Набор реагентов для количественного определения ДНК маркерных микроорганизмов бактериального вагиноза методом полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме "реального времени" "АмплиПрайм® BV" по ТУ 21.20.23-032-09286667-2018 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 2 --- • • АмплиПрайм / IVD Набор реагентов для количественного определения ДНК маркерных микроорганизмов бактериального вагиноза методом полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме «реального времени» «АмплиПрайм® BV» по ТУ 21.20.23-032-09286667-2018 «АмплиПрайм® BV» ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ iiJ ООО «НекстБио», Россия, 111394, г. Москва, ул. Полимерная, д. 8, стр. 2, тел. (495) 620-08-73, e-mail; info@nextbio.ru --- стр. 3 --- ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ...................................................................3 1. НАЗНАЧЕНИЕ................................................................................................................4 1.1 Область применения....................................................................................................4 1.2. Показания к применению............................................................................................4 1.3. Противопоказания к применению...............................................................................4 2. ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА.......................................................................................4 2.1. Формы выпуска, состав и комплектность...................................................................4 2.2. Принцип метода............................................................................................................6 2.3. Прослеживаемость значений калибратора ПКО STI.................................................7 3. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА................................................................................................8 3.1. Внутренний контроль качества...............................................................................8 3.2. Рекомендуемые контрольные материалы.............................................................9 4. ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................................9 5. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ И ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ .........................................10 6. ДОПОЛНИТЕЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ ........................................11 6.1. Взятие исследуемого материала..........................................................................11 6.2. Экстракция ДНК из исследуемых образцов.........................................................12 6.3. Амплификация, детекция продуктов амплификации, анализ и интерпретация результатов....................................................................................................................12 7. ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ......................................................................................14 8. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ..............................................................................14 8.1. Экстракция ДНК из исследуемого материала.....................................................14 8.2. Подготовка реагентов для амплификации...........................................................15 8.3. Внесение проб ДНК, проведение амплификации и детекции............................16 8.4. Анализ и вычисление результатов.......................................................................17 8.5. Интерпретация результатов..................................................................................18 8.6. Возможные ошибки.................................................................................................19 8.7. Диагностическое значение полученного результата..........................................20 9. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА................................................20 9.1. Предел обнаружения.............................................................................................20 9.2. Линейный диапазон измерения и предел измерения.........................................20 9.3. Аналитическая специфичность.............................................................................21 9.4. Воспроизводимость и повторяемость измерения...............................................21 9.5. Правильность измерения......................................................................................22 9.6. Оценка влияния интерферирующих веществ и ДНК человека..........................23 10. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ НАБОРА.... 23 11. ГАРАНТИИ ПРОИЗВОДИТЕЛЯ.................................................................................24 12. БИБЛИОГРАФИЯ.........................................................................................................25 13. СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ДОКУМЕНТАЦИИ ПРОИЗВОДИТЕЛЯ..............26 Версия 29.07.19 --- стр. 4 --- список СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИИ c t г э ДНК ДНКаза дНТФ ИППП Набор/ АмплиПрайм® BV ПК ПКО STI ОК ОКО ПЦР РУ УДГ - Cycle threshold (пороговый цикл) - геномные эквиваленты - дезоксирибонуклеиновая кислота - дезоксирибонуклеаза - дезоксирибонуклеотидтрифосфат - инфекции, передаваемые половым путем - Набор реагентов для количественного определения ДНК маркерных микроорганизмов бактериального вагиноза методом полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме «реального времени» «АмплиПрайм® BV» по ТУ 21.20.23-032- 09286667-2018 - положительный контроль - положительный контрольный образец, ДНК-калибратор - отрицательный контроль - отрицательный контрольный образец - полимеразная цепная реакция - регистрационное удостоверение - урацил-ДНК-гликозилаза Версия 29.07.19 --- стр. 5 --- 1. НАЗНАЧЕНИЕ Предназначен для количественного определения ДНК Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Lactobacillus spp. и общего количества бактерий (Bacteria) в биологическом материале (отделяемое слизистой оболочки влагалища) методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени». На основании полученных значений рассчитываются коэффициенты соотношения концентраций ДНК Lactobacillus spp., общего количества бактерий и условно-патогенной микрофлоры (G. vaginalis и А. vaginae), что позволяет определять состояние влагалищного биотопа в рамках диагностики бактериального вагиноза - заболевания, связанного с подавлением нормальной микрофлоры влагалища (Lactobacillus spp.) и заменой ее условно-патогенной (в том числе G. vaginalis и А. vaginae). Использование набора позволяет проводить динамические наблюдения за состоянием влагалищного биотопа и контролировать эффективность проводимой терапии бактериального вагиноза. Материалом для проведения ПЦР служат пробы ДНК, экстрагированные из исследуемого материала с помощью наборов реагентов, рекомендованных Производителем в разделе «Дополнительное оборудование и материалы». 