Проточный цитофлюориметр MACSQuant, с принадлежностями — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 --- ч . \ «Проточный цитофлюориметр MACSQuant®» Инструкция по применению Мильтени Байотек ГмбХ Фридрих-Эберт Штрассе, 68 51429 Бергиш Гладбах, Германия Телефон: +49 2204 8306-0 Факс: +49 2204 85197 Электронная почта: macs@miltenvibiotec.de www.miltenvibiotec.com --- стр. 2 --- Анализатор M ACSQ uant® - инновационный инструмент для автоматизированного мультипараметрического клеточного анализа. --- стр. 3 --- 1 Важная информация Пожалуйста, прочитайте перед использованием! Пожалуйста, внимательно ознакомьтесь с информацией, содержащейся в данной инструкции пользователя. Незнание правил эксплуатации прибора и несоблюдение указаний может привести к ненадлежащему или неправильному использованию прибора, его неправильному обслуживанию или уходу, или причинить вред пользователю, привести к получению непредсказуемых результатов, к повреждению устройства или его преждевременному износу, что сократит срок его эксплуатации или приведет к прекращению гарантийного обслуживания. Храните данную инструкцию в надежном месте, доступном для каждого, кто эксплуатирует анализатор M ACSQ uant. В данной главе описаны инструкции по безопасности и требования к рабочему месту, на котором должен быть установлен анализатор M ACSQ uant. Следую щ ие предупреждения и предостережения сделаны для того, чтобы помочь Вам избежать травм и не повредить данное устройство при его эксплуатации. 1.1 Символы и уровни угрозы 1.1.1 Описание символов по безопасной эксплуатации Указания по безопасности предупреждают пользователя о возможных рисках в случае, если пользователь не будет следовать указанным ниже предупреждениям и предостережениям. Пиктограмма слева указывает, какому именно риску подвергается пользователь. 1.1.2 Символы Таблица - иллюстрированный словарь, отображающий символы, используемые в данной инструкции пользователя и на самом приборе M A C S Q uant ^ е д и т ю м Индикатор возможности возникновения опасной ситуации. Если не принять мер к ее предупреждению, возникает риск угрозы з д о р о в ь ю . ___________________________________ Индикатор возможности возникновения опасной ситуации, при которой возможна угроза здоровью. А Внимание, обратитесь к инструкции пользователя для дальнейш их указаний и в дальнейш ем действуйте осторожно. Предупреждения включают: риск повреждения оборудования, угроза здоровью. А Угроза механических повреждений. Лазерное излучение Магнитное поле Устройство содержит магнит. Магнит может взаимодействовать с электронным оборудованием. Риск контаминации в случае использования биологически опасных материалов. --- стр. 4 --- Угроза здоровью оператора прибора из-за высокого напряжения. Q Защ итное заземление. Символ изображен на внутренней поверхности прибора. Обратить внимание сервисному персоналу. Включено (питание) о Выключено (питание) 1.2 Предупреждения и меры предосторож ности Анализатор M A C S Q u an t - новейший в проточной цитометрии, контролируемый компьютером инструмент. Клетки, изолированные при помощи признанной технологии M A C S , могут быть последовательно проанализированы при помощи проточного цитометра M ACSQ uant. Устройство для подачи проб M A C S M iniSam pler подключается к анализатору M A C S Q uant и, таким образом, представляет собой часть устройства. Анализатор M A C S Q uant и устройство подачи проб M A C S M iniSam pler разработаны таким образом, чтобы обеспечить безопасность работы после инсталляции и использование специально обученным персоналом в соответствии с общими инструкциями по безопасному использованию и в соответствии с указаниями, прописанными в данной инструкции пользователя. Директивы, приведенные в данной главе, объясняют потенциальные угрозы, связанны е с эксплуатацией инструмента, и обеспечивают важной информацией для минимизации таких рисков. В точности следуя этим инструкциям, Вы можете защитить себя и оборудование от потенциальных угроз и создать безопасную рабочую обстановку. Если прибор будет использован каким-либо образом, не описанным в спецификации производителя, пользователь может подвергнуть себя риску. ВАЖ Н О : Пожалуйста, прочитайте и следуйте рабочим инструкциям, приведенным в настоящем руководстве пользователя и уделите внимание всем предупреждаю щ им знакам, размещенным на инструменте. Сохраните настоящ ую инструкцию пользователя и лю бы е другие инструкции по безопасности и работе с прибором в месте, легко доступном для всех пользователей прибора. ВАЖ Н О : анализатор M A C S Q u an t предназначен только для эксплуатации в помещениях. Не используйте прибор в местах, классифицированных как опасные, таких, как помещения, обогащ аемые кислородом. Свяжитесь с местными властями, обеспечиваю щ ими подачу электроэнергии, эксплуатацию зданий, безопасность для дополнительной информации по установке оборудования. Если у Вас есть серьезны е сомнения по поводу безопасности использования инструмента, пожалуйста, свяж итесь с оф ициальным дистрибьютором продукции компании Miltenyi Biotec или позвоните в службу клиентской поддержки компании Miltenyi Biotec. 1.3. Безопасная установка прибора в этом разделе описаны требования к рабочему месту, которое должно соответствовать определенным условиям безопасного расположения анализатора M A C S Q u an t на рабочем месте. Прочтите указания этого раздела и перед подключением прибора к источнику питания убедитесь, что место, в котором предполагается установить анализатор, должным образом подготовлено. При планировании расположения места установки и положении оборудования на нем, помните о предостережениях, указанных в данном разделе инструкции. Это поможет избежать неполадок в работе прибора и вероятность отказов, обусловленных несоблю дением требований к рабочему месту. --- стр. 5 --- ВАЖ Н О : в лю бом случае, должны соблюдаться: местные инструкции по безопасности, по требованиям к рабочему месту, политика лаборатории, стандарты лаборатории, касающиеся здоровья и безопасности, предупреждения возникновения несчастных случаев. 1.4.1 Установка дополнительного оборудования Не располагайте прибор на нестабильном столе, подставке, стенде, треноге и т.п. Инструмент может упасть. Это может привести к сильным телесны м повреждениям и/или серьезным повреждениям прибора. Используйте только такой стол, подставку, стенд, треногу и т.п., которые могут легко выдержать вес в 50 кг. Не размещ айте анализатор M A C S Q u an t внутри встроенной техники или в ограниченном пространстве, таком как полка, если только такая встроенная техника и т.п. не были специально разработаны для расположения такого прибора. Необходимо обеспечение соответствую щ ей вентиляции, а также должны соблю даться все требования по установке, приведенные далее. 1.4.2 Циркуляция воздуха Переменная температура воздуха может оказаться не в состоянии обеспечить нормальное охлаждение анализатора M A C S Q u an t до соответствую щ ей рабочей температуры, если не будет обеспечена адекватная циркуляция воздуха. Убедитесь, что рабочее помещение, в котором расположен инструмент, хорош о проветривается. Нельзя размещ ать прибор рядом с радиаторами отопления, обогревательными приборами, регистраторами тепла, печами либо рядом с иным оборудованием (включая усилители), которое может производить тепло. Обеспечьте возможность достаточной циркуляции воздуха рядом с M A C S Q uant - по крайней мере, по 15 см с каждой стороны. Это позволит обеспечить нужное охлаждение прибора. Не допускайте попадания на прибор прямых солнечны х лучей. Отверстия и отрытые части прибора обеспечивают его вентиляцию и предотвращ аю т его перегрев и поэтому они никогда не должны чем-либо перекрываться. Никогда не помещ айте инородные предметы внутрь этих отверстий. 