Набор реагентов для определения РНК/ДНК вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) "АмплиСенс® ВИЧ-C-FL" по ТУ 9398-227-01897593-2014 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 ---
УТВЕРЖДАЮ
Директор Федерального бюджетного
учреждения науки «Центральный
научно-исследовательский институт
эпидемиологии» Федеральной службы
по надзору защиты прав
потребит§^^\,ЙЙ^,.... благополучия
'с^кровский
ИНСТРУКЦИЯ
по применению набора реагентов
для определения РНК/ДНК вируса иммунодефицита человека
типа 1 (ВИЧ-1) в биологическом материале методом
полимеразной цепной реакции (ПЦР)
«АмплиСенс® ВИЧ-C-FL»
АмплиСенс*^
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора,
Российская Федерация, 111123,
город Москва, улица Новогиреевская, дом За IVD
--- стр. 2 ---
О Г Л А В Л Е Н И Е
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ....................................................................................................3
НАЗНАЧЕНИЕ......................................................................................................................3
ПРИНЦИП МЕТОДА............................................................................................................4
ФОРМАТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ...............................................5
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТИСТИКИ................................................................................6
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ.......................................................................7
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ..........................................................................................7
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ................................................10
ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА.. 12
ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАЦИИ РНК/ДНК...................12
ИНТЕРФЕРИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА И ОГРАНИЧЕНИЯ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ ПРОБ
ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА.......................................................................................13
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ...........................................................................13
ЭКСТРАКЦИЯ РНК/ДНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ...........................................13
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 1 («ПЦР-комплект» вариант FRT).......................................15
СОСТАВ.........................................................................................................................15
РЕАКЦИЯ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ РНК И АМПЛИФИКАЦИЯ ДНК/кДНК С
ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» ..............................................15
A. Подготовка пробирок для ОТ-ПЦР ...................................................................16
Б. Проведение ОТ-ПЦР с детекцией в режиме «реального времени»..............17
B. Анализ и интерпретация результатов..............................................................18
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 2 (комплект реагентов QIAamp Viral RNA Mini Kit, «ПЦР-
комплект» вариант FRT - 2 штуки)..................................................................................21
СОСТАВ........................................................................................................................21
РЕАКЦИЯ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ РНК И АМПЛИФИКАЦИЯ ДНК/кДНК С
ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»..............................................22
A. Подготовка пробирок для амплификации........................................................22
Б. Проведение ОТ-ПЦР с детекцией в режиме «реального времени».............23
B. Анализ и интерпретация результатов..............................................................24
СРОК ГОДНОСТИ, УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ........................28
ГАРАНТИЙНЫЕ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА ПРОИЗВОДИТЕЛЯ...............................................28
СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ........................................30
ПРИЛОЖЕНИЕ 1...............................................................................................................31
--- стр. 3 ---
список СОКРАЩЕНИИ
В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения;
ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека типа 1
ВКО ВИЧ-M-FRT - экзогенный внутренний контрольный образец
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
кДНК - Комплементарная ДНК, получаемая в реакции обратной
транскрипции на матрице РНК
К- - отрицательный контроль ОТ-ПЦР
ОК - отрицательный контроль экстракции
ОКО - отрицательный контрольный образец
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
ПК - положительный контроль экстракции
пко - положительный контрольный образец
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
РУ - регистрационное удостоверение
ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии
Роспотребнадзора
-Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный
научно-исследовательский институт эпидемиологии»
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека
FRT - флуоресцентная детекция в режиме «реального времени»
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов «АмплиСенс® ВИЧ-C-FL» предназначен для качественного
определения РНК/ДНК вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) в
биологическом материале (очищенные сперматозоиды) методом ПЦР с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации. Набор
реагентов используется в клинической лабораторной диагностике для исследования
биологического материала, полученного от лиц, инфицированных ВИЧ, вне
зависимости от стадии заболевания. Материалом для проведения ОТ-ПЦР служат
пробы РНК/ДНК, экстрагированные из исследуемого материала с помощью
комплектов реагентов, рекомендованных Производителем.
ВНИМАНИЕ! В соответствии с федеральным законом от 21.11.2011 № 323-ФЗ «Об
основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» ПЦР-исследование
является одним из методов всестороннего обследования пациента, на основании
которого лечащий врач устанавливает диагноз и выбирает мероприятия по лечению
пациента.
Клиническая интерпретация результатов лабораторного исследования
проводится в соответствии с действующей нормативно-методической
документацией (Приказ Минздрава России №107н от 30 августа 2012 г. «Порядок
использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказания и
--- стр. 4 ---
ограничения к их применению»).
