 12
PN15035468 xtrl 15035468
Tog 1234567890 _ ^
£ ^ 2016/05/20 I
= Index Primer 12 (A712)
lllllllDX2002763-A712
--- стр. 99 ---
illumina
= = PCR Polymerase
КЗ--- [be? ] 15035469
[I5tJ 1234567890 | t'-l5“C
М 1 "iV.Vi'.r.'S56 ul - 25X A1
1 ^**"*"*^Q 2016/05/20
Jj lUunwia. Inc■■ San Oego CA 92122 USA
ПЦР полимераза (PCR
Polymerase)
PN 15035469
Label PN 15030606 01
i
Смесь для ПЦР (PCR
Master Mix)
PN 15035448
□ X2002B21 — P M M 2
PCR Master Mix
1903i44l
ЯЕГ 15035448
LOT 1234567890 '
2 8 ml
< - IIIIIIIIIMIIIIIII^ 2016/05/20
Ifiumina Inc
Mfl San Ditgo. CA »2122 USA
Lab*IPN 15036607 01
-15“C
25*C
illumina
Коробка IB
Разбавитель для
разведения библиотек
при нормализации
(Library Normalization
Diluent)
PN 15035473
0X2002824 — LNA1
library Normalization Diluent
P -15*0
16036473
lllil. ..1234667190
a J 9«n Diego. CA 92122 USA
Label PN 18038909 01
4.6 ml
^ 2016/05/20
25”C
illumina
Буфер для разведения
библиотек (Library
Dilution Buffer)
PN 20004095
П Х 20 П З 101 - MT 1
Library Dilution Buffer
AiF 20004095
Lojjl234567e90
4.5 ml
2016/05/20 1234667690
■ MHimina me
m l San Dieqa CA 62122 USA
I ahnl PN 20004678 01
illumina'
Контроль внутренний
PhiX (PhiX Internal
Control)
PN 15036574
illumina
PhiX Internal Control
1 ^ 15036574
jloTi 1234567890 p-15“C
10 Ul -25Х Д
^ 2016/05/20
(ЛШ шШ т _ J Wumir«. Inc
Ш Ш San Diego CA9?122USA
Label PN Ib0366ll0l
Коробка 2
--- стр. 101 ---
Ma жировка для первичной упаковки
Коробка 3B
.Illilllilllllllllliilllllllохгоогвзз — x p b
PCR Clean Up Beads
Manufactured by Beckman Coulter Inr
^15036674 11111111
1^1234567890 I
5 ml
Микрочастицы для
очистки ПЦР-
продуктов (PCR Clean-
Up Beads)
PN 15036674 2016/05/20
mumlni. Inc
8”C
2”C
IVD
t2346«7l90
IM I San Olcgo. CA «3122 USA
Label PN 16036876 0i illumina'
Раствор промывочный
для нормализации
библиотек (Library
Normalization Wash)
PN 15035446
0X2002963 - LNW1
Library Normalization Wash
16035446
1234567890
4 8 ml
2016/05/20
1t03S44«
12349«7в110
2°C
8°C
IVD
lllumini. Inc
IM San DIago. СД 92122 USA
Label PN 15036615.01
illumina'
Микрочастицы для
библиотеки (Library
Beads)
PN 20017098
8X
illumina
Library Beads
5 ^ 5 [ie?] 20017098
т а 1234567890
1 2 ml 2X
2016/05/20
z....... Ш ШШшаамш _ Д lUumina Inc
-* ... IM San Drego, CA 92122 USA
^abel P N 2001(1596 00
i
Набор реагентов TruSeq^’ ^ Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit
Коробка 1
Смесь для
количественной ПЦР
(qPCR Master Mix)
PN 20004098
illumina
qPCR Master Mix
20004098
[lotI 0000000000
1 ml
У YYYY-MM-DD ^
Illumina, Inc.
“ San Diego, CA 92122 USA
Label PN 20004481.00
-25 °CI
I*
15°C
--- стр. 102 ---
Маркировка для первичной упаковки
Праймеры контрольные
для проверки качества
(QC Primers)
PN 20004096
X:ю
О "
о-
UZ
I ■
DEО -
D5
illumina
QC Primers
^f] 20004096
[Гот] 1234567890 |^*15Х
75 Ml -25Х
s7 2016/05/20 IVD
IHurrvna, Inc
San Dtego, CA 92122 USA
Label PN 20004679 01
I
--- стр. 103 ---
i
Набор реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx в вариантах исполнения
Инструкция по i 11U m I п а
применению Набор реагентов для создания «библиотеки» нуклеиновых
кислот ИВД TruSeqT^» Custom Amplicon Kit Dx в вариантах
PN исполнения
10000000297721 z. только для ДИАГНОСТИКИ IN VITRO
К а т . № 2 0 0 0 5 7 1 8 : 1 -4 и с п о л ь з о в а н и я , д о 9 6 б и б л и о т е к
K a i . № 2 0 0 0 6 2 5 9 : 1 -4 и с п о л ь з о в а н и я , д о 4 8 о б р а з ц о в
Н а з н а ч е н и е
Набор рсагснюв д. 1я создания «бнблнозски» нуклеиновых кислот ИВД TruScq'^" Custom
Amplicon Kit Dx в вариантах исполнения, компании Иллюмииа (lllumina) предназначен для
приготовления образцов библиотек из ДНК, выделенной из иернферичеекой цельной крови
и тканей, фикеированных в формалине и залитых парафином (FFPE) и оценки качества
образцов ДНК (только для образцов выделсииых из FFPE). Полученные библиотеки
предназначены для секвенирования на выеокоироизводительном секвенаторе ДНК фирмы
Иллюмз1на (lllumina) секвенатор нуклеиновых кислот NextSeq^'* 550Dx. .методом
секвенирования новою поколения (NGS),
(Да.тсе но текету Набор реаг ентов TruSeq^'' Custom .Amplicon Kit Dx).
П р и н ц и п ы п р о ц е д у р ы
Набор реагентов TruSeq'^' Custom Amplicon Kit Dx ггрггмснятся ttptr ручном сггособс
ttOJry^eHitH 6tt6jrttoTCK дзгя секвенирования ДНК, выделенной ггз образцов ггериферггчеекой
цельной кровгг и тканей, фггкеггрованных в формазгине гг зазгггтьгх ггарафггном (FFPE). При
ггеггользоваггигг реатеггтов ггагЗора реаг еггтов TruSeq’ Custom Amplicon Kit Dx c ггомощьго
сисшг(|)ичных олиг онукзгеотггдов амггзгифггцггруются целевые учаетки геномной ДНК
каждого образца, также в ггроцееее работы добавзгяются индекеньге ггосзгсдовате.тьности гг
ггосзгедоватезгьггостгг, необходимые д.тя захвата ггрогочггой ячейког'г амггзгифггцироваггньгх
ггродуктов. Иргг аназгггзе ДНК ггз цельной кровгг ггеггозгьзугог ггротокол дзгя аггазгиза
г ермггназгьньгх вариантов, а дтя ДНК ггз ткангг FFPE - ггротокозг дтя еоматичеекггх вариантов.
Полученные бггблиотекгг ггрггменяготея дтя секвенггровання на вьгеокоггрогтзводигельнохг
секвенаторе ДНК ([гггрмы lllumina и дгя аншгггза с ггомошью ггрог ра.ммных модузгей ггрибора
дгя г ерминальных или еоматичеекггх вариантов.
Набор реагентов зтля оценкгг качества геномной ДНК. вьгде.тснной ггз образцов тканей,
фггкеггрованных в ([гормазгггне, гг заключенных в rraparjsrtновые б.токн TnrSeq™ Custom
Amplicon Dx FFPE QC Kit (дазгее tro текету Набор реаг ентов TruSeq^''' Custom Amplicon Dx
FFPE OC Kit) ггримснястся для оцеггки качества образцов ДНК. вьгдслсггггой из ткангг FFPE,
дгя оггредезгсгтггя ггх ггритодггосгтг ггргг ггсггозгьзовагггги с ггаборо.чг рсагсгпов IruSeq"'’ Custom
Amplicon Kit Dx. Набор ггргг.мснястся дгя количественной ИЦР в режиме решгьного врсменгг
(кПЦР), которую можно ггроводггть с иеггозгьзованггем стандартных инструментов.
Козгнчссгвенная ИЦР оггредсзгяст гготснцггазг амгглггг])ггкаигггг ДНК. выделенной ггз образцов
FFPE.
Требования к количеству вноеггмогг г ДНК вьгдс.теггггой ггз FFPE дтя ггодг отовкгг бнблгготск
основаны на дезгьта количественном цггкзгс (dCq), оггрсдслясмой с ггомошью набора. dCq -
это разнггца между цггкзгамгг ггргг которых образец гг контрозгь ггроходят линггю ггорогового
значения. Реагенты, входящггс в состав набора реагентов TruSeq”’ Custom Amplicon Dx
FFPE QC Kit. избирательно амггзгифггцируют гговторяющггсся областгг гго всему геному.
