Набор реагентов для проведения лабораторных диагностических исследований генов гистосовместимости человека и проверки температурного режима термоциклера и контроля контаминации — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 4 --- Основной материал для типирования в наборе HISTO TYPE C eliac Disease, HISTO TYPE, W ipe Test, KIR TYPE, EPITOP TYPE, HISTO TYPE N arcole psy - очищенная ДНК. Процедура анализа осущ ествляется с помощью ПЦР с использованием Праймеров, обладающих специф ичностью к последовательности (SSP) (см. рис. 1). Этот метод основывается на том факте, что распрямление праймера и, следовательно, успех ПЦР, зависит от точного соответствия 3'- концов обоих праймеров. И только в том случае, если праймеры полностью соответствуют целевой последовательности, происходит амплификация, которая впоследствии визуализируется с помощью электроф ореза на агарозном геле. - С Точное соответствие - амплиф икация Несовпадение - нет амплификации (специф ическая аллель) (неспециф ическая аллель) Рис. 1: Принцип SSP-ПЦР Состав отдельных смесей праймеров позволяет осущ ествлять четкую идентификацию типов HLA, указанных в соответствующ ей диаграмме оценки При каждом типировании используется определенное число (24) аликвотных и высуш енных реакционных смесей, включая внутренний контроль амплиф икации с конечным объемом 10 мкл. K IR T Y P E и EPITOP TYPE Натуральные киллеры (НК) и субпопуляции Т-лимф оцитов с CD8+ фенотипом или рецепторы Т-клеток у6 экспрессируют ингибирующ ие или активирующие иммуноглобулиноподобные рецепторы клеток-киллеров (KIR). Из-за разницы в количестве генов и чёткого полиморф изма отдельных генов, генная часть KIR рецепторов у отдельных лиц отличается вьюокой изменчивостью. При этом определённые молекулы HLA класса 1 были идентифицированы как лиганды для отдельных KIR рецепторов. Ингибирующ ий рецептор KIR2DL1 связывается с аллелями молекул HLA-C группы 2, которые несут в себе аминокислоты Asn^^ и Lys®°, а рецепторы KIR2DL2 / KIR2DL3 - с аллелями молекул HLA-C группы 1, которые несут в себе аминокислоты Ser^^ и Asn°°, при этом KIR3DL1 обладает сродством к аллелям HLA-B с эпитопом Bw4 в положении аминокислоты 77-83 спирали а1. Ингибирующ ий рецептор KIR3DL2 связывается с аллелями групп HLA-A*03 и *11. Лиганды активирующ их рецепторов KIR недостаточно хорошо задокументированы - при этом считается, что они обладают сродством к тем же молекулам HLA-B и HLA-C, что и их соответствующ ие ингибирующ ие рецепторы. Наиболее широко распространённая модель активации клеток натуральных киллеров в настоящий момент представляет собой предположение о том, что реакционность клеток натуральных киллеров контролируется балансом между подавляющ ими и активирующими сигналами. Таким образом, активация клеток натуральных киллеров может происходить из-за снижения подавляющ их сигналов или из-за роста связывания лигандами активирующих рецепторов В случае трансф ормации (например, опухолевое заболевания или вирусная инфекция) с сопутствующ ей утратой экспрессии HLA в качестве лиганда, утраченные подавляющие сигналы приводят к активации клеток натуральных киллеров и лизису кпеток- мишеней Данное наблюдение стало основой гипотезы «потери своего», она заключается в том. --- стр. 5 --- что здоровая ткань с устойчивой экспрессией HLA обходится без активации клеток натуральных киллеров. Обнаружение отдельных рецепторов KIR / KIR HLA лигандов выполняется с помощью метода PCR-SSP (ПЦР с сайт-специф ичными праймерами) BAG C ycle r C heck представляет собой быстрый и лёгкий метод подтверждения однородности температур в термоциклерах. При диагностике нуклеиновых кислот очень важно гарантировать надежность термоциклера в ходе его использования Поэтому такие тесты следует выполнять достаточно регулярно. BAG Cycler Check включает одну реакционную смесь, которая анализируется во всех 96 позициях блока термоциклера Реакционная смесь содержит одну пару праймеров для оценки температуры денатурации (540 пар оснований) и ещё одну пару праймеров для оценки температуры отжига (1040 пар оснований) С помощью этих двух пар праймеров можно оценить насколько ниже температура денатурации или насколько выше температура отжига, по сравнению со стандартными значениями. Если значения температур соответствуют требованиям, а профиль распределения температур однороден, то все 96 позиций блока должны иметь две полосы (Рис. 2). Откпонение в значениях температур приводит к потере полос в некоторых или во всех позициях (Рис. 3). Рис. 2: Результаты для BAG Cycler Check с указанными ниже параметрами Рис 3: Результаты для BAG Cycler Check с температурой денатурации, которая ниже на 2°С Так как тестовая смесь в BAG Cycler Check соответствует условиям набора BAG HISTO TYPE, то она превосходно подходит для оптимизации параметров ПЦР на конкретном термоциклере Такая оптимизация может потребоваться из-за разницы в настройках термоциклеров 3 . СОСТАВ Н АБО РО В 3 .1 HISTO SPOT Реагенты, поставляемые в локус-специф ичных наборах для типирования HISTG SPOT Реагентов из одного набора достаточно для проведения 96 тестов Каждый набор реагентов содержит: Тестовые лунки, в отдельной упаковке, каждая полоска содержит 8 тестов, которые содержат иммобилизованные сайт-специф ические олигонуклеотидные зонды 12 полосок --- стр. 6 --- Мактер-микс, готовый к использованию, содержит биотинилированные праймеры для выбранного локуса, дезоксирибонуклеозидтриф осф ат.Тад полимеразу, реакционный буфер, 0.05% азид натрия 1100 мкл Хлорид магния, 6 мМ, готовый к использованию, содержит 0.001% Проклин 300 600 мкл Х = А, В, С, DRB1, DQB1 или DPB1 Блокирующий буфер, готовый к использованию, содержащий 0.001% Проклин 150, 2 х 60 мл Буфер для гибридизации, готовый к использованию, содержащ ий 0.001% красителя, 0,1% додецилсульф ат натрия, О 001% Прокпин 150, 40 мл Буфер для обязательного промывания, готовый к использованию, содержащ ий 0.001% красителя, 0 1% додецилсульф ат натрия, 0.001% Проклин 150, 100 мл Промывной буф ер TBS (Трис-буф ерный ф изиологический раствор), готовый к использованию, содержащий 20 мМ Триса, О 003% красителей, 0.001% Проклин 150, 100 мл Субстрат BCIP® / NBT, готовый к использованию 36 мл (5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат / нитросиний тетразолий хлорид) Конъюгат, Стрептавидин-щ елочная фосфатаза, концентрат, 40 мкл, содержащий < 0.1% азида натрия (следует развести 1:1666 в Блокирующем буфере) 3.2 KIR-TYPE - 10 планшетов KIR-TYPE, что достаточно для проведения 10 типирований KIR Внесённые и высушенные реакционные смеси состоят из аллель-специф ичных праймеров, праймеров внутреннего контроля (последовательность специфичная для хромосомы 1) и нуклеотидов. Первая реакционная смесь несет на себе пометку и содержит контроль загрязнения/ отрицательный контроль с праймерами внутреннего контроля и амплификат-специфичными праймерами (см. таблицу специф ичности по партиям и диаграмму оценки). Номер партии напечатан на каждом планшете. - Смесь 22 включает положительный