Набор реагентов для диагностики in vitro АмплиСенс® ДНК-чип ООИ-1 по ТУ 21.20.23-347-01897593-2017 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 ---
«УТВЕРЖДАЮ»
Директор Федерального бюджетного
учреждения науки «Центральный
научно-исследовательский институт
эпидемиологии» Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека
(ФБУН ЦНИИ// Эпидемиологии
В.Г. Акимкин
2019 г.
ИНСТРУКЦИЯ по ПРИМЕНЕНИЮ
набора реагентов для диагностики in vitro
АмплиСенс® ДНК-чип ООИ-1
АмплиСенс ®
ш 1
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора,
Российская Федерация, 111123,
город Москва, улица Новогиреевская, дом ЗА IV D
Разработано совместно с ФБУН «ГНЦ ПМБ» Роспотребнадзора
(142279, Московская область, п. Оболенск, тел,: +7 (4967) 36-00-03, e-mail: info@obolensk.org)
--- стр. 2 ---
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................................................3
НАЗНАЧЕНИЕ..............................................................................................................................................3
ПРИНЦИП МЕТОДА..................................................................................................................................4
ФОРМЫ КОМПЛЕКТАЦИИ.....................................................................................................................5
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ............................................................................................5
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ......................................................................................6
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ И СВЕДЕНИЯ ОБ УТИЛИЗАЦИИ ......................................8
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ.......................................................10
ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА.. 14
ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАЦИИ ДНК/РНК .......................16
ИНТЕРФЕРИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА И ОГРАНИЧЕНИЯ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ПРОБ
ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА.........................................................................................................18
ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.....................................................................................................18
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК/РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ ....................................................18
ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ.............................................................................................................19
СОСТАВ.......................................................................................................................................................20
ПЦР-АМПЛИФИКАЦИЯ..........................................................................................................................21
ТРАНСКРИПЦИЯ.....................................................................................................................................23
ГИБРИДИЗАЦИЯ......................................................................................................................................24
А. Приготовление растворов.........................................................................................................25
Б. Проведение гибридизации.......................................................................................................26
АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ..........................................................................28
СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ .........................34
ГАРАНТИЙНЫЕ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА ИЗГОТОВИТЕЛЯ.............................................................34
СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ ................................................36
стр. 2 из 36
--- стр. 3 ---
список СОКРАЩЕНИИ
В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения:
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
кДНК - комплементарная ДНК, получаемая в реакции обратной
транскрипции на матрице РНК
к+ - положительный контроль ПЦР
к- - отрицательный контроль ПЦР
НТФ - нуклеозид-5’-трифосфат
оои - особо опасные инфекции
ок - отрицательный контроль экстракции
око - отрицательный контрольный образец
от - обратная транскрипция
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПК - положительный контроль экстракции
пко - положительный контрольный образец
РУ - регистрационное удостоверение
ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии
Роспотребнадзора
- Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный
научно-исследовательский институт эпидемиологии»
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека
Ва, B.anthracis - возбудитель сибирской язвы Bacillus anthacis
Bru - возбудитель бруцеллеза
EBOV - вирус Эбола
Ft, F.tularensis - возбудитель туляремии Francisella tularensis
IVA - вирус гриппа А
Cy5 - флуорофор cyanine 5
PBS - фосфатно-солевой буфер
Lp, L.pneumophila - возбудитель легионеллеза Legionella pneumophila
Yp, Y.pestis - возбудитель чумы Yersinia pestis
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов для диагностики in vitro АмплиСенс® ДНК-чип ООИ-1, далее -
набор реагентов, предназначен для одновременного качественного определения
фрагментов нуклеиновых кислот возбудителей особо опасных инфекционных
заболеваний, вызывающих лихорадочные состояния, а именно ДНК возбудителя
сибирской язвы (B.anthracis), ДНК возбудителя туляремии {F.tularensis), ДНК
возбудителя чумы {Y.pestis), ДНК возбудителя легионеллеза {L.pneumophila), ДНК
возбудителей бруцеллеза (В.abortus, B.melitensis и B.suis), РНК вирусов Эбола
вариант Заир (EBOV Zaire), и гриппа А в биологическом материале (цельная кровь,
мазки из ротоглотки, мазки из полости носа, культуры микроорганизмов) и объектах
окружающей среды (вода, почва) методом гибридизации на олигонуклеотидном
микрочипе (ДНК-чипе). Набор реагентов используется в клинической лабораторной
диагностике. Материалом для проведения исследования служат пробы ДНК/РНК,
экстрагированной из исследуемого материала.
стр. 3 из 36
--- стр. 4 ---
Показания и противопоказания к применению набора реагентов
Набор реагентов используется для исследования биологического материала,
полученного от лиц с подозрением на сибирскую язву, туляремию, чуму,
легионеллез, бруцеллез, лихорадку Эбола или грипп А, вне зависимости от формы и
наличия манифестации заболевания.
Противопоказания отсутствуют, за исключением случаев, когда забор материала
не может быть осуществлен по медицинским показаниям.
Потенциальные пользователи медицинского изделия
К работе с набором реагентов допускаются только медицинские работники,
обученные методам молекулярной диагностики и правилам работы в клинико-
диагностической лаборатории в установленном порядке (СП 1.3.3118-13
«Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)»).
ПРИНЦИП МЕТОДА
Принцип тестирования основывается на выявлении фрагментов нуклеиновых
кислот возбудителей, которое проводится в несколько этапов:
1) экстракция ДНК/РНК из образцов исследуемого материала;
2) проведение реакции обратной транскрипции с пробами РНК, полученными на
этапе экстракции;
3) ПЦР-амплификация участков ДНК/кДНК при помощи специфичных к этим
участкам праймеров и термостабильной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы;
4) транскрипция полученных в результате ПЦР фрагментов ДНК с помощью
фермента ДНК-зависимой РНК-полимеразы и биотинилированных
олигонуклеотидов;
5) гибридизация биотинилированных фрагментов РНК с иммобилизованными на
поверхности ДНК-чипа комплементарными олигонуклеотидными зондами (см.
табл. 1). Последующая обработка ДНК-чипа конъюгатом стрептавидина с
флуорофором Суб позволяет регистрировать образование специфического
продукта амплификации путем измерения интенсивности флуоресцентного
сигнала. Детекция флуоресцентного сигнала осуществляется с помощью
флуоресцентного сканера или имиджера.
ПКО позволяет контролировать все этапы исследования и оценивать влияние
ингибиторов на результаты.