1.4.3 Вода, влажность Не пользуйтесь прибором в сырых и влажных помещениях. Избегайте высокой влажности и образования конденсата, не допускайте попадания на прибор воды. 1.4.4 Заземление Инструмент оснащ ен трехжильным кабелем питания с заземлением, третий пин которого предназначен для заземления. Такая вилка питания подходит только к розеткам с заземлением. Это - мера безопасности. Не пытайтесь вставить вилку питания в розетку, не оборудованную заземлением. Если вы не можете вставить вилку в розетку питания, свяжитесь с электриком, обслуживающим ваш е помещ ение, и попросите его заменить розетку. 1.4.5 Источник питания Инструмент должен подключаться только к такой сети питания, параметры которой указаны на приборе. Если у вас есть вопросы по поводу типа источника питания, который необходимо использовать, свяж итесь с авторизованным представителем компании Miltenyi Biotec либо с органзацией, обеспечиваю щ ей электропитание в ваш ем учреждении. Не используйте удлинители. Не перегружайте выход сети питания. Полная нагрузка системы не должна превышать 80% от допустимой нагрузки цепи. 1.4.6 Доступность Убедитесь, что тум блер включения, а также вилка силового кабеля прибора легко доступны и расположены к оператору прибора настолько близко, насколько это возможно. Если необходимо отключить прибор от сети, вытащ ите вилку кабеля из розетки сети питания. 1.4.7 Периферийные устройства к коннекторам с обозначениями "External С ап ”, “C A N 1 ”, "C A N 2 ” следует подключать только оригинальное оборудование, предназначенное для использования с анализатором M ACSQ uant. Уровни напряжения на этих коннекторах не должны превыш ать опасные уровни напряжения в 30 10 --- стр. 6 --- Vrm s (30 среднеквадратических вольт) и 42,4 Vpeak (пиковое напряжение) или 60 V dc (напряжение постоянного тока). К коннекторам сенсоров бутылей (“Bottle S ensor”) следует подключать только кабели сенсоров бутылей (M ACSQ uant Analyser Bottle Sensor Cable). Только 20-сканер штрих кодов, рекомендованный компанией Miltenyi Biotec, следует подключать к разъему “R S232/B C R ”. Внешние лазерные устройства, подключаемые к разъему “R S 2 3 2 /B C R ”, должны соответствовать стандарту IEC 60825-1. Внеш ние вычислительные устройства, подклю чаемые через интерфейс RS232, обозначенный значком “С 0 М 1 ”, должны входить в список, соответствую щ ий стандарту UL- 60950-1. Разреш ено использование кабелей для подключения длиной до 3 м. 1.5 Безопасное использование, техническое обслуживание, транспортировка и утилизция Прочтите дальнейш ие указания по безопасной эксплуатации, техническому обслуживанию, транспортировке и утилизации прибора M ACSQ uant. ВАЖ Н О : в лю бом случае, должны соблюдаться: местные инструкции по безопасности, по требованиям к рабочему месту, политика лаборатории, стандарты лаборатории, касающиеся здоровья и безопасности, предупреждения возникновения несчастных случаев. 1.5.1 Безопасная эксплуатация Если прибор не ф ункционирует должным образом, а указания на мониторе прибора содержат требование обратиться в службу технической поддержки, дальнейш ая безопасная эксплуатация прибора невозможна. Немедленно выключите анализатор M ACSQ uant, выключите прибор из розетки сети питания и свяжитесь с авторизованной службой технической поддержки Miltenyi Biotec либо со службой клиентской поддержки компании Miltenyi Biotec. 1.5.5 Транспортировка Анализатор M A C S Q u an t должен транспортироваться с осторожностью и в упаковке, разработанной компанией Miltenyi Biotec. Возможно возникновение скрытых повреждений в случае, если упаковка с прибором будет подвергнута сильной вибрации или прибор будет уронен. Если необходима отправка прибора к производителю для сервисного обслуживания, проведите деконтаминацию инструмента перед его упаковкой. Если у вас есть вопросы, касающиеся деконтаминации и упаковки инструмента перед его отправкой, пожалуйста, свяжитесь со службой технической поддержки. См. раздел 8.1.9 для дополнительной инф ормации по деконтаминации инструмента. 2 Введение 2.1 Назначение прибора Анализатор MACSQuant® - это настольный проточный цитофлуориметр, который был специально разработан для быстрого, простого и автоматизированного флуоресцентного анализа суспензий одиночных клеток. Анализатор MACSQuant также оснащен функцией абсолютного подсчета клеточных популяций и может работать на скорости до 10000 событий в секунду. Инструмент был разработан специально для использования с реагентами для клеточного анализа MACS® Cell Analysis и реагентами для сепарации MACS® Separation Reagents в научной области применения. Тем не менее, на приборе можно работать и с использованием общепринятых флуорохромов, конъюгированных с антителами, сторонних производителей. Относительно небольш ая площ адь нижней поверхности прибора M A C S Q u an t (60 на 35 на 40 см), по сравнению с другими доступными на рынке проточными цитометрами, делает инструмент идеально подходящ им реш ением для использования в лаборатории. Также прибор имеет несколько особенностей, которые позволяют проводить полностью автоматизированную обработку проб - от окрашивания образца антителами и его перемеш ивания до отбора образца, его обогащения при помощи магнитной колонки и ф луоресцентного анализа. Анализатор M A C S Q u an t может быть дополнительно оснащ ен пробоотборником M ACS® MiniSampler. Пробоотборник M iniSam pler - это моторизованный штатив для пробирок, который может нести штативы для пробирок разного формата, включая 96-луночный микроплашечный штатив. Полностью автоматизированная процедура отбора и анализа группы образцов возможна 11 --- стр. 7 --- благодаря программному обеспечению M ACSQ uantify - таким образом, позволяя разгрузить оператора и повысить производительность труда. Автоматизированные процедуры обслуживания - также одна из разработок, отличающих анализатор M ACSQ uant. Они включают в себя различные системны е программы отмывки, проводимые перед каждым измерением, автоматический запуск инструмента, а также программы для выключения прибора на ночь или для длительного хранения. После отбора пробы прибор может анализировать клетки с ф луоресцентыми метками, используя до девяти оптических параметров - семь каналов ф луоресценции и два канала светорассеяния. Программное обеспечение, поставляемое вместе с анализатором MACSQuant® , может представлять полученные данные в стандартных для проточной цитометрии формах, включая гистограммы, точечные диаграммы, диаграммы распределения плотности, логические ограничения, данные статистики. Сбор данных может производиться по времени, по площади, высоте и ширине. Во время сбора данных, ф айлы данных автоматически сохраняются в папку, определенную пользователем, для последующ его анализа. Папки для сохранения данных индивидуальны для каждого пользователя, причем администратор прибора может задать параметры доступа к данным - для частного или публичного доступа. Анализатор M ACSQ uant® опционально может проводить предобогащ ение образца, содержащего магнитно меченые частицы, перед цитофлуориметрическим анализом. Эта функция прибора основана на знаменитой технологии M A C S и особенно полезна в случаях, когда необходимо провести анализ редких клеточных популяций, меченых магнитными частицами M A C S M icroBeads. Управление прибором осущ ествляется чрезвычайно легко посредством цветного T F T -тачскрина и благодаря интуитивно понятным меню встроенного программного обеспечения M ACSQ uant. У пользователя есть возможность выбора между простым режимом анализа, «зашитого» в программное обеспечение (режим Express Mode) или режимом с изменяемыми параметрами (режим Custom Mode). Анализ данных с использованием множества средств отображения данных и функций может проводиться на приборе, а программное обеспечение было разработано так, чтобы обеспечить максимально дружественный интерф ейс и обеспечить высокую гибкость функциональности прибора. Наконец, стандартны е буф еры и растворы M ACSQuant® , бутыли с которыми непосредственно присоединяются к прибору, стерильны, готовы к использованию и разработаны для оптимальной работы прибора. Прибор также оснащен устройством, предупреждающим пользователя при помощи различных цветов подсветки бутылей с буф ерами и расходными жидкостями, о том, что нужно заменить ту или иную рабочую жидкость или заменить емкость для отходов на пустую бутыль. 