Набор реагентов для выявления мутаций устойчивости вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) к антиретровирусным препаратам в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим массовым параллельным секвенированием продуктов амплификации "АмплиСенс® HIV-Resist-NGS" по ТУ 9398-240-01897593-2015 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 ---
«УТВЕРЖДАЮ»
Заместитель директора по
эпидемиологии - Врио директора
Федерального бюджетного учреждения
науки «Центральный научно-
исследовательский институт
эпидемиологии» Федеральной службы
по надзору защиты прав
потребителей^
человека
^благополучия
«/^ »
I
k v
I
ИНСТРУКЦИЯ
по применению набора реагентов
для выявления мутаций устойчивости вируса иммунодефицита
человека (ВИЧ-1) к антиретровирусным препаратам
в биологическом материале методом полимеразной цепной
реакции (ПЦР) с последующим массовым параллельным
секвенированием продуктов амплификации
«АмплиСенс® H/\/-Resist-NGS»
АмплиСенс
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора,
Российская Федерация, 111123,
город Москва, улица Новогиреевская, дом За IVD
--- стр. 2 ---
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................................................................ 3
НАЗНАЧЕНИЕ................................................................................................................................ 3
ПРИНЦИП МЕТОДА.....................................................................................................................4
ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ............................................................................5
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ...................................................................................6
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ .............................................................................7
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ И СВЕДЕНИЯ ОБ УТИЛИЗАЦИИ ..................................8
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ .................................................10
ВЗЯТИЕ. ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА.. 15
СОСТАВ.........................................................................................................................................16
ЭТАП 1. ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ........................................21
ЭТАП 2. РЕАКЦИЯ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ И АМПЛИФИКАЦИИ. I РАУНД....24
ЭТАП 3. АМПЛИФИКАЦИЯ. II РАУНД.................................................................................... 26
ЭТАП 4. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ ...............................................................27
A. Электрофоретическия детекция................................................................................... 27
Б. Учет результатов..............................................................................................................29
B. Оценка концентрации ДНК в исследуемых ПЦР-фрагментах ............... 31
Г. Выравнивание концентрации.........................................................................................32
Д. Подготовка ПЦР-продукта к очистке............................................................................33
ЭТАП 5. ОЧИСТКА ПЦР-ПРОДУКТА.......................................................................................34
ЭТАП 6. ИЗМЕРЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ПРОБ..................................................................36
ЭТАП 7. ТАГМЕНТАЦИЯ Д Н К..................................................................................................37
ЭТАП 8. ОЧИСТКА РЕАКЦИОННОЙ СМЕСИ ПОСЛЕ РЕАКЦИИ ТАГМЕНТАЦИИ ....38
ЭТАП 9. АМПЛИФИКАЦИЯ И ИНДЕКСАЦИЯ ДНК-БИБЛИОТЕК ...................... 39
ЭТАП 10. НОРМАЛИЗАЦИЯ ДНК-БИБЛИОТЕК...................................................................42
ЭТАП 11. ОЦЕНКА КОНЦЕНТРАЦИИ В СМЕШАННОМ ОБРАЗЦЕ ПОСЛЕ
НОРМАЛИЗАЦИИ С ПОМОЩЬЮ АМПЛИФИКАЦИИ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ
«РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ».......................................................................................................44
ЭТАП 12. ДЕНАТУРАЦИЯ БИБЛИОТЕК................................................................................47
ЭТАП 13. СЕКВЕНИРОВАНИЕ. ПОДГОТОВКА КАРТРИДЖА И ПРОТОЧНОЙ
ЯЧЕЙКИ MiSeq К РАБОТЕ. ЗАПУСК СЕКВЕНИРОВАНИЯ ..............................................49
ЭТАП 14. АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ.................................................49
СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ ......................51
СИМВОЛЫ. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ ...........................................53
стр. 2 из 53
--- стр. 3 ---
список СОКРАЩЕНИЙ
В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения
ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека 1 типа
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
кДНК - комплементарная ДНК
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
око - отрицательный контрольный образец
ок - отрицательный контроль экстракции
пко - положительный контрольный образец
ПК - положительный контроль экстракции
п.н. - пар нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии
Роспотребнадзора
- Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный
научно-исследовательский институт эпидемиологии»
Федеральной службы по надзору в сфере защиты
потребителей и благополучия человека
HIV - human immunodeficiency virus (вирус иммунодефицита
человека)
pro - protease (ген протеазы)
rev - reverse transcriptase (ген обратной транскриптазы
(ревертазы))
int - inteprase (ген интегразы)
env - envelope (ген белка оболочки)
NGS
- next-generation sequencing (секвенирование нового
(следующего) поколения); синонимы - массовое
параллельное секвенирование, высокопроизводительное
секвенирование
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов «АмплиСенс® H/V-Resist-NGS» предназначен для выявления
мутаций устойчивости ВИЧ к антиретровирусным препаратам в гене протеазы {pro),
гене обратной транскриптазы {rev), гене интегразы {int), гене белка др41 ВИЧ, а
также определения тропизма ВИЧ в биологическом материале (плазма крови)
методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим секвенированием
продуктов амплификации. Выявление мутаций устойчивости ВИЧ с использованием
данного набора может проводиться для ВИЧ-1 генетической группы М (субтипы А, В,
G, циркулирующие рекомбинантные формы 02_AG, 03_АВ).