ПРИНЦИП МЕТОДА
Принцип тестирования основывается на экстракции РНК/ДНК из образцов
исследуемого материала с внутренним контрольным образцом (ВКО ВИЧ-M-FRT),
проведении реакции обратной транскрипции РНК и одновременной амплификации
участков ДНК/кДНК выявляемого микроорганизма и кДНК ВКО ВИЧ-M-FRT с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией. ВКО ВИЧ-M-FRT позволяет
контролировать все этапы ПЦР-исследования для каждого образца и оценивать
влияние ингибиторов ПЦР на результаты исследования.
С полученными на этапе экстракции пробами РНК/ДНК проводится обратная
транскрипции РНК с помощью фермента ТМ-Ревертазы и амплификации участков
ДНК/кДНК при помощи специфичных к этому участку праймеров и фермента Taq-
полимеразы. В составе реакционной смеси присутствуют флуоресцентно-меченые
олигонуклеотиды, которые гибридизуются с комплементарным участком
амплифицируемой ДНК/кДНК-мишени, в результате чего происходит нарастание
интенсивности флуоресценции. Это позволяет регистрировать накопление
специфического продукта амплификации путем измерения интенсивности
флуоресцентного сигнала с помощью амплификатора с системой детекции
флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени».
На этапе ОТ-ПЦР одновременно в одной пробирке проводятся две реакции -
амплификация участка гена вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), а
также амплификация последовательности кДНК ВКО ВИЧ-M-FRT. Результаты
амплификации ДНК/кДНК вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), а также
кДНК ВКО ВИЧ-M-FRT регистрируются по двум различным каналам флуоресцентной
детекции;
Таблица 1
Канал для флуорофора FAM JOE
ДНК/кДНК-мишень кДНК ВКО ВИЧ-M-FRT
ДНК/кДНК вируса
иммунодефицита человека
типа 1 (ВИЧ-1)
Область амплификации STI-248-гес Регион ро1
--- стр. 5 ---
ФОРМАТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ
Набор реагентов выпускается в 3 формах комплектации:
Форма 1 включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT.
Форма 2 включает комплект реагентов для экстракции нуклеиновых кислот QIAamp
Viral RNA Mini Kit, «ПЦР-комплект» вариант FRT - 2 штуки.
Форма 3 включает наборы реагентов оптом, расфасованные по отдельным
реагентам, с маркировкой реагентов на их оптовой фасовке.
Форма комплектации 1 предназначена для проведения реакции обратной
транскрипции РНК и амплификации ДНК/кДНК с гибридизационно-флуоресцентной
детекцией в режиме «реального времени» и позволяет выявлять РНК/ДНК в
качественном формате. Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо
дополнительно использовать комплекты реагентов для экстракции РНК/ДНК,
рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
Форма комплектации 2 предназначена для проведения полного ПЦР-
исследования, включающего экстракцию РНК/ДНК из биологического материала,
проведение реакции обратной транскрипции РНК и амплификации ДНК/кДНК с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени», и
позволяет выявлять ДНК/РНК в качественном формате.
Форма комплектации 3 предназначена для производственных целей для
последующей маркировки на языке заказчика и комплектации по наборам.
ВНИМАНИЕ! Форма комплектации 3 используется только в соответствии с
регламентом, утвержденным ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
ВНИМАНИЕ! Пробы РНК/ДНК, полученные в результате экстракции из исследуемых
образцов, амплифицируются в двух повторах.
--- стр. 6 ---
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТИСТИКИ
Для данного набора реагентов применимы следующие характеристики:
Аналитическая чувствительность
Таблица 2
Вид
исследуемого
материала
Комплект для
экстракции
РНК/ДНК
Комплект для
обратной
транскрипции и
амплификации
Аналитическая
чувствительность
Очищенные
сперматозоиды
человека
QIAamp Viral RNA
Mini Kit
«ПЦР-комплект»
вариант FRT
200 копий РНК ВИЧ/мл,
300 копий ДНК ВИЧ/мл’'
Данная чувствительность достигается при соблюдении правил, указанных в
разделах «Взятие, транспортирование и хранение исследуемого материала» и
«Подготовка исследуемого материала к экстракции ДНК».
Аналитическая специфичность
Набор реагентов обнаруживает фрагмент РНК/ДНК заявленного возбудителя.
Аналитическая специфичность набора реагентов доказана при исследовании
ДНК/РНК следующих микроорганизмов/вирусов: вирус гепатита А, вирус гепатита В,
вирус гепатита С, вирус гепатита D, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр, вирус
простого герпеса типы 1, 2, вирус ветряной оспы, вирус герпеса человека типы 6, 8,
парвовирус В19, вирус клещевого энцефалита, вирус лихорадки западного Нила,
аденовирус типы 2, 3, 7, Escherichia соН, Staphylococcus aureus, Streptococcus
pyogenes, Streptococcus agalactiae, a также геномной ДНК человека.
При тестировании образцов ДНК/РНК вышеперечисленных микроорганизмов,
вирусов и ДНК человека неспецифических реакций выявлено не было.
^ Аналитическая чувствительность указана для каждого типа генетического материала в отдельности.
