Набор реагентов "VariFindТМ HLA solution IL-v2" для типирования генов HLA в высоком разрешении методом высокопроизводительного секвенирования по ТУ 21.20.23-001-39429653-2018 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 3 ---
lob
Инструкция по применению
ООО «ПАРСЕК ЛАБ» Набор реагентов VariFind™ HLA solution IL-v2
#UM L-20ru Страница 3 из 73
РЕВИЗИИ ИНСТРУКЦИИ
№ документа
Ревизия
UM_L-20ru
В/190419
Примечания к ревизии
Первичный выпуск
--- стр. 4 ---
{ ^ S J r lob
Инструкция по применению
иии «I lAHLhK ЛАЬ» Habop реагентов VariFind'” HLA solution IL-v2
#UM L-20ru Страница 4 из 73
ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................................................5
1.1. НАЗНАЧЕНИЕ НАБОРА РЕАГЕНТОВ..........................................................................................................5
1.2. НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ........................................................................................................................5
1.3. МЕДИЦИНСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ............................................................................................................. 6
1.4. ПОКАЗАНИЯ И ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ .....................................................................7
1.5. ОПИСАНИЕ.................................................................................................................................................7
1.6. ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ................................................................................................................9
1.7. СОСТАВ НАБОРА РЕАГЕНТОВ.................................................................................................................11
1.8. ОБЩАЯ СХЕМА ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА..............................................................................................13
1.9. ИНТЕРФЕРИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА..........................................................................................................13
1.10. ОБОРУДОВАНИЕ, МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ........................................................................................16
1.1 о ТРЕБОВАНИЯ К ОБРАЗЦУ..........................................................................................................................18
1.11 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ..................................................................................................................19
1.12 РЕКОМЕНДУЕМЫЕ ПРАКТИКИ РАБОТЫ..................................................................................................20
1.13 РИСКИ СВЯЗАННЫЕ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИЗДЕЛИЯ.................................................................................22
2. ПРОТОКОЛ...............................................................................................................................................23
2.1. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ОБРАЗЦОВ..............................................................................................23
2.2. ТАРГЕТНОЕ ОБОГАЩЕНИЕ..................................................................................................................... 29
2.3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ БИБЛИОТЕК.............................................................................................................32
2.4. РАЗВЕДЕНИЕ, ПУЛИРОВАНИЕ И ДЕНАТУРАЦИЯ..................................................................................43
2.5. СЕКВЕНИРОВАНИЕ..................................................................................................................................45
3. АНАЛИЗ ДАННЫХ.................................................................................................................................... 53
3.1. УСТАНОВКА ПРИЛОЖЕНИЯ VARIFIND™ HLA SOFTWARE......................................................................53
3.2. АЛГОРИТМ АНАЛИЗА ДАННЫХ..............................................................................................................54
3.2.1. Требования к входным данным...........................................................................................................54
3.2.2. Алгоритм обработки данных.................................................................................................................54
3.2.3. Просмотр результатов анализа............................................................................................................55
3.3. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ...........................................................................................................55
3.4. МЕТРИКИ КАЧЕСТВА ДАННЫХ...............................................................................................................56
3.4.1. Число прочтений на экзоны..................................................................................................................57
3.4.2. Среднее качество прочтений...............................................................................................................57
3.4.3. Размер вставки.......................................................................................................................................57
3.4.4. Дисбаланс покрытия по ключевым экзонам.......................................................................................58
3.5. ОЦЕНКА КОНТАМ И НАЦИ И.....................................................................................................................58
3.6. ФОРМАТЫ ВЫХОДНЫХ ДАННЫХ...........................................................................................................59
3.6.1. Отчет по образцу................................................................................................................................... 59
3.6.2. Таблица генотипов по образцам......................................................................................................... 59
3.6.3. Отчет по запуску.................................................................................................................................... 60
3.7. АНАЛИЗ КОНТРОЛЬНОГО ОБРАЗЦА.....................................................................................................61
3.8. УСТРАНЕНИЕ ПРОБЛЕМ......................................................................................................................... 61
4. ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ....................................................................................................64
5. УКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ..................................................................................................................64
6. БЕЗОПАСНАЯ УТИЛИЗАЦИЯ...................................................................................................................65
7. ГАРАНТИЙНЫЕ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА.......................................................................................................... 66
8. КОНТАКТЫ ПРОИЗВОДИТЕЛЯ...............................................................................................................66
ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Пример отчета по образцу...............................................................................................67
ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Пример отчета по запуску................................................................................................71
--- стр. 5 ---
Lob
Инструкция по применению
ООО «ПАРСЕК ЛАБ» Набор реагентов VariFind™ HLA solution IL-v2
#UM L-20ru Страница 5 из 73
1. ВВЕДЕНИЕ
При первом применении Набора реагентов необходимо обратиться к
производителю для настройки оборудования и программного обеспечения.
