--- стр. 1 ---
ЕОПЙЯ ВЕРНА
ГЕН. Д1
Е.Н.С)
ректор
вел й п м е И Т Кор по рэ йш и »
Е.Н.Схолль-Энгбертс
п?е.___________________________201^ ^ -.
ИНСТРУКЦИЯ
по применению набора реагентов для определения активности
аспартатаминотрансферазы (ACT) в сыворотке и плазме крови
унифицированным методом Райтмана-Френкеля.
(ACT- ВИТАЛ)
^ НАЗНАЧЕНИЕ
" Набор АСТ-ВИТАЛ предназначен для количественного определения активности
аспартатаминотрансферазы (ACT) в сыворотке и плазме крови человека унифицированным
динитрофе1гилгидразиновым методом Райтмана-Френкеля в клинико-диагностических и
биохимических лабораториях и в научно-исследовательской практике.
Набор рассчитан на проведение 400 или 800 определений при расходе 0,25 мл реагента
1 и 0,25 мл реагента 2 на один анатиз.
ПРИНЦИП МЕТОДА
В результате реакции переаминировапия между П,1,-аспартато.м и а-кетоглутаратом,
происходящей под каталитическим действием аспартатамипо-трансферазы, образуются L-
глутамат и оксалоацетат. Определение активности ACT основано на измерении оптической
плотности окрашенных в щелочной среде 2,4-динитрофенилгидразонов а-кетоглутаровой и
щавелевоуксусной кислот, причем гидразон последней обладает гораздо более высокой
оптической плотностью. Концентрация образовавшегося гидразона щавелевоуксусной кислоты
пропорциональ-на активности ACT в ана/шзируемой пробе и измеряется фотометрически при
длине волны 537 (500-560 нм).
СОСТАВ НАБОРА
В состав набора входят:
• реагент 1: субстратная смесь, состоящая из D, L-аспартата, 200 ммоль/л; а-
кетоглутаровой кислоты, 2.0 ммоль/л; фосфатного буферного раствора. 100 ммоль/л;
pH 7,4; готов к применению - 1 флакон (100 мл или 250 мл);
• реагент 2; раствор 2,4-динитрофенилгидразина. содержащий 2,4-
дииитрофенилгидразин, 1,0 ммоль/л; соляную кислоту, 1,0 моль/л; готов к
применению - 1 флакон (100 мл или 250 мл);
• реагент 3; гидроокись натрия, концентрат, 4.0 моль/л - 1 флакон (100 мл или 250
мл);
• калибратор (калибровочный раствор пирувата натрия, 1,0 ммоль/л), готов к
применению - 1 флакон (5,0 мл).
АНАЛИТИЧЕСКР1Е ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА
Линейная область определения активности ACT- в диапазоне от 4,0 до 65 Е/л,
отклонение от «линейности» - не более 10 %.
Чувствительность определения - не более 3,0 Е/л.
Коэффициент вариации результатов определений - не более 10 %.
--- стр. 2 ---
€
Окраска стабильна в течение 30 мин.
Качество набора может проверяться по отечественным или зарубежным контрольным
сывороткам, аттестованным данным методом.
Нормальные величины активности ACT в сыворотке (плазме) крови человека - не более
12 Е/л.
Рекомендуется в каждой лаборатории уточнить диапазон значений нордмальны.\ величин
для обследуемого контингента.
АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ
Свежая негемолизированная сыворотка (плазма) крови.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Потенциальный риск применения набора - класс 2а.
Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.
Реагент 2 содержит 2,4-динитрофенилгидразин, реагент 3 - щелочь. При работе с ними
следует соблюдать осторожность и нс допускать попадания этих реагентов на кожу и
слизистые; при попадании следует промыть пораженное место большим количеством
проточной воды. В случае попадания внутрь следует выпить 0,5 л теплой воды и вызвать рвоту.
Меры предосторожности - соблюдение «Правил устройства, техники безопасности,
производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в
лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы
Министерства здравоохранения СССР» (Москва, 1981 г.).
При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые
перчатки, так как образцы крови человека следует рассматривать как потенциально
инфицированные, способные длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита
или любой другой возбудитель вирусной инфекции.
Согласно классификации по СанПиН 2.1.7.2790-10 компоненты набора могут быть
отнесены к классу «Г». Утилизацию использованных реагентов и реагентов с истекшим сроком
годности производить в соответствии с СанПиП 2.1.7.2790-10 в отношении отходов класса «Г».
Пе допускается использование серии набора по истечении срока ее годности.
ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАГЕНТЫ:
Спектрофотометр, длина волны 537 нм, или фотоэлектроколориметр, длина волны
500-560 нм, кювета с длиной оптического пути 10 мм;
I - термостат, обеспечивающий температуру+37±1°С;
пробирки вместимостью 5,0-10 мл;
секундомер;
пипетки, позволяющие отбирать объемы жидкости 0,01; 0,1; 0,25; 2,5 и 5.0 мл;
колба мерная вместимостью 1000 мл;
вода бидистиллированная. свободная от карбонатов;
физиологический раствор (0,9 % NaCl);
перчатки резиновые или пластиковые.
ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ
Приготовление рабочего раствора реагента 3
Содержимое флакона с реагентом 3 (100 мл) количественно перенести в мерную колбу
вместимостью 1000 .мл, довести объем бндистиллированной водой, свободной от карбонатов,
до метки и тщательно перемешать.
Рабочий раствор реагента 3 можно хранить во флаконе из полиэтилена с плотно
закрывающейся крышкой при комнатной температуре (+18-25°С) не более 3 мес.
--- стр. 3 ---
Построение калибровочного графика
В семь пробирок вместимостью 10 мл внести калибратор, реагент 1 и физиологический
раствор в количествах, указанных в таблице.
Таблица
№
пробирок
Калибратор,
мл
Физиологический
раствор, мл
Реагент 1, мл Активность ACT,
Е/л
1 0,01 0,340 0,250 3,6
2 0,025 0,325 0,250 9,0
3 0,05 0,300 0,250 18
4 0,10 0,250 0,250 37
5 0,15 0,200 0,250 56
6 0,20 0,150 0,250 77
Контроль - 0,350 0,250 -
Тщательно перемешать содержимое пробирок, добавить в каждую пробирку по 0,5 мл
реагента 2, перемешать, вьщержать при комнатной температуре в течение 20 мин, добавить по
5,0 мл рабочего раствора реагента 3, оставить на 10 мин при комнатной температуре для
.развития окраски и измерить оптическую плотность проб при длине волны 537 (500-560) нм в
^кювете с длиной оптического пути 10 мм против контроля - физиологического раствора.
Определить разность (Л Е) .между значениями оптических плотностей проб с 1-й по 6-
ю и значением оптической плотности контрольной (холостой) пробы.
Построить калибровочный график, откладывая на оси ординат значения ДЕ для каждой
пробы, а на оси абсцисс - соответствующие им значения активности ACT.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
Подготовить по одной пробирке вместимостью 10 мл для каждой анализируемой пробы
сыворотки (плазмы) крови, а также по одной пробирке для контрольной (холостой) пробы по
каждой анализируемой пробе крови.
Во все пробирки внести по 0,25 мл реагента 1 и инкубировать при температуре -ь37°С в
течение 5 мин. В пробирки для опытных проб добавить по 0,05 мл анализируемых образцов
сыворотки (плазмы) крови, тщательно перемешать и инкубировать при температуре +37°С в
течение 30 мин. После окончания инкубации во все пробирки добавить по 0,25 мл реагента 2, а
в каждую пробирку для контрольной (холостой) пробы добавить также по 0,05 мл
соответствующего анализируемого образца сыворотки (плазмы) крови. Пробы тщательно
^ перемешать и выдержать при комнатной температуре (-*-18-25°С) в течение 20 мин. После
* окончания инкубации добавить во все пробирки по 2,5 мл рабочего раствора реагента 3, пробы
тщательно перемешать и выдержать при комнатной температуре в течение 10 мин. Измерить
оптическую плотность опытных проб против контрольных (холостых) проб при длине волны
537 (500-560) нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм.
Активность ACT в анализируемых пробах сыворотки (плазмы) крови определить по
калибровочному графику.
Для пересчета единиц активности ACT (Е/л) в ммоль/(лхч) или в мккат/л необходимо
найденное по калибровочному графику значение активности ACT разделить на коэффициенты
16,67 или 60,68, соответственно.
УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
Набор следует хранить в темном месте при комнатной температуре в упаковке
предприятия-изготовителя в течение всего срока годности.
Срок годности набора - 18 мес.
Реагент 2 и реагент 3 после вскрытия флаконов можно хранить в те.мном месте при
комнатной температуре в течение всего срока годности.
Калибратор и реагент 1 после вскрытия флаконов .можно хранить в гемном месте при
температуре +2-8°С в плотно закрыто.м флаконе не более 6 мес.
Рабочий раствор реагента 3 можно хранить при комнатной температуре не более 3 мес.
\
\