2.2 Приложения Анализатор M ACSQ uant® - это больше, чем просто проточный цитометр. Прибор был разработан так, чтобы максимально автоматизировать процесс работы с реагентами M ACS® Control - ф луоресцентными антителами, конъюгированными с ф луорохромами, разработанными в формате, предназначенном для быстрого цитометрического контроля клеточной сепарации, проведенной с помощ ью технологии M A C S . Автоматизированный отбор пробы при помощи роботизированной иглы-пробозаборника позволяет проводить анализ в заранее заданном объеме пробы, что, в свою очередь, позволяет реализовать абсолю тный подсчет клеток в образце. Различные клеточные популяции, меченые разными ф луоресцентными метками, также могут быть подсчитаны в определенной единице объема. Краткий обзор основных функциональных особенностей анализатора M A C S Q uant приведен ниже. 2.2.1 Флуоресцентный клеточный анализ Первый и передовой, анализатор M A C S Q uant - это проточный цитометр, имеющий девять оптических каналов для регистрации ф луоресцентных сигналов и относительного размера и гранулярности частиц. В совокупности с пробоотборником M A C S ® MiniSampler, автоматизированный анализ группы образцов может быть проведен с легкостью. Программное обеспечение M A C SQ uantify™ обладает всеми основными функциями для представления данных, статистического анализа. Данные могут быть представлены в виде точечной диаграммы, диаграммы распределения плотности, гистограммы, статистической таблицы. 12 --- стр. 8 --- 2.2.2. Приложения MACS® Control Качество клеточной сепарации, проведенной при помощи технологии M A C S , может быть быстро и эффективно оценено при помощи анализатора MACSQuant® . Протоколы процесса измерения и анализа, легко адаптируемы е к требованиям пользователя, могут быть созданы для флуоресцентного анализа клеток, для мечения клеток анителами, для измерения, для отбора проб. Все это может быть сделано в автоматическом режиме под контролем программного обеспечения M ACSQ uantify™ . Специализированные ко 1стейли антител M A C S Control доступны для мультипараметрического анализа определенных типов клеток, включая анализ CD14+ - моноцитов и CD19+ - В-клеток. 2.2.3 Детекция редко встречающихся клеток Включение устройства для предобогащения клеток M ACS® Enrichm ent Unit в состав системы позволяет проводить предобогащ ение клеточной суспензии in situ до флуоресцентного анализа. Устройство для предобогащ ения клеток M ACS® Enrichm ent Unit и специальная колонка M A CSQ uant позволяют снизить абсолю тное количество анализируемых клеток и получить характеристику представляю щ их интерес редко встречающ ихся клеток. Эта функция прибора может быть особенно полезной при анализе клеток с низкой частотой встречаемости, таких как стволовые клетки, субпопуляции дендритных клеток, или субпопуляции N K -клеток. 2.2.4 Абсолютный подсчет клеток Анализатор M ACSQ uant® обладает роботизированным манипулятором иглы-пробоотборника для отбора образца клеточной суспензии и последующ ей его подачи в проточную кювету. Роботизированный манипулятор дает преимущ ество автоматизации и возможность отбора четко определенного объем а пробы. Анализатор MACSQuant® , благодаря этой возможности, может считать абсолю тное число клеток на мкл объема пробы (с погрешностью ±5%). Это также означает, что несколько клеточных популяций могут быть одновременно подсчитаны в единице объема после ф луоресцентного окрашивания и анализа. Например, способность анализатора M A C SQ uant подсчитывать абсолю тное число клеток в субпопуляции позволяет оптимизировать подсчет специфичного типа клеток при помощи подготовленного заранее протокола анализа и специализированного набора антител. Так, используя набор для подсчета С D4+-RTE-клеток (CD4+ RTE Enum eration Kit, #130-092-055), можно произвести подсчет недавних тимусных иммигрантов (RTE) из образца цельной крови или из выделенных периферических мононуклеарных кровяных клеток. Кроме того, автоматизированная обработка образцов и использование пробоотборника M A C S M iniSam pler обеспечивает цельную интеграцию анализатора M A C S Q u an t в лабораторию, где необходимы рутинный подсчет абсолютного числа клеток с высокой производительнстью. Реагенты для мечения и программная обработка результатов могут быть настроены в соответствии с индивидуальными требованиями исследователя. 2.2.5 Автоматическая окраска клеток флуорохромами и анализ в анализаторе M A C S Q u an t автоматизация обработки клеточных образцов и анализа данных может быть дополнена автоматической окраской клеток ф луорохромами. С опциональным использованием пробоотборника M A C S MiniSam pler, возможна автоматическая обработка до 96 образцов, что обеспечивает высокую производительность прибора. 2.2.6 Проточная цитофлуориметрия - введение Любая популяция клеток может быть определена наличием индивидуального набора экспрессируемых антигенов, как поверхностных, так и внутриклеточных. Поэтому, эти антигены могут являться «мишенью» для их обнаружения и для последую щ его анализа с помощью проточной цитофлуориметрии. Проточные цитометры регистрируют клетки, используя два основных параметра - светорассеяние и флуоресценцию. Разм ер клетки и ее гранулярность - это неотъем лем ы е характеристики клетки, и они различны у различных типов клеток. Эти свойства клетки могут быть измерены при помощи прямого (или малоуглового) светорассеяния (FSC ) и бокового (SSC ) светорассеяния, соответственно. Однако, за исключением временной или постоянной экспрессии ф луоресцентны х белков, для того, чтобы получить стабильную флуоресценцию, величина сигнала которой будет выше, чем таковая от автофлуоресценции, клетку нужно «покрасить» ф луоресцентной меткой. Обычно это делается посредством использования антител к определенной специфичной мишени-белку или иному 13 --- стр. 9 --- биохимическому агенту, экспрессируемому на поверхности или внутри клетки. Эти антитела либо напрямую связаны с ф луорохромом, либо, в свою очередь, они могут быть связаны следующим шагом с антителами, конъюгированными с ф луорохромом (непрямое окрашивание). Только те кпетки, которые несут на себе антиген-мишень, будут нести на себе ф луоресцентную метку. После возбуждения лазером, свет, испускаемый ф луоресцентной краской, может быть зарегистрирован в определенном диапазоне длин волн. Это и позволяет отличать один флуорохром от другого. Использование различных светоф ильтров в проточных цитометрах позволяет одновременно использовать несколько ф луоресцентны х меток, и, таким образом, позволяет детектировать одновременно несколько клеточных антигенов. Эти фильтры определяют каналы флуоресценции, каждый из которых мониторируется фотоэлектронным умножителем (англ. photomultiplier tube, сокращ енно - РМТ). Каждый ф отоэлектронный умножитель, расположенный после набора светофильтров, будет усиливать сигнал детектируемого света. Поэтому лазерный луч будет возбуждать ф луоресцентную метку на клетке, который будет отражаться от клетки и будет регистрироваться под углом 90°. Этот отраженный свет будет проходить через соответствую щ ий светофильтр, а результирующий сигнал будет усилен и обработан программной частью цитометра (например, программой M ACSQuantify). Настоятельно рекомендуется прописывать значимые названия для каждого детею-ора (фотоэлектронного умножителя, РМ Т) до начала анализа, т.