стр. 4 из 36
--- стр. 5 ---
Таблица 1
Возбудитель Олигонуклеотидный
зонд Мишень (область гибридизации)
В. anthracis
Ва1 Ген радА плазмиды РХ01
ВаЗ Ген сарВ плазмиды РХ02
F.tularensis
Ft1 Гены iglABCD
Ft2 Ген fopA
Ft4 Участок гена RD1
Y. pest is
Yp2 Оперон caf1 плазмиды рМТ1
Yp4 Оперон caf2 плазмиды рМТ1
Yp6 Локус хромосомы У.рез^/5,отсутствующий в
хромосоме Y.pseudotuberculosis
L.pneumophila Lp1 Г ен mip
B. abortus,
B.melitensis и
B.suis
Bru1 Локус WboA
Bru2 Локус WboA
Bru4 Локус WboA
Вирус Эбола EBOV Ген I
Вирус гриппа А
IVA Ген гемагглютинина вируса гриппа А
IVA_H1 Ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа 1
IVA_H5 Ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа 5
1VA_H7 Ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа 7
IVA_H9 Ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа 9
ФОРМЫ КОМПЛЕКТАЦИИ
Форма 1: «ПЦР-комплект ООИ-1»; «Комплект для транскрипции»; «Комплект для
гибридизации ДНК-чип».
Форма 1 предназначена для проведения амплификации ДНК/кДНК методом ПЦР,
транскрипции ПЦР-фрагментов и гибридизационно-флуоресцентной детекции с
использованием ДНК-чипа. Для проведения полного исследования необходимо
использовать комплекты реагентов для экстракции нуклеиновых кислот и обратной
транскрипции РНК, рекомендованные Изготовителем.
Форма 1 рассчитана на проведение 48 реакций амплификации, транскрипции и
гибридизации, включая контроли.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Для данного набора реагентов применимы следующие характеристики:
Аналитическая чувствительность (предел обнаружения)
стр. 5 из 36
--- стр. 6 ---
Таблица 2
Вид исследуемого
материала
Объем
экстракции,
мкл
Комплект для
экстракции
РНК/ДНК
Аналитическая
чувствительность (предел
обнаружения), копий/мл
при выявлении ДНК B.anthracis, F.tularensis, L.pneumophila, Y.pestis
Кровь 100
«РИБО-преп»
1000
Культуры микроорганизмов 100 1000
Вода 100 1000
Почвы 100 1000
при выявлении ДНК возбудителей бруцеллеза (B.abortus, В.m elitensis и B.suis)
Кровь 100
«РИБО-преп»
1000
Культуры микроорганизмов 100 1000
при выявлении РНК вируса Эбола (E B O V Zaire)
Кровь 100 «РИБО-преп» 1000
при выявлении РНК вируса гриппа А (Influenza virus А)
Мазки из ротоглотки 100
«РИБО-преп»
1000
Мазки из полости носа 100 1000
Культуры микроорганизмов 100 1000
Данный предел обнаружения достигается при соблюдении правил, указанных в
разделах «Взятие, транспортирование и хранение исследуемого материала» и
«Подготовка исследуемого материала к экстракции нуклеиновых кислот».
Аналитическая специфичность
Набор реагентов позволяет обнаружить фрагменты ДНК/РНК заявленных
возбудителей. Аналитическая специфичность набора реагентов доказана при
исследовании образцов ДНК следующих гетерологичных штаммов микроорганизмов
^ Bacillus cereus 8, Bacillus cereus 751, Bacillus subtilis 35, Bacillus subtilis 56, Bacillus
thuringiensis, Bacillus megaterium, Bacillus globigii, Legionella micdadei, Yersinia
enterocolitica (штамм И-26-04), Yersinia pseudotuberculosis (штамм 4320), a также
геномной ДНК человека.
При тестировании образцов ДНК вышеперечисленных организмов и ДНК
человека неспецифических реакций выявлено не было. Информация об известных
интерферирующих соединениях указана в разделе «Интерферирующие вещества и
ограничения по использованию проб исследуемого материала».
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Диагностическая чувствительность набора реагентов была изучена на модельных
пробах биологического материала, искусственно контаминированных
инактивированными штаммами В. anthracis, F. tularensis, Y. pestis, L. pneumophila,
B. abortus, B. melitensis и В. suis, вируса Эбола, вариант Заир, и вируса гриппа А.
стр. 6 из 36
--- стр. 7 ---
♦
Определение диагностической специфичности набора реагентов
АмплиСенс®ДНК-чип ООИ-1 проводилось на образцах биологического материала
(цельная кровь, мазки из ротоглотки, мазки из полости носа, смывы с питательной
среды, вода и почва), отрицательных при исследовании наборами сравнения. Всего
при исследовании диагностической чувствительности и специфичности было
протестировано 840 образцов биологического материала - 590 положительных и
250 отрицательных.
Исследование проводилось в сравнении с наборами реагентов:
«АмплиСенс® Вас/7/us anthracis-FRT» (РУ № ФСР 2008/02417), «ОМ-Скрин-
Туляремия-РВ» (РУ № РЗН 2015/2866), «АмплиСенс® Yersinia pestis-FL» (РУ № ФСР
2012/13303), «АмплиСенс® Legionella pneumophila-FL» (РУ № ФСР 2010/07097),
«АмплиСенс® Brucella spp.-FL» (РУ № ФСР 2009/04212), «АмплиСенс® EBOV Zaire-
FL» (РУ № P3FI 2014/2036) и «АмплиСенс® Influenza virus А-тип-FL» (РУ № ФСР
2010/08367). Дискордантных результатов выявлено не было.
