Набор реагентов для количественного определения РНК вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией "АмплиСенс® ВИЧ-Монитор-М-FL" по ТУ 9398-208-01897593-2012 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 ---
УТВЕРЖДЕНА
Приказом Росздравнадзора
№от
УТВЕРЖДАЮ
Директор Федерального
бюджетного учреждения науки
«Центральный научно-
исследовательский институт
эпидемиологии» Федеральной
службы'|па^^^^^ н в сфере
защить1-* прав потребителей и
5лучия\человека
ювский
2012 г.
ИНСТРУКЦИЯ
по применению набора реагентов
для выявления и количественного определения РНК
вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1)
в клиническом материале методом полимеразной цепной
реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией
«АмплиСенс® ВИЧ-Монитор-M-FL»
АмплиСенс’
ш 1
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора,
Российская Федерация, 111123,
город Москва, улица Новогиреевская, дом За IVD
--- стр. 2 ---
I
1ГЛАВЛЕНИЕ
:ПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.......................................................................................................3
1АЗНАЧЕНИЕ........................................................................................................................3
1РИНЦИП МЕТОДА...............................................................................................................4
ЮРМАТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ..................................................5
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ..............................................................................6
У1ЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ...........................................................................................6
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ..................................................8
ЗЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА.... 10
ЗОСТАВ.................................................................................................................................11
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ.............................................................................12
ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ......................................................13
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ И АМПЛИФИКАЦИИ С
ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»......................................................13
АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................16
СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ.......................17
ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Экстракция РНК с использованием комплекта реагентов «МАГНО-
сорб»......................................................................................................................................18
ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Экстракция РНК с использованием комплекта реагентов «МАГНО-
сорб» совместно с автоматическими станциями для экстракции нуклеиновых кислот 22
ПРИЛОЖЕНИЕ 3. Экстракция РНК с использованием автоматической станции
NucliSENS easyMAG............................................................................................................23
СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ..........................................27
--- стр. 3 ---
к
ПИСОК СОКРАЩЕНИИ
В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения:
Верхний ПКО ВИЧ - Высококонцентрированный положительный контрольный
образец экстракции
ВКО STI-AB-rec - Внутренний контрольный образец
ВИЧ - Вирус иммунодефицита человека
Нижний ПКО ВИЧ - Низкоконцентрированный положительный контрольный
образец экстракции
ОКО - Отрицательный контрольный образец
ПКО - Положительный контрольный образец
ПЦР - Полимеразная цепная реакция
РНК - Рибонуклеиновая кислота
ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии
Роспотребнадзора
- Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный
научно-исследовательский институт эпидемиологии»
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека
FRT - Флуоресцентная детекция в режиме «реального времени»
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов «АмплиСенс® ВИЧ-Монитор-M-FL» предназначен для
количественного определения РНК вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-
1) в клиническом материале методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной
детекцией. Материалом для проведения ПЦР служат пробы РНК, выделенные из
плазмы крови. Используемые в наборе реагентов специфические праймеры и зонды
гибридизуются в области региона ро/ генома вируса иммунодефицита человека.
Набор реагентов эффективно выявляет и количественно измеряет варианты ВИЧ-1,
относящиеся к группе М (субтипы А, В, С, D, F, G, Н и рекомбинанты АВ, АЕ), группе
N и группе О. Стандартное отклонение измеренной величины вирусной нагрузки (в
логарифмах копий в мл) составляет не более 0,3 1д на всем диапазоне измерения.
ВНИМАНИЕ! Результаты ПЦР-исследования учитываются в комплексной
диагностике заболевания^
В соответствии с Директивой Европейского Союза 98/79/ЕС.
--- стр. 4 ---
1РИНЦИП МЕТОДА
Количественное определение РНК ВИЧ-1 методом полимеразной цепной реакции
ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией включает в себя два этапа:
кстракцию РНК из образцов клинического материала и обратную транскрипцию с
1мплификацией участка РНК ВИЧ-1 и гибридизационно-флуоресцентной детекцией,
:оторая производится непосредственно в ходе ПЦР. Экстракция РНК из клинического
латериала проводится в присутствии внутреннего контрольного образца (ВКО STI-
\B-rec), который позволяет контролировать выполнение процедуры исследования
для каждого образца. Затем с полученными пробами РНК проводится реакция
эбратной транскрипции, совмещенная с реакцией амплификации участка кДНК ВИЧ-1
при помощи специфичных к этому участку ДНК праймеров и фермента Taq-
полимеразы. В составе реакционной смеси присутствуют флуоресцентно-меченые
олигонуклеотидные зонды, которые гибридизуются с комплементарным участком
амплифицируемой ДНК-мишени, в результате чего происходит нарастание
интенсивности флуоресценции. Это позволяет регистрировать накопление
специфического продукта амплификации путем измерения интенсивности
флуоресцентного сигнала. Детекция флуоресцентного сигнала осуществляется
непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора с системой детекции
флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени».