е. номенклатура наименований должна соответствовать флуорохромам, используемы м для окрашивания клеток. Например, FITC (флуоресцеин изотиоцианат) имеет максимум эмиссии 521 нм (в водной среде), и, таким образом, детектируется в зеленом ф луоресцентном канале (FL2, 525 нм с шириной волны в 50 нм). Другой флуорохром, A R C (аллофикоцианин), с максимумом эмиссии 660 нм, регистрируется в красном канале флуоресценции (FL6, 655-730 нм). Анализатор M A C S Q uant оснащ ен тремя лазерами, что позволяет одновременно использовать до 7 каналов ф луоресценции (FL1-FL7) и два канала светорассеяния (FSC , SSC ). Список наиболее характерных ф луорохромов и их соответствую щ ие каналы регистрации смотрите в Таблице 2.1. Длина волны возбуждения Н азвание фотоэлектронного умножителя (РМТ) Фильтр 405 п т FL1 (VioBlue) 450/50 488 п т FL2 (FITC) 525/50 FL3 (РЕ) 585/40 FL4 (РЕ-Су5/РЕ-Су5.5) 655-730 (655LP + split 730) FL5 (РЕ-Су7) 750 (LP) 635 п т FL6 (АРС) 655-730 (655LP + split 730) FL7 (АРС-Су7) 750 (LP) 488 п т F S C /S S C 488/10 Таблица 2.1 Флуорохромы и соответствующие им каналы регистрации После окрашивания клеток флуоресцентными метками, игла-пробоотборник анализатора M ACSQ uant отбирает заданный заранее объем образца. Д алее клетки либо непосредственно направляются в проточную кювету для последующ его анализа, либо могут быть направлены в сепарационную колонку M A C S Q uant для пред-обогащения клеточной смеси клетками, несущими на себе магнитную метку (см. раздел 6.3.6). Попав в проточную кювету, каждая клетка последовательно проходит через оптический путь лазера, и отражение света от клетки используется для получения информации о физических параметрах клетки, таких как размер и гранулярность. Также луч лазера возбуждает ф луорохромы на клетках, несущ их флуоресцентные метки; свет, испускаемый каждым возбужденным ф луорохромом, регистрируется детекторами флуоресценции после прохождения через соответствую щ ие ф ильтры (каналы флуоресценции). В конце концов, клетки попадаю т в емкость для отходов. 14 --- стр. 10 --- 2.2.7 Отображение данных в проточной цитометрии Данные, полученные в результате цитофлуориметрического анализа, могут быть отображены в различных ф орм атах посредством программного обеспечения M ACSQ uantify: точечная диаграмма, гистограмма, диаграмм а распределения по плотности, статистика. Каждому из этих видов представления данных дано краткое описание, однако, стоит отметить, что обычно данные визуализируются при помощи однопараметрической гистограммы и двухпараметрической точечной диаграммы. Для более подробной инф ормации по использованию программного обеспечения M A C SQ uantify для анализа данных и их отображения см. раздел 6.12. Точечная диаграмма (dot plot) Точечная диаграмм а (dot plot) также может называться «бивариантный дисплей (bivariant display)», «диаграмма pacceяния(scattergram )» и, в некоторых случаях, «двоичным oтoбpaжeниeм(bitmap)». В этой ф орме анализа каждое событие (как правило, клетка или иная частица) представлена как единичная точка на двухосевой диаграмме. Расположение точки по отношению к х/у осям зависит от интенсивности измеряемы х параметров для того или иного события/клетки. Характеристика клеточной популяции, как правило, получается отображением на точечной диаграмме, где боковое светорассеяние (S S C , ось ординат, Y) строится против прямого светорассеяния (FSC, ось абсцисс, X ). 1000 viV ; V G r^niilocvtes • • ■ 1000 Lymphocytes Рис. 2.1 Двухпараметрическая диаграмма, отображающая распределение периферических мононуклеарных клеток крови по двум параметрам - боковому светорассеянию и прямому светорассеянию. Можно различить три четкие субпопуляции в соответствии с их параметрами светорассеяния: гранулоциты, моноциты и лимфоциты. Шкалы светорассеяния обычно линейные. В двухпараметрических диаграммах, где использованы шкалы интенсивности флуоресценции, поскольку интенсивность флуоресценции может различаться на величины в несколько порядков от клетки к клетке, обычно используется логарифмическая шкала (например, 5-декадная шкала интенсивности флуоресценции; для дополнительной инф ормации по выбору нужного типа шкалы см. раздел «Выбор масш таба отображения данных в проточной цитометрии» далее). Двухпараметрические диаграммы - идеальны для отображения относительно небольшого количества событий, где клеточные субпопуляции четко различимы (например, см. рис. 2.1). Эти диаграммы также даю т некоторое представление относительно плотности распределения клеток/событий. Чем больш е событий с похожими параметрами, тем более плотную популяцию они формирую т на диаграмм е - более плотное и контрастное облако. Однако, для более точного отображения относительной плотности распределения событий/клеток, нужно использовать диаграмму распределения по плотности. Гистограмма (histogram) Гистограммы использую тся для отображения интенсивности одного параметра (ось X) против частоты встречаемости этого параметра (ось Y). Например, ось X отображает светорассеяние или интенсивность по тому или иному каналу флуоресценции, а ось Y отображает количество событий. Поскольку гистограммы даю т представление только об одном параметре, их следует использовать для однородных субпопуляций с хорошим разреш ением либо для сравнения интенсивности одного и того же параметра у разных образцов (режим графической накладки изображения). 15 --- стр. 11 --- 1000- 1000 100- 75- 50- 25- 0- 10е2 10*-1 ГОеЗ Рис.2.2 Слева: диаграмма FSC/SSC распределения мононуклеаров периферической крови, которые были окрашены анти-СОЗ антителами, конъюгированными с РЕ, CD3+ - клетки отображены зеленым цветом. Справа: соответствующая гистограмма субпопуляции CD3->- клеток; интенсивность флуоресценции (ось X) против относительного числа клеток (ось Y). Диаграмма распределения по плотности (density plot) Диаграммы распределения плотности - полезный инструмент. Используя традиционные точечные диаграммы, бы вает трудно сразу определить интенсивность или частоту регистрируемых событий на черно-белом графике. Диаграмма распределения плотности строится в оттенках серого цвета либо в цвете; каждый цвет/оттенок дает инф ормацию об интенсивности получаемых событий. Диаграмма распределения плотности разработана для того, чтобы отображать трехмерный график, где количество клеточных событий отображается как «третье» измерение, либо с помощью оттенков серого, либо разными цветами. 2.3 Технология сепарации клеток MACS® Cell Separation Технология магнитной сепарации клеток M ACS® Cell Separation, т.