1.1 Область применения Набор используется в клинической лабораторной диагностике для исследования биологического материала, полученного от женщин репродуктивного возраста с подозрением на наличие бактериального вагиноза. Результаты ПЦР-исследования учитываются в комплексной диагностике бактериального вагиноза. 1.2. Показания к применению Набор используется в комплексной диагностике бактериального вагиноза. 1.3. Противопоказания к применению Нарушение целостности упаковки, истекший срок годности, несоблюдение требований инструкции. 2. ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА 2.1. Формы выпуска, состав и комплектность Набор выпускается в двух формах (состав форм и комплектность поставки см. в таблице 1 и 2). Обе формы выпуска предназначены для проведения амплификации ДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Для проведения полного исследования необходимо использовать наборы реагентов для экстракции ДНК, рекомендованные в разделе «Дополнительное оборудование и материалы». Версия 29.07.19 4 --- стр. 6 --- Форма выпуска 1 включает смесь для проведения ПЦР, раскапанную под прослойку парафина по стрипованным (12 стрипов по 8 пробирок) пробиркам объемом 0,2 мл. Форма предназначена для применения совместно с амплификаторами планшетного типа и рассчитана на проведение исследования 96 образцов, включая контроли. Форма выпуска 2 включает смесь для проведения ПЦР в пробирке объемом 1,5 мл для дозирования в любые типы пробирок. Форма предназначена для применения совместно с амплификаторами планшетного и роторного типа и рассчитана на проведение исследования 96 образцов, включая контроли. Форма может быть использована совместно с автоматическими станциями для приготовления и дозирования реакционных смесей. Таблица 1 Состав форм выпуска набора Компонент Объем, мл Количество Описание Форма выпуска 1 ПЦР-смесь BV 0,01 96 пробирок(12 стрипов по 8 пробирок) Буферный раствор со специфическими праймерами, флуоресцентно-мечеными зондами и дНТФ. Прозрачная жидкость, раскапана под парафин. Буфер А 0,96 1 пробирка Буферный раствор с термостабильной ДНК- полимеразой Taq, сульфатом магния и урацил- ДНК-гликозилазой. Прозрачная жидкость. ПКО STI 1,0 1 пробирка Положительный контрольный образец, ДНК- калибратор. Прозрачная жидкость. ОКО 1,0 1 пробирка Отрицательный контрольный образец. Прозрачная жидкость. Программное обеспечение «АмплиПрайм® BV ПО» версия 1.0 - - На USB флэш-накопителе. Форма выпуска 2 ПЦР-смесь BV 0,96 1 пробирка Буферный раствор со специфическими праймерами, флуоресцентно-мечеными зондами и дНТФ. Прозрачная жидкость. Буфер А 0,96 1 пробирка Буферный раствор с термостабильной ДНК- полимеразой Taq, сульфатом магния и урацил- ДНК-гликозилазой. Прозрачная жидкость. ПКО STI 1,0 1 пробирка Положительный контрольный образец, ДНК- калибратор. Прозрачная жидкость. ОКО 1,0 1 пробирка Отрицательный контрольный образец. Прозрачная жидкость. Программное обеспечение «АмплиПрайм® BV ПО» версия 1.0 - - На USB флэш-накопителе. Версия 29.07.19 --- стр. 9 --- i 3. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА 3.1. Внутренний контроль качества 3.1.1. Отрицательный и положительный контроли исследования Для оценки качества получаемых результатов каждая группа экстрагируемых образцов и каждая индивидуальная постановка ПЦР должны включать контрольные образцы: отрицательный контроль (ОК), положительный контроль (ПК). Результаты для контролей должны соответствовать заданным критериям валидности, указанным в разделе «Интерпретация результатов». В качестве отрицательного контроля используется реагент ОКО, входящий в состав набора. Отрицательный контроль тестируется, начиная с этапа экстракции, и позволяет контролировать возможную контаминацию другими образцами или ампликонами. В пробирке с отрицательным контролем ДНК выявляемых микроорганизмов и участок ДНК, общий для всех бактерий, не должны детектироваться в концентрации, превышающей граничное значение, указанное во вкладыше, прилагаемом к набору. В случае несоответствия результата для контроля заданным критериям валидности, результаты для всех образцов в постановке считаются недостоверными. Необходимо предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации и повторить исследование всех исследуемых образцов и контролей, начиная с этапа экстракции. В качестве положительного контроля используется реагент ПКО STI, входящий в состав набора. В случае несоответствия результатов для положительного контроля заданным критериям валидности, результаты для всех образцов в постановке считаются недостоверными, требуется повторить исследование всех исследуемых образцов и контролей, начиная с этапа экстракции. 3.1.2. Анализ калибровки Количественная оценка концентрации ДНК исследуемых образцов проводится относительно количественно охарактеризованного положительного контрольного образца ПКО STI. Исследование ПКО STI проводится параллельно с исследованием образцов, начиная с этапа экстракции. Определение концентрации ДНК производится в соответствии с заданными значениями концентраций ПКО и полученными значениями порогового цикла (Ct) для ПКО и исследуемых образцов. Для повышения точности количественной оценки дополнительно используется поправка, учитывающая эффективность экстракции ДНК из ПКО и исследуемых образцов. Версия 29.07.19 --- стр. 10 --- 3.1.3. Мониторинг лаборатории на наличие контаминации Рекомендуется раз в месяц проводить мониторинг лаборатории на контаминацию продуктами амплификации, исследуемыми образцами, положительными контрольными образцами. Оценка наличия/отсутствия контаминации проводится путем исследования смывов с различных объектов: пипеток, рабочих поверхностей лабораторной мебели, оборудования и поверхностей помещений. Взятие и исследование смывов следует проводить согласно процедуре, описанной в МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». При обнаружении контаминации необходимо провести обработку лаборатории моющими и дезинфицирующими растворами согласно указаниям, описанным в МУ 1.3.2569-09. 3.2. Рекомендуемые контрольные материалы В качестве контрольных материалов для проверки заявленных функциональных характеристик набора могут быть использованы зарегистрированные на территории Российской Федерации панели контрольных образцов, предназначенные для проведения внутреннего и внешнего контролей качества лабораторных исследований по обнаружению ДНК выявляемых микроорганизмов. 4. ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ 4.1. Набор применяется только для диагностики in vitro. 4.2. Набор предназначен для работы только с исследуемым материалом, указанным в разделе «Назначение». Исследование других видов биологического материала может привести к получению недостоверных результатов. 4.3. Получение достоверных результатов обеспечивается выполнением требований, предъявляемых к взятию, транспортированию и хранению образцов исследуемого материала (см. раздел «Исследуемый материал»). 4.4. При проведении исследования недопустимо использование экспресс- методов экстракции ДНК. 4.5. Применение набора возможно только персоналом, обученным методам молекулярной диагностики и правилам работы в клинико-диагностической лаборатории. 4.6. При работе с набором следует использовать только амллификаторы с системой детекции флуоресцентного сигнала, характеристики которых удовлетворяют требования, указанные в разделе «Дополнительное оборудование и материалы». Версия 29.07.19 --- стр. 11 --- 5. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ И ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ 5.1. Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно биологические (ПЦР) исследования биологического материала на наличие возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно- эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами» и методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». 5.2. При работе необходимо всегда выполнять следующие требования; - Применять набор строго по назначению в соответствии с данной инструкцией. Отклонение от пролисанных лроцедур и порядка действий может привести к получению недостоверных результатов анализа. - Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ следует проводить в отдельных помещениях (зонах) в соответствии с МУ 1.3.2569-09. Не возвращать образцы, оборудование и реагенты в зону, в которой была проведена предыдущая стадия процесса. - Рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные, организовывать работу и хранение в соответствии с СП 1.3.2322-08. - Убирать и дезинфицировать разлитые образцы или реагенты, используя дезинфицирующие средства в соответствии с СП 1.3.2322-08. - Удалять неиспользованные реагенты, реагенты с истекшим сроком годности, а также использованные реагенты, упаковку'’, биологический материал^, включая материалы, инструменты и предметы, загрязненные биологическим материалом, в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.7.2790-10. ВНИМАНИЕ! При удалении отходов после амплификации (пробирок, содержащих продукты ПЦР) недопустимо открывание пробирок и разбрызгивание содержимого, поскольку это может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны, оборудования и реагентов. - Использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для автоматических дозаторов с фильтром. Одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) необходимо сбрасывать в специальный контейнер. * Неиспользованные реагенты, реагенты с истекшим сроком годности, использованные реагенты, упаковка относятся к классу опасности медицинских отходов Г. ® Биологический материал, включая инструменты и предметы, загрязненные материалом, относятся к классу опасности медицинских отходов Б. Версия 29.07.19 10 --- стр. 13 --- биологического материала (отделяемого слизистой оболочки влагалища), содержащая изотонический водно-солевой раствор с консервантом. 6.1.2. Зонд универсальный стерильный для забора клинического материала (отделяемое слизистой оболочки влагалища), однократного применения, изготовленный из полипропилена, состоящий из головки (рабочая часть) и ручки. Рабочая часть зонда может отламываться по имеющейся насечке. 6.2. Экстракция ДНК из исследуемых образцов 6.2.1. Набор реагентов для экстракции ДНК «МагноПрайм ФАСТ» (РУ № РЗН 2019/8043 от 22.01.2019), либо «АмплиПрайм® ДНК-сорб-АМ» (РУ № РЗН 2015/2879 от 15.07.2015), либо любой другой рекомендованный производителем набор, зарегистрированный в РФ и соответствующий следующим требованиям: - набор позволяет выделять ДНК из биологического материала (отделяемое слизистой оболочки влагалища) для последующего исследования методом полимеразной цепной реакции; - набор не относится к экспресс-методам экстракции ДНК; - набор позволяет исследовать образцы объемом не менее 100 мкл; - набор позволяет проводить элюцию очищенной ДНК в объеме не менее 100 мкл. 6.2.2. Дополнительные материалы и оборудование, необходимые для экстракции ДНК, - согласно инструкции к набору реагентов для экстракции ДНК. 6.3. Амплификация, детекция продуктов амплификации, анализ и интерпретация результатов 6.3.1. Одноразовые полипропиленовые пробирки, свободные от ДНКаз, следующих видов (при работе с формой выпуска 2); - завинчивающиеся пробирки и крышки к ним или плотно закрывающиеся пробирки объемом 1,5 мл - для приготовления реакционной смеси; - тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с выпуклой или плоской оптически прозрачной крышкой или пробирки объемом 0,2 мл в стрипах по 8 шт. с прозрачными крышками - для проведения ПЦР при использовании прибора планшетного типа; - тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с плоской крышкой или пробирки для ПЦР объемом 0,1 мл в стрипах по 4 шт. с крышками - для проведения ПЦР при использовании прибора роторного типа. 6.3.2. Одноразовые наконечники, свободные от ДНКаз, для дозаторов Версия 29,07.19 12 --- стр. 14 --- переменного объема с фильтром до 100 мкл. 6.3.3. Штативы для пробирок объемом 0,2 мл или 0,1 мл (в соответствии с используемыми пробирками для ПЦР). 6.3.4. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс). 6.3.5. Вортекс. 6.3.6. Автоматические дозаторы переменного объема. 6.3.7. Станция автоматическая с модулем для приготовления и дозирования реакционных смесей и комплект расходных материалов к ней согласно инструкции Производителя, - при работе с формой выпуска 2 в случае приготовления реакционных смесей с использованием автоматической станции. 6.3.8. Программируемый амплификатор с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» роторного типа - Rotor-Gene Q, либо планшетного типа - СЮОО Touch в комплекте с модулем CFX96, либо аналогичный, рекомендованный производителем, зарегистрированный в РФ и соответствующий следующим требованиям: - наличие независимых каналов флуоресцентной детекции для флуорофоров РАМ, R6G, ROX и Суб с характеристиками, указанными в таблице 4; Таблица 4 Требуемые характеристики каналов флуоресцентной детекции Канал для флуорофора Длины волн, нм Возбуждения Детекции Минимум Максимум Минимум Максимум РАМ 450 470 510 530 R6G 515 532 545 580 ROX 565 585 605 650 Суб 620 640 660 690 - для приборов планшетного типа наличие подогреваемой крышки с температурой более 100°С; - точность поддержания температуры < ±0,4°С; - скорость нагрева не менее 2°С/сек; - скорость охлаждение не менее 1°С/сек. 6.3.9. Холодильник от 2 до 8 °С. 6.3.10.Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки в соответствии с МУ 1.3.2569-09. 6.3.11.Емкость для сброса наконечников. Версия 29.07.19 13 --- стр. 15 --- 7. ИССЛЕДУЕМЫМ МАТЕРИАЛ Материалом для исследования служит отделяемое слизистой оболочки влагалища (мазки). Взятие, транспортирование и хранение исследуемого биологического материала следует проводить в соответствии с нижеперечисленными требованиями, несоблюдение которых может привести к получению некорректных результатов исследования. Взятие материала провести из заднебокового свода влагалища с помощью стерильного одноразового зонда-тампона или универсального зонда из полипропилена/полистирола для забора клинического материала в пробирку с транспортной средой в соответствии с инструкцией по применению зонда. Головка (рабочая часть) зонда может отламываться по имеющейся насечке от ручки зонда. Необходимо максимально полно собрать отделяемое. Допустимо минимальное присутствие примесей в виде слизи и крови. Биологический материал, помещенный в транспортную среду (содержащую изотонический водно-солевой раствор с консервантом) хранить и транспортировать в течение 7-28 дней согласно требованиям, указанным в инструкции к используемой транспортной среде. Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала. 8. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование должно проводиться при нормальных показателях микроклимата клинико-диагностической лаборатории®: - температура окружающего воздуха от 20 до 28 °С; - относительная влажность 40-75 %. 