1.1. НАЗНАЧЕНИЕ НАБОРА РЕАГЕНТОВ
Набор реагентов «VariFind™ Н1_А solution IL-v2» предназначен для
качественного определения аллелей HLA генов (HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-
DQB1) в разрегиении 4 digit (2 fields) в образцах дезоксирибонуклеиновой кислоты
(ДНК), выделенных из цельной крови или лейкоцитарной массы человека,
обогагценных методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) длинных фрагментов с
последуюгцим высокопроизводительным секвенированием на генетическом
секвенаторе MiSeq (lllumina Inc.) (РУ №РЗН 2014/1568 от 29.04.2014) и
генотипированием с целью определения тканевой специфичности доноров костного
мозга для создания регистров.
Набор реагентов «VariFind™ HLA solution IL-v2» предназначен для клинической
лабораторной диагностики in vitro.
Набор реагентов предназначен для обследования всех групп населения без
градации по демографическому или популяционному признаку.
Набор реагентов предназначен только для профессионального применения.
Исследования с использованием Набора реагентов могут выполнять специалисты с
BbiCLUHM медицинским, биологическим или биотехнологическим образованием:
биолог, молекулярный биолог, биотехнолог, инженер-технолог, медицинский
лабораторный техник, лаборант, врач клинической лабораторной диагностики.
Персонал, проводягций исследования с использованием Набора реагентов,
должен владеть навыками проведения молекулярно-биологических исследований и
работы на генетическом секвенаторе MiSeq (lllumina Inc.) (РУ №РЗН 2014/1568 от
29.04.2014). Перед первой постановкой рекомендуется пройти инструктаж в
лаборатории производителя Набора реагентов.
1.2. НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ
Гены человеческих лейкоцитарных антигенов (HLA-гены) - это комплекс генов,
расположенных на шестой хромосоме, которые кодируют высоко полиморфные
молекулы двух классов: HLA класс I и HLA класс II. К первому классу относятся гены
HLA-A, HLA-B и HLA-C; ко второму классу относятся группы генов HLA-DR, HLA-DQ и
--- стр. 8 ---
,'Л» !’ 'I
Lab
Инструкция по применению
ООО «ПАРСЕК ЛАБ» Набор реагентов VariFind™ HLA solution IL-v2
#UM L-20ru Страница 8 из 73
проводится фрагментация ПЦР-продуктов, их очистка от ферментов и фрагментов
малого размера, после чего осуществляется восстановление концов,
аденилирование, лигирование адаптеров и очистка. Далее в ходе короткой ПЦР к
фрагментам добавляются молекулярные баркоды (индексы), одновременно
происходит наработка целевых продуктов с лигированными адаптерами и
баркодами. Полученные таким образом библиотеки проходят финальную очистку на
магнитных частицах, количественную флуориметрическую оценку, разводятся до
единой концентрации, объединяются и секвенируются.
Секвенирование осуществляется на генетическом секвенаторе MiSeq (lllumina
Inc.) (РУ №РЗН 2014/1568 от 29.04.2014). Метод секвенирования lllumina использует
технологию секвенирования путем синтеза, параллельно детектируя присоединение
флуоресцентно меченого нуклеотида к синтезируемой цепи ДНК в множестве
молекулярных кластеров.
Анализ данных осуществляется с помощью программного обеспечения (ПО)
VariFind™ HLA Software (ООО «ПАРСЕК ЛАБ», свидетельство о государственной
регистрации программы для ЭВМ №2018618585). Программное обеспечение
автоматически осуществляет импорт данных с секвенатора, выполняет
выравнивание прочтений, оценивает качество, определяет Н1_А-генотип образца,
формирует отчет по результатам анализа и предоставляет данные пользователю.
Подробнее см. раздел 3 - Анализ данных.
Набор реагентов рассчитан на проведение анализа 192 образцов ДНК,
включая контрольный образец из состава набора.
--- стр. 9 ---
Инструкция по применению
Lob
ООО «ПАРСЕК ЛАБ»
#UM_L-20ru Страница 9 из 73
Набор реагентов VariFind™ HLA solution IL-v2
1.6. ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
• Набор реагентов позволяет определять HLA-генотип с разрешением 4 digit (2
fields) по целевым локусам HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1 и HLA-DRB1.
Таргетные регионы локусов приведены в таблице 1.
Таблица № 1.
Локус Регионы Размер, т.п.н.