е. магнитная сепарация определенной клеточной популяции с использованием технологии M A C S , является широко известным общ епринятым «золотым» стандартом в области сепарации клеток. Технология M A C S базируется на использовании магнитных микрошариков M A C S M icroBeads, колонок M A C S и сепараторов M A C S - сильных постоянных магнитов. Технология M A C S применяется для таргетированного обогащ ения суспензии клетками определенного типа или для деплеции того или иного типа клеток или популяций на основании экспрессии клетками поверхностных антигенов. Технология M A C S обеспечивает исследователя средством обогащ ения редкой субпопуляции клеток для последую щ его цитофлуориметрического анализа. На первом этапе поверхностные антигены метятся магнитными метками с очень высокой специфичностью - происходит связывание моноклональных антител, связанных с магнитными микрочастицами M ACS® M icroBeads. Микрочастицы M ACS® M icroBeads - это суперпарамагнитные частицы, диаметр которых составляет около 50 нм, что сравнимо с размерами вирусной частицы. Обнаружено, что частицы M ACS® M icroBeads не изменяют параметры светорассеяния клетки при анализе на проточном цитометре и не регистрируются на световом микроскопе. Они ф ормирую т стабильную коллоидную суспензию, не выпадают в осадок и не агрегируются в магнитных полях. Частицы M ACS® M icroBeads состоят из биодеграбельного матрикса, состоящ его из оксида железа и полисахарида; таким образом, нет необходимости удаления магнитных микрочастиц после процесса сепарации, что сохраняет время. Частицы M ACS® M icroBeads не изменяю т структуру, функции и статус меченой клетки, также они не оказывают влияния на результаты последующ их экспериментов. И, наконец, частицы M ACS® M icroBeads - это чрезвычайно гибкий инструмент, при помощи которого можно обогащать различные типы см есей клеток, имеющ их происхождение от особей разных видов посредством использования различных типов антител. В настоящ ее время для исследователя доступно несколько сотен реагентов для изоляции клеток человека, мыши, крысы, приматов, а также реагенты для непрямого мечения многих других типов клеток. После магнитного мечения клетки проходят через сепарационную колонку M A C S, помещенную в магнитное поле сепаратора M A C S . Клетки без меток проходят через колонку и могут быть собраны в отдельную фракцию; меченые клетки остаются на колонке и могут быть смыты с нее после того, как колонка будет убрана из магнитного поля. Таким образом, как меченые, так и немеченые 16 --- стр. 12 --- клеточные фракции могут быть эффективно изолированы друг от друга при помощи технологии M A C S. Вся процедура проста, легко осущ ествима, проходит в мягких для клеток условиях. В результате исследователь получает обогащенную клеточную фракцию, к анализу которой можно непосредственно приступить. Анализатор M A C S Q u an t оснащ ен модулем для обогащения клеток (M ACS® Cell Enrichment Unit), что позволяет быстро и легко проанализаровать редкую клеточную субпопуляцию при помощи технологии M A C S . Установленная в модуль обогащения клеток специально разработанная для анализатора сепарационная колонка M A C SQ uant™ может изолировать до 5x10^ клеток, меченых магнитными микрочастицами. После сепарации магнитно меченых клеток, как негативная, так и позитивная фракции могут быть проанализированы в полностью автоматическом режиме. Обогащение суспензии требуемы м типом клеток при помощи технолгии M A C S перед цитофлуориметрическим анализом особенно ценно, когда необходимые исследователю клетки встречаются в очень малом количестве, например, в случае со стволовы ми клетками или антиген- специфичными Т-клетками. 2.4 Описание анализатора MACSQuant® Анализатор M A C S Q u an t - это современный настольный клеточный анализатор, предназначенный для высокочувствительной многоцветной проточной цитофлуориметрии. Три лазера в комбинации с мощным программным приложением M ACSQ uantify способствую т осущ ествлению быстрого и простого клеточного анализа. Прибор оснащен двумя каналами светорассеяния (FSC, S S C ) и семью каналами флуоресценции. Таким образом, анализатор M A C S Q u an t является идеальным прибором для приложений M A C S Control (оптимизированная оценка результатов сепарации, проведенной при помощ и технологии M ACS), а также для рутинного иммунофлуоресцентного анализа. С истем а включает в себя модуль для предварительного обогащения клеточной суспензии (M A C S Cell Enrichm ent Unit), что является очень важным подспорьем для надежной детекции и анализа редких клеточных субпопуляций; этот модуль напрямую контролируется программным обеспечением анализатора M ACSQ uant, что обеспечивает полную автоматизацию процесса обработки проб и анализа клеток. Для расширения возможностей автоматизации (возможность обработки больш ого количества проб) можно воспользоваться пробоотборником M A C S M in iS a m p le r-для удобного проведения измерений без участия человека. Рис. 2.7. С хе м а ти ч е ск о е изображ ен ие ан ал изатора M A C S Q u a n t - в и д спереди. П ередняя кры ш ка п ри бора и зображ ена п розрачн ой д л я нагл ядн о сти . А н ал и зато р M A C S Q u an t: о Компактный, настольный дизайн прибора 17 --- стр. 13 --- о Н епосредственный многопараметрический клеточный анализ - от простого подсчета клеток до изощренного цитофлуориметрического анализа о Абсолю тны й (волюметрический) подсчет клеток о Высокочувствительная детекция редко встречаю щ ихся клтеок о Полностью автоматизированная процедура мечения и анализа группы образцов 3 Сборка и установка прибора В данном разделе рассказано о том, как правильно распаковать и установить устройство для первого включения 3.1 Распаковка анализатора MACSQuant® Внимательно прочитайте инструкции, содержащ иеся в данном разделе перед началом установки прибора. Перед открытием упаковки, в которой перевозился прибор, проверьте ее на предмет наличия внешних повреждений. Убедитесь также в том, что индикаторы удара или смещ ения положения (в случае, если таковые имеются на упаковке) не показывают наличие удара или смещения. Если на коробке присутствуют видимые повреждения и/или сработали индикаторы удара/смещ ения, свяж итесь со службой технической поддержки (см. раздел 13). Название, описание Расположение в коробке Кабели модуля бутылочных сенсоров Справа на дне коробки Силовой кабель Верхнее отделение Трубки для жидкостей (6х) Верхнее отделение Крышки бутылей с сенсорами Верхнее отделение M A C S M iniSam pler (с крышкой) Упакован в коробку, которая содержится в верхней части упаковки Пустые контейнеры для расходных жидкостей с крышками В держ ателях для бутылей Штативы для пробирок Упакованы в коробку, которая расположена в верхней части упаковки Анализатор M ACSQ uant® В специальном отделении Руководство пользователя, D V D -диск с программным обеспечением, клавиатура с манипулятором в специальных отделениях Таблица 3.1 Описание и расположение частей прибора в контейнере для перевозки 1 ) Откройте контейнер, предназначенный для авиаперевозок прибора, либо картонную коробку (не показано) и снимите верхний упаковочный слой, убедитесь в наличии прибора и сопутствующей упаковки. Рис. 3.1. Показано, как правильно открывать контейнер для авиаперевозок. Запирающая ручка должа быть повернута (положение 1) для того, чтобы открыть запирающий зажим (2). Анализатор MACSQuant также может транспортироваться в усиленной картонной коробке. Примечание: в верхнем упаковочном элементе содержится инструкция пользователя, пробоотборник MACS MiniSampler (в случае, если он включен в комплекте поставки), и различные коробки с аксессуарами. Аккуратно достаньте их. 18 --- стр. 14 --- 2) Достаньте коробки, содерж ащ ие пробоотборник M A C S M iniSam pler с крышкой, и аксессуары. Рис. 3.2 Упаковка анализатора MACSQuant и дополнительного оборудования 3) Уберите панели из твердой упаковочной пены по обеим сторонам от анализатора Примечание: поднимать анализатор MACSQuant из упаковки необходимо вдвоем. Прибор нужно взять за основание оранжевых держателей для бутылей, расположенных по обе стороны от прибора. Обратите внимание на то, что прибор тяжелее в его фронтальной части. Убедитесь в том, что передняя часть прибора стабилизирована в момент его поднятия. Поднимайте анализатор MACSQuant с должной осторожностью. Miltenyi Biotec не несет ответственности за возможные повреждения, приобретенные в процессе поднятия/перемещения прибора 4) Поместите прибор на стабильную рабочую поверхность, например, на лабораторный стол. Снимите с прибора пластиковый мешок. Примечание: примите во внимание, что прибору необходима соответствующая вентиляция для теплообмена и охлаждения. См. раздел 1.4.2 для подробных указаний. 