Набор реагентов для определения 25 мутаций в гене CFTR (муковисцидоза) методом ДНК-микрочипов («Муковисцидоз-БиоЧип») по ТУ 9398-248-98539446-2012 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 --- Приказом Росздравнадзора Генеральный от 2012 г. № ООО «Компайчз*ХлгкорЛиоХ%-------- ----- ^ \ Л «УТВЕРЖДЕНА» «УТВЕРЖДАЮ» Ш вырёвМ .Ц,„, « р |Г » 1 ^ ° ИНСТРУКЦИЯ по ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ 25 МУТАЦИЙ В ГЕНЕ C F T R (МУКОВИСЦИДОЗА) МЕТОДОМ ДНК-МИКРОЧИПОВ «Муковисцидоз-БиоЧип» 1. НАЗНАЧЕНИЕ 1.1. Диагностический набор «Муковисцидоз-БиоЧип» предназначен для выявления мутаций в _ гене CFTR, наличие которых приводит к развитию наследственного заболевания муковисцидоз " (MB). Набор позволяет единовременно детектировать 25 наиболее часто встречающихся на территории Российской Федерации мутаций, связанных с развитием тяжелого фенотипа этого заболевания (Таблица 1). 1.2. MB - моногенное заболевание, обусловленное мутацией гена CFTR (муковисцидозного трансмембранного регулятора) и характеризующееся поражением экзокринных желез жизненно важных органов и систем. MB - одно из наиболее распространенных тяжелых наследственных заболеваний. Среди представителей европеоидной расы в среднем носителем мутантной аллели гена CFTR является каждый 25-й человек. Необходимость ранней диагностики муковисцидоза определяется следующими факторами: • раннее начало лечения MB обеспечивает более высокий терапевтический эффект и улучшает прогноз течения заболевания; • своевременная постановка диагноза вносит ясность в понимание родителями состояния ребенка и позволяет им и больному вовремя адаптироваться к трудностям, связанным с хроническим заболеванием; Ф • своевременная постановка диагноза обоим родителям о носительстве мутантноРо гена CFTR позволяет семье вовремя рещить необходимые вопросы, связанные с рождением здорового ребенка (генетическое консультирование, пренатальная диагностика MB, планирование последующих беременностей); • отсроченность диагноза, а следовательно, и отсутствие адекватной терапии, может привести к развитию необратимых патологических изменений в легких; • при отсутствии лечения нарушения со стороны желудочно-кишечного тракта могут привести к недостаточности питания и значительному отставанию в физическом развитии; • несвоевременность постановки диагноза MB может быть сопряжена с излишними, сложными, дорогостоящими диагностическими и лечебными мероприятиями, связанными с лечением осложнений MB. --- стр. 2 --- Таблица 1. Мутации в гене CFTR, детектируемые диагностическим набором «Муковисцидоз-БиоЧип » 10 11 1 2 13 14 15 16 17 18 19 2 0 21 2 2 23 24 25 Мутация F508del Del ех2-3 2143delT G542X G551D 2184insA W1282X N1303K 3732delA 1717-lO A 1677delTA 2183AA-G S1196X 3821delT R553X 1078delT I507del 2789+ 50A R1162X 3849+lOkbOT G85E 621+1G>T R347P R347H R334W Частота среди всех носителей мутаций в гене CFTR (%) 64,7 8 , 8 2 , 0 2 , 0 1,9 1 ,8 1 ,6 1,3 1 ,2 1 ,0 0 , 8 0 , 8 0 , 8 0 , 8 0 , 8 0,7 0,7 0,7 0 , 6 0,5 0,4 0,4 0,3 0,3 0 , 2 1.3. Набор предназначен только для применения ш vitro. 1.4. Набор «Муковисцидоз-БиоЧип» может быть использован в клинической молекулярно- ф генетической диагностике для вьывления носительства мутаций в гене CFTR. 1.5. Результаты, полученные с помощью диагностического набора «Муковисцидоз- БиоЧип», должны интерпретироваться специалистами только в контексте общей клинической картины. Производитель не гарантирует отсутствия мутаций в гене CFTR, не входящих в панель набора «Муковисцидоз-БиоЧип». 1.6. Набор адаптирован для применения на территории Российской Федерации и стран СНГ. Частота анализируемых с помощью диагностического набора «Муковисцидоз-БиоЧип» мутаций в гене CFTR может варьировать в разных популяциях. 