В наборе реагентов применяется «горячий старт», что значительно снижает
количество неспецифических реакций. «Горячий старт» обеспечивается
использованием химически модифицированной Taq-полимеразы.
Количественное определение РНК ВИЧ-1 методом ПЦР в режиме «реального
времени» основывается на существовании линейной зависимости между исходной
концентрацией РНК-мишени в исследуемом образце и циклом начала
экспоненциального увеличения флуоресцентного сигнала (пороговый цикл. Cycle
threshold, Ct). По результатам амплификации РНК-калибраторов строится
калибровочная линия, по которой происходит определение концентрации РНК-
мишени в исследуемых образцах.
РНК-калибраторы входят в состав «Комплекта для калибровки и необходимы в
случаях, если:
а) используется новая серия комплекта реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT;
б) используется новая серия комплекта реагентов для экстракции РНК;
в) изменился объем исследуемых образцов.
После Т О ГО , как калибровка успешно проведена, она может быть использована в
--- стр. 5 ---
^eниe 6 мес.
DPMATbl И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ
|бор реагентов выпускается в 1 формате.
зрмат FRT
j6op реагентов выпускается в 4 формах комплектации:
эрма 1 включает комплект расходных материалов, комплекты реагентов «МАГНО-
рб» вариант 100-1000, «ПЦР-комплект» вариант FRT;
орма 2 включает комплект расходных материалов, комплекты реагентов для
(томатической станции экстракции нуклеиновых кислот NucliSENS easyMAG вариант
Ю (bioMerieux, Франция), «ПЦР-комплект» вариант FRT;
орма 3 включает комплект реагентов «Комплект для калибровки».
орма 4 включает наборы реагентов оптом, расфасованные по отдельным реагентам,
маркировкой реагентов на их оптовой фасовке.
НИМАНИЕ! При использовании новой серии комплекта реагентов «ПЦР-комплект»
ариант FRT, новой серии комплекта реагентов для экстракции РНК или в случае
зменения объема исследуемых образцов необходимо предварительное проведение
алибровки с помощью «Комплекта для калибровки».
Формы комплектации 1 и 2 предназначены для проведения полного ПЦР-
сследования, включающего экстракцию РНК из клинического материала,
|роведение реакции обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК вируса
1ммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) с гибридизационно-флуоресцентной
детекцией в режиме «реального времени».
Форма комплектации 3 предназначена для проведения калибровки системы
[серия набора реагентов и прибор для амплификации). Для проведения полного
анализа необходимо дополнительно использовать форму комплектации 1 или
2 данного набора реагентов (производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора).
Форма комплектации 4 предназначена для производственных целей для
последующей маркировки на языке заказчика и комплектации по наборам.
ВНИМАНИЕ! Форма комплектации 4 используется только в соответствии с
регламентом, утвержденным ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
--- стр. 6 ---
1АЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
алитическая чувствительность и линейный диапазон измерения
Объём
:;тракций,
мкл
Комплект ДЛЯ ' "
ч экстракции РНК
л инеиныи д||апазон,
копий РНК В^Ч/мл, '
(1д[копий^л])
Аналитическая
чувствйтельность,
_ копий РНК ВИЧ/мл,
(1д[копий/мл])
1000 «МАГНО-сорб»
NucliSENS easyMAG
40-10^
(1,60-7,00) 20 (1,30)
200 «МАГНО-сорб»
NucliSENS easyMAG
150-10^
(2,18-7,00) 150 (2,18)
налитическая специфичность
Оценка аналитической специфичности набора реагентов проведена посредством
обавления в реакцию геномной ДНК/РНК следующих организмов и вирусов; вирус
апатита А, вирус гепатита В, вирус гепатита С, вирус гепатита D, цитомегаловирус,
1ирус Эпштейна-Барр, вирус простого герпеса типы 1, 2, вирус ветряной оспы, вирус
ерпеса человека типы 6, 8, парвовирус В19, вирус клещевого энцефалита, вирус
1ихорадки западного Нила, аденовирус типы 2, 3, 7, Escherichia соН, Staphylococcus
aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Homo sapiens.
Перекрестные реакции для указанных организмов и вирусов зарегистрированы
не были.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно
биологические (ПЦР) исследования клинического материала на наличие
возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-эпидемических
правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами 1II-IV групп
патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СанПиН
2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с
медицинскими отходами» и методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация
работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при
работе с материалом, содержащим микроорганизмы 1-IV групп патогенности».
При работе всегда следует выполнять следующие требования:
- Следует рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные,
организовывать работу и хранение в соответствии с СП 1.3.2322-08
«Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности
(опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
--- стр. 7 ---
я
- Убирать и дезинфицировать разлитые образцы или реактивы, используя
дезинфицирующие средства в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность
работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и
возбудителями паразитарных болезней».
- Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в
отдельных помещениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Выделения,
продолжать в Зоне Амплификации и Детекции. Не возвращать образцы,
оборудование и реактивы в зону, в которой была проведена предыдущая стадия
процесса.