5) Аккуратно извлеките иглу-пробоотбо бления в упаковочной твердой пене 19 --- стр. 22 --- 3.5 Калибровка аппаратной части прибора Перед первым использованием анализатора M A C S Q uant необходимо откалибровать аппаратную часть прибора. Это необходимо сделать до калибровки лазеров прибора. В этом разделе описана калибровка аппаратной части прибора. Примечание: Настоятельно рекомендуется, чтобы калибровка аппаратной части прибора была проведена администратором прибора, прошедшим тренинг в компании Miltenyi Biotec. Примечание: Для того, чтобы провести калибровку аппаратной части прибора, пользователь должен уметь работать с программой MACSQuantify. Дополнительную информацию см. во вводном разделе по пользовательскому интерфейсу анализатора MACSQuant. 3.5.1 Калибровка: определение типа штатива Детекция держ ателя одной пробрки и кнопки начала сбора данных. 1) Щелкните по закладке Tools (инструменты), далее по Calibrate Rack Detection 2) Нажмите Start Calibration Диалоговое окно подскажет Вам убрать держ атель для одной пробирки (single tube holder) с передней панели прибора 3) Снимите с прибора держ атель для одной пробирки, зажимая его двумя пальцами (оранжевая кнопка используется только для начала сбора данных, она - не ф иксирую щ ая кнопка, служащая для снятия держ ателя с прибора). Держатель для одной пробирки может быть легко снят с прибора простым вытягиванием детали из отверстий для крепления. Рис. 3.30 Удаление держателя для одной пробирки. Оранжевая кнопка служит лишь для старта сбора данных. 4)3атем программное обеспечение прибора попросит Вас установить держатель для одной пробирки обратно. Это осущ ествляется путем совмещ ения двух штырей на держателе с ответными отверстиями до легкого щелчка. 5) В итоге программное обеспечение попросит Вас нажать и удерживать (press and hold) оранжевую кнопку (старт сбора данных) до тех пор, пока калибровка не будет завершена. Об успешном заверш ении калибровки свидетельствует зеленый круг напротив соответствующей строки. Рис. 3.31 Успешное завершение калибровки автоматического определения штатива Примечание: При калибровке штативов пользователь должен строго следовать указаниям прибора. Это необходимо для корректной калибровки. В противном случае, калибровка не будет завершена. Автоматическое определение штативов Этот шаг необходимо выполнить в том случае, если в комплект поставки прибора входит роботизированный держ атель штативов M A C S MiniSampIer. Калибровка осущ ествляется аналогичным образом. Следуйте указаниям на мониторе. 27 --- стр. 23 --- 3.6 Калибровка настроек прибора (instrument settings) Внимание! Перед началом калибровки прибор необходимо перевести в режим сбора данных (aquisition mode). Для этого необходимо нажать на кнопку в верхнем правом углу экрана. Программа выдаст диалоговое окно, предлагающее переключиться в режим сбора данных (switch to acquisition mode), либо выключить прибор (instrument off). Необходимо выбрать «switch to acquisition mode». Запустится процесс прайминга прибора (отмывка и заполение жидкостью гидролиний, резервуара обжимающей жидкости, включение лазеров, переключение прибора в режим сбора данных). Перед началом прайминга (priming) убедитесь в герметичности соединений трубок, в том, что контейнеры с рабочими жидкостями заполнены соответствующими расходными жидкостями, а контейнер для сбора отходов пуст. Обратите внимание на то, что при первом запуске прайминга, по его завершении прибор выдаст системную ошибку. Это связано с тем, что перед транспортировкой прибора все гидролинии, а также резервуар обжимающей жидкости, осушаются, и одного цикла прайминга недостаточно для того, чтобы заполнить резервуар. В этом случае необходимо выключить прибор тумблером питания справа, подождать 5 минут и снова включить прибор, после чего повторить процедуру перевода прибора в режим сбора данных. Снова будет запущен цикл прайминга. После завершения второго цикла прибор будет готов к работе, в строке состояния прибора (внизу экрана) будет гореть зеленый круг с надписью “Calibration required” (требуется калибровка). В проточной цитометрии интенсивность флуоресценции используется для определения разницы уровня сигнала между «позитивной» и «негативной» популяциями частиц. Воспроизводимость и стабильность сигнала флуоресценции во времени является важнейшим параметром устройства. Для обеспечения стабильности измерений, которые будут независимы от течения времени и от характеристик конкретного прибора, осуществляется его калибровка. Калибровочные кривые флуоресценции рассчитываются при помощи флуоресцентных микрошариков, которые обладают определенным размером и интенсивностью флуоресценции. Выражение линейной регрессии рассчитывается на основе ответов прибора по модальной гистограмме или по гистограмме среднего значения величины сигнала по каналу флуоресценции на основе этих предопределенных значений. 3.6.1 Осуществление полностью автоматизированной калибровки 1) Перед началом калибровки убедитесь в том, что держ атель для одной пробирки правильно /становлен. Рис. 3.34 Держатель для одной пробирки и оранжевая кнопка запуска измерения (старт начала сбора данных). 2) Активируйте сканер штрих-кодов посредством нажатия на значок Barcode и поднесите сосуд с калибровочными частицами M A C S Q u an t™ (M ACSQ uant™ Calibration Beads) к сканеру штрих-кодов стороной, на которую нанесен штрих-код. Держите емкость с частицами под небольш им наклоном. Калибровочные частицы будут автоматически распознаны прибором, в диалоговом окне отобразится номер партии поставки калибровочных частиц. Для того, чтобы продолжить калибровку, нажмите Yes (да). 3) Следуйте дальнейш им указаниям прибора. Т.е. поместите пустую пробирку в держатель (single tube holder), добавьте в нее одну каплю калибровочных частиц M A C S Q uant (предварительно встряхните флакон на вортексе или вручную). 28 --- стр. 24 --- 4) Нажмите OK для начала процесса калибровки. Через иглу-пробоотборник в пробирку будет предварительно подан рабочий буф ер для того, чтобы довести полный объем в пробирке до 0,5 мл. После этого калибровчные частицы будут перемеш аны прибором, а 100 мкл растворенных калибровочных частиц будет введено в порт обжимающей жидкости. Этот объем и будет использован для калибровки. В процессе калибровки будут автоматически настроены параметры усиления и триггеры на соответствую щ их каналах флуоресценции. Калибровочные частицы M A C SQ uant - это микросф еры двух размеров (неокраш енные частицы размером 2 мкм и окрашенные размером 3 мкм, несущ ие на себе флуорохромы, ф луоресцирую щ ие во всех 7 каналах прибора). 5) Результаты калибровки для каждого канала представлены в виде точечных диаграмм (dot plot), гистограмм и в виде таблицы в двухстраничном (на двух экранах) отчете.. Успешная калибровка для каждого из каналов отмечается зеленой отметкой. Для того, чтобы просмотреть все диаграммы, гистограммы и таблицы, воспользуйтесь кнопками Previous screen или Next screen ^ ^ (предыдущий и следующ ий экраны, соответственно). 