контроль (только праймеры внутреннего контроля) - 10 X ПЦР-буфер, что достаточно для проведения 10 типирований - 8 крышек полосок, что достаточно для проведения 10 типирований - Руководство по эксплуатации, рабочий бланк с таблицей специф ичности и схемой оценки 3.3 EPITOP-TYPE - 10 полос Epitop-TYPE, что достаточно для проведения 10 типирований Epitop Внесенные и высушенные реакционные смеси состоят из аллель-специф ичных праймеров, праймеров внутреннего контроля (последовательность специфичная для хромосомы 1) и нуклеотидов. Первая реакционная смесь несёт на себе отметку (напечатан номер партии). Последняя смесь включает контроль загрязнения/ отрицательный контроль (см таблицу специфичности по патриям и диаграмму оценки ) - 10 ПЦР-буферов, что достаточно для проведения 10 типирований - 8 крышек полосок, что достаточно для проведения 10 типирований - Руководство по эксплуатации, рабочий бланк с таблицей специф ичности и схемой оценки 3.4 HISTO TYPE Н ар ко л е пси я --- стр. 7 --- 20 полосок HISTO TYPE, что достаточно для проведения 20 типирований для диагностики нарколепсии Аликвотные и высушенные реакционные смеси состоят из аллель-специфичных праймеров, праймеров внутреннего контроля (специфичных для человеческого гена G3PDH) и нуклеотидов. Первая реакционная смесь на каждой полоске несёт на себе номер партии. Реакционные смеси для ПЦР объединяют в себе контроль загрязнения с праймерами внутреннего контроля и амплиф икат-специф ичными праймерами. - 10 ПЦР-буферов, что достаточно для проведения 20 типирований - 8 или 12 крыш ек-полосок, что достаточно для проведения 20 типирований - Руководство по эксплуатации, таблица специфичности, схема оценки и рабочий бланк 3.5 W ipe Test - 5 ПЦР полосок (8 тонкостенны х пробирок для ПЦР), их достаточно для проведения 40 реакций (13 тестов для оценки загрязнения поверхности) Аликвотные и высуш енные реакционные смеси, состоящие из аллель-специф ичного набора праймеров, внутренних контрольных праймеров (специфичных для человеческого гена G3PDH) и нуклеотидов -1 X 1,1 мл 10 ПЦР буф еров - 5 X 8 полосок-крыш ек - Руководство по эксплуатации 3.6 HISTO TYPE - Планшеты H1ST0 TYPE содержат аликвотные и высушенные реакционные смеси, которые состоят из аллель-специф ичных праймеров, праймеров внутреннего контроля (специфичных для человеческого гена G3PDH) и нуклеотидов. Первая реакционная смесь несет на себе метку, и на планшете напечатан номер партии. В некоторых изделиях HISTO TYPE контроль загрязнения находится в последней позиции планшета (см. прилагаемую таблицу специф ичности и диаграмму оценки для каждой партии). - Реакционные смеси для ПЦР с контролем загрязнения, праймеры внутреннего контроля и специфичные праймеры для амплиф икации (не разделены, если контроль загрязнения встроен в последнюю позицию тестового планшета). - 10 ПЦР-буферов - Крышки полосок - Руководство по эксплуатации, таблица специфичности, схема оценки, рабочий бланк и спецификация для данной партии 4. Т Р Е Б О В А Н И Я Б Е З О П А С Н О С Т И Биологический материал, используемый для выделения ДНК, например, кровь или ткани человека, следует рассматривать как потенциально инф ицированный. При работе с биологическим материалом, следует порекомендовать использовать соответствующ ие меры предосторожности (не отбирать материал в пипетку ртом; при работе с биологическим материалом и выполнении теста следует использовать одноразовые перчатки; дезинфицируйте руки после окончания теста). --- стр. 8 --- Биологический материал следует инактивировать перед утилизацией (например, в автоклаве). Изделия для одноразового использования следует автоклавировать или сжигать после использования Разлив потенциально инф ицированных материалов следуте удалять немедленно с помощью впитывающей бумаги, а загрязнённые зоны следует протереть соответствующ им стандартным дезинфектантом или 70% спиртом. Материал, используемый для устранения разливов, включая перчатки, следует инактивировать перед утилизацией (например, в автоклаве). Блокирующий буфер. Буфер для гибридизации, Буфер для обязательного промывания и Трис-буфер для промывания содержат ProClin150, а раствор хлорида магния содержит ProClinSOO. Данный реагент содержит всего 0.001% консерванта, но все же следует избегать контакта с кожей и слизистыми М астер-микс и Конъюгат содержат консервант - азид натрия. Данный реагент содержит < 0.1% азида натрия, что не является опасной концентрацией Несмотря на это, следует избегать контакта с кожей и слизистыми. Азид натрия может реагировать со свинцовыми и медными элементами трубопроводов с образованием взрывоопасных азидов металлов. При сливе растворов, содержащ их азид натрия, в раковину в лаборатории, промойте слив большим объёмом воды, чтобы предотвраить скопление азида. Все виды работы с реагентами должны осуществляться с соответствующими предосторожностями. При работе с реагентами используйте защ иту для глаз, лабораторные халаты и одноразовые перчатки. Избегайте контакта этих материалов с кожей, глазами или слизистыми. Если контакт всё же имеет место, немедленно промойте поражённое место большим количеством воды. Если вы этого не сделаете, могут возникнуть ожоги. Если произойдёт разлив реагента, то перед тем как вытереть его, разведите реагент водой. Не подвергайте субстрат действию металлов и окисляющ их веществ. Утилизация всех образцов, неиспользованных реагентов и отходов должна осуществляться в соответствии с законами данной страны, ф едеральными законами, законами штата и местными инструкциями. Избегайте микробного загрязнения реагентов при удалении аликовотов из бутылок с реагентами Мы рекомендуем использовать стерильные одноразовые пипетки и наконечники для пипеток. Не используйте мутные реагенты или реагенты с признаками микробного загрязнения. ПЦР является чрезвычайно чувствительным методом Следует принять особые меры предосторожности, чтобы избежать загрязнения и ложных реакций: - На работе носите перчатки (если это возможно, без талька). - Каждый раз при работе с пипеткой используйте новые наконечники (со встроенным фильтром) Используйте отдельные рабочие зоны для предамплиф икации (выделение ДНК и подготовка реакции) и постамплиф икации (гель-электроф орез, документация). Лучше использовать две отдельные комнаты. - Используйте устройства и другие материалы только в соответствующ их местах и не меняйте их местами. --- стр. 11 --- О тж иг Элонгация Пауза 50 Сек 6 Г С 30 Сек 72°С о О 22°С Условия такие же, как и во всех термоциклерах, но общее время, необходимое для этого этапа, будет варьироваться в зависимости от скорости конкретного термоциклера. Как только будет завершён этап аплификации, образцы можно немедленно тестировать или хранить при 2 8°С в течение до 5 дней. 6.1.4 Автоматический анализ гибридизации с помощ ью устройства для обработки MR.SPOT Приготовление реагента Возьмите реагенты HISTO SPOT и тестовые лунки HISTO SPOT из холодильника и дайте им нагреться при комнатной температуре. Кристаллы соли можно