Таблица 3
Диагностические характеристики набора реагентов
ДЛЯ диагностики in vitro АмплиСенс® , ЦНК-ЧИП ООИ-1
Диагностическая Диагностическая
чувствител ьность специфичность,
Тип образцов (с доверительной (с доверительной ^
вероятностью 95 %), вероятностью 95 %),
в интервале, % в интервале, %
при выявлении ДНК Bacillus anthracis
Цельная кровь 88,7 - 100 90,5 - 100
Культуры микроорганизмов 88,7 - 100 86,1 - 100
Вода 88,7- 100 86,1 - 100
Почва 88,7 - 100 86,1 - 100
при выявлении ДНК Francisella tularensis
Цельная кровь 88,7-100 90,5-100
Культуры микроорганизмов 88,7 - 100 86,1 - 100
Вода 88,7 - 100 86,1 - 100
Почва 88,7 - 100 86,1 - 100
при выявлении ДНК Yersinia pestis
Цельная кровь 88,7 - 100 90,5-100
Культуры микроорганизмов 88,7 - 100 86,1 - 100
Вода 88,7 - 100 86,1 - 100
Почва 88,7-100 86,1 - 100
при выявлении ДНК Legionella pneum ophila
Цельная кровь 88,7-100 90,5- 100
Культуры микроорганизмов 88,7-100 86,1 - 100
Вода 88,7-100 86,1 - 100
Почва 88,7-100 86,1 - 100
при выявлении ДНК Brucella abortus. Brucella melitensis, Brucella suis
Цельная кровь 96,1 - 100 90,5- 100
Культуры микроорганизмов 96,1 - 100 86,1 - 100
стр. 7 из 36
--- стр. 8 ---
Тип образцов
Диагностическая
чувствительность
(с доверительной
вероятностью 95 %),
в интервале, %
Диагностическая
специфичность,
(с доверительной
вероятностью 95 %),
в интервале, %
при выявлении РНК вируса Эбола вариант Заир
Цельная кровь 88,7-100 90,5-100
лри выявлении РНК вируса грипла А
Мазки из полости носа 88,7-100 90,5-100
Мазки из ротоглотки 88,7 - 100 90,5- 100
Культуры микроорганизмов 88,7 - 100 86,1 - 100
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ И СВЕДЕНИЯ ОБ УТИЛИЗАЦИИ
Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно
биологические (ПЦР) исследования биологического материала на наличие
возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-
эпидемиологических правил СП 1.3.3118-13 «Безопасность работ с
микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)», СанПиН 2.1.7.2790-10
«Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими
отходами» и методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация работы
лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе
с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».
При работе необходимо всегда выполнять следующие требования:
- Температура в помещении лаборатории от 20 до 28°С, относительная влажность
от 15 до 75%.
- Рассматривать исследуемые образцы биологического материала как
инфекционно-опасные.
- Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в
отдельных помещениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Экстракции,
продолжать в Зоне Амплификации и Детекции. Не возвращать образцы,
оборудование и реагенты в зону, в которой была проведена предыдущая стадия
процесса.
- Неиспользованные реагенты, реагенты с истекшим сроком годности, а также
использованные реагенты, упаковку\ биологический материал, включая
материалы, инструменты и предметы, загрязненные биологическим материалом,
следует удалять в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.7.2790-10
«Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими
отходами».
' Неиспользованные реагенты, реагенты с истекшим сроком годности, использованные реагенты,
упаковка относятся к классу опасности медицинских отходов Г.
стр. 8 из 36
--- стр. 15 ---
транспортной среды для хранения и транспортировки респираторных мазков. Конец
зонда отламывают или отрезают, с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть
крышку пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.
Допускается хранение образцов материала:
- при температуре от 2 до 8 °С - в течение 1 суток;
- при температуре от минус 24 до минус 16 °С - в течение 1 недели;
Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.
Мазки из полости носа
Мазки из полости носа берут сухими стерильными зондами с тампонами. Зонд с
тампоном вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2-3 см до
нижней раковины. Затем зонд слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход
под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль
наружной стенки носа. После забора материала тампон (рабочую часть зонда с
тампоном) помещают в стерильную одноразовую пробирку с 500 мкл транспортной
среды для хранения и транспортировки респираторных мазков. Конец зонда
отламывают или отрезают, с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть крышку
пробирки. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.
Допускается хранение образцов материала:
- при температуре от 2 до 8 °С - в течение 1 суток;
- при температуре от минус 24 до минус 16 °С - в течение 1 недели;
Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.
ВНИМАНИЕ! Рекомендуется совмещать мазки из полости носа и ротоглотки в одной
пробирке. Для этого рабочие концы зондов после взятия мазков у пациента
помещаются в одну пробирку с 500 мкл транспортной среды и исследуются как один
образец.
Культуры микроорганизмов
Для получения образца культуры микроорганизмов для исследования колонии
микроорганизмов необходимо ресуспендировать в 1 мл 0,9% раствора натрия
хлорида или 0,01 М калий-фосфатном буферном растворе, pH 7,0.
Допускается хранение образцов материала:
- при температуре от 2 до 8 °С - в течение 1 суток;
- при температуре от минус 24 до минус 16 °С - в течение 1 недели;
- при температуре не выше минус 68 °С - длительно.
Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.
Образцы почвы
Для получения образцов почвы в пробирки на 5 мл с плотно закрывающейся
стр. 15 из 36
--- стр. 16 ---
(завинчивающейся) крышкой отдельным шпателем (или одноразовыми лопатками)
вносят по 0,4-1,0 г (около 1,0 мл) земли, заливают равным объемом 70 % этанола и
выдерживают в течение 10 мин.
Допускается хранение образцов почвы:
- при температуре от 2 до 8 °С - в течение 1 суток;
- при температуре от минус 24 до минус 16 °С - в течение 1 недели;
- при температуре не выше минус 68 °С - длительно.
Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.
Образцы воды
Для анализа отбирают образцы сточной воды, воды из водоема, питьевой воды в
количестве 15-25 мл в специальный сухой стерильный контейнер объемом 50-60 мл.
Допускается хранение образцов воды:
- при температуре от 2 до 8 °С - в течение 1 суток;
- при температуре от минус 24 до минус 16 °С - в течение 1 недели;
- при температуре не выше минус 68 °С - длительно.
Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.
Допускается транспортирование вышеперечисленного материала при
температуре от 2 до 8 °С в течение 1 суток.
ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАЦИИ ДНК/РНК
Образцы цельной крови требуют предварительной подготовки.
В одноразовую полипропиленовую завинчивающуюся или плотно
закрывающуюся пробирку на 1,5 мл вносят 1,5 мл цельной крови с ЭДТА, и
центрифугируют при 800 об/мин (380 g при диаметре ротора 50 мм) в течение
10 мин; затем верхний слой плазмы (500-600 мкл) с лейкоцитами переносят в новую
одноразовую полипропиленовую завинчивающуюся или плотно закрывающуюся
пробирку на 1,5 мл и центрифугируют при 8000 g в течение 5 мин. Надосадочную
жидкость (за исключением 100 мкл жидкости над осадком клеток) переносят в
контейнер с дезраствором, а осадок клеток и 100 мкл надосадочной жидкости
используют для экстракции ДНК/РНК.