Для выявления мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ данный набор
реагентов рекомендуется использовать, если концентрация РНК ВИЧ в плазме крови
более 1000 копий/мл.
Один набор рассчитан на тестирование 48 биологических образцов.
ВНИМАНИЕ! Набор реагентов «АмплиСенс® H/V-Resist-NGS» рекомендован для
проведения исследования с использованием прибора для секвенирования
стр. 3 из 53
--- стр. 5 ---
ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ
Набор реагентов выпускается в 3 формах комплектации:
Форма
комплектации Комплект реагентов/реагент Кол-во, шт.
«РИБО-золь-Е» 1
«Комплект для стабилизации РНК» 1
«ОТ-ПЦР-комплект-ВИЧ-NGS» 1
«ПЦР-комплект-ВИЧ-NGS» 1
«ЭФ NGS» 2
«Комплект для подготовки библиотек» 1
Форма 1 «Комплект для индексации библиотек» 1
«Комплект для нормализации и оценки качества
библиотек» 1
«Комплект для оценки концентрации библиотек» 1
«Комплект для массового параллельного
секвенирования, v2-500» 1
Комплект программного обеспечения «ДЕОНА
NGS» 1
«РИБО-золь-Е» 1
«Комплект для стабилизации РНК» 1
«ОТ-ПЦР-комплект-ВИЧ-NGS» 1
«ПЦР-комплект-ВИЧ-NGS» 1
«ЭФ NGS» 2
«Комплект для подготовки библиотек» 1
Форма 2 «Комплект для индексации библиотек» ■ 1
«Комплект для нормализации и оценки качества
библиотек» 1
«Комплект для оценки концентрации библиотек» 1
«Комплект для массового параллельного
секвенирования, v3-600» 1
Комплект программного обеспечения «ДЕОНА
NGS» 1
«РИБО-золь-Е» 1
«Комплект для стабилизации РНК» 1
Форма 3 «ОТ-ПЦР-комплект-ВИЧ-NGS» 1
«ПЦР-комплект-ВИЧ-NGS» 1
«ЭФ NGS» 2
Формы комплектации 1 и 2 предназначены для проведения полного
исследования и включают реагенты для экстракции нуклеиновых кислот из
биологического материала, реакции обратной транскрипции РНК и амплификации
методом ПЦР, электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном
геле, проведения очистки продуктов амплификации, для подготовки ДНК-библиотек,
постановки реакции секвенирования, биоинформационного анализа полученных
данных с выдачей формализованного отчёта о наличии лекарственной устойчивости
к антиретровирусной терапии.
Форма комплектации 3 предназначена для получения фрагментов ДНК,
содержащих кодирующую область генома ВИЧ, и включает реагенты для экстракции
стр. 5 из 53
--- стр. 6 ---
нуклеиновых кислот из биологического материала, реакции обратной транскрипции
РНК и амплификации методом ПЦР и электрофоретической детекции продуктов
амплификации в агарозном геле. Для проведения полного исследования
необходимо дополнительно использовать комплекты реагентов для подготовки ДНК-
библиотек и постановки реакции секвенирования рекомендованный производителем
используемого секвенатора.
ВНИМАНИЕ! Комплекты, рекомендованные производителем используемого
секвенатора, следует использовать в соответствии с инструкциями производителя.
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора не дает рекомендаций по
использованию коммерческих продуктов.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Для данного набора реагентов применимы следующие характеристики:
Аналитическая чувствительность
Таблица 1
Г .« " • > ' ' 1 -1 ? ” '
I j ° l ‘ .1 f '1
.
|‘ 1 и ' 1
'I i ..jTiili I J.j',’
11 и H f ^ ril 1
‘ 1 ll‘ III ^ 1 Ч .
iJ 'j
Плазма крови 1000 «РИБО-золь-Е» 1 1000
Данная чувствительность достигается при соблюдении правил, указанных в
разделах «Взятие, транспортирование и хранение исследуемого материала» и
«Подготовка исследуемого материала к экстракции РНК».