8.1. Экстракция ДНК из исследуемого материала Для экстракции ДНК использовать наборы реагентов, рекомендованные Производителем в разделе «Дополнительное оборудование и материалы». Порядок работы с наборами для экстракции ДНК смотрите в инструкции по их применению. ВНИМАНИЕ! При проведении исследования недопустимо использование экспресс- методов экстракции ДНК. Каждая группа экстрагируемых образцов должна сопровождаться постановкой отрицательного контроля (ОК) в одном повторе, положительного контроля (ПК) в одном повторе. ® Указаны допустимые нормы температуры и относительной влажности воздуха в рабочей зоне производственных помещений в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны». Версия 29.07.19 14 --- стр. 16 --- в процессе экстракции ДНК использовать следующие объемы реагентов и исследуемых образцов; - объем исследуемого образца - 100 мкл в пробирки для исследуемых образцов; - объем реагента ОКО - 100 мкл в пробирку для ОК; - объем реагента ПКО STI - 100 мкл в пробирку для ПК; - объем реагента, используемого для элюции ДНК, - 100 мкл. Допускается увеличение объема элюции до 200 мкл. 8.2. Подготовка реагентов для амплификации 8.2.1. При использовании формы выпуска 1 8.2.1.1. Отобрать необходимое количество стрипованных пробирок с ПЦР- смесью BV для амплификации ДНК исследуемых и контрольных образцов, полученной на этапе экстракции. 8.2.1.2. Убедиться, что парафин полностью покрывает раствор на дне пробирок. В противном случае, не использовать данные пробирки. 8.2.1.3. На поверхность парафина внести по 10 мкл Буфера А, при этом он не должен проваливаться под прослойку парафина и смешиваться с ПЦР-смесью. 8.2.2. При использовании формы выпуска 2 ВНИМАНИЕ! Компоненты реакционной смеси следует смешивать непосредственно перед проведением ПЦР. ВНИМАНИЕ! В случае приготовления реакционной смеси с помощью автоматической станции следуйте указаниям инструкции по ее использованию. 8.2.2.1. Рассчитать объемы ПЦР-смеси BV и Буфера А, требующиеся для приготовления реакционной смеси (см. таблицу 5). Смесь готовить на общее число исследуемых и контрольных образцов плюс запас не менее чем на одну реакцию. Таблица 5 Расчет объемов компонентов реакционной смеси Реагент Объем, мкл Обозначения ПЦР-смесь BV 10,0*(N+1) N - количество образцов ДНК, полученных на этапе экстракции, включая контролиБуфер А 10,0*(N+1) 8.2.2.2. Перемешать содержимое пробирок с ПЦР-смесью BV и Буфером А, осадить капли на вортексе. 8.2.2.3. Приготовить реакционную смесь, добавив компоненты в отдельную пробирку в объемах, рассчитанных в п. 8.2.2.1. Перемешать смесь и осадить капли на вортексе. 8.2.2.4. Отобрать необходимое количество пробирок или стрипов для амплификации ДНК исследуемых и контрольных образцов, полученной на этапе Версия 29.07.19 15 --- стр. 17 --- экстракции. Выбор пробирок для амплификации зависит от используемого амплификатора с системой детекции в режиме «реального времени». 8.2.2.5. Внести в пробирки по 20 мкл приготовленной реакционной смеси. ВНИМАНИЕ! Неиспользованные остатки реакционной смеси хранению не подлежат. 8.3. Внесение проб ДНК, проведение амплификации и детекции ВНИМАНИЕ! При добавлении проб ДНК, экстрагированных с помощью наборов реагентов для проведения экстракции методом сорбции на силикагеле или магнитной сепарации, необходимо избегать попадания сорбента в реакционную смесь. ВНИМАНИЕ! Программирование и запуск амплификатора проводить согласно инструкции по его применению. Рекомендуемые параметры для программирования амплификаторов указаны во вкладыше, прилагаемом к набору. 8.3.1. Внести в подготовленные пробирки с реакционной смесью по 10 мкл проб ДНК, полученных в результате экстракции из исследуемых и контрольных образцов. 8.3.2. Запрограммировать амплификатор с системой детекции в режиме «реального времени» для выполнения единой программы амплификации и детекции флуоресцентного сигнала (см. таблицу 6). Таблица 6 Единая программа амплификации и детекции флуоресцентного сигнала Цикл Температура, ®С Время Детекция по каналам для флуорофоров Количество циклов 1 50 15 мин - 1 2 95 15 мин - 1 3 95 Юс - 4560 20 с РАМ, R6G^ ROX, Су5 Примечание - С использованием единой программы можно одновременно проводить в одном приборе любое сочетание тестов, включая тесты с обратной транскрипцией и амплификацией. При одновременном проведении нескольких тестов детекция флуоресцентного сигнала назначается и по другим используемым каналам, помимо указанных в таблице. В случае если в одном приборе одновременно проводятся тесты только для выявления ДНК, можно удалить из данной программы первый шаг обратной транскрипции (50 °С - 15 мин) для экономии времени. 8.3.3. Установить пробирки или стрипы в ячейки реакционного модуля прибора. Примечание - Рекомендуется перед постановкой в амплификатор планшетного типа осадить капли со стенок пробирок на вортексе. ^ Детекция сигнала для флуорофора R6G осуществляется по каналу детекции для аналогичных флуорофоров Hex и Joe. Версия 29.07.19 16 --- стр. 18 --- 8.3.4. Запустить выполнение программы амплификации с детекцией флуоресцентного сигнала. 8.3.5. Прибор проводит регистрацию флуоресцентного сигнала автоматически в режиме «реального времени». 8.4. Анализ и вычисление результатов ВНИМАНИЕ! Обработку данных (флуоресцентных кривых), полученных в программном обеспечении прибора, используемого для проведения ПЦР с детекцией в режиме «реального времени», проводить согласно инструкции по его применению. Рекомендуемые параметры для обработки данных указаны во вкладыше, прилагаемом к набору. ВНИМАНИЕ! Количественный анализ результатов возможно проводить только в автоматическом режиме с использованием программного обеспечения к набору «АмплиПрайм® BV ПО» версии 1.0, согласно руководству оператора по применению программного обеспечения. Руководство оператора и программное обеспечение находятся на USB флэш-накопителе, входящем в состав набора, а также на официальном сайте Производителя по адресу: http;//www. nextbio.ru/reagents/. Необходимые значения для расчета результатов указаны во вкладыше, прилагаемом к набору. Обработка и расчет результатов происходит на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции S-образной (сигмообразной) формы с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы ДНК значения порогового цикла (Ct) в соответствующей графе таблицы результатов. Кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются по четырем каналам детекции (см. таблицу 7). Таблица 7 Детекция флуоресцентного сигнала Канал для флуорофора FAM R6G ROX Су5 Продукт амплификации ДНК G. vaginalis ДНК А. vaginae ДНК Lactobacillus spp. участок ДНК, общий для Bacteria На основании полученных значений Ct для образца ПК и исследуемых образцов и исходя из заданных значений концентраций для образца ПК происходит автоматический расчет значений концентрации геномных эквивалентов ДНК выявляемых микроорганизмов в 1 мл исследуемых и контрольных образцов. Полученные расчетные значения концентраций ДНК Bacteria, G. vaginalis, А. vaginae и Lactobacillus spp. для исследуемых образцов используются для расчета Версия 29.07.19 17 --- стр. 19 --- коэффициентов соотношений (КС1, КС2 и КСЗ), на основании которых производится интерпретация