- Неиспользованные реактивы, реактивы с истекшим сроком годности, а также
использованные реактивы следует удалять в соответствии с требованиями
СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к
обращению с медицинскими отходами».
ВНИМАНИЕ! При удалении отходов после амплификации (пробирок, содержащих
продукты ПЦР) недопустимо открывание пробирок и разбрызгивание содержимого,
поскольку это может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны,
оборудования и реагентов.
- Использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для
автоматических дозаторов с фильтром. Одноразовую пластиковую посуду
необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий
дезинфицирующее средство, которое может быть использовано для
обеззараживания медицинских отходов.
- Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка
ПЦР, до начала и после завершения работ необходимо подвергать
ультрафиолетовому облучению в течение 30 мин.
- Применять набор строго по назначению, согласно данной инструкции.
- Допускать к работе с набором только специально обученный персонал.
- Не использовать набор по истечении срока годности.
- Использовать одноразовые перчатки, лабораторные халаты, защищать глаза во
время работы с образцами и реактивами. Тщательно вымыть руки по окончании
работы.
- Избегать контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой. При контакте
немедленно промыть пораженное место водой и обратиться за медицинской
помощью.
- Листы безопасности материалов (MSDS - material safety data sheet) доступны по
--- стр. 8 ---
%
запросу.
[ОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
ЮНА 1 .Экстракция РНК из клинического материала:
. Ламинарный бокс (например, «БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2», «Ламинарные
системы», Россия, класс биологической безопасности II тип А).
!. Вортекс (например, «ТЭТА-2», BioSan, Латвия).
5. Набор электронных или механических дозаторов переменного объема с
возможностью дозирования от 10 до 1000 мкл (например, «Ленпипет», Россия).
1. Штативы для пробирок (например, «ИнтерЛабСервис», Россия) и наконечников
(например, Axygen, США).
5. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до
200 мкл и до 1000 мкл (например, Axygen, США).
6. Холодильник от 2 до 8 °С.
7. Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.2569-09.
8. Емкость для сброса наконечников.
При использовании комплекта реагентов «МАГНО-сорб» (ТУ 9398-106-01897593-
2012):
1. Термостат для пробирок объемом 5 мл, диаметром 12 мм, от 25 до 100 °С
(например, Bioer Technology, Китай).
2. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, BioSan,
Латвия).
3. Магнитный штатив для пробирок типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл (например,
Promega, США).
4. Магнитный штатив для пробирок объемом 5 мл, диаметром 12 мм (например,
Promega, США).
5. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления
надосадочной жидкости (например, «ОМ-1», г. Ульяновск, Россия).
6. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся
пробирки объемом 1,5 мл (например, Axygen, США).
7. Одноразовые полипропиленовые или полистирольные пробирки объемом 5 мл,
диаметром 12 мм, круглодонные (например, Axygen, США).
8. Одноразовые полипропиленовые крышки для пробирок объемом 5 мл,
диаметром 12 мм (например, Axygen, США).
9. Электронный или механический дозатор переменного объема с возможностью
дозирования от 1000 до 5000 мкл (например, «Ленпипет», Россия)
8
--- стр. 9 ---
D. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл, до
1000 мкл (например, Ахудеп, США) и до 5000 мкл (например, Thermo scientific,
Финляндия).
1ри использовании автоматической станции NucliSENS easvMAG:
. Автоматическая станция для экстракции РНК/ДНК NucliSENS easyMAG
(bioMerieux, Франция)
I Набор реактивов и расходных материалов к автоматической станции (например
NucliSENS easyMAG (NucliSens буфер для экстракции 1, NucliSens буфер для
экстракции 2, NucliSens буфер для экстракции 3, NucliSens буфер для лизиса,
NucliSens магнитная силика) (bioMerieux, Франция)).
3. Многоканальный дозатор переменного объема с возможностью дозирования от
50 до 300 мкл (например, «Ленпипет», Россия)
ЗОНА 2. Проведение реакций обратной транскрипции и амплификации с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации
1. Автоматические дозаторы переменного объема (от 20 до 200 мкл, от 100 до
1000 мкл) (например, «Ленпипет», Россия).
2. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс) (например, «БАВ-ПЦР-
«Ламинар-С», «Ламинарные системы», Россия).
3. Центрифуга/вортекс (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).
4. Одноразовые наконечники с фильтром до 200 мкл и 1000 мкл в штативах
(например, Ахудеп, США).
5. Холодильник от 2 до 8 °С.
6. Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.2569-09.
7. Емкость для сброса наконечников.
При использовании амплификатора Abbott m2000rt (Abbott, США):
1. Амплификатор Abbott mZOOOrt (Abbott, США).
2. Оптические 96-луночные реакционные планшеты (например, Ахудеп, США).
3. Оптические липкие крышки (например, Ахудеп, США).
4. Аппликаторы для крышек (например, Ахудеп, США).