Аналитическая специфичность
Оценка аналитической специфичности набора реагентов проведена посредством
добавления в реакцию геномной ДНК/РНК следующих организмов и вирусов: HAV
(вирус гепатита А), HBV (вирус гепатита В), HCV (вирус гепатита С), HDV (вирус
гепатита D), CMV (цитомегаловирус), EBV (вирус Эпштейн-Барра), HSV^, HSV2
(вирус простого герпеса 1 и 2 типов), VZV (вирус ветряной оспы), HHV6 (вирус
герпеса 6 типа). Parvovirus В19, TBEV (вирус клещевого энцефалита), WNV (вирус
Западного Нила), Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, a также геномной
ДНК человека.
При тестировании образцов ДНК/РНК вышеперечисленных организмов и ДНК
человека неспецифических реакций выявлено не было.
стр. 6 из 53
--- стр. 7 ---
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Таблица 2
Результаты совместного тестирования набора реагентов
«АмплиСенс® H/V^Resist-NGS» и набора сравнения
Лекарственная
устойчивость
ВИЧ
Всего
исследовано
52070 точек
мутагенеза
Положительных"^ 582 0
Oтpицaтeльныx^ 0 51488
Тропизм ВИЧ
Всего
исследовано
142 образца
Положительных^ 22 0
Отрицательных^ 0 120
Были использованы 254 образца крови от пациентов с ВИЧ-инфекцией, имеющих
различный опыт приема АРВ препаратов: 1) не имеющие опыта приема АРВ
препаратов (134 образца): 2) имеющие опыт приема АРВ препаратов (120 образцов).
Среди пациентов, принимающих АРВ препараты, 27 имели опыт смены терапии, 93
не имели опыта смены терапии. В каждом образце были исследованы 205 точек
возможного появления мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ, таким образом,
общее количество исследованных точек составило 52070.
Таблица 3
Диагностические характеристики набора реагентов
«АмплиСенс^ H/V-Resist-NGS»
Лекарственная
устойчивость ВИЧ 99,6-100 99,9-100
Тропизм ВИЧ 90,1-100 98,1-100
^ в качестве набора сравнения использовался набор реагентов «АмплиСенс® H/\/-Resist-Seq» (РУ №
ФСР 2008/02414 от 26.06.2017)
^ Точки мутагенеза, в которых при анализе лекарственной устойчивости были выявлены мутации,
ассоциированные с возникновением лекарственной устойчивости ВИЧ, или образцы, в которых
выявлен тропизм вируса к СХСК4-корецепторам.
® Точки мутагенеза, в которых при анализе лекарственной устойчивости не были выявлены мутации,
ассоциированные с возникновением лекарственной устойчивости ВИЧ, или образцы, в которых
выявлен тропизм вируса к не-СХСР4-корецепторам.
^ Точки мутагенеза, в которых были выявлены мутации, ассоциированные с возникновением
лекарственной устойчивости ВИЧ.
® Точки мутагенеза, в которых не были выявлены мутации, ассоциированные с возникновением
лекарственной устойчивости ВИЧ.
® Образцы, в которых выявлен тропизм вируса к СХСК4-корецепторам.
^ Образцы, в которых выявлен тропизм вируса к не-СХСК4-корецепторам.
® Относительно использованного набора сравнения.
® Относительно использованного набора сравнения.
стр. 7 из 53
--- стр. 8 ---
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ И СВЕДЕНИЯ ОБ УТИЛИЗАЦИИ
Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно
биологические (ПЦР) исследования биологического материала на наличие
возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-
эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с
микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями
паразитарных болезней», СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические
требования к обращению с медицинскими отходами» и методических указаний МУ
1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы
амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим
микроорганизмы I-IV групп патогенности».
При работе необходимо всегда выполнять следующие требования:
- Рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные, организовывать
работу и хранение в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с
микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями
паразитарных болезней».
- Убирать и дезинфицировать разлитые образцы, используя дезинфицирующие
средства в соответствии СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с
микроорганизмами 1II-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями
паразитарных болезней».
- Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в
отдельных помещениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Экстракции
(зона 1), продолжать в Зонах Амплификации (зона 2) и Детекции (зона 3). Не
возвращать образцы, оборудование и реагенты в Зону, в которой была проведена
предыдущая стадия процесса.
- Неиспользованные реагенты, реагенты с истекшим сроком годности, а также
использованные реагенты, включая буфер и гели, упаковку, биологический
материал, включая материалы, инструменты и предметы, загрязненные
биологическим материалом, следует удалять в соответствии с требованиями
СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению
с медицинскими отходами».
ВНИМАНИЕ! При удалении отходов после амплификации (пробирок, содержащих
продукты ПЦР) недопустимо открывание пробирок и разбрызгивание содержимого,
поскольку это может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны,
оборудования и реагентов.