HLA-A Весь ген (все экзоны и интроны) 3,2
HLA-B Весь ген (все экзоны и интроны) 4,6
HLA-C Весь ген (все экзоны и интроны) 3
HLA-DQB1 1-5 экзоны 6,1
HLA-DRB1 2-4 экзоны 4,3
• Набор реагентов идентифицирует аллели, входягцие в базу данных IMGT HLA.
• Аналитическая чувствительность Набора реагентов составляет 10 нг/мкл
геномной ДНК человека.
• Аналитическая специфичность Набора реагентов по целевым локусам
составляет 100%.
( о п р е д е л е н а к а к с п о с о б н о с т ь н а б о р а р е а г е н т о в и д е н т и ф и ц и р о в а т ь г е н о т и п
( п о р у а л л е л е й ) т о л ь к о ц е л е в ы х H L A - л о к у с о в с р е д и г о м о л о г и ч н ы х л о к у с о в в
и с с л е д у е м о м о б р а з ц е )
• Диагностическая чувствительность - 100% в отношении каждого из целевых
локусов.
( у с т а н о в л е н а к а к д о л я и с т и н н о п о л о ж и т е л ь н ы х а л л е л е й , о п р е д е л е н н ы х п о б а з е
д а н н ы х I M G T H L A н а р е п р е з е н т а т и в н о й в ы б о р к е о б р а з ц о в )
• Диагностическая специфичность - 100% в отношении каждого из целевых
локусов.
( у с т а н о в л е н а к а к д о л я и с т и н н о о т р и ц а т е л ь н ы х а л л е л е й , о п р е д е л е н н ы х п о б а з е
д а н н ы х I M G T H L A н а р е п р е з е н т а т и в н о й в ы б о р к е о б р а з ц о в )
• Набор реагентов идентифицирует контаминированные образцы.
• Анализ данных и Н1_А-типирование осуществляется с помощью входящего в
состав программного обеспечения «VariFind™ HLA Software» версия 2.1.
Программное обеспечение представляет собой набор консольных (без
графического интерфейса) приложений, установленных на удалённом сервере.
--- стр. 10 ---
,'Л» I* *1
Инструкция по применению
Lob
ООО «ПАРСЕК ЛАБ»
#UM_L-20ru Страница 10 из 73
Набор реагентов VariFind™ HLA solution IL-v2
Загрузка результатов секвенирования (без передачи персональных данных) на
сервер осуществляется автоматически после завершения процесса
секвенирования. Далее, без участия оператора, запускается процесс анализа
данных. Результаты анализа данных сохраняются в локальной
вычислительной инфраструктуре пользователя, доступ к которым
осуществляется с персонального компьютера (ПК).
Набор реагентов обеспечивает получение результатов
удовлетворяющим критериям качества по таблице 2.
анализа.
Таблица № 2.
Показатель HLA-A HLA-B HLA-C HLA-
DQB1
HLA-
DRB1
Число прочтений на
экзоны >500 >500 >500 >500 >500
Среднее качество
прочтений >30 >30 >30 >30 >30
(величина Phred3)
Размер вставки > 250 п.н. > 250 п.н. > 250 п.н. >250 п.н. >250 п.н.
Дисбаланс по
ключевым экзонам < 80% < 80% < 80% < 80% < 80%
Набор реагентов корректно идентифицирует генотип контрольного образца,
входящего в состав изделия - таблица 3.
Таблица № 3.
Локус
HLA-A
HLA-B
HLA-C
HLA-DQB1
HLA-DRB1
.J
Генотип контрольного образца
Н1_А-А*02;01 + HLA-A*11:01
HLA-B*18:01 + HLA-B*44:02
HLA-C*02:02 + HLA-C*05:01
HLA-DQB1 *03:01 + HLA-DQB1 *03:01
HLA-DRB1 *04:01 +HLA-DRB1 *08:03
' NGS: высокопроизводительное секвенирование. Д.В. Ребриков [и др.]. - М.: БИНОМ. 2014.
--- стр. 26 ---
'I
Lab
Инструкция по применению
ООО «ПАРСЕК ЛАБ» Набор реагентов VariFind™ HLA solution IL-v2
#UM L-20ru Страница 26 из 73
Достаньте из холодильника камеры Калибраторы (К1, К2 и КЗ). Тщательно
перемешайте калибраторы вортексированием, сбросьте капли быстрым
центрифугированием (повторить 3 раза).
Выдержите анализируемые образцы ДНК при комнатной температуре,
тщательно перемешайте вортексированием, сбросьте капли быстрым
центрифугированием.