Козгггчсство бггбзггготск завггсггт от колггчества амггзггг([)ггиггрусмон г ДНК, выделенной ггз
образцов FFPE. Чем выше dCq образцов, тем меньше ко.тичсство амгглггфггцггруе.мой г ДНК
гг тем бозгьшсс колггчество ДНК требуется дгя внесения в ггроцееее ггриготовления
библиотекгг.
--- стр. 104 ---
л
15.5. Примеры дополнительной маркировки на русском языке
Набор реагентов TruSeq^"^ Custom Amplicon Kit Dx
Коробка 1
Н а б о р р е а г е н т о в д л я с о з д а н и я « б и б л и о т е к и » н у к л е и н о в ы х к и с л о т И В Д T r u S e q ™ C u s t o m A m p lic o n
K i t D x в в а р и а н т а х и с п о л н е н и я .
Н а б о р р е а г е н т о в д л я с о з д а н и я « б и б л и о т е к и » н у к л е и н о в ы х к и с л о т И В Д T r u S e q ^ '^ C u s t o m A m p lic o n
K i t D x , в с о с т а в е :
Р е а г е н т ы , д л я э т а п а п р е - и п о с т - а м п л и ф и к а ц и и T r u S e q ™ C u s t o m A m p lic o n K i t D x , к о р о б к а 1:
Р е а г е н т ы д л я э т а п а п р е а м п л н ф и к а ц и и ( P r e - A m p R e a g e n t s ), к о р о б к а 1 А :
Буфер для гибридизации (Hybridization Buffer) - 1 пробирка (4,32 мл/пробирка).
Смесь для удлинения-лигирования (Extension-Ligation Mix) - 1 пробирка (4,8 мл/пробирка).
Праймеры индексированные А (А501) - Н (А508) (Index Primers А (А501) - Н (А508)) - I пробирка для
каждого праймера (192 мкл/пробирка).
Праймеры индекеированные 1 (A70I) -12 (А712) (Index Primers 1 (А701) - 12 (А712)) - 1 пробирка для
каждого праймера (128 мкл/пробирка).
ПЦР полимераза (PCR Polymerase) - 1 пробирка (56 мкл/пробирка)
Смесь для ПЦР (PCR Master Mix) - I пробирка (2,8 мл/пробирка).
Р е а г е н т ы д л я э т а п а п о с т - а м п л и ф и к а ц и и (P o s t - A m p R e a g e n t s ) к о р о б к а 1 В :
Разбавитель для разведения библиотек при нормализации (Library Normalization Diluent) - 1 пробирка (4,6
мл/пробирка).
Буфер для разведения библиотек (Library Dilution Buffer) — I пробирка (4,5 мл/пробирка).
Контроль внутренний PhiX (PhiX Internal Control) - 1 пробирка (10 мкл/пробирка).
Регистрационное удостоверение
№ от г.
Условия хранения, номер партии, срок годности и графические символы см. на оригинальной упаковке.
Только для диагностики ин витро.
Для профессионального применения.
Производитель:
«Иллюмина, Инк.», США, (lllumina, Inc.)
5200 lllumina Way, San Diego, California 92122, USA
Уполномоченный представитель производителя:
ООО «Р-Фарм Интернешнл»
Россия, 123154, г. Москва, ул. Берзарина, д. 19, корпус 1, этаж 1, помещение V, комната 9
Телефон: +7 (495) 956-79-37, Факс: +7 (495) 956-79-38
e-mail: info@rpharm.ru _____________________________________________________________
■ Итоговая версия маркировки может быть изменена по решению производителя
Коробка 2
Н а б о р р е а г е н т о в д л я с о з д а н и я « б и б л и о т е к и » н у к л е и н о в ы х к и с л о т И В Д T r u S e q ™ C u s t o m A m p lic o n
K i t D x в в а р и а н т а х и с п о л н е н и я .
Н а б о р р е а г е н т о в д л я с о з д а н и я « б и б л и о т е к и » н у к л е и н о в ы х к и с л о т И В Д T r u S e q ™ C u s t o m A m p lic o n
K i t D x , в с о с т а в е :
Р е а г е н т ы , д л я э т а п а п р е - и п о с т - а м п л и ф и к а ц и и T r u S e q ™ C u s t o m A m p lic o n K i t D x , к о р о б к а 2 :
Р е а г е н т ы д л я э т а п а п р е - а м п л и ф и к а ц и и (P r e - A m p R e a g e n t s ):
Планшет фильтровальный TruSeq^'^ Custom Amplicon Dx (TruSeq™ Custom Amplicon Dx Filter Plate) - 4
Ш Т.
Р е а г е н т ы д л я э т а п а п о с т - а м п л и ф и к а ц и и (P o s t - A m p R e a g e n t s ):
Буфер для элюции (Elution Buffer) - 1 пробирка (4,8 мл/пробирка).
Буфер для хранения библиотек (Library Storage Buffer) - 1 пробирка (3,5 мл/пробирка).
Регистрационное удостоверение
Х» от г.
Условия хранения, номер партии, срок годности и графические символы см. на оригинальной упаковке.
Только для диагностики ин витро.
Для профессионального применения.
Производитель:
«Иллюмина, Инк.», США, (lllumina, Inc.)
5200 lllumina Way, San Diego, California 92122, USA
Уполномоченный представитель производителя: ________
--- стр. 105 ---
ООО «Р-Фарм Интернешнл»
Россия, 123154, г. Москва, ул. Берзарина, д. 19, корпус 1, этаж 1, помещение V, комната 9
Телефон: +7 (495) 956-79-37, Факс: +7 (495) 956-79-38
e-mail: info@roharm.ru ______________________________________
* Итоговая версия маркировки может быть изменена по решению производителя
Коробка 3
Набор реагентов для создания «библиотеки» нуклеиновых кислот ИВД TruSeq^”^ Custom Amplicon
Kit Dx в вариантах исполнения.
Набор реагентов для создания «библиотеки» нуклеиновых кислот ИВД TruSeq™ Custom Amplicon
Kit Dx, в составе:
Реагенты, для этапа пре- и пост-амплификации TruSeq^^ Custom Amplicon Kit Dx, коробка 3:
Реагенты для этапа пре-амплификации (Pre-Amp Reagents), коробка ЗА:
Буфер для интенсивной отмывки (Stringent Wash Buffer) - 1 флакон (24 мл/флакон).
Буфер универсальный, промывочный (Universal Wash Buffer) - 1 пробирка (4,8 мл/пробирка).
Реагенты для этапа пост-амплификации (Post-Amp Reagents) коробка ЗВ:
Микрочастицы для очистки ПЦР-продуктов (PCR Clean-Up Beads) - 1 пробирка (5 мл/пробирка).
Раствор промывочный для нормализации библиотек (Library Normalization
Wash) - 2 пробирки (4,8 мл/пробирка).
Микрочастицы для библиотеки (Library Beads) - 1 пробирка (1,2 мл/пробирка).
Регистрационное удостоверение
№________от_________г.
Условия хранения, номер партии, срок годности и графические символы см. на оригинальной упаковке.
Только для диагностики ин витро.
Для профессионального применения.
Производитель:
«Иллюмина, Инк.», США, (lllumina, Inc.)
5200 lllumina Way, San Diego, California 92122, USA
Уполномоченный представитель производителя:
ООО «Р-Фарм Интернешнл»
Россия, 123154, г. Москва, ул. Берзарина, д. 19, корпус 1, этаж I, помещение V, комната 9
Телефон: +7 (495) 956-79-37, Факс: +7 (495) 956-79-38
e-mail: info@roharm.ru
* Итоговая версия маркировки может быть изменена по решению производителя
Набор реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit
Коробка 1
Набор реагентов для создания «библиотеки» нуклеиновых кислот ИВД TruSeq™ Custom Amplicon
Kit Dx, вариант исполнения: Комплектация 1:
Набор реагентов для оценки качества геномной ДНК, выделенной из образцов тканей,
фиксированных в формалине, и заключенных в парафиновые блоки TruSeq™ Custom Amplicon Dx
FFPE QC Kit в составе:
Смесь для количественной ПЦР (qPCR Master Mix) - 2 пробирки (I мл/пробирка).
Праймеры контрольные для проверки качества (QC Primers) - 4 пробирки (75 мкл/пробирка).
Регистрационное удостоверение
№
________от_________г.
Условия хранения, номер партии, срок годности и графические символы см. на оригинальной упаковке.
Только для диагностики ин витро.
Для профессионального применения.
Производитель:
«Иллюмина, Инк.», США, (lllumina, Inc.)
5200 lllumina Way, San Diego, California 92122, USA
Уполномоченный представитель производителя:
ООО «Р-Фарм Интернешнл»
Россия, 123154, г. Москва, ул. Берзарина, д. 19, корпус I, этаж 1, помещение V, комната 9
Телефон: +7 (495) 956-79-37, Факс: +7 (495) 956-79-38
e-mail: info@irohann.ru
* Итоговая версия маркировки может быть изменена по решению производителя
--- стр. 106 ---
Список определений символов приведен ниже:
--- стр. 108 ---
i
s Для предотвращения контаминации реагентов, инструментов и образцов геномной
ДНК продуктами ПЦР, необходимо соблюдать нормы надлежащей лабораторной
практики и надлежащей лабораторной гигиены. Контаминация при проведении ПЦР
может привести к неточным и ненадежным результатам.