При использовании прибора для ПЦР в режиме «реального времени» Rotor-
Gene 6000 или Rotor-Gene Q:
1. Программируемый амплификатор с системой детекции флуоресцентного
сигнала в режиме «реального времени» Rotor-Gene 6000 (Corbett Research,
Австралия) или Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия).
2. Штативы для пробирок объемом 0,2 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).
9
--- стр. 12 ---
ЮРМАТ FRT
етекциеи в режиме «реального времени» - включает:
Рещктив ОписШйе ‘ • 'ilОбъем, мл Кол-во
ОТ-ПЦР-смесь-А Прозрачная бесцветная
жидкость 1.0 4 пробирки
ОТ-ПЦР-смесь-В Прозрачная бесцветная
жидкость 0.3 4 пробирки
ОТ-ПЦР-смесь-С Прозрачная бесцветная
жидкость 0,14 4 пробирки
Сомплект реагентов рассчитан на проведение 96 реакций обратной транскрипции и
амплификации, включая контроли.
< комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа экстракции:
Реактив Описание | ' Объем, мл Кол-во
ОКО Прозрачная бесцветная
жидкость 1.2 4 пробирки
Нижний ПКО ВИЧ Прозрачная бесцветная
жидкость 1.2 4 пробирки
Верхний ПКО ВИЧ Прозрачная бесцветная
жидкость 1.2 4 пробирки
ВКО STI-AB-rec Прозрачная бесцветная
жидкость 0.3 4 пробирки
Комплект реагентов «Комплект для калибровки» - комплект реагентов для
проведения калибровки системы - включает:
Реактив Описание А Объем, мл Кол-во
Калибратор А Прозрачная бесцветная
жидкость 1.2 12 пробирок
Калибратор В Прозрачная бесцветная
жидкость 1.2 12 пробирок
Комплект реагентов рассчитан на проведение четырех калибровок при постановке
трех повторов каждого калибратора, либо трех калибровок при постановке четырех
повторов каждого калибратора. Входит в состав формы комплектации 3.
Комплект расходных материалов - комплект для проведения реакции
амплификации в приборе Abbott т2000^- включает:
, . . . .
1 Расходный материал t '.{ Кол-во М
Оптический 96-луночный реакционный планшет 4 шт.
Оптическая липкая крышка 4 шт.
Комппект рассчитан на проведение 384 реакций амплификации. Входит в состав
форм комплектации 1 и 2.
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ
ПЦР-исследование состоит из следующих этапов:
12
--- стр. 13 ---
ОРМАТ FRT
Экстракция РНК из исследуемых образцов.
Обратная транскрипция РНК и амплификация с
флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Анализ и интерпретация результатов.
гибридизационно-
КСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ
Для экстракции РНК используются комплекты реагентов:
«МАГНО-сорб» в соответствии с приложением 1 «Экстракция РНК с
использованием комплекта реагентов «МАГНО-сорб»» и приложением 2
«Экстракция РНК с использованием комплекта реагентов «МАГНО-сорб»
совместно с автоматическими станциями для экстракции».
- комплект реагентов для автоматической станции NucliSENS easyMAG в
соответствии с приложением 3 «Экстракция РНК с использованием
автоматической станции NucliSENS easyMAG».
ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ И АМПЛИФИКАЦИИ С
ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»
(проводится в ЗОНЕ 2 - помещении для проведения амплификации).
Выбор пробирок для амплификации зависит от используемого
амплификатора с системой детекции в режиме «реального времени».
Для внесения в пробирки реагентов, проб РНК и контрольных образцов
используются одноразовые наконечники с фильтрами.
Общий объем реакции - 100 мкл, объем пробы РНК - 50 мкл.
ВНИМАНИЕ! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную
маркировку RNase-free, DNase-free.
При использовании амплификатора Abbott m2000rf (Abbott. США)
1. Включить и запустить амплификатор Abbott m2000rt.
ВНИМАНИЕ! Амплификатор должен прогреться в течение 15 мин.
2. Создать файл постановки реакции в соответствии с инструкцией к
амплификатору. Выбрать вариант анализа, соответствующий объему
тестируемого образца.
Внести в файл постановки реакции значения серий калибраторов (в том случае,
если необходимо провести калибровку системы) и контролей. Значения серий
13
--- стр. 14 ---
>ОРМАТ FRT
указаны во вкладышах, прилагающихся к «Комплекту для калибровки» и
контрольным образцам.
к Приготовить реакционную смесь. Для этого достать и разморозить по одной
пробирке каждого реагента «ПЦР-комплект» вариант FRT. Затем в пробирку с
ОТ-ПЦР-смесью-С добавить 949 мкл ОТ-ПЦР-смеси-А и 271 мкл ОТ-ПЦР-смеси-
В. Тщательно перемешать на вортексе и осадить капли с крышки пробирки.
Приготовленная смесь должна быть использована в течение 1 ч после
приготовления.
ВНИМАНИЕ! Приготовленной смеси достаточно для проведения 24 реакций.