Допускается хранение полученной фракции цельной крови:
- при температуре от минус 24 до минус 16 °С - в течение 1 недели;
- при температуре не выше минус 68 °С - длительно.
Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.
Мазки из РОТОГЛОТКИ и/или полости носа требуют предварительной подготовки.
Перед экстракцией ДНК/РНК содержимое закрытой пробирки перемешивают на
стр. 16 из 36
--- стр. 17 ---
вортексе и центрифугируют в течение 5 секунд при 5 тыс об/мин для удаления
капель с внутренней поверхности крышки пробирки.
Культуры микроорганизмов требуют предварительной подготовки.
Перед экстракцией ДНК/РНК необходимо провести центрифугирование суспензий
культур микроорганизмов при 12000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную
жидкость удалить в емкость с дезинфицирующим раствором, осадок
ресуспендировать в 50 мкл 0,9% раствора натрия хлорида. Для исследования
используют 50 мкл суспензии.
Допускается хранение полученных концентрированных суспензий культур
микроорганизмов;
- при температуре от 2 до 8 °С - в течение 1 суток;
- при температуре от минус 24 до минус 16 °С - в течение 1 недели;
Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.
Образцы почвы
Перед экстракцией ДНК/РНК в каждую пробирку с образцом почвы вносят по 3 мл
физиологического раствора, тщательно перемешивают и декантируют в течение
5 минут. Из пробирок с декантированной землей переносят по 1 мл раствора и
осаждают грубодисперсную фракцию центрифугированием на микроцентрифуге в
течение 2-3 минут при 3000 g (2000 об/мин при радиусе ротора 70 мм). 100 мкл
осветленной надосадочной жидкости используют для последующей экстракции
ДНК/РНК.
Допускается хранение полученной осветленной надосадочной жидкости;
- при температуре от 2 до 8 °С - в течение 1 суток;
- при температуре от минус 24 до минус 16 °С - в течение 1 недели;
Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.
Образцы воды
Перед экстракцией ДНК/РНК 10 мл воды центрифугируют в течение 15 минут при
7000 g (например 7500 об/мин для центрифуги 5430, Eppendorf Manufacturing
Corporation («Эппендорф Мануфэктуринг Корпорэйшн»)). Надосадочную жидкость
(за исключением 100 мкл жидкости над осадком) переносят в контейнер с
дезраствором, а осадок и 100 мкл надосадочной жидкости используют для
экстракции ДНК/РНК.
Допускается хранение полученной суспенции;
- при температуре от 2 до 8 °С - в течение 1 суток;
- при температуре от минус 24 до минус 16 °С - в течение 1 недели;
Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.
стр. 17 из 36
--- стр. 18 ---
Допускается транспортирование вышеперечисленного материала при
температуре от 2 до 8 °С в течение 1 суток.
ИНТЕРФЕРИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА И ОГРАНИЧЕНИЯ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ
ПРОБ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА
Непригодными для исследования являются образцы плазмы крови, если кровь
была взята в пробирки с гепарином в качестве антикоагулянта.
Сведения о других интерферирующих веществах при условии соблюдения
правил взятия и предварительной подготовки исследуемого материалах, указанных
в инструкции, отсутствуют.
ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование состоит из следующих этапов:
- экстракция ДНК/РНК из исследуемых образцов;
- обратная транскрипция РНК;
- ПЦР-амплификация фрагментов ДНК и кДНК со специфическими
олигонуклеотидами;
- транскрипция РНК на полученной матрице фрагментов ДНК;
- гибридизация полученных фрагментов РНК с иммобилизованными на
поверхности ДНК-чипа олигонуклеотидыми зондами;
- анализ и интерпретация результатов.
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК/РНК из ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ
(проводится в ЗОНЕ 1 - помещении для обработки исследуемого материала)
ВНИМАНИЕ! При работе с ДНК/РНК необходимо использовать только одноразовые
пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку «RNase-
free», «DNase-free».
Для экстракции ДНК/РНК используется комплект реагентов «РИБО-преп».
Порядок работы смотрите в инструкции к комплекту реагентов.
Объемы реагентов и образцов при экстракции с помощью комплекта реагентов
«РИБО-преп»;
Объем исследуемого образца - 100 мкл.
В пробирку отрицательного контроля экстракции (ОК) внести 100 мкл ОКО.
В пробирку положительного контроля экстракции (ПК) внести 90 мкл ОКО и
10 мкл ПКО ООИ-1.
Объем элюции - 50 мкл.
стр. 18 из 36
--- стр. 19 ---
ВНИМАНИЕ! После проведения элюции полученный материал ДНК/РНК разделить
на 2 части по 25 мкл. Одну часть использовать для проведения ПЦР сразу, вторую -
после проведения реакции обратной транскрипции (ОТ).
ВНИМАНИЕ! Реакцию ОТ рекомендуется проводить сразу после получения проб
ДНК/РНК. Допускается хранение проб при температуре от 2 до 8 °С не более 30 мин,
при температуре от минус 24 до минус 16 °С не более недели и при температуре не
выше минус 68 °С до года. Допускается только однократное замораживание-
оттаивание проб РНК.
ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ
(проводится в ЗОНЕ 2 - помещении для проведения ОТ и ПЦР)
ВНИМАНИЕ! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые
пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку «RNase-
free», «DNase-free».
Для обратной транскрипции РНК используется комплект реагентов «РЕВЕРТА-
L». Порядок работы смотрите в инструкции к комплекту реагентов.
Объемы реагентов и образцов при проведении 1 реакции обратной транскрипции с
помощью комплекта реагентов «РЕВЕРТА-L»:
Объем РНК-пробы - 10 мкл.
Объем готовой реакционной смеси (содержит RT-mix, RT-G-mix-1, ревертазу
(MMIv)) - 10 мкл.
Общий объем реакции - 20 мкл.
Полученную в реакции обратной транскрипции кДНК для последующей
постановки ПЦР развести в 2 раза ДНК-буфером (к 20 мкл кДНК отдельным
наконечником с фильтром добавить 20 мкл ДНК-буфера, перемешать на вортексе и
осадить капли со стенок пробирок кратким центрифугированием (1-3 с)).
Готовый препарат кДНК можно хранить при температуре от минус 24 до минус
16 °С в течение 1 недели или при температуре не выше минус 68 °С в течение года.