3.6.2 Калибровка в ручном режиме Пользователи, работаю щ ие в экспертном режиме (Custom mode) и администраторы прибора могут осущ ествлять калибровку в ручном режиме. Примечание: Калибровочные частицы должны быть предварительно разведены и размешаны. Анализатор MACSQuant может провести разведение и перемешивание калибровочных частиц. Для более подробной информации см. раздел «Настройка параметров разведения и перемешивания калибровочных частиц перед калибровкой». 3.7. Н а с т р о й к а п а р а м е т р о в к о м п е н с а ц и и к а н а л о в ф л у о р е с ц е н ц и и Параметры цветовой компенсации, настроенные должным образом - важнейший компонент оптимального сбора и отображения данных в проточной цитометрии. Необходимость настройки параметров компенсации возникает вследствие присущего различным спектрам эмиссии разных флуорохромов общей области перекрытия. Этот флуоресцентный спектральный «перехлест» приводит к детекции одного и того же флуорохрома более чем в одном канале флуоресценции (что ведет к ложно позитивному сигналу). Такое «перекрытие» должно быть выявлено и скорректировано. Это особенно важно при использовании нескольких цветовых маркеров - без правильной настройки параметров компенсации результаты измерения будут неверными. Например, ф луоресценция широко распространенного ф луорохрома FITC будет определяться как в канале FL-2, так и в канале FL-3, хотя именно канал FL-2 предназначен для детекции FITC. Поэтому вся ф луоресценция от FITC, детектируемая в канале FL-3, считается излишним «переливом» сигнала; эта излишняя величина может быть выражена в процентах, значение которого можно математически «вычесть» (компенсировать) из всей величины начального сигнала. Лучш е всего это видно на рис. 3.38, где клетки, меченые CD8-FITC антителами, отображены на двухпараметрической диаграмме (FL-2 против FL-3). Слева показан график с ненастроенными параметрами компенсации, где CD8+ - клетки детектируются как в канале FL-2 (FITC), так и в FL-3(PE), попадая, таким образом, в область двойных позитивных клеток (положительных как по FITC, так и по РЕ), хотя клетки были мечены только антителами, конъюгированными с FITC. После компенсации (справа) эта процентная величина, эквивалентная перекрываемой области спектров, была удалена. Данная операция обеспечивает то, что сигнал от FITC (CD8+ - клетки) ограничен осью X (FITC). В данном случае параметры компенсации считаются настроенными правильно, если среднее значение интенсивности флуоресценции (mean) по каналу Р Е в левом нижнем и правом нижнем квадрантах равны. Эти значения можно найти в таблице Statistics. Для настройки параметров компенсации необходимо использовать суспензию клеток, окрашенных только одним ф луорохромом (например, только F1TC, или только РЕ), и далее настраивать параметры компенсации для каждого из используемых каналов, где есть перекрывающиеся спектры. 29 --- стр. 25 --- 2ашз-14.ао4ип co ain T c^ Рис. 3.38 Сигнал от клеток, окрашенных CD8-FITC, правильно скомпенсирован. Примечание: Невозможно субъективно оценить ту долю сигнала, которую необходимо вычесть; настройки компенсации должны оптимизироваться индивидуально для всех задействованных флуоресцентных каналов, также как и для каждого флуорохрома и комбинации флуорохромов. Оптимальные настройки компенсации особенно важны, когда необходимо отличить слабо меченые клетки (клетки с низкой экспрессией антигена) от негативной популяции. 3.7.1 Осуществление автоматической компенсации Проводить настройку параметров компенсации следует только после того, как прибор был успешно откалиброван и в строке состояния присутствует надпись «M A C SQ uant Ready: Calibration O K status». Автоматизированная компенсация прибора основана на матрице размером 7x7. Рекомендуется, чтобы анализатор M A C S Q uant автоматически рассчитывал подходящие настройки компенсации, используя автоматизированную матрицу компенсации и программу компенсации (метод матрицы). Однако, опытные пользователи могут предпочесть ручную настройку параметров компенсации классическим методом. Анализатор M A C S Q u an t может точно и надежно провести автоматическую настройку параметров компенсации, основанную на использовании матрицы 7x7 (каждый из каналов компенсируется против остальных 6 каналов), используя либо образцы клеток, окраш енные одним флуорохромом (т.н. single-stained cells), либо специальные калибровочные микросферы. Используемый для этих целей тип клеток и, соответственно, поверхностные маркеры на них должны иметь высокую экспрессию. Например, для того, чтобы компенсировать сигналы ф луоресценции в каналах FL2, FL3, FL6, часто использую т для контроля аликвоты мононуклеарных клеток периферической крови, меченые CD 8-FITC, C D 8-PE, C D 8 -A P C - антителами. Использование суспензии клеток, меченых одним типом антител, конъюгированных с флуорохромом, для настройки компенсации. 1) Отдельно пометьте кпетки антителами, конъюгированными с соответствую щ им флуорохромом, который детектируется в нужном Вам канале флуоресценции. Н епосредственно перед началом измерения перенесите равные объемы из всех пробирок, в каждой из которых аликвотирована проба, меченая только одним ф луорохромом, включая негативную пробу, в одну пробирку и поместите ее в держ атель для одной пробирки (single-tube holder) анализатора M ACSQ uant. Более подробную информацию, касающуюся реагентов и соответствую щ их протоколов окрашивания клеток, можно найти в каталоге компании Miltenyi Biotec и/или в технических описаниях соответствую щ их продуктов на сайте www.miltenvibiotec.com и www.m acsauant.com . 3.7.2. 7-цветовая компенсация в комбинации с функцией группирования возможно осущ ествление автоматической компенсации с использованием 7 ф луоресцентны х меток (флуорохромов). Для того, чтобы провести 7-цветовую компенсацию: Подготовьте пробирки с образцами клеток, в каждой из которых присутствует только один флуорохром (single-stained cells). 1) Определите количество клеток в образце мононуклеаров периферической крови. Открутите клетки на центрифуге (ЗООд, 7 минут). Аспирируйте супернатант и ресуспендируйте клетки в 30 --- стр. 26 --- буфере, доведя их содержание в пробе до концентрации 1x10^ клеток в 100 мкл буфера. Аликвотируйте в 9 пробирок. 2) Добавьте соответствую щ ее количество антител, конъюгированных с флуорохромом, в соответствии с рекомендуемым производителем антител титром. Повторите процедуру для других 6 пробирок, используя подходящ ие конъюгированные с ф луорхромом анитела, получив, таким образом, 7 пробирок, каждая из которых будет содержать клетки, окрашенные только одним флуорохромом. Примечание: Например, для получения клеток, меченых одним флуорохромом, можно использовать следующие флуоресцентные метки: VioBlue, FITC, РЕ, РЕ-Су5, РЕ-Су7, АРС, АРС-Су7. 3) В одну из пробирок не добавляйте антител. В последнюю пробирку добавьте йодид пропидия (Р1) в рекомендуемой производителем концентрации (см. соответствую щ ее техническое описание продукта). 4) Хорош о перемеш айте содержимое пробирок и инкубируйте в течение 10 мин. в темноте при 4°С. 5) Промойте клетки - добавьте в каждую из пробирок 1-2 мл буф ера и центрифугируйте при ЗООд в течение 10 минут. Аспирируйте супернатант. 6) Ресуспендируйте клетки в буфере, доводя их содержание до концентрации 1x10® кл./мл. 7) Приступите к проведению автоматической настройки 7-цветовой компенсации на анализаторе M ACSQ uant. 7-цветовая компенсация на анализаторе MACSQuant 8) Для того, чтобы открыть сохраненные настройки прибора, нажмите на File, затем на Open и выделите закладку Instrument settings. Выберите из списка нужный Вам файл настроек. 