1.7. Один набор рассчитан на проведение анализа 5 или 10-ти клинических образцов ДНК пациентов. 2. ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА 2.1. Принцип действия Исследуемый аналит - 25 мутаций в гене CFTR (Таблица 1). --- стр. 3 --- I в основе анализа лежит метод обратной гибридизации на биочипе: синтетическая мишень иммобилизована на биочипе, а зондом является меченый цианином (Су5) ПЦР-продукт (Рисунок 1). Алгоритм проведения анализа: 1. Амплификация интересующих фрагментов ДНК пациента в ходе двухстадийной полимеразной цепной реакции (ПЦР). 2. Гибридизация полученных продуктов ПЦР на твердой фазе (биочипе). 3. Сканирование флуоресценции биочипа. 4. Анализ результатов. М ечены й д у п л е к с Т в ё р д а я ф а з а Рисунок 1. Принцип метода обратной гибридизации на биочипе A B C D E F G H I Ш Ш'^ё Ф Л Я М * НОРМА МУТАЦИИ Рисунок 2. Схематическое изображение биочипа Слева: Внешний вид биочипа. 1-4 - четыре копии биочипа. Справа: Увеличенное изображение биочипа. Все мишени нанесены в виде парных точек. Поле А1 - Е5 составляют мишени дикого типа. Поле F1 - J5 составляют мутантные мишени. Последний столбец К - контроль для позиционирования маски. --- стр. 4 --- Диагностический набор «Муковисцидоз-БиоЧип» состоит из двух комплектов - компонентов для проведения полимеразной цепной реакции и набора для гибридизации. 2.2. Состав набора ( • Состав набора «Муковисцидоз-БиоЧип» Назва ние Компонент Тип фасовки Кол- во, шт. Объем в пробирке /флаконе, Условия хранения Компоненты для проведения полимеразной цепной реакции А1-А5 Смеси праймеров для ПЦР1. Микропробирки с красными крышками; 0,5 мл 5 По 20 мкл -18...-22°С В1-В6 Смеси праймеров для ПЦР2. Непрозрачные микропробирки с зелеными крышками; 0,5 мл 6 По 20 мкл -18...-22°С АБ Амплификацион- ный буфер Микропробирка с бесцветной крышкой; 1,5 мл 1 1,2 мл -18...-22°С П ДНК-полимераза Микропробирка с жёлтой крышкой; 0,5 мл 1 20 мкл -18...-22°С Компоненты для гибридизации Биочип Биочип Биочип помещен в пластиковую гибридизационную камеру и герметично запаян в металлизированную пластиковую упаковку с инертной средой. Стекло - 75x25x1 мм. 5 -18...-22°С V Камера Г ибридизационная камера Пластиковый футляр; 70x34x2 мм 5 -18...-22°С ББ Блокирующий буфер Флакон с зеленой крышкой; 50 мл 2 По 50 мл -18...-22°С ГБ Г ибридизационный -буфер Флакон с зеленой крышкой; 13 мл 1 10 мл -18...-22°С Примечание: Блокирующий и гибридизационный буферы м ож но хранить отдельно температуре + 2 ..Л 8 °С . при 3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 3.1. Аналитическая чувствительность Минимальная допустимая концентрация ДНК в исследуемом образце - 1 нг/мкл. 3.2. Аналитическая специфичность -Положительный контроль: наличие всех сигналов в поле дикого типа и отсутствие сигналов в поле мутаций при постановке с контрольным образцом дикого типа. --- стр. 5 --- -Отрицательный контроль: отсутствие сигналов на биочипе при постановке гибридизации с использованием продуктов реакции ПЦР2, проведенной без добавления ДНК-матрицы из ПЦР1 . 3.3. Диагностическая специфичность Диагностическая специфичность набора равна 95% 4. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖ НОСТИ 4.1. Потенциальный риск применения набора - класс 1. 4.2. Во избежание контаминации ДНК строго рекомендуется физическое разделение пре- и пост-амплификационных этапов: отдельные помещения, отдельные халаты, отдельные пипетки и другие лабораторные материалы. 4.3. Приготовление ПЦР-смесей должно проводиться с использованием наконечников с фильтрами. 4.4. Все манипуляции с биочипами должны проводиться в защищенном от пыли месте. 