Проведение анализа не позволяет дифференцировать РНК и ДНК ВИЧ-1.
--- стр. 7 ---
Воспроизводимость и повторяемость
Таблица 3
Вид исследуемого
■ материала Количество повторов Коэффициент вариации CV,
%
Разброс значений внутри одного теста
Очищенные сперматозоиды
(выявление РНК ВИЧ) 30 6,5
Очищенные сперматозоиды
(выявление ДНК ВИЧ) 30 2,1
Разброс значений между тестами, проведенными в разные дни
Очищенные сперматозоиды
(выявление РНК ВИЧ) 60 19,9
Очищенные сперматозоиды
(выявление ДНК ВИЧ) 60 14,3
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Таблица 4
Результаты тестирования набора реагентов «АмплиСенс® ВИЧ-C-FL»
Тип образцов
Результаты применения
набора реагентов
«АмплиСенс® ВИЧ-C-FL»
Истинные значения
положительных отрицательных
Очищенные
сперматозоиды
человека
Всего
исследовано
350 образцов
положительных 200 0
отрицательных 0 150
Для определения диагностической чувствительности непосредственно перед
анализом к образцам очищенных сперматозоидов, полученных от ВИЧ-негативных
доноров, добавляли РНК или ДНК вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) в
количестве, равном аналитической чувствительности набора реагентов. По каждому
типу нуклеиновой кислоты (200 копий РНК ВИЧ/мл или 300 копий ДНК ВИЧ/мл)
тестировалось по 100 модельных образцов.
Для определения диагностической специфичности использовались образцы
очищенных сперматозоидов, полученных от ВИЧ-негативных доноров.
Диагностическая чувствительность набора реагентов «АмплиСенс® ВИЧ-C-FL»
(относительная чувствительность в сравнении с истинными значениями) составляет
97,72 % с доверительной вероятностью 90 %.
Диагностическая специфичность набора реагентов «АмплиСенс® ВИЧ-C-FL»
(относительная специфичность в сравнении с истинными значениями) составляет
98,48 % с доверительной вероятностью 90 %.
--- стр. 8 ---
м
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно
биологические (ПЦР) исследования биологического материала на наличие
возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-
эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с
микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями
паразитарных болезней», СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические
требования к обращению с медицинскими отходами» и методических указаний МУ
1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы
амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим
микроорганизмы 1-IV групп патогенности».
При работе всегда необходимо выполнять следующие требования;
- Рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные, организовывать
работу и хранение в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с
микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями
паразитарных болезней».
- Убирать и дезинфицировать разлитые образцы, используя дезинфицирующие
средства в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с
микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями
паразитарных болезней».
- Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в
отдельных помещениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Экстракции,
продолжать в Зоне Амплификации и Детекции. Не возвращать образцы,
оборудование и реактивы в зону, в которой была проведена предыдущая стадия
процесса.
- Неиспользованные реагенты, реагенты с истекшим сроком годности, а также
использованные реагенты, биологический материал, включая материалы,
инструменты и предметы, загрязненные биологическим материалом, следует
удалять в соответствии с требованиями СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-
эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами».
ВНИМАНИЕ! При удалении отходов после амплификации (пробирок, содержащих
продукты ПЦР) недопустимо открывание пробирок и разбрызгивание содержимого,
поскольку это может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны,
оборудования и реагентов.
- Использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для
8
--- стр. 12 ---
б) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с плоской крышкой
(например, Axygen, Inc. («Эксиджен, Инк»), США, или аналогичные) или
пробирки для ПЦР к Rotor-Gene объемом 0,1 мл в стрипах по 4 шт. с крышками
(например, QIAGEN GmbH («Киаген ГмбХ»), Германия, или аналогичные) - при
использовании прибора роторного типа.
25.Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до 10,
100, 200мкл (например, Axygen, Inc. («Эксиджен, Инк»), США, или аналогичные).
26. Штативы для пробирок объемом 1,5 мл или 0,2 мл или 0,1 мл и наконечников
(например, Axygen, Inc. («Эксиджен, Инк»), США, или аналогичные).
27. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс) (например, «БАВ-ПЦР-
«Ламинар-С», ЗАО «Ламинарные системы», Россия).
28. Вортекс (например, SIA Biosan, Латвия, или аналогичный).
29. Автоматические дозаторы переменного объема (например, ООО «Биохит»,
Россия, или аналогичные).
30. Программируемый амплификатор с системой детекции флуоресцентного сигнала
в режиме «реального времени», имеющий 2 или более независимых каналов
флуоресцентной детекции (например, Rotor-Gene О (QIAGEN GmbH («Киаген
ГмбХ»), Германия), и другие рекомендованные Производителем).
31 .Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 до минус 16 °С.
32.Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.2569-09.
33.Емкость для сброса наконечников.
ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА
Материалом для исследования служат очищенные сперматозоиды человека.