стр. 19 из 36
--- стр. 20 ---
СОСТАВ
«ПЦР-комплект ООИ-1». Комплект реагентов используется для проведения ПЦР-
амплификации участков ДНК/кДНК B.anthracis, F.tularensis, Y.pestis, L.pneumophila,
возбудителей бруцеллеза, вирусов Эбола вариант Заир {EBOV Zaire), и гриппа А
{Influenza virus А). Комплект реагентов включает;
Реагент Описание Объем, мл Количество
ПЦР-смесь-1 ООИ-1 Прозрачная бесцветная
жидкость 0,5 1 пробирка
ПЦР-смесь-2 blue Жидкость синего цвета 1.2 1 пробирка
Минеральное масло для ПЦР Вязкая бесцветная жидкость 4,0 1 флакон
Воск для ПЦР Твердое вещество белого
цвета 1,3 2 пробирки
Бетаин Прозрачная бесцветная
жидкость 0,5 1 пробирка
К+ ООИ-1 Прозрачная бесцветная
жидкость 0,05 1 пробирка
К- Прозрачная бесцветная
жидкость 0,05 1 пробирка
i
Комплект реагентов рассчитан на проведение 96 реакций, включая контрольные
образцы.
Дополнительно к комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа
экстракции ДНК/РНК из биологического материала:
Реагент Описание Объем, мл Количество
ПКО ООИ-1 Прозрачная бесцветная
жидкость 0,1 1 пробирка
ОКО Прозрачная бесцветная
жидкость 1,2 1 пробирка
«Комплект для транскрипции». Комплект реагентов используется для проведения
реакции транскрипции - синтеза молекул РНК на матрице ДНК, полученных в
результате ПЦР-амплификации фрагментов ДНК/кДНК B.anthracis, F.tularensis,
Y.pestis, L.pneumophila, возбудителей бруцеллеза, вирусов Эбола вариант Заир
(ЕВО\/Zaire) и гриппа А {Influenza virus А). Комплект реагентов включает:
Реагент Описание Объем, мл Количество
5х Буфер для транскрипции
Прозрачная жидкость
светло-желтого цвета или
бесцветная
0,5 1 пробирка
Смесь НТФ Прозрачная бесцветная
жидкость 0,5 1 пробирка
\ Т7-РНК-полимераза
Прозрачная бесцветная или
слегка опалесцирующая
жидкость
0,1 1 пробирка
Н20 стерильная Прозрачная бесцветная
жидкость 1,8 1 пробирка
стр. 20 из 36
--- стр. 21 ---
Комплект реагентов рассчитан на проведение 48 реакций, включая контрольные
образцы.
«Комплект для гибридизации ДНК-чип». Комплект реагентов используется для
проведения гибридизации на ДНК-чипах. Комплект реагентов включает:
Реагент Описание Объем, мл Количество
ДНК-чип ООИ-1
Микроскопный слайд
размером 25+1 мм шириной,
75+1 мм длиной, 1+0.2мм
высотой
-
4 слайда в
пластмассовом
боксе
Концентрат конъюгата Слегка вязкая жидкость
светло-голубого цвета 0,05 1 пробирка
2х Буфер для гибридизации Прозрачная бесцветная
жидкость^ 2.0 1 пробирка
Твин-20 Вязкая жидкость светло-
желтого цвета 0,15 1 пробирка
20х SSC Прозрачная бесцветная
жидкость 3,0 1 пробирка
10х Раствор для отмывки Прозрачная бесцветная
жидкость"* 1,5 1 пробирка
Раствор для разведения
концентрата конъюгата
Прозрачная бесцветная
жидкость 5,0 1 пробирка
Н20 стерильная Прозрачная бесцветная
жидкость 27 1 флакон
Комплект реагентов рассчитан на проведение 48 реакций, включая контрольные
образцы.
ПЦР-АМПЛИФИКАЦИЯ
(проводится в ЗОНЕ 2 - помещении для проведения ОТ и ПЦР)
ВНИМАНИЕ! При работе с ДНК/кДНК необходимо использовать только одноразовые
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку
RNase-free, DNase-free.
Выбор пробирок для амплификации зависит от типа амплификатора.
Для внесения в пробирки реагентов, проб ДНК/кДНК и контрольных образцов
используются одноразовые наконечники с фильтрами.
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем пробы ДНК/кДНК - 5 мкл.
1. Разморозить пробирку с ПЦР-смесью-1 ООИ-1. Перемешать содержимое всех
реагентов ПЦР-комплекта, осадить капли на вортексе.
2. Пробирку с воском для ПЦР прогреть в термостате при температуре 95°С до
полного расплавления.
^ Допустимо образование кристаллического осадка, полностью растворяющегося при температуре от
35 до 39 °С.
стр. 21 из 36
--- стр. 22 ---
3. Отобрать необходимое количество пробирок для ПЦР-амплификации ДНК/кДНК
исследуемых и контрольных образцов. Необходимо обратить внимание на то, что
для каждого исследуемого образца следует приготовить по две пробирки: для
образца ДНК после этапа экстракции нуклеиновых кислот и для образца кДНК
после этапа обратной транскрипции.
4. Внести на дно приготовленных пробирок по 5 мкл ПЦР-смеси-1 ООИ-1. Сверху
добавить по капле (примерно 10-15 мкл) расплавленного воска так, чтобы он
полностью накрыл жидкость, закрыть крышки пробирок. Пробирки с разлитой
ПЦР-смесью-1 и воском можно хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение
1 недели.
5. В отдельной пробирке подготовить реакционную смесь 1. Для этого смешать
компоненты из расчета на 1 реакцию в следующем соотношении: 10 мкл ПЦР-
смеси-2 blue, 5 мкл Бетаина. Смесь готовить на общее число исследуемых и
контрольных образцов (количество контрольных образцов см. в пункте 8) плюс запас
на одну реакцию.
6. Перемешать реакционную смесь 1 и осадить капли кратковременным
центрифугированием с помощью центрифуги/вортекса.
7. Внести в каждую пробирку с ПЦР-смесью-1 ООИ-1 на поверхность застывшего
воска по 15 мкл реакционной смеси 1. при этом она не должна проваливаться
под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1 ООИ-1. При использовании
амплификатора без термостатируемой крышки сверху добавить по 1 капле
минерального масла для ПЦР.
8. Промаркировать пробирки.
9. В случае хранения образцов ДНК/кДНК, пробирки необходимо встряхнуть и
осадить на вортексе.
10. В подготовленные пробирки внести по 5 мкл проб ДНК или ло 5 мкл проб кДНК,
полученных из исследуемых и контрольных образцов в результате экстракции
или обратной транскрипции, соответственно.