стр. 8 из 53
--- стр. 12 ---
II раунд амплификации (nested-ПЦР)
28.Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся
пробирки объемом 0,5 мл (например, Axygen, Inc. («Эксиджен, Инк»), США, или
аналогичные) для приготовления реакционной смеси.
29.Одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с плоской
крышкой (в зависимости от модели используемого амплификатора) (например,
Axygen, Inc. («Эксиджен, Инк»), США, или аналогичные).
30.Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до
100 и 200 мкл (например, Axygen, Inc. («Эксиджен, Инк»), США, или аналогичные).
31. Штативы для пробирок объемом 0,2 мл (в зависимости от типа используемых
пробирок) (например, Axygen, Inc. («Эксиджен, Инк»), США, или аналогичные).
32. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс) (например, «БАВ-ПЦР-
«Ламинар-С.», ЗАО «Ламинарные системы», Россия, или аналогичный).
33. Вортекс (например, SIA Biosan, Латвия, или аналогичный).
34. Автоматические дозаторы переменного объема (например, ООО «Биохит»,
Россия, или аналогичные).
35. Программируемый амплификатор (например, MaxyGene Gradient (Axygen,
Scientific Inc. («Эксиджен Саентифик, Инк»), США и другие рекомендованные
Производителем).
36. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 до минус 16 °С.
37.Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.2569-09.
38. Емкость для сброса наконечников.
ЗОНАЗ
Детекция продуктов амплификации методом электрофореза в агарозном геле
39. Камера для горизонтального электрофореза объёмом не более 400 мл
(например, SE-2, «Хеликон», Россия).
40. Источник постоянного тока с напряжением 150 - 460 В (например, «Эльф-4»,
«ДНК-Технология», Россия).
41. Ультрафиолетовый трансиллюминатор с кабинетом для просмотра гелей
(например, «Биоком», Россия).
42. Гель-документирующая система GelDoc-lt (например, UVP, LLC. («ЮВиПи, ЛЛС»),
США).
43. Система фильтрации и очистки воды качества МШЮ (например, «МИЛЛИПОР»,
Австрия).
44. Микроволновая печь для плавления агарозы.
стр. 12 из 53
--- стр. 13 ---
45. Колба коническая из термостойкого стекла (ГОСТ 21400-75) для плавления агарозы
на 250 мл.
46. Мерный цилиндр на 1 л (ГОСТ 1770-74).
47.Одноразовые нестрипованные полипропиленовые пробирки для ПЦР объемом
0,5 мл (например, Axygen, Inc., («Эксиджен, Инк»), США или аналогичные).
48. Штативы для пробирок объемом 0,5 мл (например, Axygen, Inc. («Эксиджен,
Инк»), США, или аналогичные).
49. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс) (например, «БАВ-ПЦР-
«Ламинар-С», ЗАО «Ламинарные системы», Россия, или аналогичный)
50. Автоматические дозаторы переменного объема (например, ООО «Биохит»,
Россия, или аналогичные).
51.Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до
200 мкл (например, Axygen, Inc. («Эксиджен, Инк»), США, или аналогичные).
52.Одноразовые пластиковые контейнеры для сброса и инактивации материалов.
53.Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.2569-09.
54. Емкость для сброса наконечников.
ЗОНАЗ
Подготовка к секвенированию
55.Оптические 96-луночные реакционные планшеты (например, Axygen, Inc.
(«Эксиджен, Инк»), США).
56.Оптические липкие крышки (например, например, Axygen, Inc. («Эксиджен, Инк»)
США).
57.Одноразовые полипропиленовые пробирки завинчивающиеся или плотно
закрывающиеся объемом 1,5 мл (например, Axygen, Inc. («Эксиджен, Инк»), США,
или аналогичные).
58.Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до 10,
100 и 200 мкл (например, Axygen, Inc. («Эксиджен, Инк»), США, или аналогичные).
59. Штативы для пробирок объемом 1,5 мл (например, Axygen, Inc. («Эксиджен,
Инк»), США, или аналогичные).
60. Магнитный штатив для пробирок типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл диаметром
12 мм.
61. Магнитный штатив для 96-луночных планшетов (например, DynaMag™-96 Bottom,
Thermo Fisher Scientific Inc., США).
62. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс) (например, «БАВ-ПЦР--
«Ламинар-С.», ЗАО «Ламинарные системы», Россия, или аналогичный).
стр. 13 из 53
--- стр. 14 ---
63. Вортекс (например, SIA Biosan, Латвия, или аналогичный).
64. Центрифуга с ротором для планшетов до 2 тыс д. (например, центрифуга 5804 с
ротором A-2-DWP, Eppendorf AG («Эппендорф АГ»), Германия).
бб.Шейкер для 9б-луночных планшетов, (например, мини-шейкер PSU-2T, SIA
Biosan, Латвия).