видеть в буфере для гибридизации, а также в растворе для обязательного промывания. Если видны кристаллы, нагрейте реагенты до 30°С, чтобы они растворились. Нагрейте всё содержимое бутылки, а не аликвоту. Конъюгат следует развести в соотнош ении 1:1666 в блокирующ ем буфере. Разведение конъюгата следует всегда готовить заново для каждого теста. Требуемые объёмы реагентов будут варьироваться в зависимости от числа тестируемых полосок. MR.SPOT выводит на экран требуемые объёмы для выбранного числа полосок Перенесите требуемые объёмы реагентов в емкости с соответствующ ими этикетками. Поместите тестовые лунки и планшет для ПЦР в соответствующ ие отсеки устройства для обработки MR SPOT, Обратите внимание на правильное расположение планшета для ПЦР. Подготовка устройства для обработки MR.SPOT Выключите устройство для обработки MR.SPOT, внутренний ПК и сенсорный экран. Появится начальный экран Следуйте рекомендациям, указанным на экране. Более детальную информацию можно найти в руководстве по эксплуатации устройства MR SPOT. Передача результатов на ПК для интерпретации Передайте данные в программное обеспечение HISTO MATCH через сеть или USB-накопитель в соответствии с описанием, приведённым в руководстве по эксплуатации программного обеспечения HISTO MATCH Интерпретация результатов Откройте программное обеспечение HISTO MATCH (если оно ещё не устновлено, то его можно установить с CD, поставляемого с устройством для обработки M R.SPOT) и интерпретируйте --- стр. 12 --- данные в соответствии с описанием программного обеспечения HISTO MATCH. 6.2 Cycler Check 6.2.1 Амплификация - С помощью пипетки возьмите мастер-микс, состоящий из 10 х буфер ПЦР, раствора ДНК, Taq- полимеразы и Дистиллированной воды, тщ ательно перемешайте на вортексе. 104 мкл контрольной ДН К (60 иг / мл) 824 мкл дистиллированной воды 104 мкл 10 X буфер для ПЦР 8.3 мкл Taq полимеразы (5 Ед/мкл) - Добавьте 10 мкл этой смеси к предварительно капельно внесённым реакционным смесям. Плотно закройте пробирки соответствующ ей фольгой При работе с термоциклерами, оснащёнными регулируемой крышкой, можно также использоваться маты для ПЦР плашек многократного использования Немного встряхните плашку в направлении вниз, чтобы растворить синий шарик в основании плашки. Все растворы ПЦР должны оседать на дне. Если используется подогреваемая и регулируемая крышка, то наслоение на реакционные смеси минерального масла не требуется' - Поместите реакционные пробирки в термоциклер, и плотно закройте крышку. Реакционные пробирки должны быть надёжно ф иксированы в блоке. Запустите программу ПЦР. Положение плашки в блоке термоциклера (А1 сверху и с левой стороны) очень важно, это позволяет поменять реакции в позициях циклера. Таблица 2. Параметры амплиф икации Программа-Этап Темп. Время Число циклов Первая Денатурация 96“С 5 мин 1 Цикл Денатурация 96°С 20 сек 5 Циклов Отжиг+Элонгация 68°С 1 мин Денатурация 96°С 20 сек 10 Циклов Отжиг 64“С 50 сек Элонгация 72°С 45 сек Денатурация 96°С 20 сек 15 Циклов Отжиг 6 Г С 50 сек Элонгация 72“С 45 сек Окончательная элонгация 72“ С 5 мин 1 Цикл Типы термоциклеров: РТС 100 / 200 (MJ Research / Biozym) и ПЦР-система GeneAm p 9600 / 9700 (Perkin Elmer) 6.2.2 Гель-электроф орез Разделение продуктов амплиф икации производится в ходе электроф ореза в (горизонтальном) агарозном геле В качестве буфера для электрофореза мы рекомендуем 0.5 х ТВЕ (45 мм триса, 12 --- стр. 13 --- 45 мм борной кислоты, 0 5 мм ЭДТА). Концентрация геля должна составить 2.0 - 2.5% агарозы. Перед загрузкой образцов обеспечьте полимеризацию геля в течение, по крайней мере, 30 минут. После окончания амплиф икации, выньте образцы из термоциклера и аккуратно загрузите в каждую порцию геля полноценные реакционные смеси Помимо этого добавьте 10 мкл стандарта длины ДНК для сравнения размера Электроф оретическое разделение осуществляется при 10-12 В/см (при расстоянии 20 см между электродами приблизительно 200-240 В) в течение 20-40 мин. По окончании цикла весь гель окрашиваются раствором бромида этидия (EtBr) (приблизительно 0.5 мкг/мл EtBr в НгО или буф ере ТВЕ в течение 30-45 мин.). В качестве альтернативы можно также добавить EtBr (0.5 мкг/мл) к буф еру для электроф ореза или к агарозному гелю. Если это необходимо, избыток EtBr может быть удален при замачивании геля в НгО или в 0.5 х буфера ТВЕ в течение 20-30 минут. 6.3 H is to Т у р е C e lia c D is e a s e 6.3.1 Безопасные условия и особы е примечания ПЦР является чрезвычайно чувствительным методом и должен выполняться хорошо обученным персоналом, обладаю щ им достаточным опытом в области методов молекулярной генетики и оценки тканевой совместимости. Следует выполнять требования руководящих принципов в области трансплантации, а также стандарты EFI, что позволит минимизировать риск ложного типирования в конкретном случае несоответствий серологического и молекулярно-генетического методов. Необходимо учитывать особые условия безопасности, что позволит избежать загрязнения и, таким образом, ф ормирования ложной реакции: - При работе используйте перчатки (если это возможно, используйте перчатки без талька). - При использовании пипетки каждый раз берите новые наконечники (со встроенным фильтром). - Используйте отдельные рабочие зоны для предамплиф икации (выделение ДНК и подготовка реакций) и постамплиф икации (электроф орез в геле, регистрация). Лучш е это делать в двух отдельных помещениях - Используйте устройства и другие материалы только в соответствую щ их местах и не меняйте их. 6.3.2 Выделение ДНК Для HLA-SSP типирования одного пациента требуется 5-10 мкг ДН К (что соответствует приблизительно 0 5 мл крови). Например, набор BAG EXTRA-GENE больше других подходит для выделения, так как чистую ДНК можно получить из цельной крови за короткое время без использования токсичных химикатов или растворителей. Помимо этого, для получения ДНК достаточной чистоты можно использовать и другие методы, описанные в литературе [5], типа, хлороф орм-триэтил-аммония-бромида (СТАВ) или ф енол-хлороф ормной очистки. Наличие гепарина может ингибировать ПЦР‘^’ [6]. Поэтому для типирования рекомендуется использовать кровь, обработанную ЭДТА или цитратом. ДНК должна иметь индекс чистоты (коэффициент экстинкции OD 2 6 0/O D2 8 0) между 1 5 и 2.0. 