11 .Поставить контрольные реакции.
а) положительный контроль ПЦР (К+) - в пробирку с реакционной смесью
внести 5 мкл К+ ООИ-1.
б) отрицательный контроль ПЦР (К-) - в пробирку с реакционной смесью
внести 5 мкл К-.
в) отрицательный контроль экстракции (ОК) - в пробирку с реакционной
смесью внести 5 мкл пробы, экстрагированной из ОКО.
стр. 22 из 36
--- стр. 23 ---
г) положительный контроль экстракции (ПК) - в пробирку с реакционной
смесью внести 5 мкл пробы, экстрагированной из ПКО ООИ-1.
ВНИМАНИЕ! Перед постановкой амплификации рекомендуется осадить капли со
стенок пробирок кратким центрифугированием на вортексе (1-3 с).
12.Запрограммировать амплификатор для выполнения программы амплификации
(таблица 4).
Таблица 4
Программа амплификации
Цикл Температура, °С Время Количество
циклов
1 94 1 мин 1
2
94 15 с
4053 25 с
72 25 с
3 72 2 мин 1
4 4 хранение
13. Установить пробирки в ячейки амплификатора и запустить программу
амплификации.
14. По окончании выполнения программы пробирки отправить в помещение для
транскрипции и гибридизации (ЗОНУ 3).
Допускается хранение продуктов амплификации:
- при температуре от 18 до 25 °С - в течение 16 часов;
- при температуре от 2 до 8 °С - в течение 1 недели;
- при температуре от минус 24 до минус 16 °С - длительно.
ТРАНСКРИПЦИЯ
(проводится в ЗОНЕ 3 - помещении для детекции продуктов амплификации в
ПЦР-боксе или в вытяжном шкафу, при наличии в нем локального источника
УФ-света)
ВНИМАНИЕ! Работа с амплифицированной кДНК/ДНК должна проводиться в
отдельной комнате сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в
зоне 1 и зоне 2.
ВНИМАНИЕ! При работе с ДНК/РНК необходимо использовать только одноразовые
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку
RNase-free, DNase-free.
Перед проведением транскрипции необходимо объединить пробы, относящиеся к
одному исследуемому образцу (см. п. 3 раздела ПЦР-АМПЛИФИКАЦИЯ).
Перемешать полученную смесь и осадить капли кратковременным
стр. 23 из 36
--- стр. 24 ---
центрифугированием с помощью центрифуги/вортекса. Таким образом, в одной
пробирке будут находиться продукты амплификации как участков ДНК, так и
участков кДНК.
Для внесения в пробирки реагентов и продуктов амплификации используются
одноразовые наконечники с фильтрами.
Общий объем реакционной смеси - 50 мкл, объем пробы продуктов ПЦР-
амплификации - 20 мкл.
ВНИМАНИЕ! Компоненты реакционной смеси следует смешивать непосредственно
перед проведением транскрипции.
1. Разморозить комплект реагентов для проведения реакции транскрипции.
2. Перемешать содержимое всех реагентов для транскрипции, осадить капли на
вортексе.
3. В отдельной пробирке подготовить реакционную смесь 2. Для этого смешать
компоненты из расчета на 1 реакцию в следующем соотношении: 10 мкл 5х
Буфера для транскрипции, 10 мкл смеси НТФ, 8 мкл Н20 стерильной, 2 мкл
Т7-РНК-полимеразы. Смесь готовить на общее число исследуемых и контрольных
образцов, плюс запас на одну реакцию. Осадить капли на вортексе.
4. Отобрать необходимое количество пробирок для проведения транскрипции
исследуемых и контрольных проб.
5. Промаркировать пробирки.
6. Внести в приготовленные пробирки для транскрипции по 30 мкл реакционной
смеси 2.
7. Добавить по 20 мкл продуктов амплификации исследуемых и контрольных
проб, полученных на предыдущем этапе. Осторожно перемешать
пипетированием.
8. Осадить капли со стенок пробирок кратким центрифугированием на вортексе.
9. Запрограммировать термостат на 37 °С. Запустить термостат.
10. Когда температура достигнет 37 °С, поместить пробирки в термостат, закрыть
крышку прибора.
11.Оставить пробирки в термостате на 60 минут. По окончании выполнения
программы приступить к этапу гибридизации.
Допускается хранение продуктов транскрипции при температуре от минус 24 до
минус 16 °С - в течение 1 недели.
ГИБРИДИЗАЦИЯ
(проводится в ЗОНЕ 3 - помещении для детекции продуктов амплификации в
стр. 24 из 36
--- стр. 25 ---
ПЦР-боксе или в вытяжном шкафу, при наличии в нем локального источника
УФ-света)
ВНИМАНИЕ! Работа с амплифицированной кДНК/ДНК должна проводиться в
отдельной комнате сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в
зоне 1 и зоне 2.
ВНИМАНИЕ! При работе с ДНК/РНК необходимо использовать только одноразовые
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку
RNase-free, DNase-free.
Для внесения в пробирки реагентов и продуктов транскрипции используются
одноразовые наконечники с фильтрами.
А. Приготовление растворов
ВНИМАНИЕ! Все растворы необходимо отбирать одноразовыми
наконечниками.
Приготовить растворы для гибридизации необходимого числа ДНК-чипов, в
соответствии с табл. 5.
Таблица 5
Объемы реагентов для проведения анализа
на необходимом количестве ДНК-чипов
Название
раствора Используемые реагенты
Количество ДНК-чипов в одной постановке
1 2 3 ■ 4
Объем реагентов, мл
Буфер 1
20х SSC 0,35 0,65 0,95 1,25
Твин-20 0,014 0,026 0,038 0,05
Н20 стерильная 1,04 1,93 2,82 3,7
Буфер 2
20х SSC 0,14 0,26 0,38 0,5
Твин-20 0,014 0,026 0,038 0,05
Н20 стерильная 1,26 2,32 3,38 4,45
Буфер 3
20х SSC 0,14 0,26 0,38 0,5
Н20 стерильная 1,26 2,34 3,42 4,5
Рабочий раствор
конъюгата
Концентрат конъюгата 0,012 0,024 0,036 0,048
Раствор для разведения
концентрата конъюгата 1,2 2,4 3,6 4,8
Рабочий раствор
для отмывки
10х Раствор для отмывки 0,26 0,5 0,75 1,0
Н20 стерильная 2,34 4,5 6,75 9,0
Буферы 1 - 3 и рабочий раствор для отмывки хранить при температуре от 2 до
8 °С не более 3 суток.