4.5. Не использовать компоненты набора после истечения срока их годности. 4.6. Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. 4.7. При работе с набором следует соблюдать требования ГОСТ Р 529205-2007 «Лаборатории медицинские. Требования безопасности». 4.8. В наборе отсутствуют компоненты, содержащие потенциально опасные биологические ^материалы. 4.9. Удаление неиспользованных реактивов необходимо проводить в соответствии с требованиями СП 2.1.7.728-99 «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно профилактических учреждений». 4.10. При работе с образцами биоматериала необходимо руководствоваться МУ 287-113 «Методические указания по дезинфекции, предстерилизационной очистке и стерилизации изделий медицинского назначения» и МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот, при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» и соблюдать санитарно-эпидемические правила СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». 5. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ 5.1. Этап проведения амплификации (ПЦР) -ПЦР-бокс; ^ -амплификатор для проведения ПЦР с нагреваемой крышкой (методика анализа с ^использованием набора «Муковисцидоз-БиоЧип» отработана на амплификаторах MyCycI^’ CFX (Bio-Rad) и Biometra; -центрифуга/вортекс типа «Микро-спин FV-2400» с максимальной скоростью вращения 2400 об/мин; -пипетки полуавтоматические одноканальные со сменными наконечниками с изменяемым объёмом отбора жидкостей: на 0 ,5-10 мкл; на 5 - 50 мкл; на 20 - 200 мкл; -стерильные пробирки на 0,2 мл или на 0,5 мл для ПЦР; -пробирки типа «эппендорф» на 1,5 мл; -штатив «рабочее место» для пробирок 0,2 или 0,5 мл; -наконечники к пипеткам-дозаторам с фильтрами; -вода ампулированная или деионизованная; -перчатки резиновые без обсыпки; -фильтровальная бумага; -холодильник фармацевтический типа Sanyo MPR-414F. --- стр. 7 --- Перемешать смеси на вортексе и собрать капли коротким центрифугированием при комнатной температуре (+18...+25 °С) в течение 10 секунд при 2400 об/мин. 6) Для каждого анализируемого образца приготовить по 5 пробирок, подходящих для используемого типа амплификатора, и промаркировать их от 1 до 5. Али квотировать каждую рабочую смесь в соответствующие пять пробирок по 22 мкл. 7) Добавить по 3 мкл каждой смеси праймеров «А1»-«А5» в соответствующие пробирки с рабочими смесями. Перемешать готовые смеси на вортексе и удалить со стенок пробирок капли центрифугированием при комнатной температуре в течение 10 секунд при 2400 об/мин. Примечание: После приготовления смесей убр ать все исходные компоненты в морозильную камеру на -18...-22 °С. 8) Поместить пробирки в амплификатор и провести реакцию по следующей программе: Денатурация +95 °С - 3 мин +96 °С - 5 с +49 °С - 20 с + 70° С - Юс +96 °С - 2 с +53 ° С - Юс +68 ° С -Ю с 6 циклов 29 циклов 9) Объединить продукты ПЦР1: в отдельную 1,5 мл пробирку типа «эппендорф» внести 700 мкл воды и добавить по 2 мкл из всех пяти ПЦР-смесей после проведения реакции ПЦР1. Примечание: Объединенные и разбавленные в воде продукты ПЦ Р1 можно хранить в течение 7 дней в морозильной камере на -18...-22 "С . 7.1.2. Второй этап ПЦР Внимание! П Ц Р 1 и П Ц Р 2 следует проводить в разных боксах. При о т с у т с т в и и возмож ности пространственного разнесения П Ц Р 1 и П Ц Р 2 тщ а те л ьн о пр о ж игать бокс ультраф иолетовы м свето м после постановки каждого анализа. Внимание! При каж д ом проведении анализа необходимо вкл ю чи ть в постановку П Ц Р отрицательны й контроль (П Ц Р 2 б е з Д Н К и з П Ц Р 1 ). В реакционную смесь для отрицательного контроля вм есто объединенных продуктов П Ц Р 1 добавить 10 мкл воды. 1) Заранее разморозить пробирки «В1»-«В6» и «АБ». Перед использованием все реагенты тщательно перемешать на вортексе. Удалить со стенок пробирок капли смеси коротким центрифугированием при комнатной температуре (+18...