Допускается хранение образцов очищенных сперматозоидов:
- при температуре не выше минус 68 °С - длительно.
Допускается лишь однократное замораживание-оттаивание материала.
ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАЦИИ РНК/ДНК
Образцы очищенных сперматозоидов человека не требуют предварительной
подготовки. Для получения очищенных сперматозоидов в стерильную коническую
пробирку на 15 мл с завинчивающейся крышкой на дно помещается 2 мл среды для
выделения жизнеспособных сперматозоидов с концентрацией 80 %, сверху
наслаивается такой же объем градиента 40 %, далее сверху наслаивается такой же
объем эякулята. Пробирка центрифугируется при 800-1600 g в течение 20 минут.
После центрифугирования на дне образуется клеточный осадок, выше - слой
12
--- стр. 13 ---
градиента, над ним - слой семенной плазмы. Надосадочная жидкость вместе с
градиентом аккуратно удаляется пипеткой.
Осадок помещается в свежую стерильную пробирку на 15 мл со средой для
приготовления сперматозоидов в объеме от 5 до 10 мл. Осадок равномерно
распределяется пипетированием во всем обьеме среды. Проводится
центрифугирование при 800-1600 g 10-15 минут. Надосадочная жидкость удаляется
и процедура отмывки повторяется еще раз.
Осадок делится на две равные аликвоты, одна из которых используется для
проведения тестирования на наличие РНК/ДНК ВИЧ методом ПЦР. Вторая аликвота
криоконсервируется (при температуре не выше минус 68 °С) и может быть
использована в программах вспомогательных репродуктивных технологий в случае
получения отрицательного результата ПЦР-исследования.
ИНТЕРФЕРИРУЮЩИЕ ВЕЩЕСТВА И ОГРАНИЧЕНИЯ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ
ПРОБ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА
Использование для проведения ПЦР-исследования биологического материала,
содержащего избыточное количество примесей в виде, например, слизи может
приводить к ингибированию реакции амплификации. Для контроля эффективности
экстракции РНК/ДНК и возможного ингибирования ПЦР в наборе реагентов
предусмотрено использование внутреннего контрольного образца (ВКО ВИЧ-M-FRT),
который добавляется в каждый биологический образец на этапе экстракции
нуклеиновых кислот. По окончании реакции амплификации наличие сигнала,
свидетельствующего о накоплении фрагментов кДНК ВКО ВИЧ-M-FRT, говорит о
достаточной эффективности экстракции нуклеиновых кислот и отсутствии
ингибиторов реакции ПЦР.
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ
ПЦР-исследование состоит из следующих этапов:
- экстракция РНК/ДНК из исследуемых образцов,
- обратная транскрипция РНК и амплификация ДНК/кДНК с гибридизационно-
флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени»,
- анализ и интерпретация результатов.
ЭКСТРАКЦИЯ РНК/ДНК из ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ
ВНИМАНИЕ! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые
пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку «RNase-
13
--- стр. 14 ---
т
free», «DNase-free».
Для экстракции РНК/ДНК используется комплект реагентов QIAamp Viral RNA Mini
Kit и другие рекомендованные Производителем, в соответствии с инструкцией к
используемому комплекту для экстракции. Порядок работы с комплектом реагентов
QIAamp Viral RNA Mini Kit смотрите в приложении 1.
Объемы реагентов и образцов при экстракции с помощью комплекта QIAamp Viral
RNA Mini Kit:
Экстракция РНК/ДНК из каждого исследуемого образца и контролей проводится в
присутствии внутреннего контрольного образца - ВКО ВИЧ-M-FRT.
Объем ВКО - 10 мкл в каждую пробирку.
Объем исследуемого образца - 140 мкл.
В пробирку отрицательного контроля экстракции (ОК) внести 140 мкл ОКО.
В пробирку положительного контроля экстракции (ПК) внести 130 мкл ОКО и
10 мкл ПК01 ВИЧ.
Объем элюции - 70 мкл.
14
--- стр. 15 ---
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 1. КАЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 1 («ПЦР-комплект» вариант FRT)
СОСТАВ
Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT для обратной транскрипции
РНК и амплификации фрагментов ДНК/кДНК вируса иммунодефицита человека типа
1 (ВИЧ-1) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального
времени» позволяет проводить ПЦР-исследование в качественном формате.
Комплект реагентов включает:
Реагент Описание Объем, мл Количество
ОТТ лиофилизированный Порошок белого цвета — 4 пробирки
ПЦР-смесь-FL ВИЧ Прозрачная бесцветная
жидкость 0,3 4 пробирки
ПЦР-буфер-С Прозрачная бесцветная
жидкость 0,2 4 пробирки
Полимераза (TaqF) Прозрачная бесцветная
жидкость 0,03 4 пробирки
ТМ-Ревертаза (MMIv) Прозрачная бесцветная
жидкость 0,01 4 пробирки
К- Прозрачная бесцветная
жидкость 0,2 4 пробирки
ОКО Прозрачная жидкость
соломенно-желтого цвета 1,2 4 пробирки
ПК01 ВИЧ Прозрачная бесцветная
жидкость 0,1 4 пробирки
ВКО ВИЧ-M-FRT Прозрачная бесцветная
жидкость 0,28 4 пробирки
Комплект реагентов рассчитан на проведение 80 реакций обратной транскрипции и
амплификации, включая контроли.