полученных данных, по формулам, представленным в таблице 8. Таблица 8 Расчет коэффициентов соотношений Коэффициент соотношения Описание Формула КС1 Отражает соотношение концентраций Lactobacillus spp. (Lac) и анаэробных микроорганизмов G. vaginalis и А. vaginae (Gv+Av) КС1 = Ig [ДНК Lac] - Ig [ДНК (Gv+Av)] КС2 Отражает соотношение концентраций Bacteria (Вас) и Lactobacillus spp. (Lac) КС2 = Ig [ДНК Вас] - Ig [ДНК Lac] КСЗ Отражает соотношение концентраций Bacteria (Вас) и анаэробных микроорганизмов G. vaginalis и А. vaginae (Gv+Av) КСЗ = Ig [ДНК Вас] - Ig [ДНК (Gv+Av)] 8.5. Интерпретация результатов Интерпретация результатов проводится автоматически с использованием программного обеспечения к набору «АмплиПрайм® BV ПО» версии 1.0. Используемые в программном обеспечении алгоритм интерпретации результатов для исследуемых образцов и критерии валидности результатов, полученных для контролей, представлены в таблицах 9 и 10 соответственно. Таблица 9 Интерпретация результатов для исследуемых образцов Результат Интерпретация По каналу для флуорофора Су5 отсутствует значение Ct или общее количество ДНК бактерий меньше 1x10® ГЭ/мл и/или меньше рассчитанного значения концентрации ло каналу для флуорофора ROX более чем на 0,5 Lg. Невалидный КС1 < -0,3 Соотношения концентраций ДНК микроорганизмов соответствуют бактериальному вагинозу. КС1 > 1 и общее количество ДНК бактерий больше 1x10® ГЭ/мл На основании соотношений концентраций ДНК микроорганизмов бактериальный вагиноз не установлен. -0,3 < КС1 < 1 Соотношения концентраций ДНК микроорганизмов соответствуют промежуточному состоянию микрофлоры. КС2>1 и КСЗ>2, любое значение КС1 Соотношения концентраций ДНК микроорганизмов соответствуют дисбиозу неуточненной этиологии. КС1>1 и общее количество ДНК бактерий находится в диалазоне от 1x10® до 1x10® ГЭ/мл Снижение степени бактериальной обсеменённости. Версия 29.07.19 18 --- стр. 20 --- Таблица 10 Результаты для контролей Контроль Результаты амплификации по каналу для флуорофора РАМ R6G ROX Суб ОК (отрицательный контроль) Значение концентрации отсутствует или определено не больше граничного®. Значение концентрации отсутствует или определено не больше граничного. Значение концентрации отсутствует или определено не больше граничного. Значение концентрации отсутствует или определено не больше граничного. ПК (положительный контроль) Определено значение Ct не больше граничного® и рассчитана концентрация по каждому каналу детекции. 8.6. Возможные ошибки 8.6.1. Для отрицательного контроля (ОК) по каналам для флуорофоров РАМ и/или R6G и/или ROX и/или Суб определено значение концентрации больше граничного. Вероятна контаминация лаборатории продуктами амплификации или контаминация реагентов или исследуемых образцов другими образцами или продуктами амплификации на каком-либо этапе исследования. Необходимо предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации и повторить исследование для всех образцов, начиная с этапа экстракции ДНК. 8.6.2. Для положительного контроля (ПК) значение Ct отсутствует или определено больше граничного по какому-либо из указанных каналов для флуорофоров (см. таблицу 10). Требуется повторное исследование всех образцов, начиная с этапа экстракции ДНК. 8.6.3. Для исследуемого образца определено значение порогового цикла, при этом на графике флуоресценции отсутствует участок характерного экспоненциального подъема (график представляет собой приблизительно прямую линию). Необходимо проверить правильность выбранного уровня пороговой линии или параметров расчета базовой линии. Если результат получен при правильном уровне пороговой линии (базовой линии), требуется повторно провести амплификацию и детекцию для этого образца. 8.6.4. В случае получения невалидных результатов требуется повторное исследование образца, начиная с этапа экстракции ДНК. В случае воспроизводимого результата рекомендуется повторно провести взятие и исследование биологического материала. ® Граничные значения Ct и граничные значения концентрации указаны во вкладыше, прилагаемом к набору. Версия 29.07.19 19 --- стр. 21 --- 8.7. Диагностическое значение полученного результата ПЦР-исследование является одним из методов всестороннего обследования пациента, на основании которых лечащий врач устанавливает диагноз и выбирает мероприятия по лечению лациента. Результаты, полученные при использовании набора, следует рассматривать и интерпретировать в сочетании с данными других клинических и лабораторных исследований. 9. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА 9.1. Предел обнаружения^ Предел обнаружения набора «АмплиПрайм® BV» был определен с использованием пробит-анализа с 95%-ой доверительной вероятностью (см. таблицу 11). Значения характеристики, указанные в таблице 11, достигаются при соблюдении правил, указанных в разделе «Исследуемый материал». Таблица 11 Предел обнаружения набора Микроорганизм Предел обнаружения по ProbIt 95%. ГЭ/мл’® 95%-ый доверительный интервал, ГЭ/мл G. vaginalis 1x10® 7,20x102-1,48x10® А. vaginae 1x10® 6,70x102-1,50x10® Lactobacillus spp. 1x10® 7,10x102- 1,46x10® 9.2. Линейный диапазон измерения и предел измерения Диапазон, в котором набор «АмплиПрайм® BV» дает линейный ответ, приведен в таблице 12. Предел измерения набора является нижним пределом линейного диапазона измерения набора. Указанные значения характеристики достигаются при соблюдении правил, указанных в разделе «Исследуемый материал». Таблица 12 Линейный диапазон измерения набора Микроорганизм Линейный диапазон измерения, ГЭ/мл G. vaginalis 3x10®- 1x10®А. vaginae Lactobacillus spp. ® Предел обнаружения - 95%-ое положительное пороговое значение концентрации (концентрация ДНК определяемого микроорганизма, при которой 95% тестов дают положительный результат). Количество геномных эквивалентов микроорганизма (ГЭ) в биологическом материале (отделяемое слизистой оболочки влагалища), помещенном в транспортную среду, в пересчете на 1 мл. Версия 29.07.19 20 --- стр. 22 --- 9.3. Аналитическая специфичность Набор «АмплиПрайм® BV» обнаруживает фрагменты ДНК Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Lactobacillus spp. и участок ДНК, общий для Bacteria. Аналитическая специфичность набора оценивалась тестированием ДНК микроорганизмов (см. таблицу 13) и геномной ДНК человека. ДНК микроорганизмов в концентрации не менее 1x10® ГЭ/мл и геномную ДНК человека в концентрации 1 мкг/мл вносили в образцы биологического материала, не содержащие определяемые с помощью набора микроорганизмы. Дополнительно подтверждалось отсутствие перекрестных реакций между выявляемыми микроорганизмами при тестировании ДНК микроорганизмов в концентрации не менее 1x10^ ГЭ/мл. Таблица 13 Микроорганизмы, ДНК которых использовалась для оценки аналитической специфичности Микроорганизмы Herpes simplex virus type 1 Neisseria gonorrhoeae Herpes simplex virus type 2 Neisseria flava Human papilloma virus 16 Neisseria mucosa Cytomegalovirus Neisseria sicca Candida albicans Neisseria sub flava Candida glabrata Staphylococcus aureus Candida krusei Streptococcus agalactiae Candida parapsilosis Streptococcus pyogenes Candida tropicalis Treponema pallidum Chlamydia trachomatis Trichomonas vaginalis Enterococcus faecium Toxoplasma gondii Mycoplasma genitalium Ureaplasma parvum Mycoplasma hominis Ureaplasma urealyticum При тестировании