') Для предотвращения контаминации убедитесь, что в зонах для пре- и
постамплификации имеется специальное оборудование (в т.ч. пипетки, наконечники
для пипеток, вихревая мещалка и центрифуга).
И) Избегайте кросс-контаминации. Для каждого образца и добавления каждого реагента
используйте новые наконечники для дозаторов. Перемещайте образцы
пипетированием и отцентрифугируйте планщет, если это указано. Не встряхивайте
планщеты на вихревой мещалке. Использование наконечников с аэрозольным
фильтром снижает риск переноса ампликона и кросс-контаминации образцов.
11 Количественные методы зависят от точности методов пипетирования. Не используйте
пипетки на предельных значениях их объема. Убедитесь в том, что пипетки
откалиброваны.
12 При индексировании образцов следуйте напечатанной схеме планщета. Local Run
Manager автоматически вносит информацию об индексных праймерах, связанных с
наименованиями образцов при внесении в модуль. Пользователю рекомендуется
перед началом прогона проверить индексные праймеры относительно каждого
образца. Несоответствие между списком образцов и схемой планщета приводит к
потере правильной идентификации образца и получению неправильных результатов.
13 Для этапов промывки всегда готовьте свежий 80% раствор этанола. Этанол может
поглощать воду из воздуха, что влияет на результаты.
14 Убедитесь, что весь этанол удален со дна лунок во время промывок. Остаток
этанола может повлиять на результаты.
13 Придерживайтесь указанного времени сущки после этапа работы с магнитным
щтативом, чтобы обеспечить полное испарение. Остаточный этанол может повлиять
на проведение последующих реакций.
16 Не смещивайте пользовательский набор олигонуклеотидов и буфер для гибридизации
при хранении. После смещивания пользовательский набор олигонуклеотидов
етановится нестабильным, даже если хранится в замороженном виде.
17 Использование термоциклеров с активным охлаждением (например, Peltier с
термоэлектрическим охлаждением) для этапа гибридизации не рекомендуется. Для
надлежащей гибридизации этап пассивного охлаждения является ключевым.
18 Всегда добавляйте ПЦР-полимеразу в смесь для ПЦР непосредственно перед
использованием. Готовый рабочий раствор не подлежит хранению.
19 На этапе нормализации библиотек крайне важно полностью ресуспендировать осадок
гранул. Это важно для достижения стабильной плотности кластеров в проточной
ячейке при секвенировании.
20 Придерживайтесь указанного времени инкубации на этапе нормализации библиотек.
Неправильная инкубация может повлиять на представленность библиотеки и
плотность кластеров.
21 В связи с больншм числом переносов материала из планщета в планщет и связанной
с этой возможностью контаминации следует соблюдать крайнюю осторожность,
чтобы содержимое лунки полностью оставалось в лунке. Не разбрызгивайте
содержимое.
17. Описание испытаний с использованием лабораторных животных с целью
подтверждения правильноети концепции готового медицинского изделия
Не применимо.
--- стр. 109 ---
<
18. Перечень материалов человеческого и (или) животного происхождения вместе с
информацией об их биологической совместимости и безопасности, выборе источника
(донора), заборе, обработке хранении подобных материалов и о правилах обращения
с ними
Не применимо. Примечание! ДНК, которая содержится в составе некоторых компонентов,
не была выделена из животного или человеческого материала.
19. Ссылки на предыдущие версии медицинского изделия или на версии похожих
медииинских изделий, которые находятся в обороте, если информация о похожих или
предыдущих версиях медицинского изделия включена в техническую документацию
с целью подтверждения соответствия медицинского изделия требованиям по
безопасности и эффективности
Не применимо.
20. Информация из Государственного реестра лекарственных
медипинского применения, входящих в состав медицинского изделия
Не применимо.
средств для
21. Описание метода стерилизации, методов валидаини стерилизации (включая тесты
на биологическую нагрузку, пирогенные вещества и остаточное количество
стерилизующих веществ) и методов валидации упаковки (если медипинское изделие
поставляется в стерильном состоянии)
Не содержит компонентов, которые должны быть стерилизованы.
22. Информация о проектировании, разработке и валидации программного
обеспечения, готовом используется в готовом медицинском изделии (если
медицинское изделие используется с программным обеспечением, которое
обеспечивает его корректную работу и (или) предусмотренное применение)
Не применимо.
23. Требования к техническому обслуживанию и ремонту медицинского изделия
Не применимо.
24. Процедура утилизации или разрущения медицинского изделия
Отходы следует утилизировать как эпидемиологически опасные (класс Б) с соблюдением
установленных лабораторных правил, а также местных и государственных регламентов.
25. Экологические требования к применению медицинского изделия
При правильном применении, транспортировке, хранении, утилизации данное медицинское
изделие не представляет угрозы для окружающей среды.
Характеристики Значение
Предел обнаружения [LoD]* не менее 5%
Предел холостой пробы [LoB]* не менее 2,6%
Рабочие хацактецистики протокола для герминальных вариантов
Выделение ДНК
(Точность)
100%
J
--- стр. 110 ---
А налит ическая
чувст вит ельност ь
(Ддиапазон количества
вносимой ДНК) _______
Рекомендуемое количество ДНК составляет 50 иг.
Диапазон количества вносимой ДНК:
не менее 25 нг и не более 100 нг.
Оби ее Концентрация Концентрация у
в крови в крови ^ч и гп о ^ ^ определения(Нижнии ^ вариантапредел)
А налит ическая специф ичност ь
(Влияющие вещества) ,, Общее ^Исследуемое в крови•' число ^вещество (Верхнийповторов предел)
Билирубин 16 681 мкмоль/л 137 мкмоль/л 100%
Холестерин 16 13 мкмоль/л 2,6 мкмоль/л 100%
Г емоглобин 16 2 г/л 0.4 г/л 100%
Триглицериды 16 37 мкмоль/л 7.4 мкмоль/л 100%
ЭДТА 16 7 мг/мл 2.8 мг/мл 100%
Ни одно из потенциально интерферирующих веществ не
влияет на рабочие характеристики набора реагентов.
Б олее подробн о см. инф орм ацию ниж е в р а зд ел е
«Влияю щ ие вещ ест ва». _____________________________
Рабочие характеристики протокола для соматических вариантов
А налит ическая
чувст вит ельност ь
(Диапазон количества вносимой
ДНК (Диапазон dCq))
Рабочий диапазон
Верхний предел ACq = 2
Нижний предел ACq = 4
Допустимый диапазон (с учетом разбавления)
Верхний предел ACq = -1,5
Нижний предел ACq = 4_______________________
Выделение ДНК
(Точность)_____
РРА -100 %
NPA- 100%
А налит ическая специф ичност ь
(Влияющие вещества)
Экзогенные вещества:
Влияющее вещество Фактическое количество
[мкл/25 мкл элюата]
Депарафинизирующий
раствор
1,69 X Ю "'*
Парафиновый воск (в
ксилене)
2,50 X Ю-05
Ксилен 2,50 X Ю-05
Этанол 1,69 X 10 °^
Протеиназа К' 3,30 X 10-°^
Промывочный раствор^ 6,25 X Ю-о'
IX промывочный
раствор^
6,25 X 10-«'
Промывочный буфер
AW1'
6,25 X 10-“
Промывочный буфер
AW2'
6,25 X 10-“
'■^Три представленных на рынке набора для колоночного
метода выделения ДНК.
Ни одно из потенциально влияющих на результаты
веществ, оцениваемых в максимальных концентрациях в
процессе выделения геномной ДНК (гДНК) из ткани FFPE,
не влияет на рабочие характеристики набора реагентов.
--- стр. 111 ---
Эндогенные вещества (гемоглобин)
Присутствие или в отсутствие 2 мг/мл гемоглобина,
который определен по классификации CLSI как высокий
уровень не влияет на рабочие характеристики набора
реагентов.
Эндогенные вещества (при некрозе тканей)
Рабочие характеристики набора реагентов соответствуют
заявленным при некротизации ткани 10-80%.
А
* данные характеристики зависят также от используемых пользователем олигонуклеотидов.
Набор реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx:
Рабочие характеристики - Исследования герминальных вариантов с использованием
набора реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx:
В исследовании герминальных вариантов для приготовления библиотек используют набор
реагентов MiSeqDx Universal Kit 1.0 (выделение ДНК и удаление посторонних веществ)
или набор реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx (количество вносимой ДНК). В двух
наборах используются идентичные реагенты, и имеется только одно различие в протоколе:
количество циклов полимеразной цепной реакции (ПЦР) (28 и 32, соответственно).
Увеличение числа циклов ПЦР позволяет снизить количество вносимой ДНК при работе с
набором реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx (50 нг) по сравнению с набором
реагентов MiSeqDx Universal Kit 1,0 (250 нг), как продемонстрировано в исследовании
количества вносимой ДНК с использованием набора реагентов TruSeq™ Custom Amplicon
Kit Dx. В каждом исследовании указаны используемые для приготовления библиотеки
реагенты и раеходные материалы для секвенирования, но все исследования отражают
рабочие характеристики набора реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx в связи с
эквивалентностью с набором реагентов Universal Kit 1.0.