+25 °С) в течение 10 секунд при 2400 об/мин. 2) Взять необходимое количество пробирок (объемом 0,2 или 0,5 мл), соответст 1^ющее числу анализируемых образцов, промаркировать их и расположить в штативе. 3) Достать из набора пробирку «П» и установить ее в штатив. 4) «В1», «В2», «ВЗ», «В4», «В5», «В6», «АБ» и «П» готовы к использованию. 5) Для каждого образца приготовить рабочую смесь по протоколу: «АБ» (амплификационный буфер) 127 мкл «Пл^ДНК-полимераза) 3,3 мкл Объединенные продукты ПЦР 1 10 мкл Общий объём: 140,3 мкл. Перемешать смеси на вортексе и собрать капли коротким центрифугированием при комнатной температуре в течение 10 секунд при 2400 об/мин. 6) Для каждого анализируемого образца приготовить по 6 пробирок, подходящих для используемого типа амплификатора, и промаркировать их от 1 до 6. Аликвотировать каждую рабочую смесь в 6 пробирок по 22 мкл. 7) Добавить по 3 мкл каждой смеси праймеров «В1»-«В6» в соответствующие пробирки с рабочими смесями. Перемешать готовые смеси на вортексе и удалить со стенок пробирок капли центрифугированием при комнатной температуре в течение 10 секунд при 2400 об/мин. --- стр. 8 --- 1 Примечание: После приготовления смесей убр ать все исходные компоненты в морозильную меру на -18...-22 °С. 8) Поместить пробирки в амплификатор и провести реакцию по следующей программе: Денатурация +95 °С - 1 мин Г +96 ° С - 2 с 40 циклов ^ + 5 5 ° С -1 0 с +68 °С - 5 с 7.2. Гибридизация 7.2.1. Не менее чем за час перед гибридизацией разморозить блокирующий буфер («ББ») и гибридизационный буфер («ГБ»). Включить водяную баню или суховоздущный термостат на ■ I - 5 0 °С (водяная баня должна быть наполнена водой на 5 см выще площадки для размещения стакана). Поместить в водяную баню емкость Хеллендаля с 70 мл «ББ» и стакан объемом 50 мл с 40 мл воды. 7.2.2. Поместить флакон с «ГБ» в водяную баню (термостат) и вьщержать 10 минут при +50 °С до полного растворения осадка. 7.2.3. Нанести маркировку на гибридизационные камеры и этикетки биочипов водостойким фмаркером. 7.2.4.Поместить биочип в «ББ» в емкость Хеллендаля при +50 °С на 10 минут. На всех последующих этапах работы с биочипом не допускать его высыхания! 7.2.5. Внести 1 мл «ГБ» в пробирку типа «эппендорф» на 1,5 мл. 7.2.6. Внести в неё указанное ниже количество меченых зондов из смесей ПЦР2 (В1-В6): В1 - 7 мкл, В2 - 10 мкл, ВЗ - 4 мкл, В 4 -2 1 мкл, В5 - 17 мкл, В6 - 17 мкл. Перемещать смесь на вортексе и собрать капли коротким центрифугированием. 7.2.7. Перенести гибридизационный буфер с зондами в гибридизационную камеру. 7.2.8. Извлечь биочип из блокирующего буфера, вставить его в гибридизационную камеру так, чтобы маркировка биочипа находилась наверху и лицевой стороной к расщирению камеры. Проконтролировать, чтобы биочип был покрыт буфером не менее чем на 4 см. Поместить камеру с ц л биочипом в водяную баню (термостат) и инкубировать при +50 °С в течение 90 минут. Камеры с 'биочипами должны быть расположены вертикально и на 2/3 находиться в воде. В качестве держателя рекомендуется использовать химический стакан объемом 50 мл с 40 мл воды. 7.2.9. После окончания гибридизации извлечь биочип из камеры и промыть в ёмкости с дистиллированной водой 1 минуту при комнатной температуре, затем высущить центрифугированием. 