1 3 --- стр. 14 --- 6.3.3 Амплификация Все аликвотные и высуш енные реакционные смеси уже содержат аллель-, контроль-специфичные праймеры и нуклеотиды Они поставляются высушенными в реакционных сосудах. Параметры амплификации оптимизированы для окончательного объема 10 мкл 6.3.4 Регистрация и интерпретация результатов Для регистрации необходимо визуализировать амплиф икацию ПЦР с помощью прибора для УФ- просвечивания (220-310 нм), а также сделать снимок соответствующ ей камерой с использованием соответствующей плёнки и ф ильтров (например, полароид, тип плёнки 667). Выберите значение выдержки и диаф рагмы таким образом, чтобы полоски были резкими и выделялись на тёмном фоне (примерные установки - диаф рагма 11, выдержка 1 секунда). Возможные результаты: - Если значения температуры в термоциклере верны для всего блока, то должны быть две полосы во всех позициях (540 пар оснований + 1040 пар оснований). - Если температура денатурации будет слишком низка, то в некоторых или во всех позициях будет отсутствовать меньшая полоска. - Если температура отжига слишком высока, то в некоторых или во всех позициях будет отсутствовать в больш инстве случаев большая, а также и нижняя полосы - Если температура отжига будет слишком низкой, то могут иметь место неспецифичные полосы. Если результат ПЦР не соответствует требованиям, то необходимо проверить значения температуры с помощ ью электронного измерительного прибора, а в случае необходимости, связаться с отделом обслуживания компании-производителя. 6.3.5 Электроф орез в геле Разделение продуктов амплиф икации осуществляется с помощью электрофореза через (горизонтальный) агарозный гель. В качестве буфера для электроф ореза мы рекомендуем использовать 0 5 х ТВЕ (45 ммоль трис, 45 ммоль борной кислоты, 0.5 ммоль ЭДТА). Концентрация геля должна составить 2.0 - 2.5% агарозы Перед загрузкой образца дайте гелю полимеризироваться, по крайней мере, в течение 30 минут. После того, как амплификация будет завершена, возьмите образцы из термоциклера и загрузите реакционные смеси в полном объеме в каждую ячейку геля. Кроме того, добавьте 10 мкл стандарта длины ДНК для сравнения размера Электроф оретическое разделение осуществляется при 10-12 В/см (при расстоянии между электродами 20 см и приблизительно 200-240 В), в течение 20-40 минут. После завершения процедуры весь гель окраш ивается раствором бромистого этидия (EtBr) (приблизительно 0.5 мкг/мл Бромистого этидия в НгО или буфере ТВЕ) в течение 30-40 минут. В качестве альтернативы EtBr (0.5 мкг/мл) можно также добавить в буфер для электроф ореза или агарозный гель. Если потребуется, избыток EtBr можно удалить, замочив гель в НгО или 0.5 х ТВЕ буфере на 20-30 минут. 6.3.6 Регистрация и интерпретация результатов С целью регистрации визуализируйте ПЦР амплиф икацию, используя ультрафиолетовый трансиллюминатор (220-310 нм), и сф отограф ируйте её, используя соответствующ ую камеру, 14 --- стр. 15 --- пленки и фильтры (например, Polaroid, тип пленки 667). Выберите выдержку и диафрагму, чтобы полосы выглядели четкими и выделялись на темном фоне (примерная диафрагма 11, время выдержки 1 секунда). Для интерпретации воспользуйтесь таблицей специф ичности и диаграммой оценки (см. дополнительный лист); положительными следует считать только те полосы, которые имеют правильный размер по сравнению со стандартом длины ДНК. Правильные размеры приведены в таблице соответствующ ей диаграммы. На всех дорожках без аллель-специф ичной амплификации, должен быть хорошо виден внутренний контроль 1070 Ьр / 429 Ьр. В большинстве случаев при наличии аллель-специф ичной амплификации, внутренний контроль слабо выражен или полностью исчезает' При получении неверных результатов обратитесь к разделу «Поиск и устранение неисправностей». 6.4 H IS T O T Y P E 6.4.1 Безопасные условия и особы е примечания ПЦР является чрезвычайно чувствительным методом и должен выполняться хорошо обученным персоналом, обладающ им достаточным опытом в области методов молекулярной генетики и оценки тканевой совместимости. Следует выполнять требования руководящих принципов в области трансплантации, а также стандарты EFI, что позволит минимизировать риск ложного типирования в конкретном случае несоответствий серологического и молекулярно-генетического методов Необходимо учитывать особые условия безопасности, что позволит избежать загрязнения и, таким образом, ф ормирования ложной реакции: - При работе используйте перчатки (если это возможно, используйте перчатки без талька). - При использовании пипетки каждый раз берите новые наконечники (со встроенным фильтром). - Используйте отдельные рабочие зоны для предамплиф икации (выделение ДНК и подготовка реакций) и постамплиф икации (электроф орез в геле, регистрация). Лучш е это делать в двух отдельных помещениях. - Используйте устройства и другие материалы только в соответствующ их местах и не меняйте их. 6.4.2 Выделение ДНК Для HLA-SSP типирования одного пациента требуется 5-10 мкг ДНК (что соответствует приблизительно 0.5 мл крови). Например, набор BAG EXTRA-GENE больш е других подходит для выделения, так как чистую ДН К можно получить из цельной крови за короткое время без использования токсичных химикатов или растворителей Помимо этого, для получения ДНК достаточной чистоты можно использовать и другие методы, описанные в литературе [5], типа, хлороф орм-тризтил-аммония-бромида (СТАВ) или ф енол-хлороф ормной очистки. Наличие гепарина может ингибировать ПЦР*^’ [6]. Поэтому для типирования рекомендуется использовать кровь, обработанную ЭДТА или цитратом. ДНК должна иметь индекс чистоты (коэффициент экстинкции OD 2 6 0/O D2 8 0) между 1.5 и 2.0. 1 5 --- стр. 16 --- Все аликвотные и высуш енные реакционные смеси уже содержат аллель-, контроль-специфичные праймеры и нуклеотиды. Они поставляются высушенными в реакционных сосудах. Параметры амплификации оптимизированы для окончательного объема 10 мкл, 1. Извлеките требуемое число планшетов HISTO TYPE HLA-SSP из - 20°С и разморозьте 10 х ПЦР-буфер при комнатной температуре. 2. С помощью пипетки возьмите Основную смесь (Master-Mix), состоящ ую из 10 х ПЦР-буфера, раствора ДНК. Taq полимеразы и дистиллированной воды, хорошо перемешайте. Разные наборы HISTO TYPE работают с одной Основной смесью, поэтому их можно объединять. Состав основной смеси в зависимости от числа реакционных смесей приведен в Таблице 3. Если необходимо осущ ествить ко н тр о л ь загрязнения, получите Основную смесь без раствора ДНК и с помощью пипетки перенесите 10 мкл этого соединения в контроль загрязнения. Впоследствии добавьте раствор ДНК и распределите Основную смесь по предварительно внесенным реакционным смесям. Таблица 3 Состав Основной смеси в зависимости от числа реакционных смесей 6.4.3 Амплификация Число смесей Диет. вода Буфер 10 X ПЦР Раствор ДНК (50-100 нг/мкл) Тар-полимераза (5 ед/мкл) Общий объем, мкл 1 8 1 1 0.08 10 8 79 10 10 0.8 100 16 151 19 19 1.5 190 24 222 28 28 2.2 280 30 269 34 34 2.7 340 32 285 36 36 2.9 360 48 412 52 52 4 2 520 54 459 58 58 4.6 580 56 475 60 60 4 8 600 72 618 78 78 6.2 780 80 681 86 86 6.9 860 96 808 102 102 8 2 1020 - для различных концентраций ДНК, количество ДНК и воды должно отличаться (например, для 24 смесей; 11,7 мкл раствора Д Н К (120 нг/мкл) и 238 мкл дистиллированной воды.). 3. После перемеш ивания немедленно добавьте 10 мкл этой смеси к предварительно внесенным и вьюушенным реакционным смесям Маркировка - > ■ : ^ [Г Меняйте наконечник после каждого использования пипетки. Плотно закройте пробирки соответствующими крышками. Не касаетесь внутренней стороны крышек и верхних краев пробирок пальцами, это позволит вам избежать загрязнения. Если используются амплификаторы с плотной крышкой, то можно также использовать ПЦР маты многократного использования. 