В исследованиях соматичееких вариантов использовали набор реагентов TruSeq™ Custom
Amplicon Kit Dx.
Для библиотек, приготовленных с использованием набора реагентов MiSeqDx Universal Kit
1.0, рабочие характеристики определяли с использованием расходных материалов для
секвенирования компании Иллюмина (Illumina) версии 1, а для приготовленных с
использованием набора реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx - расходные материалы
для секвенирования версии 3. Секвенирование проводили на приборах MiSeqDx. В
исследованиях с использованием панелей из двух или одного гена в качестве
репрезентативных панелей мутаций использовали специфичные для анализа протоколы и
модули для анализа.
Определения, используемые при расчетах рабочих характеристик
1 Процент согласия положительных результатов (РРА) рассчитывается как доля локусов,
классифицированных референтным методом как варианты, правильно выявленные при
анализе.
- (количество вариантов локусов, правильно выявленных при анализе)/(общее
количество вариантов локусов)
Вариант локуса, выявленный при анализе, соответствует выявленному референтным
методом, является истинно положительным (ТР).
Вариантные локусы, выявленные при анализе как референтные или как другие
варианты, являются ложноотрицательными (FN).
2 Процент согласия отрицательных результатов (NPA) рассчитывается как доля локусов,
классифицированных референтным методом как локусы дикого типа, правильно
выявленных при анализе.
--- стр. 112 ---
- (количество локусов дикого типа, правильно выявленных методом)/(общее
количество локусов дикого типа)
Локусы дикого типа, выявленные при анализе, совпадающие с выявленными
референтным методом, являются истинно отрицательными (TN).
Локусы дикого типа, выявленные при анализе как варианты, являются
ложноположительными (FP).
Процент общего согласия (overall percent agreement - OP А) рассчитывается как доля
локусов, правильно выявленных при анализе относительно референтного метода.
- ((количество вариантов локусов, правильно выявленных при анализе) + (количество
локусов дикого типа, правильно выявленных при анализе))/((общее количество
вариантов локусов) + (общее количество локусов дикого тина))
Расчеты РРА, NPA и ОРА не включают в себя нераспознанные основания (вариант или
референтные локусы, не прошедшие один или несколько фильтров качества). В два
исследования специально включали нераспознанные варианты в категорию «%
правильно распознанных», это указано в соответствующих таблицах.
Уровень распознанных вариантов рассчитывается как общее число локусов, прошедших
фильтр, деленное на общее число секвенированных или выявленных позиций. Этот
показатель не учитывает соответствия с референтным методом.
Контаминация
Протоколы для герминальных и соматических вариантов включают в себя приготовление
библиотек и секвенирование нескольких образцов и контролем одновременно. Изучение
процесса контаминации провели для оценки влияния переноса образцов на получение
ложноположительных результатов, имеется в виду перенос материала (контаминация) из
лунки в лунку во время подготовки библиотек или из прогона в прогон между
последовательными прогонами секвенирования. Использовали соматические варианты, так
как они могут быть обнаружены при более низких частотах аллелей, чем герминальные
варианты.
Образцы состояли из 4 образцов геномной ДНК, выделенной из клеточных линий, каждая
из которых содержала различные мутации в панели из двух генов. Образцы были отобраны
таким образом, чтобы в конкретной позиции в одном образце была мутация, а в другом
образце эта позиция была бы референсной (дикого типа).
Перенос из лунки в лунку определяется как неправильный, потенциально вызванный
ошибками при работе в ручном режиме (пипетирование, смешивание образцов и т.д.). Для
оценки переноса из одной лунки в другую были проведены 2 испытательных прогона:
- Схема в шахматном порядке при добавлении большого количества образца
геномной ДНК, содержащего мутацию в гене 1, при чередовании с добавлением
малого количества образца геномной ДНК, содержащего мутацию в гене 2.
- Схема в шахматном порядке при добавлении большого количества образца
геномной ДНК, содержащего мутацию в гене 2, при чередовании с добавлением
малого количества образца геномной ДНК, содержащего мутацию в гене 1.
В каждом прогоне в отношении ложноположительных результатов оценивали в общей
сложности 12 повторов (т.е. мутация гена 1 была зарегистрирована в лунке, обозначенной
как образец с мутацией в гене 2, или наоборот).
Перенос из прогона в прогон определяется как неправильный, потенциально вызванный
остатком материала от предыдущего прогона секвенирования. Для оценки контаминации
между прогонами секвенирования приготовили 2 плашки, каждая из которых содержала 11
копий уникального образца с большим количеством вносимой геномной ДНК и чистый
образец, их последовательно секвенировали на одном приборе MiSeqDx, далее оценивали
ложноположительные результаты. Первый прогон содержал 11 копий образца с мутацией
в гене 2 и 1 чистый образец. Второй прогон содержал 11 копий образца с мутацией в гене 1
--- стр. 113 ---
и 1 чистый образец. Сначала секвенировали библиотеку образца с мутацией в гене 2, затем
- библиотеку образца е мутацией в гене 1, а затем - снова библиотеку образца е мутацией в
гене 2. Наличие мутаций гена 2 в прогоне с образцами с мутацией гена 1 и наоборот
свидетельствует о контаминации.
Число ложноположительных (0/24, 0 %) результатов в связи с кросс-контаминацией при
переносе образцов из лунки в лунку равнялось нулю. Все ожидаемые мутации были
обнаружены. Число ложноположительных (0/24, 0 %) результатов в связи с кросс
контаминацией в связи с ост ат кам и м а т ер и а т п реды дущ его п рогон а равнялось нулю. Все
ожидаемые мутации были обнаружены. Чиело ложноположительных (0/48, 0 %)
результатов в связи с кросс-контаминацией в целом (переное из лунки в лунку и из прогона
в прогон) равнялось нулю.
Рабочие характеристики протокола для герминальных вариантов:
В исследовании количества вносимой ДНК использовали панель из 23 хромосом в качестве
репрезентативной панели мутаций. В других исследованиях в качестве репрезентативной
панели мутаций использовали панель из одного гена.
Выделение ДНК:
Оценивали три различных метода выделения (с помощью магнитных микрочастиц,
осаждения спиртом и на колонке е силикагелем) из цельной крови с добавлением КгЕОТА.
Библиотеки готовили с использованием набора реагентов MiSeqDx Universal Kit 1.0. В
исследовании использовали 14 уникальных образцов крови, представляющих ряд
генотипов для панели одного гена. Три метода выделения ДНК независимо тестировали два
разных оператора, каждый из которых выполнил 3 прогона секвенирования для каждого
метода выделения. Каждое выделение проводилось каждым оператором в разные дни.
Концентрацию ДНК и отношение А260/А280 в выделенных образцах гДНК определяли
спектрофотометрически. Общее количество образцов для каждого метода выделения в этом
иселедовании еоставило 168 (14 образцов х 2 оператора/метод выделения х 3
прогона/оператор х 2 повторности/образец выделенной гДНК). Результаты каждого метода
приведены в таблице: Точность, уровень определения вариантов и уровень
прохождения образцом протокола.
--- стр. 114 ---
Таблица: Точность, уровень определения вариантов и уровень прохождения образном
протокола
Метод выделения Число исследованных
образцов
Уровень
определения
вариантов
Точность' Уровень прохождения
образцом протокола^
Преципитация этанолом 168 100% 100% 100%
Выделение с
использованием колонки
для фильтрации
(силикагель)
168 100% 100% 100%
Выделение с помощью
магнитных гранул 168 100% 100% 100%
'Точность - процент соотношения с референтным методом тестирования (двунаправленное секвенирование
по Сэнгеру), рассчитанная для тех позиций, основания в которых определены.
^Уровень прохождения образцом протокола - число образцов, которые соответствуют указанному уровню
определения варианта при первом анализе (т.е. без необходимости повторного прогона или дополнительной
обработки) в процентах от общего числа образцов за один прогон секвенирования на Генетическом
секвенаторе MiSeqDx.
Количество вносимой ДНК:
Диапазон количества вносимой ДНК для приготовления библиотек (набор реагентов
TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx) оценивали в исследовании серийных разведений 13
образцов ДНК при репрезентативном анализе, направленном на множество генов с охватом
12 588 оснований в 23 различных хромосомах. Для исследования использовали набор
реагентов MiSeqDx v3 (MiSeqDx Reagent Kit v3.) для секвенирования нуклеиновых кислот.
Все образцы тестировали в двух повторностях при пяти уровнях вносимой ДНК в диапазоне
от 250 до 12 нг (250 нг, 100 нг, 50 нг, 25 нг и 12 нг). Для определения точности генотипы
образцов сравнивали с данными в Platinum Genomes версии 2016-01.
Результаты определяли для каждого количества вносимой ДНК. Значения РРА для каждого
типа вариантов (делеции, инсерции и SNV). Точность при всех количествах ДНК была
одинаковой. Рекомендуемое количество ДНК составляет 50 нг, 25 нг и 100 нг - это
соответственно нижний и верхний пределы, обеспечиваюгцие соответствие заявленной
точности. Значения РРА для каждого для каждого количества вносимой ДНК приведены
ниже в таблице: Результаты определения РРА для каждого количества внесенной ДНК
по типу вариантов.