1. Приготовьте рабочий раствор для количественной оценки по следующему
протоколу с учетом измерения в каждом запуске, помимо образцов ДНК, 3
Калибраторов (К1, К2 и КЗ) в 3 повторах (итого, 9 реакций калибраторов)
(необходимо готовить единый раствор сразу для всего набора
анализируемых образцов):
Компонент Объем, мкл
Буфер для количественной оценки (Б) 49,95
Краситель (КР) 0,05
Итого 50
Рабочий раствор можно хранить в темноте в течение 1 часа.
Внимание: Калибраторы необходимы для построения калибровочной
кривой и их постановка обязательна. Калибраторы измеряются вместе с
исследуемыми образцами ДНК в одном 96-луночном планшете или в
соседних стрипах. Измерение Калибраторов отдельно от исследуемых
образцов ДНК может привести к получению некорректных значений
концентраций ДНК. При измерении концентраций целого сета из 96
образцов проводится 2 запуска прибора, в каждый запуск необходимо
включать калибраторы.
2. В лунку 9б-луночного планшета (или пробирку стрипа) для StepOnePlus
внесите по 48 мкл рабочего раствора.
3. В каждую лунку с рабочим раствором внесите по 2 мкл Калибратора или
анализируемого образца ДНК.
4. Запечатайте планшет пленкой (закройте стрипы), тщательно перемешайте
реакции на вортексе, сбросьте капли быстрым центрифугированием.
5. Установите в прибор планшет (стрипы), запустите созданную ранее
программу.
6. По завершении программы скачайте эксперимент из амплификатора с
помощью StepOne™ Software v2.3 (нажмите Download Experiment from
Instrument).
7. Откройте скачанный эксперимент, экспортируйте (вкладка Export) сырые
данные (Raw data) в excel-файл.
--- стр. 27 ---
» I* 'I
Lab
Инструкция no применению
ООО «ПАРСЕК ЛАБ» Набор реагентов VariFind™ HLA solution IL-v2
#UM L-20ru Страница 27 из 73
8. Создайте новый excel файл. Перенесите в него значения столбца GREEN из
excel файла «Raw data», соответствующие калибраторам.
9. Для каждого из калибраторов рассчитайте среднее значение по 3
измерениям (формула для строки excel =СРЗНАЧ). Подпишите ячейки
среднего значения соответственно концентрации калибраторов О, 10, 100.
Пример;
Левый столбец - среднее значение raw data для каждого из калибраторов.
Правый столбец - соответствующая концентрация калибратора.
77,33333 0
10264,33 10
134105,3 100
10. Создайте в этом же excel файле точечную диаграмму (Вставка -> диаграммы
-> точечная), выберите данные для диаграммы, выделив средние значения
raw data, полученные по калибраторам, и концентрации калибраторов. На
диаграмме появятся размеченные оси и 3 точки значений (ось X - значения
raw data, ось Y - концентрация калибраторов). Добавьте линию тренда, для
этого нажмите на одну из точек правой кнопкой мыши -> добавить линию
тренда.
11. Во вкладке «Параметры линии тренда» выбрать «линейная» и нажать
Р галочки «показывать уравнение на диаграмме», «поместить на диаграмму
величину достоверной аппроксимации». На диаграмме появятся 2
формулы:
- формула R^ (величина достоверной аппроксимации). Значение R^ должно быть не
ниже 0,9.
- формула уравнения калибровочной кривой в формате у=Ах + В или у=Ах - В.
Пример графика калибровочной кривой с уравнениями:
--- стр. 28 ---
ООО «ПАРСЕК ЛАБ» Набор реагентов VariFind™ HLA solution IL-v2
Инструкция по применению #UM_L-20ru Страница 28 из 73
120
100
80
60
40
20
О #
Калибровочная кривая
у = 0,0007х + 1,2308
8^ = 0,9994 ..•••
О 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 160000
12.Создайте в этом же excel файле таблицу с названиями анализируемых
образцов. В столбец напротив каждого образца внесите значение Green из
Raw data. Создайте пустой столбец для расчета концентраций по каждому
образцу.
Пример:
Sample ID GREEN С, нг/мкл
1
2
3
4
5
б
7
8
9
10
13. В первой ячейке с концентрацией пропишите следующую формулу =A*R +/-
В, где А и В соответствующие числа из уравнения калибровочной кривой, R
- ячейка со значением raw data образца.
14. Полученное с применением данной формулы значение является
концентрацией образца в нг/мкл.
15. Растяните формулу для расчета концентраций по всем ячейкам.