РЕАКЦИЯ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ РНК И АМПЛИФИКАЦИЯ ДНК/кДНК С
ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»
ВНИМАНИЕ! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку
RNase-free, DNase-free.
Для внесения в пробирки реагентов, проб РНК/ДНК и контрольных образцов
используются одноразовые наконечники с фильтрами.
15
--- стр. 16 ---
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 1. КАЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ
А. Подготовка пробирок для ОТ-ПЦР
Общий объем реакционной смеси - 50 мкл, включая объем пробы ДНК/кДНК -
25 мкл.
ВНИМАНИЕ! Пробы РНК/ДНК, полученные в результате экстракции из исследуемых
образцов, амплифицировать в двух повторах. Пробы РНК/ДНК, полученные в
результате экстракции из контрольных образцов (ПК01 ВИЧ и ОКО),
амплифицировать в одном повторе.
1. До начала работы разморозить, тщательно перемешать на вортексе все реагенты
набора и осадить капли с крышек пробирок.
2. Для приготовления реакционной смеси на 20 реакций^ в пробирку с ОТТ
лиофилизированным добавить все содержимое пробирки с ПЦР-буфером-С,
все содержимое пробирки с ПЦР-смесью-FL ВИЧ, все содержимое пробирки с
полимеразой (TaqF) и все содержимое пробирки с ТМ-Ревертазой (MMIv).
Приготовленная смесь не хранится.
Примечание - Для приготовления реакционной смеси на меньшее количество
реакций необходимо:
- в пробирку с DTT лиофилизированным добавить все содержимое пробирки с
ПЦР-буфером-С. Тщательно перемешать смесь на вортексе и осадить капли
с крышки пробирки кратковременным центрифугированием.
- в отдельной одноразовой пробирке смешать реагенты из расчета на 1
реакцию: 15 мкл ПЦР-смеси-FL ВИЧ, 10 мкл ПЦР-буфера-С и DTT
лиофилизированного, 1,0 мкл полимеразы (TaqF) и 0,5 мкл ТМ-Ревертазы
(MMIv). Тщательно перемешать смесь на вортексе и осадить капли с крышки
пробирки кратковременным центрифугированием.
3. Отобрать необходимое количество пробирок или стрипов для ОТ-ПЦР ДНК/РНК
исследуемых и контрольных проб.
4. Внести в каждую пробирку по 25 мкл приготовленной реакционной смеси.
Неиспользованные остатки реакционной смеси выбросить.
5. Используя наконечник с фильтром, в пробирки с реакционной смесью внести по
25 мкл проб РНК/ДНК, полученных в результате экстракции из исследуемых
образцов.
ВНИМАНИЕ! Содержимое пробирок необходимо тщательно перемешать
пипетированием, не допуская появления пузырьков воздуха.
2 Анализ 8 исследуемых образцов в 2-х повторах, 2 контролей этапа экстракции и 1 отрицательного
контроля ОТ-ПЦР (если необходимо).
16
--- стр. 20 ---
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 1. КАЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ
I
от среднего значения Cf для контрольных образцов ПК01 ВИЧ и ОКО по данному
каналу).
- Результат анализа невалидный, если для данной пробы по каналу для
флуорофора РАМ (ВКО) значение порогового цикла (СО не определено
(отсутствует) или превышает рассчитанное по вкладышу граничное значение
(значение зависит от среднего значения Cf для контрольных образцов ПК01 ВИЧ
и ОКО по данному каналу). Необходимо провести повторное ПЦР-исследование
соответствующего исследуемого образца, начиная с этапа экстракции ДНК.
ВНИМАНИЕ! Граничные значения Ct указаны во вкладыше, прилагаемом к набору
реагентов.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены
правильные результаты для контролей этапов экстракции и ОТ-ПЦР, в
соответствии с табл. 7 и вкладышем, прилагаемым к набору реагентов.
Таблица 7
Результаты для контролей различных этапов ПЦР-исследования
Контроль
Контролируемый
этап ПЦР-
исследования
Значение порогового цикла по каналу для
флуорофора ( C t )
РАМ JOE
ПК Экстракция РНК/ДНК опоеделено меньше
граничного
определено меньше
граничного
ОК Экстракция РНК/ДНК определено меньше
граничного отсутствует
К- ОТ-ПЦР отсутствует отсутствует
Возможные ошибки;
1. Для положительного контроля экстракции (ПК) значение порогового цикла {Ct) по
каналам для флуорофоров РАМ и/или JOE превышает граничное значение.