4. Внести по 50 мкл реакционной смеси в ячейки 96-луночного реакционного
планшета. Неиспользованные остатки реакционной смеси выбросить.
5. Используя отдельные наконечники с фильтром для каждого образца, добавить по
50 мкл проб РНК, полученных в результате экстракции из исследуемых,
контрольных образцов или калибраторов, в ячейки 96-луночного реакционного
планшета. Содержимое пробирок осторожно перемешать пипетированием.
ВНИМАНИЕ! При добавлении проб РНК необходимо избегать попадания магнитного
сорбента в реакционную смесь.
6. Заклеить 96-луночный реакционный планшет оптической липкой пленкой.
7. Поместить реакционный планшет в амплификатор Abbott mlOOOrt.
8. Запустить протокол анализа в соответствии с инструкцией по использованию
амплификатора Abbott m2000rt.
9. По окончании выполнения программы приступить к учету результатов.
При использовании амплификаторов Rotor-Gene 6000 или Rotor-Gene Q
1. Включить амплификатор Rotor-Gene 6000 или Rotor-Gene Q.
2. Запустить программное обеспечение FRT Manager.
3. В закладке Быстрый запуск нажать кнопку Новая постановка.
4. В раскрывающемся списке указать модель прибора Rotor-Gene 6000.
5. Во вкладке Реакционный блок выбрать необходимый тип реакционного блока.
6. Во вкладке Г руппа совместимости выбрать группу «ВИЧ-Монитор-M-FL».
7. В открывшемся окне необходимо выбрать методику, разместить образцы в
реакционном блоке и указать используемую серию набора реагентов (пп. 8-10).
8. В окне Методики выбрать методику с соответствующим объемом клинических
образцов (0,2 мл или 1 мл).
9. В окне Размещение необходимо разместить исследуемые образцы и контроли в
постановке:
14
--- стр. 17 ---
7 *
: р о к г о д н о с т и, у с л о в и я т р а н с п о р т и р о в а н и я и х р а н е н и я
;^рок годности. 12 мес. Набор реагентов с истекшим сроком годности применению
не подлежит. Срок годности вскрытых реагентов соответствует сроку годности,
/казанному на этикетках для невскрытых реагентов, если в инструкции не указано
иное.
Транспортирование. Набор реагентов транспортировать при температуре от 2 до
8 °С не более 5 сут. При получении разукомплектовать в соответствии с указанными
температурами хранения.
Хранение. Комплект расходных материалов хранить при температуре от 15 до
25 °С. Комплект реагентов «МАГНО-сорб» хранить при температуре от 2 до 25 °С.
Комплект реагентов для автоматической станции экстракции нуклеиновых кислот
NucliSENS easyMAG (bioMerieux, Франция) хранить при температуре от 2 до 8 °С.
Комплекты реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT и «Комплект для калибровки»
хранить лри температуре от минус 24 °С до минус 16 °С.
Рекламации на качество набора реагентов «АмплиСенс® ВИЧ-Монитор-M-FL»
направлять на предприятие-изготовитель ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора (111123 г. Москва, ул. Новогиреевская, д. За) в отдел по работе с
рекламациями и организации обучения (тел. (495) 974-96-46, факс (495) 916-18-18, е-
mail: products@pcr.ru)^.
Заведующий НПЛ ОМДиЭ
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
Е.Н. Родионова
Главный врач ФГБУ «Поликлиника № 1» Никонов
Управления делами Президента Российской Ф^фации
^ Отзывы и предложения о продукции «АмплиСенс» вы можете оставить, заполнив анкету
потребителя на сайте; www.amplisens.ru.
17
--- стр. 18 ---
ЭКСТРАКЦИЯ РНК
ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Экстракция РНК с использованием комплекта реагентов
«МАГНО-сорб»
(Проводится в ЗОНЕ 1 - помещении для обработки исследуемого материала).
Объем исследуемого материала для экстракции РНК - 1 мл или 0,2 мл.
ВНИМАНИЕ! Для работы с РНК необходимо использовать только одноразовые
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную
маркировку RNase-free, DNase-free.
Разморозить контрольные образцы, ВКО STI-AB-rec и калибраторы (в случае
необходимости процедуры калибровки). Перемешать на вортексе и осадить капли с
крышки пробирки кратковременным центрифугированием.
ВНИМАНИЕ! После размораживания контрольные образцы и калибраторы
необходимо использовать в течение 24 ч. Повторное замораживание/оттаивание не
допускается!
Порядок работы.
Экстракция РНК из 1 мл образца
1. Лизирующий раствор МАГНО-сорб и раствор для отмывки 5 прогреть при
температуре 60 °С до полного растворения кристаллов.
2. Подготовить необходимое количество одноразовых пробирок на 5 мл и
одноразовых крышек (включая отрицательный и положительные контроли
экстракции) и промаркировать их.