66. Автоматические дозаторы переменного объема, в том числе многоканальные (на
8 каналов) (например, ООО «Биохит», Россия, или аналогичные).
67. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 до минус 16 °С.
68.Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.2569-09.
69. Емкость для сброса наконечников.
При измерение концентрации проб
70. Спектрофотометр со специализированными кюветами для работы в УФ-
диапазоне или один из приборов NanoDrop (Thermo Fisher Scientific Inc., США),
Picodrop (Picodrop Limited, Великобритания).
71. Флуориметр, например. Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific Inc., США) c
использованием набора реагентов Qubit dsDNA HS Assay System или аналогичный.
При тагментаиии и амплисЬикаиии ДНК-библиотек
72. Программируемый амплификатор, адаптированный для пробирок 0,2 мл и 96-
луночные планшеты (например, GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems,
США), PalmCycler (Corbett Research, Австралия)).
При оценки качества ДНК-библиотек
73. Флюориметр (например. Qubit 3.0 (2.0) Fluorometer (Thermo Fisher Scientific Inc.,
США), NanoDrop (Thermo Fisher Scientific Inc., США)).
74. Биоанализатор (например. Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, США)).
75. Программируемый амплификатор с системой детекции флуоресцентного сигнала в
режиме «реального времени», имеющий 2 или более независимых каналов
флуоресцентной детекции (например, Rotor-Gene Q (QIAGEN GmbH («Киаген
ГмбХ»), Германия), CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Inc. («Био-Рад Лабораториз, Инк.»),
США) и другие рекомендованные Производителем).
Проведение реакции секвенирования, автоматическая детекция нуклеотидной
последовательности
76.Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до
100 мкл (например, Axygen, Inc. («Эксиджен, Инк»), США, или аналогичные).
77.Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс) (например, «БАВ-ПЦР-
«Ламинар-С.», ЗАО «Ламинарные системы», Россия, или аналогичный).
стр. 14 из 53
--- стр. 20 ---
Комплект реагентов «Комплект для оценки концентрации библиотек»
включает:
■ ■; 1 ifiij 1 .' 1 >
ПЦР-смесь-2-FRT Прозрачная бесцветная
жидкость 0.6 1 пробирка
Полимераза (TaqF) Прозрачная бесцветная
жидкость 0,02 1 пробирка
EvaGreen (20х) Прозрачная жидкость
оранжевого цвета 0,02 1 пробирка
ПЦР-смесь-FL Р5 / Р7 Прозрачная бесцветная
жидкость 0,25 1 пробирка
К+ NGS Прозрачная бесцветная
жидкость 0,01 1 пробирка
Н20 стерильная Прозрачная бесцветная
жидкость 1.8 1 пробирка
Комплект реагентов рассчитан на проведение исследования по оценки концентрации
одной библиотеки. Входит в состав форм комплектации 1, 2 (1 шт.).
Комплект реагентов «Комплект для массового параллельного секвенирования,
V2-500» включает;
NaOH, сухая навеска Таблетки белого цвета 0.4 г 1 флакон
Н20 стерильная Прозрачная бесцветная
жидкость 1,8 мл 4 пробирки
Набор буферов для
секвенирования MiSeq v2
Reagent Tray 500 cycles
Картридж, содержащий 14
лунок с прозрачной
бесцветной жидкостью, 4
пустые лунки, 2 лотка с
бесцветной жидкостью, 1
лоток с окрашенной
жидкостью
1 шт 1 картридж
Буфер HT1 Прозрачная бесцветная
жидкость 3,0 мл 1 флакон
Буфер PR2 Прозрачная бесцветная
жидкость 500 мл 1 бутылка
Проточная ячейка РЕ MiSeq
Flow Cell
Флакон, содержащий
прозрачную бесцветную
жидкость, в которую
погружена проточная
ячейка (пластина из
стекла и пластика)
Жидкость
16 мл
Пластина
48x26 мм
1 флакон
Комплект реагентов рассчитан на проведение массового параллельного
секвенирования 50 образцов. Входит в состав формы комплектации 1 (1 шт.).
стр. 20 из 53
--- стр. 21 ---
Комплект реагентов «Комплект для массового параллельного секвенирования,
V3-600» включает:
NaOH, сухая навеска Таблетки белого цвета 0,4 г 1 флакон
Н20 стерильная Прозрачная бесцветная
жидкость 1,8 мл 4 пробирки
Набор буферов для
секвенирования MiSeq v3
Reagent Tray 600 cycles
Картридж, содержащий 14
лунок с прозрачной
бесцветной жидкостью, 4
пустые лунки, 2 лотка с
бесцветной жидкостью, 1
лоток с окрашенной
жидкостью
1 шт 1 картридж
Буфер HT1 Прозрачная бесцветная
жидкость 3 мл 1 флакон
Буфер PR2 Прозрачная бесцветная
жидкость 500 мл 1 ' бутылка
Проточная ячейка РЕ MiSeq
Flow Cell
Флакон, содержащий
прозрачную бесцветную
жидкость, в которую
погружена проточная
ячейка(пластина из
стекла и пластика)
Жидкость
16 мл
Пластина
48x26 мм
1 флакон
Комплект реагентов рассчитан на проведение массового параллельного
секвенирования 50 образцов. Входит в состав формы комплектации 2 (1 шт.).