--- стр. 34 ---
\ I*
Lab
ООО «ПАРСЕК ЛАБ» Набор реагентов VariFind™ HLA solution IL-v2
Инструкция по применению #UM_L-20ru Страница 34 из 7 '
Пипетки одноканальные со сменными
наконечниками с изменяемым объемом
отбора жидкостей: на 0,5—10 мкл; на 10—
100 мкл; на 20—200 мкл; на 100—1000 мкл
любой -
Восьмиканальный дозатор 30—300 мкл любой -
Восьмиканальный дозатор 0,5—10 мкл любой -
Магнитный штатив См.описание в разделе 1.10
МАТЕРИАЛЫ
Оптические 9б-луночные планшеты для
ПЦР (например, MicroAmp® Optical 96-well
Reaction Plates, или аналогичные)
Thernno Fisher Scientific, США N8010560
Защитные пленки для 96-луночных
планшетов (например, Thernno Fisher
Scientific или Axygen)
- -
Наконечники с фильтром в штативах для
дозаторов объемом до 10 мкл, 20 мкл, 100
мкл, 300 мкл, 1000 мкл
любой -
Пробирки LoBind™ объемом 1,5 мл Eppendorf 022431021
Пробирки LoBind™ объемом 2 мл Eppendorf 022431048
Пробирки типа фалькон 50 мл Eppendorf 0030 122.178
Холодный штатив для планшетов и
пробирок 0,2 мл любой -
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ РЕАГЕНТЫ
Этанол, медицинский любой -
ЭДТА (динатриевая соль), класс чистоты:
для молекулярной биологии любой -
--- стр. 35 ---
'I
Lob
Инструкция по применению
ООО «ПАРСЕК ЛАБ» Набор реагентов VariFind™ HLA solution IL-v2
#UM L-20ru Страница 35 из 73
Фрагментация
Перед началом работы:
Заблаговременно подготовьте к работе холодный штатив: выдержите
в морозильной камере не менее 30 минут до начала этапа
фрагментации.
Приготовьте 0,5М ЭДТА (рН=8.0) в необходимом объеме по прописи;
Компонент
ЭДТА (динатр.соль)
NaOH*
Вода
Характеристика
стокового
раствора
372,24 г/моль
10 М
I типа
на 50 мл 0,5М ЭДТА
9,31 г
~2,5 мл**
-42,12 мл
*EDTA не растворяется в воде при кислом pH; при растворении нужно постепенно
добавлять щелочь и контролировать pH.
**06ъем щелочи может быть большим или меньшим в зависимости от условий
приготовления и свойств реагента.
Важно: заблаговременно включите амплификатор. чтобы обеспечить
нагрев крышки прибора перед началом фрагментации!
Установите на амплификаторе программу для фрагментации
(см.ниже).
Достаньте из морозильной камеры Буфер для фрагментации (БФ),
выдержите при комнатной температуре с учетом полной разморозки
буфера. Тщательно перемешайте на вортексе и центрифугируйте в
импульсном режиме.
Достаньте из морозильной камеры Смесь для фрагментации (СФ).
Тщательно перемешайте на вортексе и центрифугируйте в
импульсном режиме.
Достаньте из холодильной камеры Комплект для очистки и
оставьте при комнатной температуре на 30 мин.
Внимание: этап фрагментации следует проводить на холодном штативе.
1. В каждую лунку нового планшета внесите по 16 мкл ПЦР-смеси
соответствующего образца ДНК.
--- стр. 36 ---
Lob
Инструкция по применению
ООО «ПАРСЕК ЛАБ» Набор реагентов VariFind™ HLA solution IL-v2
#UM_L-20ru Страница 36 из 73
Приготовьте мастер-микс для фрагментации по следующему протоколу (из
расчета на каждый образец):
(Важно: при приготовлении мастер-миксов закладывайте
дополнительные реакции на погрешности пипетирования)
Компонент
Буфер для фрагментации (БФ)
Смесь для фрагментации (СФ)
Объем, мкл
2
2
Итого
3. Тщательно вортексируйте мастер-микс и центрифугируйте в импульсном
режиме.
4. Установите планшет на холодный штатив. В каждую лунку с образцом внесите
по 4 мкл мастер-микса для фрагментации.
5. Запечатайте планшет защитной пленкой, тщательно вортексируйте планшет,
центрифугируйте для сбора капель на дне лунок и поместите планшет в
амплификатор с заданной программой:
Температура
37°С
Время
5 мин
б. Незамедлительно после окончания программы извлеките планшет из
амплификатора, поместите на холодный штатив и внесите в каждую лунку с
образцом 5 мкл 0,5М ЭДТА. Запечатайте планшет защитной пленкой, тщательно
вортексируйте планшет, центрифугируйте в импульсном режиме.
Очистка на магнитных частицах
Перед началом работы:
• Достаньте из холодильной камеры Комплект для очистки, выдержите
магнитные частицы при комнатной температуре 30 мин. Тщательно
перемешайте частицы перед использованием!