3. При экстракции РНК из 24 образцов:
а) во флакон с лизирующим раствором МАГНО-сорб (70 мл) внести все
содержимое пробирки с ВКО STi-AB-rec (0,3 мл) (ВКО), все содержимое
пробирки с компонентом А (0,6 мл) и все содержимое пробирки с
магнетизированной силикой (0,9 мл).
б) закрыть крышку флакона и аккуратно перемешать переворачиванием 5-7 раз,
избегая образования пены.
в) внести в пробирки объемом 5 мл по 2,6 мл подготовленной смеси
лизирующего раствора МАГНО-сорб, ВКО, компонента А и
магнетизированной силики.
4. П р и экстракции РНК менее чем из 24 образцов:
а) смешать в отдельной стерильной пробирке объемом 1,5 мл ВКО STI-AB-rec
(ВКО), компонент А и магнетизированную силику из расчета на одну точку
1!
--- стр. 19 ---
ЭКСТРАКЦИЯ РНК
10 мкл ВКО, 20 мкл компонента А и 30 мкл магнетизированной силики. При
расчете необходимо учитывать запас - рассчитывать на одну точку больше,
например;
Количество образцов
для экстракции РНК ВКО, мкл Компонент А; |йкл Магнетизированная
силика, мклЦ^
6 70 140 210
12 130 260 390
18 190 380 570
б) внести в пробирки объемом 5 мл по 60 мкл подготовленной смеси ВКО,
компонента А и магнетизированной силики.
в) внести в пробирки объемом 5 мл по 2,6 мл лизирующего раствора МАГНО-
сорб.
5. Добавить в каждую пробирку с лизирующим раствором 1 мл исследуемого
образца плазмы и перемешать пипетированием, закрыть крышкой.
6. Для каждой панели необходимо поставить верхний положительный контроль и
нижний положительный контроль. Для этого в промаркированную пробирку с
лизирующим раствором добавить по 1 мл соответствующего контрольного
образца (верхний ПКО ВИЧ или нижний ПКО ВИЧ), перемешать
пипетированием, закрыть крышкой.
7. Для каждой панели необходимо поставить отрицательный контроль (ОК). Для
этого в пробирку с лизирующим раствором добавить 1 мл ОКО, перемешать
пипетированием, закрыть крышкой.
ВНИМАНИЕ! В случае необходимости проведения калибровки требуется провести
экстракцию двух калибровочных образцов (калибратор А и калибратор В) не менее
чем в трех повторах каждый. Процедура экстракции калибраторов аналогична
процедуре экстракции исследуемых образцов.
8. Поместить пробирки в термостат с температурой 60 °С на 10 мин.
9. Перенести пробирки в магнитный штатив на 6 мин.
10. Отобрать надосадочную жидкость, используя наконечники без фильтра на
1000 мкл. Перенести пробирки в обычный штатив.
11. Добавить в пробирки по 700 мкл раствора для отмывки 5, пробирки закрыть
крышкой.
12. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл
(включая отрицательный и положительные контроли экстракции) и
промаркировать их.
13. Смыть магнетизированную силику со стенок осторожным вортексированием, а
19
--- стр. 21 ---
ЭКСТРАКЦИЯ РНК
(ВКО), компонент А и магнетизированную силику из расчета на одну точку:
10 мкл ВКО, 10 мкл компонента А и 20 мкл магнетизированной силики. При
расчете необходимо учитывать запас - рассчитывать на одну точку больше,
например:
Количество образцов для ВКО, мкл Компонент А, Магнетизированная
экстракции РНК мкл.. силика, мкл
6 70 70 140
12 130 130 260
18 190 190 380
24 250 250 500
4. Внести в пробирки по 40 мкл подготовленной смеси ВКО, компонента А и
магнетизированной силики.
5. Внести в пробирки 900 мкл лизирующего раствора МАГНО-сорб.
6. Добавить в каждую пробирку с лизирующим раствором 200 мкл исследуемого
образца плазмы и перемешать на вортексе.
7. Для каждой панели необходимо поставить верхний положительный контроль и
нижний положительный контроль. Для этого в лромаркированную пробирку с
лизирующим раствором добавить по 200 мкл соответствующего контрольного
образца (верхний ПКО ВИЧ или нижний ПКО ВИЧ) и перемешать на вортексе.
8. Для каждой панели необходимо поставить отрицательный контроль (ОК). Для
этого в промаркированную пробирку с лизирующим раствором добавить 200 мкл
ОКО и перемешать на вортексе.
ВНИМАНИЕ! В случае необходимости проведения калибровки требуется провести
экстракцию двух калибровочных образцов (калибратор А и калибратор В) не менее
чем в трех повторах каждый. Процедура экстракции калибраторов аналогична
процедуре экстракции исследуемых образцов.
9. Поместить пробирки в термостат с температурой 60 °С на 10 мин.
10. Кратким центрифугированием осадить капли и перенести пробирки в магнитный
штатив на 2 мин.
11. Отобрать надосадочную жидкость. Перенести пробирки в обычный штатив.
12. Добавить в пробирки по 700 мкл раствора для отмывки 5.