Необходимо повторить ПЦР-исследование, начиная с этапа экстракции ДНК/РНК,
для всех образцов.
2. Для отрицательного контроля экстракции (ОК):
а) по каналу для флуорофора JOE определено значение порогового цикла {Ct).
Вероятна контаминация лаборатории продуктами амплификации или
контаминация реагентов, исследуемых образцов на каком-либо этапе ПЦР-
исследования. Необходимо предпринять меры по выявлению и ликвидации
источника контаминации и повторить ПЦР-исследование для всех образцов, в
которых обнаружена специфическая ДНК/кДНК, начиная с этапа экстракции
РНК/ДНК.
19
--- стр. 21 ---
б) по каналу для флуорофора РАМ (ВКО) значение порогового цикла (Ct)
превышает граничное значение. Требуется повторное проведение анализа для
всех образцов, начиная с этапа экстракции.
3. Для отрицательного контроля ОТ-ПЦР (К-) по каналам для флуорофоров РАМ
и/или JOE определено значение порогового цикла (Ct). Вероятна контаминация
лаборатории продуктами амплификации или контаминация реагентов,
исследуемых образцов на каком-либо этапе ПЦР-исследования. Р1еобходимо
предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации и
повторить амплификацию и детекцию для всех образцов, в которых обнаружена
специфическая ДР1К/кДР1К.
4. Для исследуемого образца определено значение порогового цикла (Ct), при этом
на графике флуоресценции отсутствует участок характерного экспоненциального
подъема (график представляет собой приблизительно прямую линию).
Необходимо проверить правильность выбранного уровня пороговой линии или
параметров расчета базовой линии. Если результат получен при правильном
уровне пороговой линии (базовой линии), требуется повторно провести
амплификацию и детекцию для этого образца.
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 1. КАЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ
20
--- стр. 22 ---
W M A КОМПЛЕКТАЦИИ 2. КАЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 2 (комплект реагентов QIAamp Viral RNA
Mini Kit, «ПЦР-комплект» вариант FRT - 2 штуки)
СОСТАВ
Комплект реагентов QIAamp Viral RNA Mini Kit - комплект реагентов и расходных
материалов для экстракции РНК/ДНК из биологического материала - включает:
Реагент Описание Объем, мл Количество
Лизирующий раствор AVL
(Buffer AVL)
Прозрачная бесцветная
жидкость 31 1 флакон
Промывочный буфер AW1
(Buffer AW1)
Прозрачная бесцветная
жидкость 19 1 флакон
Промывочный буфер AW2
(Buffer AW2)
Прозрачная бесцветная
жидкость 13 1 флакон
Буфер AVE (Buffer AVE) Прозрачная бесцветная
жидкость 2 3 пробирки
Нагрузочная РНК (Carrier
RNA) Порошок белого цвета - 1 пробирка
Комплект расходных материалов
клинического материала - включает:
комплект для экстракции РНК/ДНК из
Расходный материал Количество
Колонки с сорбентом (QIAamp Mini Spin Columns) 50 ШТ.
Пробирки (Collection tubes, 2 ml) 3 X 50 ШТ.
Комплект реагентов и расходных материалов рассчитан на экстракцию РНК/ДНК из
50 проб, включая контроли.
Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT для обратной транскрипции
РНК и амплификации фрагментов ДНК/кДНК вируса иммунодефицита человека типа
1 (ВИЧ-1) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального
времени» позволяет проводить ПЦР-исследование в качественном формате.
Комплект реагентов включает;
Реагент Описание Объем, мл Количество
DTI лиофилизированный Порошок белого цвета — 4 пробирки
ПЦР-смесь-FL ВИЧ Прозрачная бесцветная
жидкость 0,3 4 пробирки
ПЦР-буфер-С Прозрачная бесцветная
жидкость 0,2 4 пробирки
Полимераза (TaqF) Прозрачная бесцветная
жидкость 0,03 4 пробирки
ТМ-Ревертаза (MMIv) Прозрачная бесцветная
жидкость 0,01 4 пробирки
21
--- стр. 23 ---
гФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 2 КАЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ
Реагент Описание Объем, мл Количество
К- Прозрачная бесцветная
жидкость 0,2 4 пробирки
ОКО Прозрачная жидкость
соломенно-желтого цвета 1,2 4 пробирки
ПК01 ВИЧ Прозрачная бесцветная
жидкость 0.1 4 пробирки
ВКО ВИЧ-M-FRT Прозрачная бесцветная
жидкость 0,28 4 пробирки
Комплект реагентов рассчитан на проведение 80 реакций обратной транскрипции и
амплификации, включая контроли,
РЕАКЦИЯ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ РНК И АМПЛИФИКАЦИЯ ДНК/кДНК С
ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»
ВНИМАНИЕ! При работе с РНК/ДНК необходимо использовать только одноразовые
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку
«RNase-free», «DNase-free».