Комплект программного обеспечения «ДЕОНА NGS» (ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), предназначенный для определения
устойчивости ВИЧ к антиретровирусной терапии на основе секвенирования нового
поколения, включает:
1. Инсталляционный носитель информации с программным обеспечением «ДЕОНА
NGS» версия 1.0.0 (02/11/2015);
2. Руководство пользователя:
3. Инструкцию по установке (может быть записана на инсталляционный носитель
информации).
Входит в состав форм комплектации 1 и 2 (1 шт.).
ЭТАП 1. ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ
(проводится в ЗОНЕ 1 - помещении для обработки исследуемого материала)
ВНИМАНИЕ! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые
пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку «RNase-
стр. 21 из 53
--- стр. 22 ---
free», «DNase-free».
ВНИМАНИЕ! Рекомендуется проводить этапы экстракции, ОТ-ПЦР и II раунда ПЦР
одновременно для 16 исследуемых образцов и 2 контрольных образца (ПК и ОК).
Всего 18 проб на исследование.
Экстракция РНК из плазмы крови с помощью комплекта реагентов «РИБО>
золь-Е» и «Комплекта для стабилизации РНК».
Объем исследуемого материала для экстракции РНК -1 мл.
ВНИМАНИЕ! Перед началом процедуры экстракции поместить флакон с
раствором для отмывки 3 в морозильную камеру с температурой от минус 24
до минус 16 ‘’С, включить центрифугу с охлаждением и задать температуру от
2 до 8 ® С .
Порядок работы
1. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок объемом на 1,5 мл с
завинчивающимися или плотно закрывающимися крышками (включая
отрицательный (ОК) и положительный контроль экстракции (ПК)).
Промаркировать пробирки.
2. В пробирки для исследуемых образцов внести по 1 мл исследуемых образцов,
используя для каждой пробы отдельный наконечник с фильтром. Плотно закрыть
крышки, тщательно перемешать на вортексе.
3. Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге в течение 1 ч при скорости
центрифугирования не менее 24 тыс. g и температуре от 2 до 8 °С.
4. Во время центрифугирования образцов подготовить калибратор HIV-Q к работе
(используется для приготовления положительных контролей). Для этого осадить
на вортексе содержимое пробирки калибратор HIV-Q, аккуратно открыть крышку
и, избегая распыления содержимого, добавить 250 мкл растворителя Q. Плотно
закрыть пробирку и оставить ее на 15 мин при комнатной температуре (от 18 до
25 °С), периодически перемешивая на вортексе. После полного растворения
осадить содержимое пробирки калибратор HIV-Q на вортексе для сброса капель
с крышки.
5. После окончания ультрацентрифугирования, необходимо незамедлительно
удалить 800 мкл надосадочной жидкости и далее работать с осадком (200 мкл).
6. В пробирку положительного контроля экстракции (ПК) внести 10 мкл
растворенного калибратора HIV-Q и 190 мкл ОКО. В пробирку отрицательного
контроля экстракции (ОК) внести 200 мкл ОКО. Плотно закрыть крышки,
тщательно перемешать и затем осадить капли на вортексе. Остатки
стр. 22 из 53
--- стр. 23 ---
растворенного калибратора HIV-Q не хранить!
7. Во все пробирки добавить по 3 мкл 2-меркаптоэтанола из «Комплекта для
стабилизации РНК», используя отдельные наконечники с фильтром. Плотно
закрыть крышки, тщательно перемешать и затем осадить капли на вортексе.
8. Во все пробирки добавить по 200 мкл 0,05% раствора SDS из «Комплекта для
стабилизации РНК», используя отдельные наконечники с фильтром. Плотно
закрыть крышки, тщательно перемешать и затем осадить капли на вортексе.
9. Во все пробирки добавить по 400 мкл раствора D.
ВНИМАНИЕ! После добавления раствора D проба может раствориться не
полностью. Полное растворение происходит после добавления раствора Е и
раствора А.
10. Добавить в пробирки по 40 мкл раствора Е. Плотно закрыть крышки,
перемешать и затем осадить капли на вортексе.
11. Добавить в пробирки по 400 мкл раствора А. Плотно закрыть крышки,
перемешать и затем осадить капли на вортексе.