13. Смыть магнетизированную силику вортексированием, а затем осадить капли
кратким центрифугированием.
14. Поставить лробирки в обычный штатив, открыть крышки и переставить в
магнитный штатив. Инкубировать 2 мин.
15. Отобрать надосадочную жидкость и перенести пробирки в обычный штатив.
21
--- стр. 22 ---
ЭКСТРАКЦИЯ РНК
16. Повторить отмывку раствором для отмывки 5 {пп. 12-15).
17. Аналогично провести одну отмывку 700 мкл раствора для отмывки 6.
18. Добавить 200 мкл раствора для отмывки 7, перемешать, а затем осадить капли
на вортексе. Поставить пробирки в обычный штатив и открыть крышки.
19. Переставить пробирки в магнитный штатив на 1 мин, затем отобрать
надосадочную жидкость.
20. Высушить сорбент, оставив пробирки с открытыми крышками на магнитном
штативе, в течение 10 мин.
21. Добавить 100 мкл буфера для элюции и перемешать на вортексе.
22. Поместить пробирки в термостат при температуре 60 °С на 5 мин, через 2 мин
перемешать на вортексе.
23. Коротко осадить капли на вортексе и переставить пробирки в магнитный штатив.
Инкубировать 2 мин. Для отбора надосадочной жидкости без примеси
магнетизированной силики необходимо провернуть пробирки на 360° вокруг
своей оси, не снимая их с магнитного штатива. Надосадочная жидкость содержит
очищенные РНК.
ВНИМАНИЕ! Отбор очищенных РНК для проведения ОТ-ПЦР осуществляется без
снятия пробирок с магнитного штатива. Отбирать раствор РНК для реакции нужно
очень осторожно, не захватывая магнетизированную силику.
Пробы РНК не рекомендуется хранить дольше 30 мин при температуре от 2 до
8°С.
ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Экстракция РНК с использованием комплекта реагентов
«МАГНО-сорб» совместно с автоматическими станциями для экстракции
нуклеиновых кислот
(Проводится в ЗОНЕ 1 - помещении для обработки исследуемого материала).
Объем исследуемого материала для экстракции РНК - 1 мл или 0,2 мл.
ВНИМАНИЕ! Для работы с РНК необходимо использовать только одноразовые
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную
маркировку RNase-free, DNase-free.
Комплект реагентов «МАГНО-сорб» возможно использовать с открытыми
автоматическими станциями экстракции нуклеиновых кислот, использующими
принцип магнитных стержней для переноса магнитного сорбента. В этом случае,
программирование протокола экстракции осуществляется по инструкции
22
--- стр. 23 ---
[СТРАКЦИЯ РНК
оизводителя автоматической станции в соответствии с последовательностью
зпов, объемами реактивов и продолжительностью инкубаций, описанных выше в
иложении 1.
^ИЛОЖЕНИЕ 3. Экстракция РНК с использованием автоматической станции
ucliSENS easyMAG
1роводится в ЗОНЕ 1 - помещении для обработки исследуемого материала).
)бъем исследуемого материала для экстракции РНК - 1 мл или 0,2 мл.
1НИМАНИЕ! Для работы с РНК необходимо использовать только одноразовые
терильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную
ларкировку RNase-free, DNase-free.
Порядок работы
Зариант 1. Экстракция РНК из образца объемом 200 мкл и лизис образца вне
прибора.
Данный метод экстракции позволяет в 4 раза снизить расход буфера для лизиса.
1. Включить прибор NucliSENS easyMAG и подготовить его к экстракции РНК,
следуя инструкции к прибору.
2. В окне для ввода исследуемых образцов ввести для каждого образца следующие
параметры; название образца, материал {Matrix) для экстракции РНК - плазма
(Plasma), объем образца (Volume) - 0,2 ml, объем элюции (Eluate) - 100 mkl, тип
образца (Туре) - Lysed, очередность экстракции РНК в образцах (Priority) -
Normal.
3. Создать новый протокол экстракции РНК и сохранить его. В протоколе указать,
что лизис и инкубация образцов происходит вне прибора: On-board Lysis Buffer
Dispensing - No, On-board Lysis Incubation - No.
4. Перенести запрограммированные образцы в созданный протокол.
5. В ячейки картриджа, предназначенные для экстракции РНК в приборе NucliSENS
easyMAG, внести по 900 мкл буфера для лизиса.
6. В каждую ячейку добавить 200 мкл исследуемой плазмы отдельным
наконечником с фильтром, тщательно перемешать пипетированием.
7. Для каждой панели необходимо поставить отрицательный контроль (ОК) и два
положительных. Для отрицательного контроля в ячейку с буфером для лизиса
добавить 200 мкл ОКО. В пробирку, предназначенную для нижнего
положительного контроля, добавить 200 мкл нижнего ПКО ВИЧ. В ячейку,
23
--- стр. 24 ---
ЖСТРАКЦИЯ РНК
предназначенную для верхнего положительного контроля, добавить 200 мкл
верхнего ПКО ВИЧ. Тщательно перемешать пипетированием не менее 10 раз.