--- стр. 115 ---
Результаты определения РРА для каждого количества внесенной ДНК по типу
вариантов
ДНК (нг) Тип варианта Ожидаемые
варианты Всего ТР Всего FN Нераспознанные
варианты РРА (%)
12 Деления 552 534 3 15 99,4
25 541 0 11 100
50 542 0 10 100
100 542 0 10 100
250 542 0 10 100
12 Инсерция 588 569 0 19 100
25 572 0 16 100
50 572 0 16 100
100 572 0 16 100
250 572 0 16 100
12 SNV 1752 1725 2 25 99,9
25 1739 3 10 99,8
50 1742 0 10 100
100 1740 0 12 100
250 1735 0 17 100
NPA для каждого количества вносимой ДНК ниже в
Таблица: Количество вносимой ДНК
таблице: Количество вносимой ДНК.
ДНК (нг) Ожидаемые
варианты TN FP
Реф. число
нераспознанных
оснований
NPA (%)
12 2892 307179 0 3935 100
25 2892 309767 0 1347 100
50 2892 309999 0 1115 100
100 2892 309754 0 1360 100
250 2892 308922 0 2192 100
Влияющие вещества:
Для оценки влияния посторонних веществ на процесс получения библиотеки выполнили
анализ одного гена с охватом 11 529 оснований с и без добавления посторонних веществ,
потенциально мешающих проведению анализа. Библиотеки готовили с использованием
набора реагентов Universal Kit 1.0. В исследовании включили 8 образнов цельной крови,
представляющих 8 уникальных генотипов. Четыре эндогенных вещества (билирубин,
холестерин, гемоглобин и триглицериды) тестировали путем добавления их в образцы
крови перед выделением ДНК. Для оценки потенциальных помех, возникающих при заборе
крови, в образцы крови добавляли ЭДТА в 2 концентрациях. Диапазоны концентраций всех
веществ приведены в таблице: Уровень определения вариантов для каищого
--- стр. 116 ---
исследуемого вещества. Кроме того, для оценки проблем, возникающих в результате
приготовления образца, к 8 очищенным геномным ДНК добавляли 15% промывочного
буфера. Иепользовали панель для одного гена. Для веех тестируемых образцов были
достигнуты 100% уровень определения варианта и 100% его воспроизводимость при
анализе образцов с или без добавления посторонних веществ.
Таблица: Уровень определения вариантов для каждого исследуемого вещества
Исследуемое
вещество Общее число повторов Концентрация в крови
(Верхний предел)
Концентрация в крови
(Нижний предел)
Уровень
определения
варианта
Билирубин 16 681 мкмоль/л 137 мкмоль/л 100%
Холестерин 16 13 мкмоль/л 2,6 мкмоль/л 100%
Г емоглобин 16 2 г/л 0,4 г/л 100%
Триглицериды 16 37 мкмоль/л 7.4 мкмоль/л 100%
ЭДТА 16 7 мг/мл 2.8 мг/мл 100%
Рабочие характеристики протокола для соматических вариантов:
В исследовании количества вносимой ДНК использовали панель из 26 генов в качестве
репрезентативной панели мутаций. В других исследованиях в качестве репрезентативной
панели мутаций использовали панель из 2 генов.
Количество вносимой ДНК:
Для оценки образцов ДНК, вьщеленных из образцов FFPE девяти различных тканей,
использовали набор реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Dx - FFPE QC. Для каждого
образца измеряли значение Cq и сравнивали с контролем для вычисления значений ACq,
которые варьировались в диапазоне от -1,2 до 6,4. Образцы разводили 1:8, 1:4, 1:2 или
работали без разведения в соответствии с инструкциями набора. Некоторые образцы были
разведены дополнительно (до 1:64) для повыгнения значений ACq. Два образца, для
которых значения ACq определялись как для разведения 1:8, также не разводились для
исследования количества, превыгнающего рекомендуемое. Все разведения проводили по
протоколу приготовления библиотек и секвенировали. Определение вариантов при
использовании модуля для соматических вариантов сравнивали с результатами
двунаправленного секвенирования по Сэнгеру, проводимого для определенных генов, в
зависимости от типа ткани. Разведения группировали в один из четырех диапазонов ACq и
анализировали в отнощении точности и уровня не определенных вариантов (таблица:
Точность и не определенные варианты по группам ACq). Верхний предел ACq составил
2, что было достигнуто путем серийных разведений образцов с ACq <2 в соответствии с
инструкциями набора. Нижний предел - ACq = 4. Для значений ACq от 2 до 4 точность
одинакова. Для методов, использующих ACq при анализе образцов FFPE, следует
определить необходимую отсечку для достижения желаемой достоверности и точности.
--- стр. 117 ---
груипа ACq Варианты Позиции дикого типа
Ожидаемое
значение
ТР FN Варианты
не
определены
РРА TN FP Варианты
не
определены
NPA
ACqs-1,2 и-0,8 1 1 0 0 100 1387 1 0 99,9
ACqs 1,5-4 19 18 0 1 100 14358 1 78 99,9
ACqs~4 19 18 0 1 1 100 14333 1 103 99,9
ACqs ~5 22 20 90,9 15878 439 99,9
Выделение ДНК:
Для выделения ДНК и определения влияния на эффективноеть приготовления библиотек
иеследовали 3 коммерческих набора. Наборы, основанные на колоночном методе
выделения, включены реагенты для депарафинизации и для реверсии поперечных сшивок,
образуюш,ихся при применении формалина и специфичных для тканей FFPE. Методы были
модифицированы путем удвоения количества протеиназы К, используемой для одного
образца и увеличения времени инкубации (в течение ночи) с перемешиванием. ДНК
элюировали в меньшем объеме, чем рекомендованный в инструкции для набора или как
минимумЗО мкл. Для исследования каждого набора использовали 10 образцов в двух
повторностях. Все образцы (20/20) соответствовали спецификациям контроля качества
метода. Анализ проводили с использованием панели для двух генов. Для каждого набора
значение РРА составляло 100 % (16/16), NPA - 100 % (1104/1104). В качестве референсного
метода использовали секвенирование по Сэнгеру.
Влияющие вещества:
Для оценки влияния веществ, которые потенциально могут изменить результат и
эффективность процесса приготовления библиотек провели исследование. Рабочие
характеристики анализа оценивали в присутствии экзогенных веществ (парафиновый воск,
ксилол, этанол и протеиназа К, растворы для экстракции), а также эндогенных веществ
(некротизированная ткань и гемоглобин).
Экзогенные вещества:
Испытуемые экзогенные вещества представляют собой компоненты набора для выделения,
их названия и тестированное количество приведены в таблице: Исследуемые вещества.
Для каждого вещества тестировали 15 образцов FFPE ткани колоректальной опухоли,
результаты сравнивали с контролями без добавления веществ. Образцы были представлены
образцами дикого типа, не содержащими мутаций гена 1 (5/15 образцов), а также образцами
с мутациями (10/15 образцов). Образцы секвенировали при максимальном уровне
мультиплексирования: 10 образцов плюс контроли на прогон.
--- стр. 118 ---
Влияющее вещество Фактическое количество [мкл/25 мкл элюата]
Депарафинизирующий раствор 1,69 X 10 ““*
Парафиновый воск (в ксилене) 250х 10-°5
Ксилен 250 X 10-“
Этанол 1,69 X 10'“
Протеиназа К' 3,30 X 10-“
Промывочный раствор' 6,25 X 10-°'
IX промывочный раствор^ 6,25 X 10-°'
Промывочный буфер AW1 ’ 6,25 X 10-°^^
Промывочный буфер AW2' 6,25 X 10-°'
4 '■-’1'ри представленных на рЕлнке набора для колоночного метола выделения ДНК.
Для всех экзогенных веществ все 15 образцов соответствовали заявленным требованиям
(15/15, 100% уровень прохождения контроля качества) и показали валидный результат
после секвенирования библиотек (15/15, 100% уровень прохождения образцом протокола).
РРА рассчитывали для каждого образца. ОРА и NPA рассчитывали на одно основание
мутаций; число мутаций на образец составило 56. Все 15 образцов для всех 9 экзогенных
веществ показали соответствие результатов с контрольными условиями (без добавления
вещества) для всех позиций с мутациями (10/10) и без мутаций (830/830). Ни одно из
потенциально влияющих на результаты веществ, оцениваемых в максимальных
концентрациях в процессе выделения геномной ДНК (гДНК) из ткани FFPE, не влияет на
рабочие характеристики набора реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx.
Эндогенные вещества (гемоглобин):
Пятнадцать (15) образцов FFPE ткани из колоректальной опухоли тестировали в
присутствии или в отсутствие 2 мг/мл гемоглобина, который определен по классификации
CLSI как высокий уровень. Образцы включали образцы дикого типа, не содержащие
мутаций (5/15 образцов), а также образцы с наличием мутаций репрезентативной панели
(10/15 образцов). Образцы секвенировали при максимальном уровне мультиплексирования:
10 образцов плюс контроли на прогон. Все 15 образцов соответствовали заявленным
требованиям (15/15, 100% уровень прохождения контроля качества) и показали валидный
результат после секвенирования библиотек (15/15, 100% уровень прохождения образцом
протокола). Все 15 образцов показали соответствие с контрольными условиями (без
добавления вещества) для всех позиций с мутациями (10/10) и без мутаций (830/830).