7.3. Высущивание биочипа. Для удаления остатков жидкости с поверхности биочипа перед сканированием‘й предотвращения контаминации рабочей поверхности (поверхности биочипа, на которую нанесены мишени) продуктами амплификации рекомендуется открутить биочипы в центрифуге (Дастан ОПн-3.02 или ELMI СМ-б), поместив по 2 стекла в фалькон 40 мл таким образом, чтобы рабочие поверхности биочипов были направлены друг против друга. Примечание: В случае использования гибридизационной станции «Тесап» следуйте инструкции производителя. --- стр. 9 --- 8. РЕГИСТРАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ 8.1. Сканирование. -«Муковисцидоз-БиоЧип» совместим со всеми сканерами для чипов (ScanArray Gx j(PerkinElmer), MArS (Ditabis) и PowerScanner (Tecan)) стандартного размера 75x25x1 мм. (Настройки сканера (мощность лазера, коэффициент усиления, разрешение) устанавливаются индивидуально. Биочип вставляется в сканер рабочей поверхностью вверх и маркировкой наружу. 8.2. Результат сканирования биочипа сохраняется в формате TIF. Внимание! Не следует касаться рабочей области биочипов, поскольку это может привести к повреждению их поверхности. Биочипы следует брать в перчатках без обсыпки и держать за края в области маркировки. Вся работа с биочипами должна проводиться в месте, защищенном от пыли. 9. АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ Для снижения вероятности ошибки поле анализа представлено на биочипе в четырех повторах. Результаты теста могут быть проанализированы визуально или с помощью программы МВ25- СКАН. Схема биочипа «Муковисцидоз-БиоЧип» приведена на Рисунке 3. Все мишени нанесены в ^ вертикальных дублях. Зоны А-Е (1-5) представляют собой мишени, соответствующие дикому типу гена по исследуемым мутациям. Зоны F-J (1-5) соответствуют мутантным аллелям. Зона К (1-5) является маркером для позиционирования координатной маски (двумерной координатной сетки, отражающей положение точек на графическом изображении, полученном при сканировании). Критерием правильности работы набора реагентов «Муковисцидоз-БиоЧип» является наличие сигналов в поле дикого типа, что является контролем прохождения всех этапов реакции. Все сигналы в поле дикого типа должны присутствовать для всех образцов ДНК, за исключением случаев анализа образцов ДНК мутантной гомозиготы. В этом случае в мутантном поле должны светиться точки, отсутствующие в поле дикого типа. При визуальном анализе должны быть учтены следующие условия: 1) Вывод о наличии мутации основывается на сравнении интенсивности сигналов топографически сходных точек в полях А-Е (1-5) и F-J (1-5). Например, А1 и F1, А2 и F2 и т.п. Положительным сигналом в «мутантном поле» считается сигнал, интенсивность которого равноценна или лишь незначительно отличается от интенсивности топографически соответствующей точки в поле «дикого типа». Возможны следующие три варианта результатов (на примере полей А1 и F1): 1. Присутствие сигнала в А1 и отсутствие в F1. Вывод: гомозигота - дикий тип по мутации del Щ ех2,3. V 2. Присутствие сигналов и в А1 и в F1. Вывод: гетерозигота по мутации del ex 2,3. 3. Отсутствие сигнала в А1 и присутствие в F1. Вывод: гомозигота по данной мутации. В случае дикого типа по всем анализируемым мутациям все точки в зоне А-Е (1-5) должны давать положительные сигналы. В случае наличия мутаций должно появиться не более двух точек в зоне F-J (1-5). В противном случае анализ рекомендуется повторить. 2) Если в .поле дикого типа отсутствует более одной пары точек, то результаты анализа считаются недействительными. В этом случае рекомендуется повторение ПЦР. Исключение составляют следующие ситуации: -отсутствие А1 и А2 в случае присутствия сигнала F1; -отсутствие А1 и А2 в случае присутствия сигнала F2; -отсутствие D1 и D2 в случае присутствия сигнала II; -отсутствие D1 и D2 в случае присутствия сигнала 12; -отсутствие ВЗ и В5 в случае присутствия G3; -отсутствие ВЗ и В5 в случае присутствия G5.