• Приготовьте свежий 70% спирт из расчета 300 мкл на образец.
1. Добавьте 12,5 мкл тщательно перемешанных магнитных частиц к каждому
образцу ДНК.
2. Запечатайте планшет защитной пленкой, тщательно перемешайте на вортексе,
центрифугируйте в импульсном режиме.
3. Инкубируйте полученную смесь в течение 5 минут при комнатной температуре.
--- стр. 46 ---
» I* 'I
Lab
Инструкция no применению
ООО «ПАРСЕК ЛАБ» Набор реагентов VariRnd™ HL7\ solution IL-v2
#UM L-20ru Страница 46 из 73
генерирование кластеров и выполняется реакция секвенирования. Реактивы
попадают в проточную кювету через входное отверстие, проходят по
однодорожечной области визуализации, а затем покидают проточную кювету через
выходное отверстие. Отработанная жидкость из проточной кюветы направляется в
бутыль для сбора отходов. Перед настройкой цикла библиотеки загружаются в
картридж с реактивами, а затем автоматически переносятся в проточную кювету
после начала цикла.
Картридж для секвенирования. Картридж с реактивами MiSeq представляет
собой одноразовый расходный материал, состоящий из емкостей с колпачками из
фольги, предварительно заполненных реактивами для кластеризации и
секвенирования в количестве, достаточном для секвенирования одной проточной
кюветы. Все емкости картриджа с реактивами пронумерованы. Библиотеки образцов
загружаются в положение 17 картриджа, отмеченное этикеткой Load Samples.
Запуск прибора MiSeq
Включите прибор MiSeq, следуйте инструкции производителя.
По завершении инициализации откроется главная страница. На главной
странице выберите Run Options (Опции цикла). Выберите вкладку Run Settings
(Настройки цикла). Выберите Post Run Wash (Послецикловая промывка) или
Maintenance Wash (Профилактическая промывка). Промывку прибора требуется
выполнять после каждого цикла секвенирования.
Программное обеспечение требует, чтобы промывка выполнялась перед
настройкой последующего цикла. Послецикловая промывка занимает около 30
минут. Профилактическая промывка занимает около 1 часа.
Разморозка картри/рка для секвенирования
Извлеките картридж из морозильной камеры с температурой от -22 до -18 °С.
Поместите картридж в воду комнатной температуры, содержащую
деионизированную воду в количестве, достаточном для погружения основания
картриджа с реактивами. Нельзя погружать картридж глубже, чем до линии,
указанной на его упаковке.
Оставьте картридж с реактивами размораживаться при комнатной температуре
до полной разморозки (~ 60 минут). Достаньте картридж и осторожно постучите им
по поверхности стола, чтобы удалить воду с основания картриджа. Вытрите
основание картриджа насухо.
Переверните картридж с реактивами десять раз для перемешивания
размороженных реактивов, а затем внимательно проверьте, что все позиции
разморожены. Проверьте реактивы в положениях 1,2 и 4 и удостоверьтесь в том, что
они равномерно перемешаны и не содержат осадка. Осторожно постучите
картриджем по столу, чтобы уменьшить количество пузырьков воздуха в реактиве.
--- стр. 47 ---
\ I-
Lab
Инструкция по применению
ООО «ПАРСЕК ЛАБ» Набор реагентов VariFind™ HLA solution IL-v2
#UM_L-20ru Страница 47 из 73
Поместите кассету с реактивами на лед на срок до б часов или положите в
холодильник с температурой от плюс 2 до плюс 8°С до начала секвенирования.
Создание sample sheet
Файл sample sheet - файл формата csv (comma-separated values), который
содержит информацию, необходимую для установки параметров, исполнения и
анализа запуска секвенирования. Рекомендуется создавать sample sheet файл во
время разморозки картриджа перед секвенированием.
Файл sample sheet создается в любом текстовом редакторе и должен содержать
4 обязательных раздела:
• Header (заголовки)
• Reads (прочтения)
• Settings (Настройки)
• Data (Данные)
Между разделами должна быть одна пустая строка.
Раздел Header представляет собой набор строк вида «Параметр,3начение». Для
части параметров значения фиксированы.
Между разделами должна быть одна пустая строка.
Образец заполнения раздела Header:
[Header]
IEMFileVersion,5
Investigator Name,Маш
Experiment Name,ll-v2
Date, 70.70.2078
Workflow,GenerateFASTQ
Application,VariFind
Instrument Type,MiSeq
Assay,VariFind HLA solution IL-v2
Index Adapters,VariFind Barcodes s1-s4
Description,2878-7
Chemistry,Amplicon
Фиксированные значения выделены полужирным шрифтом и должны
оставаться неизменными при каждом заполнении sample sheet. Переменные
значения выделены курсивом и должны заполняться пользователем. В поле
Description следует указывать лот Набора реагентов, с которым приготовлены
библиотеки для запуска рана секвенирования.