16 --- стр. 17 --- Немного потрясите планшет, чтобы растворить синий шарик на дне планшета. Весь ПЦР раствор должен осесть на дне. 4 Поместите реакционные пробирки в термоциклер и закрепите крышку так, чтобы реакционные сосуды не деф ормировались при нагреве. Запустите программу ПЦР. Покрытие реакционных смесей минеральным маслом не требуется, если используется обогреваемая и регулируемая крышка! Типы амплификаторов: РТС 100/200 (MJ Research / BioRad) и GeneAm p PCR-System 9600/9700 (пожалуйста, используйте скорость нагрева 9600) (ABI) Таблица 4. Параметры амплиф икации Этап программы Температура Время Число циклов Первая денатурация 96°С 5 минут 1 Цикл Денатурация Отжиг+Элонгация 96°С 68°С 20 секунд 5 Циклов 60 секунд Денатурация Отжиг Элонгация 96°С 64°С 72°С 20 секунд 50 секунд 45 секунд 10 Циклов Денатурация Отжиг Элонгация 96°С 6 Г С 72“ С 20 секунд 50 секунд 45 секунд 15 Циклов Заключительная элонгация 72“С 5 минут 1 Цикл Так как амплиф икаторы различных производителей имеют разные рабочие характеристики, и даже устройства одного типа могут быть откалиброваны по-разному, может возникнуть необходимость в оптимизации параметров амплификации. Чтобы оптимизировать работу вашего устройства, воспользуйтесь следующ ими принципами: Ложноположительные реакции (неспециф ичные полосы, дополнительны е типы): Увеличить температуру отжига с шагом 1°С. Ложноотрицательные реакции (отсутствие полос): Снизить температуру отжига с шагом 1°С и/или увеличить период отжига с шагом 5 секунд и/или увеличить периоды денатурации с шагом 5 секунд. Рекомендуется использовать только те амплификаторы, которые регулярно проходят калибровку. Для этого с успехом можно использовать набор BAG-Cycler Check (Номер по каталогу: 7104). Тесты в рамках контроля качества были выполнены на РТС-200 - 100 (MJ Research) и 9700 (ABI) соответственно. 6.4.4 Э л е ктр оф о ре з в геле Разделение продуктов амплиф икации осуществляется с помощью электрофореза через (горизонтальный) агарозный гель. В качестве буфера для электроф ореза мы рекомендуем использовать 0.5 х ТВЕ (45 ммоль трис, 45 ммоль борной кислоты, 0.5 ммоль ЭДТА). Концентрация геля должна составить 2.0 - 2.5% агарозы. Перед загрузкой образца дайте гелю полимеризироваться, по крайней мере, в течение 30 минут После того, как амплификация будет 1 7 --- стр. 18 --- завершена, возьмите образцы из термоциклера и загрузите реакционные смеси в полном объеме в каждую ячейку геля. Кроме того, добавьте 10 мкл стандарта длины ДН К для сравнения размера Электроф оретическое разделение осуществляется при 10-12 В/см (при расстоянии между электродами 20 см и приблизительно 200-240 В), в течение 20-40 минут. После завершения процедуры весь гель окраш ивается раствором бромистого этидия (EtBr) (приблизительно 0.5 мкг/мл Бромистого этидия в НгО или буфере ТВЕ) в течение 30-40 минут. В качестве альтернативы EtBr (0.5 мкг/мл) можно также добавить в буфер для электрофореза или агарозный гель. Если потребуется, избыток EtBr можно удалить, замочив гель в НгО или 0.5 х ТВЕ буфере на 20-30 минут 6.5 W ip e T es t 6.5.1 Выделение ДНК Для положительного контроля требуется ДНК из лейкоцитов. Например, набор BAG EXTRA-GENE лучше всего подходит для выделения, так как чистую ДН К можно получить из цельной крови за короткое время без использования токсичных химикатов или растворителей. Среди других методов, описанных в литературе [5], метод с использованием бромида цетилтриметиламмония (СТАВ) или ф енол-хлороф ормной очистки также подходят для получения ДНК достаточной чистоты. Наличие гепарина потенциально подавляет ПЦР [6]. Таким образом, рекомендуется использовать кровь, обработанную ЭДТА, или цитратную кровь. ДН К должна иметь коэффициент чистоты (коэф ф ициент экстинкции OD260/OD280) между 1.6 и 2.0. 6.5.2 Амплификация Аликвотные и высуш енные реакционные смеси уже содержат аллель-специф ичный набор праймеров, внутренние контрольные праймеры и нуклеотиды Параметры амплификации оптимизированы до конечного объёма 20 мкл. В каждом тесте используется три реакции. Процедура проведения теста для оценки загрязнения поверхности 1. Реакционные сосуды объёмом 1,5 мм несут на себе название исследованных участков (например, рабочее место, дверная ручка...) и содержат 200 мкл стерильной дистиллированной воды. 2. При выполнении каждого теста кусочек флиса погружают в соответствующ ий реакционный сосуд, и тестовую зону протирают влажным флисом 3. Поместите флис в соответствующ ий реакционный сосуд и выдерживайте в течение 2 часов при комнатной температуре в 200 мкл дистиллированной воды. После этого флис нужно выбросить. 4. Извлеките требуемое количество ПЦР сосудов из зоны с температурой - 20°С и разморозьте при комнатной температуре. Обозначьте один из сосудов "тестовый участок", второй - "положительный контроль", а третий - "контроль подавления". 5. Приготовьте предварительное разведение Taq (минимум 5 реакций) и перемешайте смесь на вортексе в течение короткого промежутка времени Приготовление предварительного разведения Taq для нескольких реакций Таблица 5, --- стр. 19 --- на 1 реакцию 5 реакций 8 реакций 10 ПЦР буферов 2 мкл 10,0 мкл 16 мкл Taq Полимераза (5 Ед/мкл) 0,12 мкл 0,60 мкл 0,96 мкл 4. Перенесите пипеткой следующ ие реакционные смеси в сосуды для ПЦР с этикетками Таблица 6 исследуемый участок положительный контроль контроль подавления стерильная дистиллированная вода 14 мкл 17 мкл 13 мкл проба с участка испытания 4 мкл - 4 мкл геномная ДНК (40 нг/мкл) 1 мкл 1 мкл предварительное разведение Taq 2 мкл 2 мкл 2 мкл 7 Плотно закройте пробирки соответствующ ими крышками Не касайтесь внутренней поверхности крышек и верхних краёв пробирок пальцами, чтобы избежать загрязнения. Тальк, который содержится в перчатках, является сильным ингибитором ПЦР! Слегка потрясите планшет, чтобы растворить синий шарик на дне планшета. Весь раствор ПЦР должен осесть на дне. 8, Поместите реакционные пробирки в термоциклер и закройте посильнее крышку, чтобы реакционные сосуды не деф ормировались при нагреве. Запустите программу ПЦР. Если используется крышка с подогревом и возможностью регулировки, то заливка реакционных смесей минеральным маслом не требуется! Параметры амплиф икации: Типы циклеров РТС 100 / 200 (MJ Research/ BioRad) и ПЦР система GeneAm p 9600 / 9700 (используйте тепловой режим 9600) (ABI) Таблица 7 Программа - Этап Время Температура Число циклов Первая денатурация 5 минут 96°С 1 цикл Денатурация 20 секунд 96“С 5 циклов Отжиг+Элонгация 60 секунд 68 Денатурация 20 секунд 96 10 циклов Отжиг 50 секунд 64 Элонгация 45 секунд 72 19 --- стр. 20 --- Денатурация О тж иг Элонгация 20 секунд 50 секунд 45 секунд 96 6 1 72 15 циклов Заключительная элонгация 5 минут 72 1 цикл Так как амплиф икаторы различных производителей имеют разные рабочие характеристики, и даже устройства одного типа могут быть откалиброваны по-разному, может возникнуть необходимость в оптимизации параметров амплификации. Чтобы