12. Добавить в пробирки по 130 мкл раствора В. Плотно закрыть крышки,
перемешать на вортексе в течение 15-20 с (раствор должен стать молочно-
белым).
13. Поставить пробирки в морозильную камеру с температурой от минус 24 до
минус 16 °С на 10 мин.
14. Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге в течение 10 мин при 10-
16 тыс. g (если количество пробирок нечетное, уравновесить центрифугу
пробиркой на 1,5 мл, содержащей примерно 1,0 мл воды). В процессе
центрифугирования раствор разделится на две фазы: нижнюю - фенольную,
содержащую белки и ДНК и верхнюю - водную, содержащую РНК.
15. Во время центрифугирования образцов отобрать необходимое количество
одноразовых пробирок объемом 1,5 мл с завинчивающимися или плотно
закрывающимися крышками (включая ОК и ПК). Внести в каждую пробирку по
500 мкл раствора С. 10 мкл тРНК 1 мкг/мкл (препарата нагрузочной РНК) и по
10 мкл гликогена 1%.
16. Из каждой пробирки с образцами после центрифугирования аккуратно отобрать
верхнюю фазу (приблизительно 700-750 мкл), используя для каждой пробы
отдельный наконечники с фильтром, и перенести в пробирки, срдержащие
раствор С, тРНК 1 мкг/мкл и гликоген 1%. Плотно закрыть крышки, перемешать
и затем осадить капли на вортексе.
стр. 23 из 53
--- стр. 24 ---
17. Поставить пробирки в морозильную камеру с температурой от минус 24 до
минус16 "С на 20 мин.
18. Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге в течение 10 мин при 10-
16 тыс. д. Визуально найти положение осадка РНК (если пробирка была
помещена в центрифугу «хвостиком» или меткой на крышке пробирки вверх, то
осадок после центрифугирования будет находиться на дне пробирки строго под
«хвостиком» или меткой). Аккуратно, не задевая осадок, удалить надосадочную
жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником без фильтра, используя
вакуумный отсасыватель. Если осадок не виден, отобрать надосадочную
жидкость, не касаясь стенок, оставив на дне пробирки примерно 20 мкл.
19. Добавить в пробирки по 800 мкл охлажденного при температуре от минус 24 до
минус 16 ® С раствора для отмывки 3, плотно закрыть крышки, перемешать на
вортексе.
20. Центрифугировать пробирки на микроцентрифуге в течение 10 мин при 10-
16 тыс. д. Аккуратно, не задевая осадок, удалить надосадочную жидкость,
используя отдельный наконечник на 1000 мкл для каждой пробы.
21. Поместить пробирки с открытыми крышками в термостат с температурой 56 ® С
на 5-7 мин для подсушивания осадка.
22. Добавить в пробирки по 50 мкл РНК-буфера и перемешать на вортексе.
Поместить пробирки в термостат с температурой 56 °С на 5 мин. Перемешать и
затем осадить капли на вортексе. Надосадочная жидкость содержит очищенную
РНК. Пробы готовы к постановке реакции обратной транскрипции и ПЦР.
Очищенная РНК может храниться при температуре не выше минус 68 °С в
течение года.
ЭТАП 2. РЕАКЦИЯ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ И АМПЛИФИКАЦИИ. I РАУНД
(проводится в ЗОНЕ 2 - помещении для проведения ПЦР)
ВНИМАНИЕ! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку
RNase-free, DNase-free.
Реакция ОТ-ПЦР I раунд проводится с помощью «ОТ-ПЦР-комплекта-ВИЧ-NGS»
Выбор пробирок для проведения ОТ-ПЦР зависит от используемого
амплификатора.
Для внесения в пробирки реагентов, проб ДНК/РНК и контрольных образцов
стр. 24 из 53
--- стр. 25 ---
используются одноразовые наконечники с фильтрами.
Общий объем реакции - 25 мкл, объем пробы РНК - 10 мкл.
1. Отобрать необходимое количество пробирок объемом 0,2 мл для ОТ-ПЦР
исследуемых и контрольных образцов.
2. Приготовить 4 реакционные смеси. Для этого для каждой смеси (ОТ-ПЦР-смесь-
1-А ВИЧ, ОТ-ПЦР-смесь-1-В ВИЧ, ОТ-ПЦР-смесь-1-С ВИЧ, ОТ-ПЦР-смесь-1-D
ВИЧ) смешать компоненты из расчета на 1 реакцию в следующем соотношении
(на примере приготовления смеси с использованием ОТ-ПЦР-смеси-1-А ВИЧ):
- 2 мкл ОТ-ПЦР-смеси-1-А ВИЧ,
- 13 мкл HI-FI Reaction Mix,
- 0,2 мкл HI-FI Enzyme Mix.
3. Внести в каждую пробирку по 15 мкл подготовленной реакционной смеси.