Для внесения в пробирки реагентов, проб РНК/ДНК и контрольных образцов
используются одноразовые наконечники с фильтрами.
А. Подготовка пробирок для амплификации
Общий объем реакционной смеси - 50 мкл, включая объем пробы ДНК/кДНК -
25 мкл.
ВНИМАНИЕ! Пробы РНК/ДНК, полученные в результате экстракции из исследуемых
образцов, амплифицировать в двух повторах. Пробы РНК/ДНК, полученные в
результате экстракции из контрольных образцов (ПК01 ВИЧ и ОКО),
амплифицировать в одном повторе.
1. До начала работы разморозить, тщательно перемешать на вортексе все реагенты
набора и осадить капли с крышек пробирок.
2. Для приготовления реакционной смеси на 20 реакций'* в пробирку с DTT
лиофилизированным добавить все содержимое пробирки с ПЦР-буфером-С,
все содержимое пробирки с ПЦР-смесью-FL ВИЧ, все содержимое пробирки с
полимеразой (TaqF) и все содержимое пробирки с ТМ-Ревертазой (MMIv).
Приготовленная смесь не хранится.
Примечание - Для приготовления реакционной смеси на меньшее количество
реакций необходимо;
Анализ 8 исследуемых образцов в 2-х повторах, 2 контролей этапа экстракции и 1 отрицательного
контроля ОТ-ПЦР (если необходимо).
22
--- стр. 24 ---
f
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 2. КАЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ
- в пробирку с DTT лиофилизированным добавить все содержимое пробирки с
ПЦР-буфером-С. Тщательно перемешать смесь на вортексе и осадить капли
с крышки пробирки кратковременным центрифугированием.
- в отдельной одноразовой пробирке смешать реагенты из расчета на 1
реакцию: 15 мкл ПЦР-смеси-FL ВИЧ, 10 мкл ПЦР-буфера-С и DTT
лиофилизированного, 1,0 мкл полимеразы (TaqF) и 0,5 мкл ТМ-Ревертазы
(MMIv). Тщательно перемешать смесь на вортексе и осадить капли с крышки
пробирки кратковременным центрифугированием.
3. Отобрать необходимое количество пробирок или стрипов для ОТ-ПЦР ДНК/РНК
исследуемых и контрольных проб.
4. Внести в каждую пробирку по 25 мкл приготовленной реакционной смеси.
Неиспользованные остатки реакционной смеси выбросить.
5. Используя наконечник с фильтром, в пробирки с реакционной смесью внести по
25 мкл проб РНК/ДНК, полученных в результате экстракции из исследуемых
образцов.
ВНИМАНИЕ! Содержимое пробирок необходимо тщательно перемешать
пипетированием, не допуская появления пузырьков воздуха.
6. Поставить контрольные реакции:
а) положительный контроль экстракции (ПК) - в пробирку с реакционной
смесью внести 25 мкл пробы, экстрагированной из ПК01 ВИЧ.
б) отрицательный контроль экстракции (ОК) - в пробирку с реакционной
смесью внести 25 мкл пробы, экстрагированной из ОКО.
ВНИМАНИЕ! Содержимое пробирок необходимо тщательно перемешать
пипетированием, не допуская появления пузырьков воздуха.
ВНИМАНИЕ! При подозрении на возможную контаминацию также необходима
постановка отрицательного контроля ОТ-ПЦР (К-). Для этого в пробирку с
реакционной смесью внести 25 мкл К-.
ВНИМАНИЕ! Провести ОТ-ПЦР сразу после соединения реакционной смеси и
ДНК/РНК-пробы и контролей.
Б. Проведение ОТ-ПЦР с детекцией в режиме «реального времени»
1. Запрограммировать амплификатор с системой детекции в режиме «реального
времени») для выполнения соответствующей программы амплификации и
детекции флуоресцентного сигнала (см. табл. 8).
23
--- стр. 27 ---
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 2. КАЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ
Таблица 10
Результаты для контролей различных этапов ПЦР-исследования
Контроль
Контролируемый
этал ПЦР-
исследования
Значение порогового цикла по каналу для
флуорофора ( C t )
FAM JOE
ПК Экстракция РНК/ДНК определено меньше
граничного
определено меньше
граничного
ОК Экстракция РНК/ДНК определено меньше
граничного отсутствует
К- ОТ-ПЦР отсутствует отсутствует
Возможные ошибки;
1. Для положительного контроля экстракции (ПК) значение порогового цикла {Ct) по
каналам для флуорофоров РАМ и/или JOE превышает граничное значение.
Необходимо повторить ПЦР-исследование, начиная с этапа экстракции ДНК/РНК,
для всех образцов.
2. Для отрицательного контроля экстракции (ОК):
а) по каналу для флуорофора JOE определено значение порогового цикла {Ct).