Еемоглобин в тестированной концентрации не влияет на рабочие характеристики набора
реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx.
Эндогенные вещества (при некрозе тканей):
Для оценки влияния некротизированных тканей использовали 15 образцов FFPE ткани
колоректальной опухоли, которые были представлены образцами дикого типа без мутаций
репрезентативной панели (10/15 образцов), а также образцами с мутациями
репрезентативной панели (5/15 образцов), и некротизированные ткани, согласно
патологической оценке некроз составлял 10-80 %. Образцы секвенировали при
--- стр. 119 ---
4
максимальном уровне мультиплексирования: 10 образцов плюс контроли на прогон. 14/15
образцов показали валидный результат поеле секвенирования библиотек (уровень
прохождения образцом протокола с первого раза - 93,3%)- Процент обгцего соответствия с
секвенированием по Сэнгеру составил 99,9% (783/784). Значение РРА составляло 100 %
(4/4)^ NPA - 99,87 % (779/780). Обнаружен 1 ложноположительный результат, вероятно, в
связи с тем, что частота мутации в образце ниже предела обнаружения секвенирования по
Сэнгеру. В целом рабочие характеристики набора реагентов TruSeq™ Custom Amplieon Kit
Dx соответствуют заявленным при некротизации ткани 10-80%.
Набор реагентов TruSeg^'^ Custom Amplieon Dx FFPE QC Kit:
Рабочие характеристики:
В таблице: Значения Cq ДНК для контроля качества, полученной от поставщиков или
выделенной из крови приведены значения Cq для гДНК в концентрации 0,25 нг/мкл от
пяти коммерчееких поставщиков (В, С, Р, R и Т) или выделенных из образца цельной крови.
Для сравнения приведены результаты для референтного материала, NIST, в той же
концентрации. Значения Cq получены тремя незавиеимыми операторами при
использовании трех независимых платформ для кПЦР (А, В, S). Результаты показывают
среднее ± стандартное отклонение. При иепользовании прибора В значения Cq были
етабильно выше, чем при использовании приборов А и S; значения dCq образцов при
нормализации с помощью ДНК для контроля качества при использовании различных
приборов были сходными (данные не показаны).
Таблица: Значения Cq ДНК для контроля качества, полученной от поставщиков или
Прибор для
кПЦР
NIST Мужчина Поставщик
2372 в Поставщик С Поставщик Р Поставщик R Поставщик Т Выделено
Прибор А 18,87+/- 0,07 19,14+/-
0,14
18,79+/-
0,13
19,11 +/-
0,17
19,07 +У-
0,12
19,03 +/-
0,17
18,78 +/-0,07
Прибор В 20,47 +/- 0,09 20,75 +/-
0,12
20,43 +/-
0,12
20,71 +/-
0,19
20,71 +У-
0,06
20,69 +/-
0,15
20,46 +/- 0,09
Прибор S 19,06 +/- 0,10 19,39+/-
0,13
18,99 +/-
0,14
19,29 +/-
0,16
19,31 +У-
0,10
19,24 +/-
0,15
19,08+/- 0,16
Ниже представлена выдержка из отчета.
Исследование по верификации предела холостой пробы (LOB) и предела обнаружения
(LOD) генетического секвенатора MiSeqDx для образцов типа FFPE, TruSeq^’ '* Custom
Amplieon Dx FFPE.
Цель данного исследования заключалась в том, чтобы оценить, действительно ли
параметры системы MiSeqDx соответствуют проектному заданию в отношении предела
обнаружения (LoD) и предела холостой пробы (LoB) для соматических вариантов при
использовании ДНК, выделенной из фиксированных формалином и залитых в парафин
(FFPE) образцов.
Это исследование имело две задачи:
• Основная задача: определить LoB и LoD системы MiSeqDx System с помощью
набора TruSeqT’'^ Custom Amplieon Kit Dx для FFPE-образцов.
• Дополнительная задача: оценить РРА для набора реагентов TruSeq^'^ Custom
Amplieon Kit Dx около предела обнаружения.
--- стр. 120 ---
Заключение/резюме исследования:
Цель данного исследования заключалаеь в том, чтобы определить предел холоетой пробы
(LoB) и предел обнаружения (LoD) на открытой платформе MiSeqDx для FFPE-образцов
ДНК. Согласно руководству, ЕР17-А2 два образца ДНК (GM12878-D и GM12877)
тестировали два оператора, которые использовали два инструмента и реагенты из двух
партий в ходе в общей сложности десяти (10) циклов секвенирования генетического
секвенатора MiSeqDx. В результате этого было получено 40 повторностей для каждого
варианта в GM12878-D и 60 повторностей для каждой из еоответствующих координат
дикого типа в GM12877 для каждой из партий реагентов. Семьдееят геномных координат
(52 SNV, 9 инеерций и 9 делеций) анализировали на предмет ЕоВ и LoD. В данном
иселедовании каждый вариант принимали за независимый образец; поэтому ЕоВ для
каждой партии реагентов раесчитывали в 3120 повторноетях для SNV, 540 повторноетях
для инеерций и 540 повторностях для делеций. LoD для каждой партии реагентов
расечитывали в 2080 повторностях для SNV, 360 повторностях для инеерций и 360
повторноетях для делеций. Операторы 1 и 2 готовили библиотеки е помощью реагентов из
партий 1 и 2 еоответетвенно. Затем каждый оператор провел пять циклов секвенирования с
помощью двух инетрументов.
Результаты этого иеследования показали, что величины ЕоВ и LoD для набора реагентов
TruSeq™ Сц81ощ Amplieon Kit Dx в системе MiSeqDx еоответетвовали критериям
приемлемоети.
Расчетные значения ЕоВ для SNV, инеерций и делеций составляли 0,9 ^, 0,8 ^ и 1,0 А
соответственно при вероятности ошибки 1 типа в 1%. Как правило, критерий приемлемоети
не накладываетея на определенный ЕоВ. Однако у аналитичеекого модуля пороговое
значение обнаружения соетавляет 2,6%, что еоглаено ЕР17-А2 равноеильно ЕоВ. Для
такого эффективного ЕоВ вероятноеть ощибки 1 типа должна еоетавлять не более 1%, что
соответствует требованию, еоглаено которому NPA должно быть 99%. Величины ЕоВ,
определенные в ходе иселедования, были равны или меньще порогового значения в 2,6 /о .
Это говорит о том, что эффективное значение ЕоВ в 2,6% позволяет добиться частоты
возникновения ощибки I типа для SNV, инеерций и делеций менее, чем в 1 /о . Хотя по
результатам данного иселедования пороговые значения для программного обеепечения
можно опустить ниже, чем до ~1%, это потребует увеличения минимальной епецификации
глубины для тех раепознаваемых вариантов, которые находятся вблизи порогового
значения. Такое изменение может повлиять на количество образцов, которое можно
обработать в ходе одного цикла. Пороговое значение предетавляет еобой результат баланеа
между аналитичеекой чувствительностью и пропускной способностью обработки образцов.
Значения LoD раеечитывали с учетом порогового значения в 2,6%. Расчетные значения LoD
для SNV, инеерций и делеций составляли 5% при вероятности ощибки 1 типа в 5%. Более
того, минимальные значения РРА при использовании разных партий реагентов для SNV,
инеерций и делеций еоставляли 99,95%, 100% и 100% еоответетвенно.
Повторный анализ данных е помощью новых вереий программного обеспечения LRM and
Somatic Variant Module был проведен еоглаено протоколу повторного анализа. Volcano
--- стр. 121 ---
Germline и Somatic Variant Modules Reanalysis Protocol. Bee результаты оценивали на
предмет их соответствия критериям приемлемости. Все циклы были действительными, все
критерии приемлемости были соблюдены.
Результаты:
Исследование проводили два оператора в период с 28.06.2016 г. по 19.07.2016 г. Согласно
протоколу исследования, было проведено 10 прогонов на генетическом секвенаторе
MiSeqDx. Все десять прогонов были успешно проведены на соответствуюгцих генетических
секвенаторах MiSeqDx. В этом исследовании все десять прогонов были действительными и
повторно проводить прогоны секвенирования необходимости не было, как показано в
таблице: Спецификации показателей прогона, необходимые для признания прогона
секвенирования действительным.