--- стр. 48 ---
ILab
ООО «ПАРСЕК ЛАБ» Набор реагентов VariFind™ HLA solution IL-v2
Инструкция по применению #UM_L-20ru Страница 48 из 73
В разделе Reads (прочтения) записывается количество циклов для прямого и
обратного прочтения. Значения должны быть 151 для прямого и 151 для обратного
прочтения.
Образец заполнения раздела Reads:
[Reads]
151
151
В разделе Settings все значения фиксированные.
Образец заполнения поля Settings:
[Settings]
ReverseConnplennent,0
Adapter,AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA
AdapterRead2,AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT
В разделе Data записываются данные об образцах, предназначенных для
секвенирования. В данном разделе 10 столбцов для заполнения информации о
каждом образце. Данные об образце записываются в строчку через разделитель в
виде запятой без пробела. Первая строка раздела [Data] содержит заголовки
столбцов:
Sample_ID (идентификатор образца)
Sample_NaiTie (название образца)
Sample_Plate (название сета образцов)
Sample_Well (номер лунки)
l7_lndex_ID (ID индекса i7)
Index (последовательность индекса 17)
l5_lndex_ID (ID индекса i5)
index2 (последовательность индекса i5)
Sample_Project (проект)
Description (описание)
Образец заполнения раздела Data:
[Data]
--- стр. 56 ---
л К'*”
Lob
ООО «ПАРСЕК ЛАБ»
Инструкция по применению #UM_L-20ru Страница 56 из 73
Набор реагентов VariFind™ HLA solution IL-v2
Идентифицируются аллели, включенные в актуальную версию базы
данных IMGT HLA;
Под актуальной понимается версия базы данных IMGT HLA,
используемая для выравнивания прочтений в программном
обеспечении VariFind™ HLA Software;
Обновление версии IMGT HLA в VariFind™ HLA Software осуществляется
каждые б месяцев;
Версия базы данных IMGT HLA указывается в отчете по образцу и отчете
по запуску;
Генотип определяется по пяти локусам: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQB1 и
HLA-DRB1;
Разрешение генотипирования: 4 digit (2 fields);
Генотип записывается соответствии с номенклатурой IMGT HLA:
В случае если генотип не определен, см. разделы 3.4. Метрики качества
данных и 3.8. Устранение проблем.
Перед интерпретацией результатов постановки необходимо убедиться в
корректности определения генотипа Контрольного образца из состава
набора (см. раздел 3.7 АНАЛИЗ КОНТРОЛЬНОГО ОБРАЗЦА).
3.4. М ЕТРИКИ КАЧЕСТВА ДАННЫ Х
Метрики качества данных рассчитываются автоматически для
каждого локуса HLA в отдельности. При выходе значений метрик за
установленные пороги (см. таблицу) алгоритм автоматически
присваивает статус генотипа по локусу «Отсутствует (не пройден
автоматический контроль качества)» (см. раздел 3.8. Устранение
проблем).
Метрики качества и установленные пороги значений:
Показатель HLA-A HLA-B HLA-C HLA-
DQB1
HLA-
DRB1
Число прочтений на
экзоны
Среднее качество
>500 >500 >500 >500 >500
прочтений
(величина Phred^°)
>30 >30 >30 >30 >30
Размер вставки > 250 п.н. > 250 п.н. > 250 п.н. > 250 п.н. > 250 п.н
' NGS: высокопроизводительное секвенирование. Д.В. Ребриков [и др.]. - М.: БИНОМ. 2014.
--- стр. 57 ---
» I
Lab
ООО «ПАРСЕК ЛАБ» Набор реагентов VariFind™ HLA solution IL-v2
Инструкция no применению #UM_L-20ru Страница 57 из 73
Дисбаланс по
ключевым экзонам < 80% < 80% < 80% < 80% < 80%
Основным критерием качества секвенирования является метрика
«Среднее качество прочтений» (см. раздел 3.4.2. Среднее качество
прочтений).
3.4.1. Число прочтений на экзоны
Число прочтений, выровненных на кодирующие последовательности
локуса и прошедших фильтрацию по качеству;
Пороговое значение для прохождения контроля качества: > 500
прочтений на локус;
Основной показатель точности генотипирования на уровне 4 digit;
Недостаточное количество прочтений может привести к ошибочному
генотипированию или невозможности генотипирования по локусу.