ВНИМАНИЕ! В случае необходимости проведения калибровки требуется провести
экстракцию двух калибровочных образцов (калибратор А и калибратор В) не менее
чем в трех повторах каждый. Процедура экстракции калибраторов аналогична
процедуре экстракции исследуемых образцов.
8. Оставить картридж с образцами на 10 мин при комнатной температуре для
прохождения лизиса.
9. Для экстракции РНК необходимо в отдельной стерильной пробирке объемом
1,5-2 мл смешать магнитную силику и ВКО STI-AB-rec стерильным
наконечником с фильтром в следующем соотношении:
Количество! образцов для
экстракции РНК
Количество магнитной-^
силики. мкл^"
Количество А
ВКО STI-AB-rec, мкл
1 20 10
24
(полная загрузка прибора)
500
(объем указан с запасом на
1 пробу)
250
Пробирку тщательно перемешать. Смесь магнитной силики и ВКО STI-AB-rec
хранится не более 30 мин.
10. Тщательно перемешать пробирку с приготовленной смесью магнитной силики и
ВКО STI-AB-rec на вортексе до однородного состояния. Добавить в каждую
ячейку отдельным наконечником по 30 мкл смеси. Каждую ячейку тщательно
перемешать пипетированием с помощью многоканального дозатора отдельными
наконечниками с фильтром на 200 мкл.
11. Загрузить картридж с образцами в прибор, установить наконечники, запустить
программу экстракции РНК с лизисом образцов вне прибора {Off board).
После окончания экстракции РНК, извлечь картридж из прибора. Пробы РНК не
рекомендуется хранить дольше 30 мин при температуре от 2 до 8 °С.
Вариант 2. Экстракция РНК из образца объемом 200 мкл или 1 мл с лизисом
образца в приборе
1. Включить прибор NucliSENS easyMAG и подготовить его к экстракции РНК,
следуя инструкции к прибору.
2. В окне для ввода исследуемых образцов ввести для каждого образца
следующие параметры; название образца, материал (Matrix) для экстракции
РНК - плазма (Plasma), объем образца (Volume) - 0,2 ml или 1 ml, объем
элюции (Eluate) - 100 mkl, тип образца (Туре) - Primary, очередность
24
--- стр. 25 ---
ЭКСТРАКЦИЯ РНК
экстракции РНК в образцах {Priority) - Normal.
3. Создать новый протокол экстракции РНК и сохранить его. В протоколе указать,
что лизис и инкубация образцов происходит в приборе: On-board Lysis Buffer
Dispensing - Yes, On-board Lysis Incubation - Yes.
4. Перенести запрограммированные образцы в созданный протокол.
5. В каждую ячейку картриджа, предназначенную для экстракции РНК в приборе
NucIiSENS easyMAG, необходимо добавить 200 мкл или 1 мл исследуемой
плазмы отдельным наконечником с фильтром.
6. Для каждой панели необходимо поставить отрицательный контроль (ОК) и два
положительных. Для отрицательного контроля в ячейку, предназначенную для
экстракции РНК в приборе NucIiSENS easyMAG, добавить 200 мкл или 1 мл
ОКО. В ячейку, предназначенную для нижнего положительного контроля,
добавить 200 мкл или 1 мл нижнего ПКО ВИЧ. В ячейку, предназначенную для
верхнего положительного контроля, добавить 200 мкл или 1 мл верхнего ПКО
ВИЧ. Тщательно перемешать пипетированием не менее 10 раз.
ВНИМАНИЕ! В случае необходимости проведения калибровки требуется провести
экстракцию двух калибровочных образцов (калибратор А и калибратор В) не менее
чем в трех повторах каждый. Процедура экстракции калибраторов аналогична
процедуре экстракции исследуемых образцов.
7. Загрузить пробирки с образцами в прибор, установить наконечники, запустить
программу экстракции РНК с лизисом образцов в приборе (On board).
8. Для экстракции РНК необходимо в отдельной стерильной пробирке объемом
1,5- 2 мл смешать магнитную силику и ВКО STI-AB-rec стерильным
наконечником с фильтром в следующем соотношении:
Количество образцов
для экстракции РНК
У Количество магнитно^ i ,
силики, мкл 7
Количество ^
ВКО STI-AB-rec, мкл
1 20 10
24
(полная загрузка прибора)
500
(объем указан с запасом
на 1 пробу)
250
Пробирку тщательно перемешать. Смесь магнитной силики и ВКО STI-AB-rec
хранится не более 30 мин.
9. Дождаться, пока автоматическая станция NucIiSENS easyMAG не остановит
работу в положении Instrument State-Idle (примерно через 15-20 мин).
10. Тщательно перемешать пробирку с приготовленной смесью магнитной силики и
ВКО STI-AB-rec на вортексе до однородного состояния. Открыть крышку прибора
25