оптимизировать работу вашего устройства, воспользуйтесь следующ ими принципами: Ложноположительные реакции (неспециф ичные полосы, дополнительны е типы); Увеличить температуру отжига с шагом 1°С. Ложноотрицательные реакции (отсутствие полос): Снизить температуру отжига с шагом 1°С и/или увеличить период отжига с шагом 5 секунд и/или увеличить периоды денатурации с шагом 5 секунд. Рекомендуется использовать только те амплификаторы, которые регулярно проходят калибровку. Для этого с успехом можно использовать набор BAG-Cycler Check. Тесты в рамках контроля качества были выполнены на РТС-200 - 100 (MJ Research) и 9700 (ABI) соответственно 6.5.3 Электрофорез в геле Разделение продуктов амплиф икации осуществляется с помощью электрофореза через (горизонтальный) агарозный гель. В качестве буфера для электроф ореза мы рекомендуем использовать 0.5 х ТВЕ (45 ммоль трис, 45 ммоль борной кислоты, 0.5 ммоль ЭДТА) Концентрация геля должна составить 2.0 - 2.5% агарозы. Перед загрузкой образца дайте гелю полимеризироваться, по крайней мере, в течение 30 минут. После того, как амплификация будет завершена, возьмите образцы из термоциклера и загрузите реакционные смеси в полном объеме в каждую ячейку геля. Кроме того, добавьте 10 мкл стандарта длины ДН К для сравнения размера. Электроф оретическое разделение осуществляется при 10-12 В/см (при расстоянии между электродами 20 см и приблизительно 200-240 В), в течение 20-40 минут После завершения процедуры весь гель окраш ивается раствором бромистого этидия (EtBr) (приблизительно 0.5 мкг/мл Бромистого этидия в НгО или буфере ТВЕ) в течение 30-40 минут. В качестве альтернативы EtBr (0.5 мкг/мл) можно также добавить в буфер для электроф ореза или агарозный гель. Если потребуется, избыток EtBr можно удалить, замочив гель в НгО или 0 5 х ТВЕ буфере на 20-30 минут 6.5.4 Регистрация и интерпретация результатов С целью регистрации визуализируйте ПЦР амплификацию, используя ультрафиолетовый трансиллюминатор (220-310 нм), и сф отограф ируйте её, используя соответствующ ую камеру, 20 --- стр. 21 --- пленки и фильтры (например, Polaroid, тип пленки 667). Выберите выдержку и диафрагму, чтобы полосы выглядели четкими и выделялись на темном фоне (примерная диафрагма 11, время выдержки 1 секунда). В том случае, если исследуемый участок не загрязнён, в образце из исследуемой зоны не должно быть никаких видимых полос. Следующие полосы указывают на загрязнения; Загрязнение амплиф икатом: 78 Ьр и/или 104 Ьр и/или 282 Ьр Загрязнение геномной ДНК: 282 Ьр и возможно 78 Ьр, 104 Ьр, 176 Ьр, приблизительно 580 Ьр Положительный контроль и контроль подавления должны иметь полосы, соответствующие ожидаемым при геномной ДНК. Если в положительном контроле нет амплификатов, ПЦР не произошла, и весь тест интерпретировать нельзя Если в положительном контроле видны правильные полосы, но в контроле подавления нет видимых полос, в тестовом участке были ингибиторы В данном случае образец из чистого "исследуемого участка" не смог доказать отсутствия загрязнений в исследуемом участке. 6.6 KIR TYPE и EPITOP TYPE 6.6.1 В ы д ел ени е ДН К Для типирования одного пациента требуется 1,5-3 мкг ДНК (что соответствует приблизительно 0.2.мл крови) Например, набор BAG EXTRA-GENE лучше всего подходит для выделения, так как чистую ДНК можно получить из цельной крови за короткое время без использования токсичных химикатов или растворителей Другие методы выделения ДН К достаточной чистоты включают имеющиеся продаже системы на основе колонок или сфер, а также методы, описанные в литературе [5], такие как: метод с использованием бромида цетилтриметиламмония (СТАВ) или фенол-хлороформной очистки Наличие гепарина потенциально подавляет ПЦР [17]. Поэтому для типирования рекомендуется использовать кровь, обработанную ЭДТА или цитратом. ДНК должна иметь коэффициент чистоты (коэф ф ициент экстинкции OD260/OD280) между 1,5 и 2.0. 6.6.2 А м п л и ф и ка ц и я Все аликвотные реакционные смеси уже содержат аллель-, контроль-специф ичные праймеры и нуклеотиды. Они поставляются вьюушенными в реакционных сосудах Параметры амплификации оптимизированы до конечного объёма 10 мкл. 1. Извлеките требуемое число планшетов KIR-TYPE / полос Epitop-TYPE из - 20°С и разморозьте 10 X ПЦР-буферов при комнатной температуре. 2. С помощью пипетки возьмите Основную смесь (Master-Mix), состоящ ую из 10 х ПЦР-буфера, раствора ДНК, Taq полимеразы и дистиллированной воды, хорошо перемешайте. Набор KIR-TYPE / Epitop-TYPE работает с той же Основной смесью, что и другие Наборы HISTO TYPE SSP, поэтому их можно объединять Состав Основной смеси приведен в Таблице 8. Если необходимо осущ ествить контроль загрязнения, получите Основную смесь без раствора ДНК и с помощью пипетки перенесите 10 мкл этой смеси в контроль загрязнения. Впоследствии 21 --- стр. 22 --- добавьте раствор ДНК и распределите Основную смесь по предварительно внесенным реакционным смесям. Таблица 8 Состав Основной смеси в зависимости от числа реакционных смесей: Число смесей Диет, вода 10 буферов ПЦР Раствор ДНК (25- 40 нг/мкл) Taq Полимераза (5 Ед/мкл) Общий объём, мкл 1 0,08 10 55 16 0,64 80 22 180 26 52 2,1 260 28 221 32 64 2,6 320 235 34 68 2 7 340 46 346 50 100 4.0 500 54 401 58 116 4.6 580 70 526 76 152 6.1 760 118 858 124 248 9.9 1240 Количество ДНК должно составлять 50-80 нг на смесь Для различных концентраций ДНК, количество ДНК и воды должно отличаться (например, для 22 смесей; 26,0 мкл раствора ДНК (50 нг/мкл) и 206 мкл Дистиллированной воды). М а р ки р (» н ка 3 После перемеш ивания немедленно добавьте 10 мкп этой смеси к предварительно внесенным и высушенным реакционным смесям. Меняйте наконечник после каждого использования пипетки. Плотно закройте пробирки соответствующими крышками. Не касайтесь внутренней поверхности крышек и верхних краев пробирок пальцами, чтобы избежать заражения. Если используются амплификаторы с плотной крышкой, то можно также использовать ПЦР маты многократного использования. Слегка потрясите планшет, чтобы растворить синий шарик на дне планшета. Весь раствор ПЦР должен осесть на дне 4. Поместите реакционные пробирки в термоциклер и плотно закройте крышку, чтобы реакционные сосуды не деф ормировались при нагреве. Запустите программу ПЦР. Если используется крышка с подогревом и возможностью регулировки, то заливка реакционных смесей минеральным маслом не требуется' Параметры амплиф икации Типы термоциклеров; РТС 100/200 (MJ Research / ВюРас1), GeneAm p PCR-System 9600/9700 (пожалуйста, используйте скорость нагрева 9600) (ABI) и M astercycler epGradient S (Eppendorf) 22 --- стр. 23 --- Таблица 9. Программа - Этап Первая денатурация Денатурация О тж иг Элонгация Денатурация Отжиг Элонгация Температура,“с 94 94 65 72 94 61 72 Время 2 минут 15 секунд 50 секунд 45 секунд 15 секунд 50 секунд 30 секунд Число циклов 1 цикл 10 циклов 20 циклов 1ри использовании термоциклеров с очень высокой скоростью нагрева и охлаждения рекомендуется использоваться более низкую скорость нагрева и охлаждения. Так как амплиф икаторы различных производителей имеют разные рабочие характеристики, и даже устройства одного типа могут быть откалиброваны по-разному, может возникнуть необходимость в оптимизации параметров амплификации. Чтобы оптимизировать работу вашего устройства, воспользуйтесь следующ ими принципами: Ложноположительные реакции (неспециф ичные полосы, дополнительны е типы): Увеличить температуру отжига с шагом 1°С. Ложноотрицательные реакции (отсутствие полос): Снизить температуру отжига с шагом 1°С и/или увеличить период отжига с шагом 5 секунд и/или увеличить периоды денатурации с шагом 5 секунд. Рекомендуется использовать только те амплификаторы, которые регулярно проходят калибровку Для этого с успехом можно использовать набор BAG-Cycler Check. Тесты в рамках контроля качества были выполнены на РТС-200 - 100 (MJ Research), 9700 (ABI) и Mastercycler epG radient S (Eppendorf). 