Таблица: Спецификации показателей прогона, необходимые для признания прогона
секвенирования действительным
Критерии Спец. ПрогонПрогон Прогон Прогон Прогон ПрогонПрогонПрогонПрогон Прогон
1 2 3 456789 1 0
Показатель Q30 (при длине
рида 2x150 п.о.) > 80% 88 90 91 90 91 90 90 91 90 90
Кол-во миллионов Р И Д О В ,
прошедших фильтры >15 32 35 35 34 34 33 34 35 33 34
Выход секвенирования
(миллиардов нуклеотидов) >5 10 11 11 11 11 10 11 11 10 11
Результаты LoB:
Непараметрический анализ LoB проводили в соответствии с ЕР17-А2. Расчетные значения
LoB для SNV, инсерций и делеций составляли < 1% VF при вероятности ошибки I типа в
1%, как показано в таблице: Расчет LoB для каждой партии реагентов в зависимости
от типа варианта. Более того, ни в одном из измерений VF, результаты которых
использовались для расчета предел холостой пробы, значения не превышали предельное
значение VF в 2,6% (эффективный LoB), которое использовалось в программе Somatic
Variant Module, как показано в таблице: Расчет LoB для каждой партии реагентов в
зависимости от тина варианта.
Таблица: Расчет LoB для каждой партии реагентов в зависимости от типа варианта
Тип
варианта
Координаты,
которые
использовались
для анализа
Количество
повторностей на одну
координату
LoB, партия LoB, партия
реагентов 1 (®/о) реагентов 2 (%)
SNV 52 60 0,87 0,75
Инсерция 9 60 0,79 0,60
Делеция 9 60 0,96 0,84
--- стр. 122 ---
Результаты LoD:
Для каждой партии реагентов распределение VF в каждом типе варианта сравнивали с
пороговым значением 2,6%, чтобы определить возникновение ошибки II типа, как показано
в таблице: Процент LoD. Частота возникновения ошибки II типа была меньше допустимых
5%, поэтому непараметрический анализ LoD проводили в соответствии с EPI7-A2. Чтобы
определить LoD рассчитывали значение медианы каждого распределения, как показано в
таблице: Расчет LoD для каждой партии реагентов в зависимости от типа варианта.
Значение LoD для SNV, инсерций и делений составляло приблизительно 5% VF для обеих
испытуемых партий реагентов, как показано в таблице: Процент LoD.
Таблица: Процент LoD
Партия
реагента
Тип
варианта
Общее количество
измерений VF,
использованное для
расчета LoD
Кол-во измерений VF
<2,6% Ошибка II типа'
SNV 2080 4 0,2%
1 Инсерция 360 0 0,0%
Деления 360 2 0,6%
SNV 2080 26 1,3%
2 Инсерция 360 0 0,0%
Делеция 360 0 0,0%
' Тип ошибки 11 - это процент измерений VF которые ниже допустимых LoB мисиользуемых в модуле для соматических
вариантов. LoB используемый модулем для соматических вариантов Somatic Variant Module 2,6Уо VF.
Таблица: Расчет LoD для каждой партии реагентов в зависимости от типа варианта
Тип
варианта
Кол-во
координат,
которые
использовались
для анализа
Кол-во повт.
на один
вариант
LoD, партия
реагентов I (%
VF)
LoD, партия
реагентов 2 (%
VF)
SNV 52 40 5,45 5,44
Инсерции 9 40 4,86 4,88
Делеции 9 40 5,44 5,24
Результаты определения РРА:
Значения РРА для соматических SNV были больше 95% для всех испытуемых партий
реагентов, как показано в таблице: Критерии приемлемости и результаты определения
РРА для вариантов GM12878-D в диапазоне 3-7%. Следует добавить, что значения РРА
для соматических инсерций и делений были больше 85% для всех испытуемых партий
реагентов. Самая крупная инсерция в данном исследовании составляла 11 и.о. в длину.
Величина LoD для данной инсерции составляла 5%, как показано в таблице: Расчет LoB и
LoD по вариантам, при 100% РРА. Самая крупная деления в данном исследовании
составляла 25 н.о. в длину. Величина LoD для данной делении составляла 6%, как показано
в таблице: Расчет LoB и LoD по вариантам, при 100% РРА. Вторая по величине деления
--- стр. 123 ---
в данном исследовании составляла 20 п.о. в длину. Величина LoD для данной делеции
составляла 5% при 100% РРА.
Таблица: Критерии приемлемости и результаты определения РРА для вариантов
GM12878-D в диапазоне 3-7%
Образец Тип
варианта
Партия
реагента
КоЛ-80
повт.
Кол-во
вариантов
на одну
повторность
Ожидаемый
вариант ТР FN
Нераспозн
анные
BapMaHTbP
Общий
РРА {%)
SNV 52 2080 2065 0 15 100
Инсерция 1 40 9 360 360 0 0 100
GM12878 Делеция 9 360 358 0 2 100
-D SNV 52 2080 1958 1 121 >99,9
Инсерция 2 40 9 360 355 0 5 100
Делеция 9 360 355 0 5 100
^ Количество нераспознанных вариантов рассчитывали, вычитая из количества ожидаемых
вариантов количество истинно положительных вариантов (ТР) и количество ложноотрицательных
ваоиантов СРМТ
Индивидуальный расчет LoB и LoD:
Индивидуальные значения LoD для SNV варьировали от 3% до 7% VF, а значения LoB - от
0,3% до 1,1% VF, как показано в Таблице: Расчет LoB и LoD в завцсцмости от варцацта.
Кроме того, в этой же таблице приведена следующая информация:
Для инсерций индивидуальные значения LoD варьировались от 4% до 6% VF, а значения
LoB - от 0,3% до 0,9% VF.
Для делеций индивидуальные значения LoD варьировали от 4% до 6% VF, а значения LoB
- от 0,7% до 1,1% VF.
Самая крупная инсерция с LoD до 5% включительно была 11 п.о. в длину, а величина ее
LoD составляла 4% VF.Самая крупная деления с LoD до 5% включительно была 20 п.о. в
длину, а величина ее LoD составляла 5%
--- стр. 126 ---
Chr. Позиция Референсныи
аллель
Альтернативный
аллель
Геномный
контекст
ампликона
LoB LoD LoB LoD
Партия Партия Партия Партия
1 1 2 2
chr17 64023624 T C Poly T (7),
22% GC 0,70 5,78 0,68 5,67
chr18 2616457 G C GA(3) 0,43 4,72 0,44 5,07
chr18 59774037 C T 0,49 4,92 0,39 5,27
chr19 18121466 C T 68% GC 0,34 3,75 0,49 2,91
chr20 746098 G A 0,38 5,77 0,36 5,78
chr20 17705664 G A CT(3) 0,46 6,54 0,61 5,59
chr20 62331989 T G Poly G (6),
73% GC 0,99 4,88 0,95 4,40
chr21 46705621 G A Poly T (5),
Poly A (6) 1,13 5,13 0,82 5,41
chr22 32439274 C T 68% GC 0,46 5,42 0,43 5,92
chr22 37637653 G c Poly G (5) 0,35 5,60 0,36 5,39
chr1 236372081 C CTTAAG Инсерция 5
П.О. 0,35 5,15 0,36 5,03
chr1 247812083 C CATG Инсерция 3
п.о. 27% GC 0,65 5,68 0,55 5,82
chr2 55862804 T TTTGGTAA Инсерция 7
п.о. 0,82 4,46 0,67 4,99
chr2 235016388 A ATG Инсерция 2
п.о. 0,58 5,00 0,47 4,96
chr4 164446785 T TTATGGTA TTGA
Инсерция
11 п.о. 27%
GC
0,87 4,33 0,62 4,66
chr11 59837721 T TTATGAAA A Инсерция 8
п.о. 0,67 4,31 0,63 4,48
chr15 85438311 c CTTG Инсерция 3
п.о. 0,42 5,32 0,33 4,77
chr15 89864316 G GCTAC Инсерция 4
п.о. 0,38 5,54 0,34 5,34
chr21 30300873 G GATAAAAC TTTA Инсерция
11 по. 0,44 4,30 0,44 4,19
I
--- стр. 127 ---
chr1 109465165 ACTT A Делеция
3 П.О. 0,69 5,19 0 ,6 8 4,50
chr5 74077155 TAGTA T Делеция
4 п.о. 0,80 5,70 0,83 5,45
chr6 32986905
CTTTCACTTT
CCCGTCTCA
TGCAAAG
c Делеция
25 п.о. 1,03 5,90 1,07 4,88
chr10 5987158 TAAC T Делеция
3 п.о. 0 ,8 8 5,54 0,67 5,05
chr11 118406328 CAGTGTGGA c Делеция
8 п.о. 0,93 4,80 0,94 5,73
chr13 77665265
ATCTATTTTC
TAATAGACG
GC
A Делеция
2 0 п.о. 0,83 5,33 0 ,6 8 5,28
chr14 102808554 CGTGGA C Делеция
5 п о. 1,03 5,49 0,92 5,50
chr15 63446199 CAAAATT C
Делеция
6 п о.,
25% GC
0,82 5,54 0,74 5,26
chr20 21766863 TACTTGAGA
ACTGAGG T Делеция
15 п.о. 0,91 5,76 0,82 5,40
Сопоставление е критериями приемлемости:
Критерии валидности были указаны в протоколе по показателям прогона секвенирования.