стр. 25 из 36
--- стр. 26 ---
Рабочий раствор конъюгата готовить перед использованием за 10-20 мин до его
внесения. Хранить не более 2 часов при температуре от 18 до 25 °С, в защищенном
от света месте.
Б. Проведение гибридизации
ВНИМАНИЕ! Компоненты реакционной смеси следует смешивать непосредственно
перед проведением гибридизации.
Общий объем реакционной смеси - 80 мкл, включая объем пробы продуктов
транскрипции -10 мкл
1. Вскрыть фольгированный пакет и извлечь из пластмассового бокса необходимое
количество ДНК-чипов. В ходе работы необходимо держать слайды за боковую
поверхность или матовое поле, не касаясь рабочего поля чипа.
Неиспользованные ДНК-чипы оставить в закрытом пластмассовом боксе в
фольгированном пакете, при этом пакет следует плотно закрыть с помощью
скрепки, предварительно свернув край пакета 2-3 раза. Осушитель (силикагель)
из пакета не удалять!
2. Сверху на ДНК-чип (на стороне маркировки) наложить 16-луночный трафарет для
предотвращения контаминации образцов. Вставить ДНК-чипы с надетыми на них
трафаретами в рамку-держатель для слайдов.
ВНИМАНИЕ! Запрещается наносить на поверхность ДНК-чипов какие-либо отметки.
3. Перемешать реагенты для гибридизации, осадить капли на вортексе.
4. Отобрать необходимое количество пробирок объемом 0,5 мл для проведения
гибридизации исследуемых и контрольных проб.
5. Внести в приготовленные пробирки по 40 мкл 2х буфера для гибридизации,
30 мкл Н20 стерильной и 10 мкл продуктов транскрипции исследуемых и
контрольных проб, полученных на предыдущем этапе.
6. Пробирки прогреть в термостате при 80 °С в течение 2 минут.
7. Перед постановкой гибридизации осадить капли со стенок пробирок кратким
центрифугированием на вортексе (1-3 с).
8. Запрограммировать термошейкер для планшетов на 37 °С.
9. Внести в эрреи (лунки рамки-трафарета) ДНК-чипа 80 мкл предварительно
прогретых смесей, содержащих продукты транскрипции. Рамку-держатель
накрыть крышкой. Поместить в термошейкер.
10. Инкубировать ДНК-чипы в термошейкере в течение 60 минут при температуре
37 °С и при скорости вращения платформы 300 об/мин.
11. После инкубации аккуратно удалить содержимое лунок рамки-трафарета с
стр. 26 из 36
--- стр. 27 ---
помощью вакуумного медицинского отсасывателя и отдельного наконечника для
каждого эррея, не повреждая центральное поле эррея.
12. Внести в каждый эррей по 100 мкл Буфера 1. Рамку-держатель накрыть
крышкой. Поместить в термошейкер.
13. Инкубировать ДНК-чипы в термошейкере в течение 7 минут при температуре
37 °С и при скорости вращения платформы 300 об/мин.
14. После инкубации аккуратно удалить содержимое лунок рамки-трафарета с
помощью вакуумного медицинского отсасывателя, не повреждая центральное
поле эррея.
15. Внести в каждый эррей по 100 мкл Буфера 2. Рамку-держатель накрыть
крышкой. Поместить в термошейкер.
16. Инкубировать ДНК-чипы в термошейкере в течение 7 минут при температуре
37 °С и при скорости вращения платформы 300 об/мин.
17. После инкубации аккуратно удалить содержимое лунок рамки-трафарета с
помощью вакуумного медицинского отсасывателя, не повреждая центральное
поле эррея.
18. Внести в каждый эррей по 100 мкл Буфера 3. Рамку-держатель накрыть
крышкой. Поместить в термошейкер.
19. Инкубировать ДНК-чипы в термошейкере в течение 7 минут при температуре
37 °С и при скорости вращения платформы 300 об/мин.
20. После инкубации аккуратно удалить содержимое лунок рамки-трафарета с
помощью вакуумного медицинского отсасывателя, не повреждая центральное
поле эррея.
21. Внести в каждый эррей по 90 мкл рабочего раствора конъюгата. Рамку-
держатель накрыть крышкой. Поместить в термошейкер.
22. Инкубировать ДНК-чипы в термошейкере в течение 30 минут при температуре
37 °С и при скорости вращения платформы 300 об/мин.
23. После инкубации аккуратно удалить содержимое лунок рамки-трафарета с
помощью вакуумного медицинского отсасывателя, не повреждая центральное
поле эррея.
24. Внести в каждый эррей по 100 мкл рабочего раствора для отмывки. Рамку-
держатель накрыть крышкой. Поместить в термошейкер.
25. Инкубировать ДНК-чипы в термошейкере в течение 2 минут при температуре
37 °С и при скорости вращения платформы 300 об/мин.
26. После инкубации аккуратно удалить содержимое лунок рамки-трафарета с
помощью вакуумного медицинского отсасывателя, не повреждая центральное
стр. 27 из 36
--- стр. 28 ---
поле эррея.
27. Повторить отмывку, следуя пп. 24-26.
28. Вынуть ДНК-чипы с надетыми на них рамками-трафаретами из рамки-держателя.
Снять рамку-трафарет с каждого ДНК-чипа.
29. Каждый ДНК-чип ополоснуть 70-100 мл дистиллированной воды.
30. Сбросить капли с ДНК-чипов центрифугированием в течение 1 мин при
1000 об/мин.
31. Перейти к анализу и интерпретации результатов.
АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. ДНК-чипы после проведения гибридизации сканировать на многоканальном
флуоресцентном сканере для биочипов, активируя канал Суб с разрешением
10 мкм/пкс.
2. Полученные результаты сканирования, отражающие специфические сигналы
флуоресценции каждого спота'* и фоновые значения на эррее^, в виде выходных
файлов сохранить в формате TIFF.
3. Сканированные образы в формате TIFF открыть в программе для последующей
интерпретации изображения, например, SpotScout Pro (прилагается к сканеру для
биочипов MarS, Ditabis). На каждый эррей наложить сетку по размеру эррея и
спотов (кроме границы эррея). Обработать изображения и сохранить полученные
результаты в формате Excel.
4. Результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) в точках
(спотах), соответствующих иммобилизованным олигонуклеотидным зондам,
комплементарным фрагментам последовательности ДНК/РНК возбудителей,
сигнала флуоресценции, превышающего пороговое значение. Расположение
спотов на эррее и эрреев на ДНК-чипе представлено в таблицах 6 и 7.
ВНИМАНИЕ! Параметры для обсчета и пороговые значения сигналов
флуоресценции по каждому олигонуклеотидному зонду указаны во вкладыше,
прилагаемом к набору реагентов.
* Спот - индивидуальная точка на эррее.
® Эррей - ограниченная зона на поверхности чипа для лостановки одного клинического/контрольного
образца, содержащая набор иммобилизованных молекул ДНК или РНК и вспомогательных
маркерных белков, молекул ДНК или РНК в виде индивидуальных слотов (точек).
стр. 28 из 36
--- стр. 29 ---
Таблица 6
Дизайн эррея ДНК-чипа
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) маркер
Ft1 Ft2 Ft4 Yp2 Yp4 Yp6 Brul Bru2 Bru4
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) маркер
Ft1 Ft2 Ft4 Yp2 Yp4 Yp6 Brul Bru2 Bru4
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) маркер
Ft1 Ft2 Ft4 Yp2 Yp4 Yp6 Brul Bru2 Bru4
(10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) маркер
Lp1 Ba1 ВаЗ EBOV IVA IVA_H1 IVA_H5 IVA_H7 IVA_H9
(10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) маркер
Lp1 Bal ВаЗ EBOV IVA IVA_H1 IVA_H5 IVA_H7 IVA_H9
(10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) маркер
Lp1 Bal ВаЗ EBOV IVA IVA_H1 IVA_H5 IVA_H7 IVA_H9
(19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) маркер
Нет
зондов
Нет
зондов
Нет
зондов
Нет
зондов
Нет
зондов
Нет
зондов
Нет
зондов
Нет
зондов
буфер
(19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) маркер
Нет
зондов
Нет
зондов
Нет
зондов
Нет
зондов
Нет
зондов
Нет
зондов
Нет
зондов
Нет
зондов
буфер
(19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) маркер
Нет
зондов
Нет
зондов
Нет
зондов
Нет
зондов
Нет
зондов
Нет
зондов
Нет
зондов
Нет
зондов
буфер
маркер маркер маркер маркер маркер маркер маркер маркер маркер маркер
Таблица 7
Расположение эрреев (образцов) на ДНК-чипе
1 7
2 8
3 9
4 10
5 11
6 12
Критерии оценки валидности и достоверности анализа:
Результат анализа эррея считают валидным*, если на ДНК-чипе на канале Су5
визуально наблюдают флуоресцирующие споты в положениях, соответствующих
маркерам границы эррея. Значения сигналов флуоресценции маркеров границы
эррея должно быть не менее 1000. Сигнал флуоресценции оценивается вручную при
стр. 29 из 36
--- стр. 33 ---
• наличие положительного сигнала в спотах, соответствующих одному из зондов
IVA_H5, IVA_H7, IVA_H9 - наличие в пробе вируса гриппа птиц, обладающего
гемагглютинином субтипа 5, 7 или 9, соответственно {Influenza virus А/Н5-
avian. Influenza virus А/И7-avian, Influenza virus AJH9-av\an, соответственно).
Вирус Эбола
Используемый в реакции зонд EBOV комплементарен последовательности участка
гена I, отвечающего за синтез полимеразы вируса Эбола варианта Zaire.
Наличие положительного сигнала в спотах, соответствующих зонду EBOV,
свидетельствует о наличие в исследуемом образце РНК вируса Эбола.
стр. 33 из 36
--- стр. 34 ---
СРОК годности. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ и ХРАНЕНИЯ
Срок годности. 6 мес. Набор реагентов с истекшим сроком годности применению не
подлежит. Срок годности вскрытых реагентов соответствует сроку годности,
указанному на этикетках для невскрытых реагентов, если в инструкции не указано
иное.
Транспортирование. Набор реагентов транспортировать при температуре от 2 до
8 °С не более 3 сут в термоконтейнерах, содержащих хладоэлементы, всеми видами
крытых транспортных средств. Набор реагентов при получении разукомплектовать в
соответствии с указанными температурами хранения.
Хранение. «ПЦР-комплект ООИ-1» хранить в холодильной камере при температуре
от 2 до 8 °С, кроме ПЦР-смеси-1 ООИ-1. ПЦР-смесь-1 ООИ-1 хранить в морозильной
камере при температуре от минус 24 до минус 16 °С.
«Комплект для транскрипции» хранить в морозильной камере лри температуре от
минус 24 до минус 16 °С.
«Комплект для гибридизации ДНК-чип» хранить в холодильной камере при
температуре от 2 до 8 °С, кроме ДНК-чипа ООИ-1 и Концентрата конъюгата. ДНК-чип
ООИ-1 и Концентрат конъюгата хранить в морозильной камере при температуре от
минус 24 до минус 16 °С. ДНК-чип ООИ-1 хранить в пакетах с влагопоглотителем в
защищенном от света месте. Концентрат конъюгата хранить в защищенном от света
месте.
Холодильные и морозильные камеры должны обеспечивать регламентированный
температурный режим.
г а р а н т и й н ы е о б я з а т е л ь с т в а и з г о т о в и т е л я
Изготовитель гарантирует соответствие основных параметров и характеристик
набора реагентов требованиям, указанным в технической и эксплуатационной
документации, в течение указанного срока годности при соблюдении всех условий
транспортирования, хранения и применения.
Рекламации на качество набора реагентов направлять по адресу 111123,
г. Москва, ул. Новогиреевская, дом ЗА, e-rnail: cs@pcr.ru®.
При выявлении побочных действий, не указанных в инструкции по применению
набора реагентов, нежелательных реакций при его использовании, фактов и
обстоятельств, создающих угрозу жизни и здоровью граждан и медицинских
работников при применении и эксплуатации набора реагентов, рекомендуется
Отзывы и предложения о продукции «АмплиСенс» вы можете оставить, заполнив анкету
потребителя на сайте: www.amDlisens.ru .
стр. 34 из 36
--- стр. 35 ---
направить сообщение по адресу, указанному выше, и в уполномоченную
государственную регулирующую организацию (в РФ - Федеральная служба по
надзору в сфере здравоохранения) в соответствии с действующим
законодательством.
Заведующий НПЛ ОМДиЭ
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора Е.Н. Родионова
стр. 35 из 36