3.4.2. Среднее качество прочтений
Среднее phred-качество по всем прочтениям, выровненным на
кодирующие последовательности локуса;
Параметр phred отражает вероятность ошибки; для технологии
высокопроизводительного секвенирования (next-generation sequencing,
NGS) около 90% нуклеотидов имеют качество равное 30, то есть
вероятность ошибки составляет 1/1000, или точность прочтения 99,9%;
Параметр зависит от качества реагентов для секвенирования и
соблюдения протокола при выборе параметров запуска секвенатора;
Пороговое значение для прохождения контроля качества: > 30.
3.4.3. Размер вставки
• Средняя длина секвенируемых фрагментов, определенная по
результатам выравнивания на локус пары прочтений;
• Под вставкой понимается длина фрагмента без учета
последовательностей адаптеров;
--- стр. 58 ---
Lob" ^
ООО «ПАРСЕК ЛАБ» Набор реагентов VariFind™ HLA solution IL-v2
Инструкция по применению #им L-20ru Страница 58 из 73
•5
*3
70 пн
Адаптер 1
150 пн
Прочтение 1 70 пн
Адаптер 2
иставка 1
◄---------------------------------
Прочтение 2
150 пн
<--------------------------------------------------------------------------------------------------р .
‘3
•5
Размер вставки > 300 пн
Длина фрагмента > 440 пн
Размер вставки в основном зависит от точности соблюдения протокола
на этапе фрагментации и при очистках магнитными частицами;
Пороговое значение для прохождения контроля качества: > 250 п.н.
Низкий размер вставки может привести к увеличению неоднозначности
результатов генотипирования.
3.4.4. Дисбаланс покрытия по ключевым экзонам
Среднее соотношение между покрытием аллелей по ключевым экзонам;
Ключевые экзоны: экзоны 2 и 3 для HLA class I; экзон 2 для HLA class И.
Значения, близкие к 0,5, соответствуют сбалансированной гетерозиготе;
Значения, близкие к 0,0 и 1,0 свидетельствуют о дисбалансе между
количеством прочтений с гомологичных хромосом;
Гомозиготные аллели имеют значение 0,5;
Пороговое значение для прохождения контроля качества: < 80%.
3.5. О ЦЕНКА КО Н ТАМ И Н АЦ ИИ
Контаминация исследуемых образцов посторонней геномной ДНК
человека идентифицируется автоматически и показывает присутствие
третьей аллели с частотой более 25% (в формате «обнаружено/не
обнаружено»);
При обнаружении контаминации алгоритм присваивает статус генотипа
по локусу «Отсутствует (не пройден автоматический контроль
качества)» (см. раздел 3.8. Устранение проблем).
--- стр. 59 ---
» I-
Lab
Инструкция по применению
ООО «ПАРСЕК ЛАБ» Набор реагентов VariFind™ HLA solution IL-v2
#UM L-20ru Страница 59 из 73
3.6. Ф О РМ АТЫ выходных ДАННЫ Х
3.6.1. Отчет по образцу
Пример отчета по образцу приведен в Приложении 1 настоящей
Инструкции;
Отчет по образцу состоит из четырех разделов: общая информация об
анализе, результат генотипирования, контроль качества (КК) и раздел
пользователя;
Общая информация включает: сокращенное наименование
медицинского изделия и серию набора реагентов, метод анализа,
анализируемые локусы, разрешение генотипирования; номер образца и
материал; дату секвенирования, номер запуска, номер образца в
постановке, дату анализа и версию базы данных IMGT HLA;
Результат генотипирования представлен в таблице: локус, генотип и
результат контроля качества (КК) в формате «Пройден/Не пройден»);
В случае если степень неоднозначности высока и запись генотипа
превышает 300 символов, в графе генотип указывается "Отображение
невозможно: степень неоднозначности выше предельно допустимой"
(подробнее см. раздел 3.7. Устранение проблем).
Контроль качества содержит информацию о метриках качества по
каждому локусу, заданных порогах и результат КК, подробнее см. раздел
3.4 - Метрики качества данных;
Раздел пользователя опционально заполняется вручную после печати
отчета и включает информацию об исполнителях, а также служебные
заметки;
Формат отчета: PDF.
3.6.2. Таблица генотипов по образцам
• Объединенная таблица по результатам генотипирования всех образцов
в одной постановке;
• 7-колоночная таблица;
Колонка 1 - порядковый номер;
Колонка 2 - название образца;
Колонка 3 - генотип по локусу HLA-A;
Колонка 4 - генотип по локусу HLA-B;
Колонка 5 - генотип по локусу HLA-C;
Колонка 6 - генотип по локусу HLA-DQB1;
Колонка 7 - генотип по локусу HLA-DRB1;