образцов ДНК вышеперечисленных микроорганизмов и геномной ДНК человека, а также ДНК выявляемых микроорганизмов в высоких концентрациях с использованием набора перекрестных реакций выявлено не было. 9.4. Воспроизводимость и повторяемость измерения Воспроизводимость и повторяемость измерений с помощью набора «АмплиПрайм® BV» оценивали путем тестирования модельных образцов биологического материала, содержащих ДНК выявляемых микроорганизмов в трех диапазонах концентраций (см. таблицу 14 и 15). Модельные образцы были приготовлены разведением стандартных образцов предприятия, содержащих ДНК выявляемых микроорганизмов, в биологическом материале, не содержащем ДНК Версия 29.07.19 21 --- стр. 24 --- Таблица 16 Правильность измерения Микроорганизм Среднее значение измерения, 1одю Установленное значение концентрации, 1одю Систематическая погрешность (В) logic % G. vaginalis 4,88 4,70 0,18 3,90 А. vaginae 4,86 4,70 0,16 3,31 Lactobacillus spp. 4,87 4,70 0,17 3,70 9.6. Оценка влияния интерферирующих веществ и ДНК человека Влияние интерферирующих веществ, потенциально содержащихся или присутствующих в отделяемом слизистой оболочки влагалища, на эффективность ПЦР при использовании набора «АмплиПрайм® BV» отсутствует. Не выявлено ингибирование реакции амплификации при добавлении к образцам отделяемого слизистой оболочки влагалища на этапе экстракции следующих интерферирующих веществ в максимально возможной концентрации для данного вида биоматериала: - муцина в концентрации 0,23 мг/100 мкл; - гемоглобина в концентрации 0,20 мМ/100 мкл; - мочевины в концентрации 0,033 мМ/100 мкл; - лубрикантов в концентрации 5 мкг/100 мкл; - семенной жидкости в концентрации 5 мкг/100 мкл; - мирамистина в концентрации действующего вещества 0,001 %; - итраконазола в концентрации 6,5 мкг/100 мкл; - метронидазола в концентрации 5 мкг/100 мкл; - дидрогестерона в концентрации 5 мкг/100 мкл; - прогестерона в концентрации 5 мкг/100 мкл. Также при использовании набора «АмплиПрайм® BV» не выявлено ингибирование реакции амплификации при добавлении к образцам отделяемого слизистой оболочки влагалища искусственно-синтезированной ДНК человека в максимально возможной концентрации (7,5x10^-3,0x10® ГЭ/мл) для данного вида биоматериала. 10. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ НАБОРА 10.1. Срок годности Срок годности набора составляет 12 месяцев от даты изготовления. После вскрытия реагенты использовать до истечения срока годности набора. Набор с истекшим сроком годности применению не подлежит. 10.2. Транспортирование Набор транспортировать при температуре от 2 до 8 °С всеми видами крытых Версия 29.07.19 23 --- стр. 25 --- транспортных средств в термоконтейнерах с хладоэлементами или в авторефрижераторах. Не допускается замораживание реагентов. Допускается транспортирование при температуре от 8 до 25 °С не более 3 суток. Набор, транспортированный с нарушением указанного температурного режима, применению не подлежит. 10.3. Хранение Набор хранить при температуре от 2 до 8 °С в защищенном от света месте в течение всего срока годности набора. Не допускается замораживание реагентов. Реагенты после вскрытия хранить в тех же условиях, что и реагенты до вскрытия. Невскрытые и вскрытые реагенты стабильны в течение срока годности, указанного на этикетке, при соблюдении указанных условий хранения. При использовании формы выпуска 2 реакционная смесь, приготовленная из ПЦР-смеси BV и Буфера А, хранению не подлежит. Набор, хранившийся с нарушением указанного режима хранения, применению не подлежит. 11. ГАРАНТИИ ПРОИЗВОДИТЕЛЯ Производитель гарантирует соответствие характеристик набора требованиям, указанным в технической и эксплуатационной документации, в течение указанного срока годности при соблюдении всех условий транспортирования, хранения и применения. Рекламации на качество набора «АмплиПрайм® BV» направлять в адрес производителя ООО «НекстБио»: 111394, г. Москва, ул. Полимерная, 8 стр. 2, тел. (495) 620-08-73, e-mail: info@nextbio.ru. При выявлении нежелательных реакций при использовании набора, фактов и обстоятельств, создающих угрозу жизни и здоровью граждан и медицинских работников при обращении и эксплуатации набора, рекомендуется направить сообщение по адресу, указанному выше, и в уполномоченную государственную регулирующую организацию (в Российской Федерации - Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения) в соответствии с действующим законодательством. Консультацию по работе с набором, а также по вопросам, касающимся качества набора, можно получить по контактам, указанным на официальном сайте Производителя; www.nextbio.ru. Версия 29.07.19 24 --- стр. 26 --- 12. БИБЛИОГРАФИЯ 1. Pavsic J., Devonshire A., Blejec A., at al. Inter-laboratory assessment of different digital PCR platforms for quantification of human cytomegalovirus DNA. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2017; 409: 2601-2614. 2. Hayden R.T., Gu Z., Sam S.S., at al. Comparative evaluation of three commercial quantitative cytomegalovirus standards by use of digital and real-time PCR. Journal of Clinical Microbiology 2015; 53(5); 1500-1505. Версия 29.07.19 25 --- стр. 31 --- _ ■ • i АмплиПрайм Краткое руководство по применению набора реагентов для количественного определения ДНК маркерных микроорганизмов бактериального вагиноза методом полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме «реального времени» «АмплиПрайм® BV» по ТУ 21,20.23-032-09286667-2018 «АмплиПрайм® BV» ВНИМАНИЕ! Перед использованием набора реагентов необходимо ознакомиться с инструкцией по его применению. Инструкция размещена в электронном виде на официальном сайте Производителя: http://www.nextbio.ru/reagents/. МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ отделяемое слизистой оболочки влагалища (мазки). Форма выпуска 1 REF X ООО «НекстБио», Россия, 111394, г. Москва, ул. Полимерная, д. 8, стр. 2 тел. (495) 620-08-73, e-mail: lnfo@,nextbio.ru СОСТАВ КОМПЛЕКТНОСТЬ Компонент Описание Объем, мл Количество ПЦР-смесь BV Прозрачная жидкость, раскапана под парафин 0,01 96 пробирок (12 стрипов по 8 пробирок) Буфер А Прозрачная жидкость 0,96 1 пробирка ПКО STI 1,0 1 пробирка ОКО 1,0 1 пробирка Программное обеспечение «АмплиПрайм® BV ПО» версия 1.0 На USB фпэш-накопителе Набор реагентов рассчитан на проведение исследования 96 образцов, включая контроли. ХРАНЕНИЕ Условия хранения набора 2°С ... 8°С в защищенном от света месте Компонент Формат Набор реагентов форма выпуска 1 Инструкция по применению в электронном виде на USB флэш-накопителе и по адресу: http://www.nextbio.ru/reagents/ Паспорт качества в электронном виде по адресу: http://www.nextbio.ru/passport/ Краткое руководство в бумажном виде Вкладыш в бумажном виде Руководство оператора в электронном виде на USB флэш-накопителе и по адресу: http://www.nextbio.ru/reagents/ Версия 29.07.19 --- стр. 32 --- ^/(СТРАКЦИЯ ДНК ИЗ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА Для экстракции ДНК использовать наборы реагентов, рекомендованные Производителем в /инструкции по применению набора «АмплиПрайм® BV». Порядок работы с наборами для экстракции ДНК смотрите в инструкции по их применению, / Объемы реагентов и исследуемых образцов, используемые при экстракции ДНК с помощью ' рекомендуемых наборов реагентов, указаны в таблице ниже. Добавляемый реагент / образец Исследуемые образцы 100 мкл в пробирки для исследуемых образцов ОКО 100 мкл в пробирку для ОК (отрицательного контроля) ПКО STI 100 мкл в пробирку для ПК (положительного контроля) Реагент для элюции ДНК 100 мкл^ в каждую пробирку АМПЛИФИКАЦИЯ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» ВНИМАНИЕ! Для внесения в пробирки реагентов, проб ДНК и контрольных образцов использовать одноразовые наконечники с фильтрами. 