6.6.3 Э л е ктр оф о ре з в геле Разделение продуктов амплиф икации осуществляется с помощью электрофореза через (горизонтальный) агарозный гель. В качестве буфера для электроф ореза мы рекомендуем использовать 0 5 х ТВЕ (45 ммоль трис, 45 ммоль борной кислоты, 0.5 ммоль ЭДТА). Концентрация геля должна составить 2.0 - 2.5% агарозы. Перед загрузкой образца дайте гелю полимеризироваться, по крайней мере, в течение 30 минут. После того, как амплификация будет завершена, возьмите образцы из термоциклера и загрузите реакционные смеси в полном объеме в каждую ячейку геля. Кроме того, добавьте 10 мкл стандарта длины Д Н К для сравнения размера. Электроф оретическое разделение осущ ествляется при 10-12 В/см (при расстоянии между электродами 20 см и приблизительно 200-240 В), в течение 20-40 минут. После завершения процедуры весь гель окраш ивается раствором бромистого этидия (EtBr) (приблизительно 0.5 мкг/мл Бромистого этидия в НгО или буфере ТВЕ) в течение 30-40 минут В качестве альтернативы EtBr (0.5 мкг/мл) можно также добавить в буфер для электроф ореза или агарозный 23 --- стр. 24 --- гель. Если потребуется, избыток EtBr можно удалить, замочив гель в Н 2О или 0.5 х ТВЕ буфере на 20-30 минут 6.6.4 Регистрация и интерпретация результатов С целью регистрации визуализируйте ПЦР амплиф икацию, используя ультрафиолетовый трансиллюминатор (220-310 нм), и сф отограф ируйте её, используя соответствующ ую камеру, пленки и фильтры (например, Polaroid, тип пленки 667). Выберите выдержку и диафрагму, чтобы полосы выглядели четкими и выделялись на темном фоне (примерная диаф рагма 11, время выдержки 1 секунда). Для интерпретации воспользуйтесь таблицей специф ичности и диаграммой оценки Положительными следует считать только те полосы, которые имеют правильный размер по сравнению со стандартом длины ДНК. Правильные размеры приведены в таблице соответствующей диаграммы. На всех дорожках без аллель-специф ичной амплификации, должен быть хорошо виден внутренний контроль 659 Ьр. В больш инстве случаев при наличии аллель- специфичной амплиф икации, внутренний контроль слабо выражен или полностью исчезает! При получении неверных результатов обратитесь к разделу «Поиск и устранение неисправностей» (6). В контроле загрязнения не должно быть видимых полос. Если имеет место загрязнение геномной ДНК, будет иметь место полоса на 282 Ьр. Дополнительны е полосы могут встречаться на 78 Ьр, 104 Ьр, 176 Ьр и приблизительно 580 Ьр. Если имеет место загрязнение амплификатами, то полосы появятся на 78 Ьр и/или 104 Ьр и/или 282 Ьр. 6.7 H1ST0 TYPE N a rco le p sy 6.7.1 Выделение ДНК Для HLA-SSP типирования одного пациента требуется 1 мкг Д Н К (что соответствует приблизительно 0.1 - 0.5 мл крови). Например, набор BAG EXTRA-G ENE лучше всего подходит для выделения, так как чистую ДНК можно получить из цельной крови за короткое время без использования токсичных химикатов или растворителей. Помимо этого, для получения ДНК достаточной чистоты можно использовать и другие методы, описанные в литературе, типа, хлороф орм-триэтил-аммония-бромида (СТАВ) или ф енол-хлороф ормной очистки. Наличие гепарина может ингибировать ПЦР. Поэтому для типирования рекомендуется использовать кровь, обработанную ЭДТА или цитратом. ДНК должна иметь коэф фициент чистоты (коэффициент экстинкции O D260/O D280) между 1,5 и 2.0. 6.7.2 Амплиф икация Все аликвотные и высуш енные реакционные смеси уже содержат аллель- и контроль- специфичные праймеры, а также нуклеотиды. Они поставляются высушенными в реакционных сосудах. Параметры амплиф икации оптимизированы до конечного объёма 10 мкл. 1. Извлеките требуемое число полос HISTO TYPE из - 20°С и разморозьте 10 ПЦР-буферов при комнатной температуре. 24 --- стр. 25 --- 2. С помощью пипетки возьмите Основную смесь (Master-Mix), состоящ ую из 10 ПЦР-буферов, раствора ДНК, Taq полимеразы и дистиллированной воды, хорошо перемешайте. Набор HISTO TYPE Narcolepsy работает с той же Основной смесью, что и другие Наборы BAG HISTO TYPE SSP, поэтому их можно объединять. Состав Основной смеси приведен в Таблице 10. Если необходимо осущ ествить ко н тр о л ь загрязнения, получите Основную смесь без раствора ДНК и с помощью пипетки перенесите 10 мкл этой смеси в контроль загрязнения. Впоследствии добавьте раствор ДНК и распределите Основную смесь по предварительно внесенным реакционным смесям. Таблица 10. Состав Основной смеси: Число смесей Диет, вода 10 буферов ПЦР Раствор ДНК (25 40 нг/мл) Taq Полимераза (5 Ед/мкл) Общий объем, мкл 69 10 20 0,8 100 М а р ки ро н кп Количество ДНК должно составлять 50-80 нг на смесь. Для различных концентраций ДНК, количество ДН К и воды должно отличаться. (например: 20 мкл раствора ДНК (20 нг/мкл) и 69 мкл дистиллированной воды, 10 мкл раствора ДНК (50 нг/мкл) и 79 мкл дистиллированной воды). 3. После перемешивания немедленно добавьте 10 мкл этой смеси к предварительно внесенным и высушенным реакционным смесям. Меняйте наконечник после каждого использования пипетки. Плотно закройте пробирки соответствующими крышками. Не касайтесь внутренней поверхности крышек и верхних краёв пробирок пальцами, чтобы избежать заражения. Если используются амплификаторы с плотной крышкой, то можно также использовать ПЦР маты многократного использования Слегка потрясите планшет, чтобы растворить синий шарик на дне планшета. Весь раствор ПЦР должен осесть на дне 4. Поместите реакционные пробирки в термоциклер и закройте посильнее крышку, чтобы реакционные сосуды не деф ормировались при нагреве. Запустите программу ПЦР. Если используется крышка с подогревом и возможностью регулировки, то заливка реакционных смесей минеральным маслом не требуется! Параметры амплиф икации: Типы циклеров: РТС 100/200 (MJ Research / BioRad), GeneAm p PCR-System 9600/9700 (используйте скорость нагрева 9600) (ABI) и M astercycler epGradient S (Eppendorf) Таблица 11 Программа - Этап Температура, “ С Время Число циклов 25 --- стр. 26 --- Программа - Этап Температура, “ СВремя Число циклов Первая денатурация 96 5 минут 1 цикл Денатурация Отжиг+Элонгация 96 68 20 секунд 5 циклов 60 секунд