9) Выберите штатив для пробирок, например. Chill Rack 5. Штатив должен быть предварительно охлажден до 4°С. 10) Поместите каждую из семи пробирок с образцами, мечеными одной ф луоресцентной меткой, в колонны в штативе Chill R ack 5. Порядок размещ ения пробирок должен быть следующим: VioBlue (А), FITC (В1), РЕ(С1), PE-Cy5(D 1), РЕ-Су7(А2), А Р С (В2), А Р С -С у 7 (С2). Разместите оставшиеся две пробирки - содерж ащ ие клетки, окрашенные Р1, в положение D2, и пробирку с неокрашенными клетками в положение АЗ. 11) Сгруппируйте образцы вместе таким образом, чтобы получилась одна группа проб (так, как показано ниже). Рис. 3.46 Образцы клеток были сгруппированы вместе 31 --- стр. 27 --- н12) Нажмите на кнопку L U , чтобы начать настройку компенсации. 13) Пользователю будет предложено нарисовать регион (гейт) вокруг интересуемой субпопуляции клеток. 14) Анализатор M A C S Q u an t проведет 7-цветовую настройку компенсации в выбранном Вами гейте. 4 Базовые принципы работы с анализатором MACSQuant® Вкпючите прибор тум блером включения питания. Дотроньтесь до сенсорного экрана. Прибор включится, при этом сначала произойдет инициализация всех систем прибора. Далее Вам будет предложено ввести пароль администратора (создается на более раннем этапе, при первом включении прибора). По умолчанию прибор находится в режиме A n a ly sis. В этом режиме рекомендуется создать шаблон эксперимента (A n a ly sis Tem plate). Создайте необходимый Вам шаблон, пользуясь меню W in dow -> N ew a n a ly s is w indow . При этом кнопка А должна быть серого цвета. Вам будет предложено на выбор несколько готовых шаблонов. Выберите наиболее подходящий шаблон, щелкните по нему мышью. В появившихся диаграмм ах выберите необходимые Вам параметры (например, S S C и FSC). При помощи кнопок, описанных в таблице 6.1, создайте требуем ы е регионы, гейты различной формы, квадранты. Задайте вы водим ые на экран параметры статистики. Сохраните готовый шаблон под требуемым названием при помощи кнопки S ave (сохранить шаблон можно тогда, когда кнопка А оранжевая). Ш аблоны сохраняю тся в папку A n a ly s is tem plates. Кнопкой M ain in stru m e n t co n tro l (кнопка в верхнем правом углу экрана) переключите прибор в A cq u isitio n M ode. Подтвердите выбор нажатием кнопки Y es. Запустится автоматическая процедура прайминга (подготовка прибора к работе в режиме измерения). Когда процедура прайминга будет заверш ена, появится зеленый круг в левом углу экрана с надписью рядом A cq u isitio n M ode. C a lib ra tio n O K (в случае, если калибровка не требуется) либо C alib ration recom m ended, либо C a lib ra tio n required. В двух последних случаях проведите калибровку прибора, используя калибровочные частицы. Затем перейдите в меню Experiment. Выберите требуемый тип штатива (например. S in g le tube rack - штатив для одной пробирки). В следую щ ей строке (File) можно задать имя файла, в который будут сохраняться данные, полученные в результате измерения. Для этого необходимо снять галочку справа и вписать имя файла. При помощи кнопок Low , M edium , H igh выберите требуемую скорость прохождения образца через проточную кювету (например. M edium ). Если требуется перемеш ать образец до начала измерения, поставьте галочку рядом с надписью M ix Sam ple. В ниспадаю щ ем меню M ode выберите необходимый режим проведения измерения, например, Standard. В меню U ptake V o lu m e задайте тот объем пробы, который будет отобран прибором для последующ его измерения (минимальный объем - 25 мкл, максимальный - 450 мкл). В меню S am ple V o lu m e укажите приблизительный полный объем пробы, находящ ийся в пробирке (имеет значение для автоматического перемешивания, а также для автоматического разбавления пробы), В закладке Settings задайте дополнительные опции измерения - E x p re ss (доступны режимы Setup и A n a ly sis) и C u sto m (более детальное задание параметров). В режиме C u stom выберите необходимые настройки прибора (Instrum ent settin g s) из ниспадаю щ его списка предварительно сохраненных ф айлов настройки. В поле A n a ly s is tem plate выберите необходимый Вам предварительно созданный шаблон. Активируйте окно Instrum ent S ettin g s, содерж ащ ее закладки C h a n n e l и C o m p e nsa tio n. Поместите пробирку с образцом в держ атель пробирки. Нажмите кнопку S tart (начало измерения). Прибор автоматически перемеш ает пробу, отберет заданный заранее объем и начнет измерение. Пользуясь настроечными ползунками, регулирующими напряжение на фотоэлектронных умножителях, а также параметром Trig (триггер, дискриминатор), добейтесь нужной вам «картинки» на диаграмме. Например, при иммунофенотипировании (определение субпопуляций лейкоцитов человека) настройки параметров F S C и S S C должны быть настроены таким образом, чтобы на диаграмм е отображ алось минимальное количество дебриса, или клеточных «обломков» 32 --- стр. 28 --- (правильно настроенный триггер по FSC), но в то же время не «отсекались» основные субпопуляции лейкоцитов - лимфоциты, моноциты и гранулоциты. При этом все три указанные субпопуляции должны попадать в видимую область на диаграмме; ни одна из них не должна «уходить» за пределы диаграммы. Также субпопуляции не должны быть сильно «прижаты» к сторонам диаграммы. Создайте нужный Вам гейт, либо откорректируйте положение уже созданного гейта (возможно только тогда, когда кнопка А серого цвета). Реализуйте нужную Вам стратегию гейтирования. Чтобы на последую щ ей диаграмме/гистограмме отображались лиш ь события из определенного гейта, в верхней ее части выберите нужный вам гейт из ниспадаю щ его списка (по умолчанию - надпись live). Проведите дальнейш ую корректировку настроек, если это необходимо (напряжение на фотоэлектронных умножителях различных каналов ф луоресценции, значения компенсации и т.п.), а также настройку шаблона. Не забудьте сохранить настройки в ф айл (настройки прибора сохраняются тогда, когда кнопка А серого цвета), а также сам шаблон (шаблон можно сохранить тогда, когда кнопка А оранжевая). При изменении значений напряжения на Ф Э У или значений дискриминатора, а также при изменении значений компенсации в процессе измерения, не забывайте нажимать кнопку C le a r (очистить). В противном случае в сохраненном ф айле будут записаны и данные, полученные до начала внесения изменений, так и после них, что некорректно. Сохраненные в результате измерения файлы отображены в закладке S am p les. Пользуясь закладкой File -> Export, Вы можете сохранить полученные данные на внешний носитель инф ормации (например, флеш-накопитель, CD /D VD диск). 5 Выключение анализатора MACSQuant 5.1 В ы к л ю ч е н и е в р у ч н о м р е ж и м е 1) Нажмите на кнопку (главная контрольная кнопка). Вам будет предложено два варианта - “data analysis m ode” и “instrument o ff’. Для выключения выберите второй вариант. Автоматически будет запущен протокол отмывки прибора длительностью около 7 минут (включая инкубацию гидролиний с отмывочным буф ером, последующ ей отмывкой и заполнением гидролиний буфером для хранения). П римечание: п р и б о р м ож ет и сп о л ь зо в а т ь ся в реж им е “ data a n a ly s is m od e” д л я анализа д а н н ы х даж е п о сл е того, как он б ы л вы кл ю ч ен с о тм ы в к о й . 5.2. А в т о м а т и ч е с к о е в ы к л ю ч е н и е Прибор может быть выключен автоматически (если данная опция активирована через программу M ACSQuantify). Эту опцию можно использовать во избежание холостой работы лазеров (что сокращ ает время жизни диодных лазеров). Также опция не позволит прибору находиться во включенном состоянии в течение ночи или во время нерабочих дней, если вдруг оператор забыл выключить прибор. 33