1. Отобрать необходимое количество стрипованных пробирок с ПЦР-смесью BV для амплификации ДНК исследуемых и контрольных образцов, полученной на этапе экстракции. 2, Внести в подготовленные пробирки Буфер А и образцы согласно таблице: Добавляемый реагент / образец Внести по 10 мкл Буфер А в пробирки с ПЦР-смесью BV на поверхность парафина ВНИМАНИЕ! Буфер А не должен проваливаться под парафин. Внести по 10 мкл ВНИМАНИЕ! Избегать попадания сорбента в реакционную смесь. Пробы ДНК, экстрагированной из исследуемого образца в пробирки для исследуемых образцов Пробы ДНК, экстрагированной из ОКО в пробирку для ОК (отрицательного контроля) Пробы ДНК, экстрагированной из ПКО STI в пробирку для ПК (положительного контроля) 3. Запрограммировать амплификатор с системой детекции в режиме «реального времени» согласно инструкции по его применению для выполнения следующей программы: Единая программа амплификации и детекции флуоресцентного сигнала Цикл Температура, ”0 Время Детекция по каналам для с^уорофосюв Количество циклов 1 50 15 мин - 1 2 95 15 мин - 1 3 95 10 с - 45 60 20 с РАМ, R6G, ROX, Су5 Примечания 1) Рекомендуемые параметры для программирования амплификаторов указаны во вкладыше, прилагаемом к набору. 2) В случае, если в одном приборе одновременно проводятся тесты только для выявления ДНК, можно удалить из указанной программы первый шаг (50 °С - 15 мин) для экономии времени. 4. Установить стрипы в ячейки реакционного модуля прибора. Рекомендуется предварительно осадить капли со стенок пробирок на вортексе. ^ Допускается увеличение объема элюции до 200 мкл. Версия 29.07.19 --- стр. 33 --- /Запустить выполнение программы амплификации с детекцией флуоресцентного сигнала согласно инструкции по применению используемого амплификатора. Щ АНАЛИЗ, ВЫЧИСЛЕНИЕ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ I ВНИМАНИЕ! Обработку данных (флуоресцентных кривых), полученных в программном обеспечении прибора, используемого для проведения ПЦР с детекцией в режиме «реального времени», проводить согласно инструкции по его применению. Рекомендуемые параметры для обработки данных указаны во вкладыше, прилагаемом к набору. Анализ, вычисление и интерпретацию результатов провести в автоматическом режиме с использованием программного обеспечения к набору «АмплиПрайм® BV ПО» версии 1.0 согласно руководству оператора по применению программного обеспечения. Руководство оператора и программное обеспечение находятся на USB флэш-накопителе, входящем в состав набора, а также на официальном сайте Производителя по адресу: http://www.nextbio.ru/reagents/ . Необходимые значения для расчета результатов указаны во вкладыше, прилагаемом к набору. Версия 29.07.19 --- стр. 34 --- Лист регистрации изменений Г| Изм. Номера листов Всего листов в документе Номер извещения об изменении Изменения внес Датаизменённ ых заменённ ых новых аннулиро ванных 1 - 1 -4 - - 4 09286667.014.3/11 -2019 Ю.А. Дарикова 29.07.2019 Версия 29.07.19 --- стр. 38 --- ГСТРАКЦИЯ ДНК из ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА Л|Д ля экстракции ДНК использовать наборы реагентов, рекомендованные Производителем в /нструкции по применению набора «АмплиПрайм® BV». Порядок работы с наборами для экстракции /дНК смотрите в инструкции по их применению. Объемы реагентов и исследуемых образцов, используемые при экстракции ДНК с помощью рекомендуемых наборов реагентов, указаны в таблице ниже. Добавляемый реагент / образец Исследуемые образцы 100 мкл в пробирки для исследуемых образцов ОКО 100 мкл в пробирку для ОК (отрицательного контроля) ПКО STI 100 мкл в пробирку для ПК (положительного контроля) Реагент для элюции ДНК 100 мкл'' в каждую пробирку АМПЛИФИКАЦИЯ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» ВНИМАНИЕ! Для внесения в пробирки реагентов, проб ДНК и контрольных образцов использовать одноразовые наконечники с фильтрами. 1. Рассчитать объемы реагентов, необходимые для приготовления реакционной смеси, согласно таблице: Компонент реакционной смеси Объем, мкл Обозначения ПЦР-смесь BV 10,0*(N+1) N - количество образцов ДНК, полученных на этапе экстракции, включая контролиБуфер А 10,0*(N+1) ВНИМАНИЕ! Компоненты реакционной смеси следует смешивать непосредственно перед проведением исследования. ВНИМАНИЕ! В случае приготовления реакционной смеси с помощью автоматической станции следуйте указаниям инструкции по ее использованию. 2. Перемешать ПЦР-смесь BV и Буфер А и осадить капли на вортексе. 3. Приготовить реакционную смесь, добавив компоненты в отдельную пробирку в объемах, рассчитанных в п. 1. Перемешать смесь и осадить капли на вортексе. 4. Отобрать необходимое количество пробирок или стрипов для амплификации ДНК исследуемых и контрольных образцов, полученной на этапе экстракции. 5. Внести в подготовленные пробирки реакционную смесь и образцы согласно таблице; Добавляемый реагент / образец Внести по 20 мкл Приготовленной реакционной смеси в пробирки для исследуемых и контрольных образцов Внести по 10 мкл ВНИМАНИЕ! Избегать попадания сорбента в реакционную смесь. Пробы ДНК, экстрагированной из исследуемого образца в пробирки для исследуемых образцов Пробы ДНК, экстрагированной из ОКО в пробирку для ОК (отрицательного контроля) Пробы ДНК, экстрагированной из ПКО STI в пробирку для ПК (положительного контроля) ВНИМАНИЕ! Неиспользованные остатки реакционной смеси хранению не подлежат. 6. Запрограммировать амплификатор с системой детекции в режиме «реального времени» согласно инструкции по его применению для выполнения следующей программы; ' Допускается увеличение объема элюции до 200 мкл. Версия 29.07.19 --- стр. 39 --- Единая программа амплификации и детекции флуоресцентного сигнала ] i Цикл Температура, °С Время Детекция по каналам для ФлуороФоров Количество циклов 1 50 15 мин - 1 2 95 15 мин - 1 3 95 10 с - 45 60 20 с РАМ, R6G, ROX, Су5 Примечания 1) Рекомендуемые лараметры для лрограммирования амплификаторов указаны во вкладыше, прилагаемом к набору. 2) В случае, если в одном лриборе одновременно проводятся тесты только для выявления ДНК, можно удалить из указанной программы первый шаг (50 °С - 15 мин) для экономии времени. 7. Установить пробирки или стрипы в ячейки реакционного модуля прибора. Примечание - Рекомендуется перед постановкой в амплификатор планшетного типа осадить капли со стенок пробирок на вортексе. 