Денатурация Отжиг Элонгация 96 64 72 20 секунд 10 циклов 50 секунд 45 секунд Денатурация Отжиг Элонгация 96 61 72 20 секунд 15 циклов 50 секунд 45 секунд Заключительная элонгация 72 5 минут 1 цикл При использовании термоциклеров с очень высокой скоростью нагрева и охлаждения рекомендуется использоваться более низкую скорость нагрева и охлаждения. Так как амплиф икаторы различных производителей имеют разные рабочие характеристики, и даже устройства одного типа могут быть откалиброваны по-разному, может возникнуть необходимость в оптимизации параметров амплиф икации Чтобы оптимизировать работу вашего устройства, воспользуйтесь следующ ими принципами; Ложноположительные реакции (неспециф ичные полосы, дополнительны е типы): Увеличить температуру отжига с шагом 1°С, Ложноотрицательные реакции (отсутствие полос): Снизить температуру отжига с шагом 1°С и/или увеличить период отжига с шагом 5 секунд и/или увеличить периоды денатурации с шагом 5 секунд Рекомендуется использовать только те амплификаторы, которые регулярно проходят калибровку. Для этого с успехом можно использовать набор BAG-Cycler Check (Номер по каталогу: 7104). Тесты в рамках контроля качества были выполнены на РТС-200 - 100 (MJ Research), 9700 (ABI) и Mastercycler epG radient S (Eppendorf). 6.7.3 Э л е ктр оф о ре з в геле Разделение продуктов амплиф икации осуществляется с помощ ью электрофореза через (горизонтальный) агарозный гель. В качестве буфера для электроф ореза мы рекомендуем использовать 0 5 х ТВЕ (45 ммоль трис, 45 ммоль борной кислоты, 0.5 ммоль ЭДТА). Концентрация геля должна составить 2.0 - 2.5% агарозы. Перед загрузкой образца дайте гелю полимеризироваться, по крайней мере, в течение 30 минут. После того, как амплификация будет завершена, возьмите образцы из термоциклера и загрузите реакционные смеси в полном объеме в каждую ячейку геля. Кроме того, добавьте 10 мкл стандарта длины ДНК для сравнения размера. Электроф оретическое разделение осущ ествляется при 10-12 В/см (при расстоянии между электродами 20 см и приблизительно 200-240 В), в течение 20-40 минут. После завершения 26 --- стр. 27 --- процедуры весь гель окраш ивается раствором бромистого этидия (EtBr) (приблизительно 0.5 мкг/мл Бромистого этидия в Н 2О или буфере ТВЕ) в течение 30-45 минут. В качестве альтернативы EtBr (0,5 мкг/мл) можно также добавить в буфер для электроф ореза или агарозный гель. Если потребуется, избыток EtBr можно удалить, замочив гель в Н 2О или 0.5 х ТВЕ буфере на 20-30 минут. 6.7.4 Регистрация и интерпретация результатов С целью регистрации визуализируйте ПЦР амплиф икацию, используя ультрафиолетовый трансиллюминатор (220-310 нм), и сф отограф ируйте её, используя соответствующ ую камеру, пленки и фильтры (например, Polaroid, тип пленки 667). Выберите выдержку и диафрагму, чтобы полосы выглядели четкими и выделялись на темном фоне (примерная диаф рагма 11, время выдержки 1 секунда). Для интерпретации воспользуйтесь таблицей специф ичности и диаграммой оценки (см. дополнительный лист); положительными следует считать только те полосы, которые имеют правильный размер по сравнению со стандартом длины ДН К Правильные размеры приведены в таблице соответствующ ей диаграммы. На всех дорожках без аллель-специф ичной амплификации, должен быть хорошо виден внутренний контроль 1070 Ьр В больш инстве случаев при наличии аллель-специф ичной амплиф икации, внутренний контроль слабо выражен или полностью исчезает! При получении неверных результатов обратитесь к разделу «Поиск и устранение неисправностей». В контроле загрязнения не должно быть видимых полос. Если имеет место загрязнение геномной ДНК, будет иметь место полоса на 282 Ьр. Дополнительные полосы могут встречаться на 78 Ьр, 104 Ьр, 176 Ьр и приблизительно 580 Ьр. Если имеет место загрязнение амплификатами, то полосы появятся на 78 Ьр и/или 104 Ьр и/или 282 Ьр 7. П О И С К И У С Т Р А Н Е Н И Е Н Е И С П Р А В Н О С Т Е Й Признак Возможная проблема(ы) Потенциальное решение(я) Неисправность прибора Множество См. руководство к MR.SPOT Сообщение об ош ибке при передаче данных Ошибка передачи данных Передайте данные вручную через привод USB Нет результата Ошибка при ф ормировании изображения по сетке Выполните разделение вручную Нет пятен в лунке Ошибка при добавлении мастер-микса к ПЦР Повторите весь анализ и проверьте продукт ПЦР на геле Положительную реакцию дают только контрольные пятна Ошибка при добавлении ДН К к ПЦР или ошибка амплификации Повторите весь анализ и проверьте продукт ПЦР на геле Никаких результатов / неубедительные результаты из- за слабых сигналов Ошибка при разбавлении конъюгата или неисправность инструмента для амплификации Повторите анализ. Проверьте тепературу гибридизации на инструменте отсутствие амплиф икации, виден стандарт длины ДНК содержит ингибиторы ПЦР повторите выделение ДНК, попробуйте разные методы слишком высокая / слишком низкая концентрация ДНК измените концентрацию ДНК, повторите выделение ДНК отсутствует фермент или его концентрация слишком низкая повторите типирование, измените концентрацию фермента ДНК из гепаринизированной крови повторите типирование, используя кровь, обработанную этилендиаминтетрауксусной 27 --- стр. 28 --- г Признак повторный деф ект в отдельных дорож ках(нет контроля _амплификации) _____________ неспецифическая амплификация, дополнительные полосы, (дополнительные полосы несоответствующ его размера следует отбрасывать) при оценке выявлено более 2 специфичностей полосы не видны или видны только очень светлые полосы, стандарт д л ины не виден слишком яркое ф оновое свечение геля размытая полоса Возможная проблема(ы) неверные параметры амплификации _ течь в реакционных пробирках; потеря воды и изменение концентрации в ходе ПЦР __ загрязнение продуктами амплификации ДНК загрязнена солями слишком высокая концентрация ш _________________ _______ слишком высокая концентрация фермента ______________________ неверные параметры амплификации ______ загрязнение при переносе (продукты амплиф икации!) новая аллель слишком слабое окрашивание EtBr (бромистым этидием) слишком длительное окрашивание, слишком высокая концентрация E tB r(бромистого этидия)_________________________ слишком горячий буфер для электрофореза неправильный буфер для электрофореза Потенциальное решение(я) кислотои или цитратом оптимизируите параметры амплиф икации ____________ плотно закройте пробирки крышками: возьмите другие реакционные пробирки повторите типирование, гарантируйте точность исполнения повторите выделение ДНК, попробуйте разные методы возьмите меньшее количество _Д Н К___________________________ возьмите меньшее количество фермента_____________________ оптимизируйте параметры амплификации ________________ проверьте смеси для типирования(Д Н К не добавлена) гарантируйте точность исполнения повторите окрашивание замочите гель в Н 2О или в ТВЕ (трис-борат-ЭДТА буфере) снизьте концентрацию EtBr (бромистого этидия) ___________ понизьте напряжение воспользуйтесь буфером 0,5хТВЕ 28 --- стр. 29 ---