Вероятна контаминация лаборатории продуктами амплификации или
контаминация реагентов, исследуемых образцов на каком-либо этапе ПЦР-
исследования. Необходимо предпринять меры по выявлению и ликвидации
источника контаминации и повторить ПЦР-исследование для всех образцов, в
которых обнаружена специфическая ДНК/кДНК, начиная с этапа экстракции
РНК/ДНК.
б) по каналу для флуорофора FAM (ВКО) значение порогового цикла {Ct)
превышает граничное значение. Требуется повторное проведение анализа для
всех образцов, начиная с этапа экстракции.
3. Для отрицательного контроля ОТ-ПЦР (К-) по каналам для флуорофоров РАМ
и/или JOE определено значение порогового цикла {Ct). Вероятна контаминация
лаборатории продуктами амплификации или контаминация реагентов,
исследуемых образцов на каком-либо этапе ПЦР-исследования. Необходимо
предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации и
повторить амплификацию и детекцию для всех образцов, в которых обнаружена
специфическая ДНК/кДНК.
4. Для исследуемого образца определено значение порогового цикла {Ct), при этом
на графике флуоресценции отсутствует участок характерного экспоненциального
подъема (график представляет собой приблизительно прямую линию).
26
--- стр. 28 ---
ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ 2. КАЧЕСТВЕННЫЙ ФОРМАТ
Необходимо проверить правильность выбранного уровня пороговой линии или
параметров расчета базовой линии. Если результат получен при правильном
уровне пороговой линии (базовой линии), требуется повторно провести
амплификацию и детекцию для этого образца.
27
--- стр. 29 ---
СРОК годности, УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ и ХРАНЕНИЯ
Срок годности. 12 мес. Набор реагентов с истекшим сроком годности применению
не подлежит. Срок годности вскрытых реагентов соответствует сроку годности,
указанному на этикетках для невскрытых реагентов, если в инструкции не указано иное.
Транспортирование. Набор реагентов транспортировать при температуре от 2 до
8 °С не более 5 сут. Комплект реагентов QIAamp Viral RNA Mini Kit и «ПЦР-комплект»
вариант FRT при получении разукомплектовать в соответствии с указанными
температурами хранения.
Хранение.
Форма комплектации 1. Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT хранить
при температуре от минус 24 до минус 16 °С. Не допускается замораживание /
оттаивание ПК01 ВИЧ и ВКО ВИЧ-M-FRT более двух раз, после размораживания
ПК01 ВИЧ и ВКО ВИЧ-M-FRT хранить при температуре от 2 до 8 °С не более 6 мес,
ПЦР-смесь-FL ВИЧ хранить в защищенном от света месте.
Форма комплектации 2. Комплект реагентов QIAamp Viral RNA Mini Kit хранить при
температуре от 15 до 25 °С. Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT
хранить при температуре от минус 24 до минус 16 °С. Не допускается замораживание /
оттаивание ПК01 ВИЧ и ВКО ВИЧ-M-FRT более двух раз, после размораживания
ПК01 ВИЧ и ВКО ВИЧ-M-FRT хранить при температуре от 2 до 8 °С не более 6 мес.
ПЦР-смесь-FL ВИЧ хранить в защищенном от света месте.
ГАРАНТИЙНЫЕ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА ПРОИЗВОДИТЕЛЯ
Производитель гарантирует соответствие основных параметров и характеристик
набора реагентов, требованиям, указанным в технической и эксплуатационной
документации, в течение указанного срока годности при соблюдении всех условий
транспортирования, хранения и применения.
Рекламации на качество набора реагентов «АмплиСенс® ВИЧ-0-FL» направлять в
отдел рекламаций, организации обучения и контроля качества по адресу 115035,
г. Москва, ул. Садовническая, д. 20/13, стр. 2 (тел. (495) 664-28-84, факс (495) 664-
28-89, e-mail: cs@ilslab.ru®.
При выявлении побочных действий, не указанных в инструкции по применению
набора реагентов, нежелательных реакций при его использовании, фактов и
обстоятельств, создающих угрозу жизни и здоровью граждан и медицинских
работников при применении и эксплуатации набора реагентов, рекомендуется
® Отзывы и предложения о продукции «АмплиСенс» вы можете оставить, заполнив анкету
потребителя на сайте; www.amplisens.ru.
28
--- стр. 30 ---
направить сообщение в отдел по работе с рекламациями по адресу, указанному
выше, и в уполномоченную государственную регулирующую организацию (в РФ -
Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения) в соответствии с
действующим законодательством.
Е.Н. РодионоваЗаведующий НПЛ ОМДиЭ
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
Директор Федерального государственна
бюджетного учреждения «Уральский
научно-исследовательский институт
го> #'
г- ■^-4'L.
Н.В.Башмакова
о Ч
охраны материнства и младенчества>^Л^^'^ ;')^;^»^^^^
Минздрава России
ч
29