Для расчета LoB и LoD использовали данные только из тех циклов, которые
соответствовали этим критериям, как показано в таблице: Расчет LoB для каждой партии
реагентов в завиеимоети от типа варианта и в таблице: Раечет LoD для каждой партии
реагентов в завиеимоети от типа варианта. Кроме того, значения РРА рассчитывали
только по данным, полученным в ходе действительных циклов секвенирования, как
показано в таблице: Критерии приемлемоети и результаты определения РРА для
вариантов GM12878-D в диапазоне 3-7%. Этим критериям соответствовали 10 прогонов,
поэтому не было необходимости повторять тестирование, как показано в таблице:
Спецификации показателей цикла, необходимые для признания цикла
секвенирования действительным.
27. Описание процедур измерения, методологической отслеживаемости величин
калибровки и контрольных материалов
Не применимо.
28. Информация по стабильности медицинского изделия.
Срок годности
Срок годности набора реагентов составляет 12 месяцев. Набор реагентов стабилен до
указанного на упаковке срока годности. Не используйте набор реагентов по истечению
срока годности.
--- стр. 128 ---
Стабильность открытой пробирки
Коробка Количество циклов
замораживания/оттаивания/
использования
Температура Относительная
влажность
Давление
Набор реагентов TruSeq™ Custom Amplicon Kit Dx
Коробка
lA
6 циклов
замораживания/оттаивания до
указанного срока годности
от -25°С до -
15°С
10% - 80%, без
конденсации
атмосферное
давление
Коробка
IB
6 циклов
замораживания/оттаивания до
указанного срока годности
от -25°С до -
15°С
10% - 80%, без
конденсации
атмоеферное
давление
Коробка
2
Для 2-кратного
использования
Между использованиями на
пробирках с реагентами
следует повторно закрыть
крыгпку и вернуть на
исходную температуру
хранения.
от 15°С до
зо°с
10% - 80%, без
конденсации
атмосферное
давление
Коробка
ЗА
Для 2-кратного
использования
Между использованиями на
пробирках с реагентами
следует повторно закрыть
крышку и вернуть на
исходную температуру
хранения.
от 2°С до
8°С
10% - 80%, без
конденсации
атмосферное
давление
Коробка
ЗВ
Для 2-кратного
использования
Между использованиями на
пробирках с реагентами
следует повторно закрыть
крышку и вернуть на
исходную температуру
хранения.
от 2°С до
8°С
10% - 80%, без
конденсации
атмосферное
давление
Набор реагентов TruSeq^''* Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit
Коробка
1
6 циклов
замораживания/оттаивания до
указанного срока годности
от -25°С до -
15°С
10% - 80%, без
конденсации
атмосферное
давление
Условия хранения и обращения
Условия хранения и транспортировки:
1. Под комнатной понимается температура от 15°С до 30°С.
--- стр. 130 ---
очевидные изменения цвета или помутнение реагента при явном микробном
загрязнении), не следует их использовать.
6. Буфер для гибридизации (Hybridization Buffer), буфер для интенсивной отмывки
(Stringent Wash Buffer) и разбавитель для разведения библиотек при нормализации
(Library Normalization Diluent) могут образовывать видимый осадок или кристаллы.
Перед применением их следует интенсивно взболтать, а затем осмотреть, чтобы
убедиться в отсутствии осадка.
7. При обращении с Микрочастицами для очистки ПЦР-продуктов (PCR Clean-Up Beads)
и Микрочастицами для библиотеки (Library Beads) необходимо придерживаться
следующих рекомендованных способов:
— Микрочастицы никогда нельзя замораживать.
— Микрочастицы следует оставить, пока они не достигнут комнатной температуры.
— Непосредственно перед применением микрочастицы следует перемешать на
вортексе до образования однородной суспензии равномерного цвета.
— После добавления микрочастиц в образец его следует тщательно перемешать, десять
раз набрав в пипетку и обратно. Для тщательного перемешивания образцов можно
использовать шейкер.
— Смесь образца с микрочастицами следует инкубировать при комнатной температуре
на протяжении всего указанного в подобных случаях периода.
— При использовании магнитного штатива следует соблюдать инструкции. Перед
аепирацией необходимо подождать, пока раствор не станет прозрачным. Держа плашку
на магнитном штативе и медленно удаляя надосадок, будьте внимательны и не
затрагивайте сформировавшийся осадок микрочастиц.
8. Планшет для ПЦР-амплификации можно оставить в термоциклерена на всю ночь или
оставить его в условиях, варианты которых перечислены ниже. Перед тем, как оставить
планшет, его необходимо как следует запечатать.
— до двух дней при температуре от 2°С до 8°С
— до 1 недели при температуре от -25°С до -15°С
9. Микрочастицы для библиотеки (Library Beads) нельзя замораживать или смешивать с
разбавителем для разведения библиотек при нормализации (Library Normalization
Diluent), если смесь не будет использована сразу после этого.
10. Заполненный планшет для нормализации библиотек (LNP) можно оставить при
температуре от 2 до 8 °С до 3 часов или при температуре от -25°С до -15°С до 1 недели.
11. Планшет для хранения (SGP) можно хранить при температуре от -25°С до -15°С до 48
часов.
12. Разведенную библиотеку ампликона (DAL) можно хранить при температуре от -25°С до
-15°С до 84 дней.
13. Разведенный пул ампликонов необходимо загрузить в картридж реагентов немедленно
после денатурации.
--- стр. 131 ---
Условия транспортировки
Медицинское изделие транспортируют всеми видами транспорта, в крытых транспортных
средствах, при температуре хранения, указанной в инструкции по применению, в
соответствии с требованиями страны и правилами перевозки грузов, действующими для
каждого вида транспорта.
Стабильность при транспортировке - в течение 72 часов для реагентов с температурой
хранения 2 °С - 8 °С и -25 °С - -15 °С.
29. Гарантия
Производитель гарантирует стабильность медицинского изделия до истечения срока его
годности при соблюдении условий транспортировки, хранения и при условии применения
в соответствии с инструкциями. Производитель гарантирует безопасность медицинского
изделия, отсутствие неприемлемого уровня риска причинения вреда жизни и здоровью
человека, а также вреда окружающей среде при целевом использовании медицинского
изделия в условиях, оговоренных производителем.
30. Список национальных и международных регламентов/стандартов, которым
соответствует медицинское изделие
Номер/ редакция
стандарта Название
BSI BS EN ISO
14971:2012
Изделия медицинские. Применение менеджмента риска к
медицинским изделиям
BSI BS EN ISO
13485:2016
Изделия медицинские. Системы менеджмента качества. Требования
для целей регулирования
BSI BS EN ISO
18113-1:2011
Медицинские изделия для диагностики in vitro. Информация,
предоставляемая производителем (маркировка). Часть 1. Термины,
определения и общие требования
BSI BS EN ISO
18113-2:2011
Медицинские изделия для диагностики in vitro. Информация,
предоставляемая производителем (маркировка). Часть 2. Реагенты
для диагностики in vitro, предназначенные для профессионального
применения
BSI BS EN ISO
18113-3:2011
Медицинские изделия для диагностики in vitro. Информация,
предоставляемая производителем (маркировка). Часть 3.
Инструменты для диагностики in vitro, предназначенные для
профессионального применения
BSI BS EN
13612:2002
Лабораторная оценка технических характеристик медицинских
устройств
BSI BS EN
62366:2008
Аппаратура медицинская. Использование технологий по
применимости к медицинской аппаратуре
--- стр. 132 ---
Номер/ редакция
стандарта Название
BSI BS EN ISO
15223-1:2016
CORR:2017
Изделия медицинские. Символы, иепользуемые на ярлыках
медицинских изделий при их маркировке и в предоставляемой
информации. Часть 1. Общие требования
BSI BS EN ISO
23640:2015
Изделия медицинские для диагностики in vitro. Оценка стабильности
реагентов для диагноетики in vitro
31. Рекламации
В случае возникновения вопроеов по поводу обязательств по гарантии производителя
можно связаться с официальным представителем производителя в Российской Федерации:
ООО Р-Фарм Интернешнл (R-Pharm International LLC),
123154, Москва, ул. Берзарина, д. 19, етроение 1, 1-й этаж, помещение V, комната 9
www.r-pharm.com
Тел. +7 (495) 956-79-37
Факс +7 (495) 956-79-38
e-mail: info(^rpharm.ru
--- стр. 133 ---
illumina'
Набор реагентов для создания «библиотеки»
нуклеиновых кислот ИВД TruSeq тм Custom Amplicon
Kit Dx в вариантах исполнения
Дополнение к инструкции по применению
Производитель;
«Иллюмина, Инк.»
Адрес;
5200, Иллюмина Уэй, г. Сан-Диего, штат Калифорния, 92122, США (5200 Illumina Way
San Diego, California 92122, USA)
От имени «Иллюмина, Инк.» (Illumina, Inc.)
/Подпись/
Аурелия Браунридж (Aurelia Brownridge)
Старший специалист отдела по вопросам
нормативно-правового обеспечения
«Иллюмина, Инк.»
Дата 22 октября 2020 г.
/Штамп/. КАРА М. ДЕ ЛА КРУС (CARA М. DE LA CRUZ) * Нотариус, штат Калифорния
* Округ Сан-Диего * Лицензия №2333147* Срок действия моих полномочий истекает 3
сентября 2024 г. * VS11