8. Запустить выполнение программы амплификации с детекцией флуоресцентного сигнала согласно инструкции по применению используемого амплификатора. АНАЛИЗ, ВЫЧИСЛЕНИЕ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ВНИМАНИЕ! Обработку данных (флуоресцентных кривых), полученных в программном обеспечении прибора, используемого для проведения ПЦР с детекцией в режиме «реального времени», проводить согласно инструкции по его применению. Рекомендуемые параметры для обработки данных указаны во вкладыше, прилагаемом к набору. Анализ, вычисление и интерпретацию результатов провести в автоматическом режиме с использованием программного обеспечения к набору «АмплиПрайм® BV ПО» версии 1.0 согласно руководству оператора по применению программного обеспечения. Руководство оператора и программное обеспечение находятся на USB флэш-накопителе, входящем в состав набора, а также на официальном сайте Производителя по адресу: http://www.nextbio.ru/reagents/ . Необходимые значения для расчета результатов указаны во вкладыше, прилагаемом к набору. Версия 29.07.19 --- стр. 40 --- Лист регистрации изменений Номера листов Всего листов в документе Номер извещения об изменении Изменения внес ДатаIsm. изменённ ых заменённ ых новых аннулиро ванных 1 - 1 -4 - - 4 09286667.014.3/11 -2019 Ю.А. Дарикова 29.07.2019 Р Версия 29.07.19 --- стр. 46 --- список СОКРАЩЕНИИ И ОБОЗНАЧЕНИИ ct гэ ДНК ок ПК по Cycle threshold (пороговый цикл) геномные эквиваленты дезоксирибонуклеиновая кислота отрицательный контроль положительный контроль программное обеспечение Версия 29.07.19 --- стр. 47 --- 1. НАЗНАЧЕНИЕ ПРОГРАММЫ Программное обеспечение «АмплиПрайм® BV ПО» версии 1.0 предназначено для автоматической обработки исходных данных и получения формализованных результатов при использовании набора реагентов для количественного определения ДНК маркерных микроорганизмов бактериального вагиноза методом полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме «реального времени» «АмплиПрайм® BV» по ТУ 21.20.23-032-09286667-2018. ПО позволяет проводить автоматическую обработку и анализ исходных данных, полученных в программном обеспечении используемого амплификатора с детекцией в режиме «реального времени», а также автоматическую интерпретацию результатов и формировать бланк с формализованными результатами. ПО предназначено для работы на персональных компьютерах в учреждениях медицинского профиля (клинико-диагностических лабораториях), применяющих в своей работе набор реагентов «АмплиПрайм® BV». ПО предоставляется на USB флэш-накопителе в составе набора реагентов «АмплиПрайм® BV», а также в электронном виде на официальном сайте Производителя по адресу; http://www.nextbio.ru/reagents/. 2. УСЛОВИЯ ВЫПОЛНЕНИЯ ПРОГРАММЫ 2.1. Минимальный состав технических средств Минимальный состав используемых технических средств включает: a. Компьютер со следующими характеристиками: ■ Операционная система Windows 7 и выше; ■ Оперативная память объемом не менее 2 Гб; ■ Процессор с тактовой частотой не менее 1,5 ГГц. b. Устройство для вывода бланка с результатами на печать (опционально). 2.2. Минимальный состав программных средств Минимальный состав используемых программных средств включает: a. Операционную систему Windows 7 и выше; b. Microsoft .NET Framework 4.5 и выше. 2.3. Требования к пользователю (оператору) Пользователями ПО (операторами) должны являться сотрудники клинико- диагностической лаборатории, обладающие практическими навыками работы с персональным компьютером. Версия 29.07.19 --- стр. 48 --- 3. ПРИНЦИП РАБОТЫ В качестве исходных данных ПО использует значения порогового цикла амплификации (Ct) исследуемых образцов и контролей по соответствующим каналам для флуорофоров. Для начала работы исходные данные должны быть получены в программном обеспечении используемого прибора, в соответствии с инструкцией по применению к используемому прибору. Поля вкладки ПО «Параметры» заполняют значениями из вкладыша к используемой серии набора реагентов «АмплиПрайм® BV». Далее значения порогового цикла (Ct) по каждому каналу флуоресцентной детекции размещают во вкладке ПО «Расчет результатов» в соответствующих столбцах таблицы «Данные прибора». После нажатия кнопки «Расчет результатов» ПО автоматически проводит расчет концентрации специфических мишеней, оценку полученных значений для контрольных образцов в соответствии с заданными критериями и интерпретацию результатов. 4. ВЫПОЛНЕНИЕ ПРОГРАММЫ 4.1. Загрузка и запуск программы Запустить инсталлятор ПО, находящийся на USB флэш-накопителе^ или загруженный с официального сайта Производителя по ссылке: http://www.nextbio.ru/reagents/. Следовать указаниям в появившемся окне Мастера установки. После установки ПО на рабочем столе автоматически будет создан ярлык (рис. 1). АмплиПрайм® BV Рисунок 1 Для запуска программы необходимо запустить ярлык с рабочего стола. 4.2. Обновление программы После запуска ПО автоматически проверяет наличие обновления. В случае если обновление доступно, предлагается его загрузить и установить (рис. 2). ‘ Поставляется в составе набора реагентов «АмплиПрайм® BV» Версия 29.07.19 --- стр. 49 --- о Доступна новая версия АмплиПрайм® BV ПО (Версия 2.0). Обновить? Да Нет Рисунок 2 При нажатии кнопки «Да» будет загружен инсталлятор с обновлением, по окончании загрузки будет выдано сообщение о готовности обновления к установке (рис. 3). 22 Загрузка завершена. Программа будет закрыта и обновлена. ОК Рисунок 3 После нажатия кнопки «ОК» программа закроется, и инсталлятор с обновлением будет запущен. Для установки обновления ПО необходимо следовать указаниям Мастера установки. 4.3. Выполнение программы Для проведения анализа исходных данных необходимо внести значения во вкладку «Параметры» и в таблицу «Данные прибора» во вкладке «Расчет результатов». 4.3.1. Заполнение таблицы «Параметры» Пустые поля таблицы «Параметры» (рис. 4) должны быть заполнены в соответствии с вкладышем к используемой серии набора реагентов «АмплиПрайм® BV». Параметры Green Yellow FAM R6G G.v. A.V. Orange ROX Lact spp. Red Cy5 Bact. I Значения тЯШ0нпшйШий. ГЭЛШ i ПК i 200000' i 200000 200000 Г 200000 I гш т т ш ж вт чеиияШ т Ш Ш Ш ш Ш ! I ПК ОК ГМт.. Рисунок 4 Версия 29.07.19 --- стр. 50 --- 4.3.2. Заполнение таблицы «Данные прибора» Для проведения корректной обработки данных заполнение таблицы «Данные прибора» (рис. 5) во вкладке «Расчет результатов» должно проводиться без ошибок. '^ Данные прибора (значения Ct) < Green Yellow Orange Red № Образец FAM R6G ROX Cy5 G.v. A.V. Lact. spp. Bact. 1 2 H H i ШШШШ 3 4 5 _______ Рисунок 5 Столбцы таблицы следует заполнять путем копирования данных (значений Ct) непосредственно из программного обеспечения прибора, используемого для проведения амплификации и детекции флуоресцентного сигнала, либо из файла экспорта данных в Microsoft Excel, соблюдая при этом соответствие каналов для флуорофоров. В ПО предусмотрено копирование данных без заголовков столбцов. Для этого используется кнопка «Игнорировать заголовки столбцов при копировании» (рис. 6). Рисунок 6 По умолчанию функция копирования данных без заголовков столбцов включена. Если изначально возможно внесение данных без заголовков столбцов, функцию необходимо отключить путем нажатия кнопки (рис. 6), чтобы избежать потери данных для первого образца. В столбец «Образец» необходимо внести обозначения исследуемых и контрольных образцов. Обозначение контрольных образцов вносить строго в соответствии с таблицей 1. В случае правильного обозначения контролей цвет их названия меняется с черного на синий. Таблица 1 Обозначение контрольных образцов Контрольный образец Возможные обозначения Отрицательный контроль РУС: ОК или ок Положительный контроль РУС: ПК или ПК 4.3.3. Заполнение таблицы «Информация о постановке» В ПО предусмотрена возможность сохранять дополнительную информацию о проведении анализа. Для этого следует заполнить поля таблицы «Информация о Версия 29.07.19