4. Промаркировать пробирки.
5. Подготовить пробирки с экстрагированной РНК, предназначенной для проведения
исследования. В случае хранения пробирок их необходимо встряхнуть и осадить
на вортексе.
6. В подготовленные пробирки внести по 10 мкл проб РНК, полученных в результате
экстракции из исследуемых или контрольных образцов. Осторожно перемешать
пипетированием.
7. Запрограммировать амплификатор для выполнения соответствующей программы
амплификации (см. табл. 4).
Таблица 4
Программа ОТ-ПЦР кодирующей области генома ВИЧ
94
94
50
68
68
4-10
2 мин
15с
30 с
3 мин 30 с.
7 мин
30
хранение
8. Установить пробирки в ячейки амплификатора и запустить программу
амплификации.
9. После окончания реакции пробирки отправить в специальный бокс для проведения
реакции Nested-ПЦР. Бокс должен быть снабжен отдельным комплектом
лабораторной одежды, автоматических дозаторов, вспомогательных материалов
стр. 25 из 53
--- стр. 27 ---
амплификации.
7. После окончания реакции пробирки отправить в помещение для детекции
продуктов амплификации и проведения реакции секвенирования (ЗОНУ 3).
Пробы после амплификации можно хранить в течение 3 сут при температуре от
2 до 8 °С, в течение 1-2 мес при температуре от минус 24 до минус 16 °С.
ЭТАП 4. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ
(проводится В ЗОНЕ 3 - помещении для детекции продуктов амплификации в
ПЦР-боксе или в вытяжном шкафу при наличии в нем локального источника
УФ-света).
ВНИМАНИЕ! Работа с амплифицированной ДНК должна проводиться в отдельной
комнате сотрудником лаборатории, не производящим в этот день манипуляций в
зоне 1 и зоне 2.
Учет результатов и оценка концентрации полученных ПЦР-фрагментов
проводится методом электрофореза в агарозном геле с помощью комплекта
реагентов «ЭФ NGS».
А. Электрофоретическия детекция
Объем ПЦР-продукта - 5 мкл.
ВНИМАНИЕ! Для внесения реагентов и продуктов амплификации используются
одноразовые наконечники с фильтрами.
ВНИМАНИЕ! До начала работы разморозить, тщательно перемешать на вортексе
маркер молекулярных масс, буфер для нанесения образцов, осадить капли с
крышек пробирок.
1. Приготовить рабочий электрофорезный буфер. В мерный цилиндр влить 25 мл
трис-боратного буфера (ТБЕ) концентрированного с бромидом этидия,
довести дистиллированной водой до 500 мл, закрыть цилиндр парафильмом и
перемешать.
ВНИМАНИЕ! Бромид этидия - соединение, обладающее репродуктивной и острой
токсичностью, поэтому при работе с ним следует соблюдать правила безопасности:
работать только в перчатках, избегать попадания на кожу и слизистые, при
попадании на кожу или слизистые тщательно промыть соответствующий участок
водой.
2. Агарозу из одного флакона пересыпать в стеклянную колбу из термостойкого
стекла на 250 мл. Налить 100 мл рабочего буфера, перемешать вращением
колбы и плавить в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Время
стр. 27 из 53
--- стр. 28 ---
плавления агарозы в микроволновой печи мощностью 800 Вт при ее
загруженности 1 колбой - 1,5 мин. Если в микроволновую печь мощностью 800 Вт
ставится 5 колб с агарозой, время плавления увеличивается до 5 мин. Вынуть
колбу с расплавленной агарозой из микроволновой печи, аккуратно перемешать,
вращая колбу. После этого вновь поместить колбу с агарозой в микроволновую
печь на 1,5 мин (при мощности 800 Вт), довести агарозу до кипения. Вынуть колбу
из микроволновой печи и остудить агарозу, вращая колбу, до температуры 65-
70 °С
3. Выровнять столик для заливки гелей, залить расплавленный гель в форму камеры
для горизонтального электрофореза. Установить гребенки, не касаясь дна
формы, на расстоянии не менее 3 см друг от друга. Толщина геля должна быть
около 0,6 см.
4. После полного застывания геля (30 мин при комнатной температуре), осторожно
вынуть из него гребенки, не повредив лунки. Поместить подложку с готовым
гелем в камеру для горизонтального электрофореза, лунки должны
располагаться ближе к отрицательному электроду (ДНК будет мигрировать к
положительному электроду). Залить в камеру для горизонтального
электрофореза ранее приготовленного буфера (см. п. 1) столько, чтобы он
покрывал гель на 5 мм сверху.
5. Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок на 0,5 мл с учетом
количества исследуемых и контрольных образцов. Промаркировать пробирки.
6. Внести на дно промаркированных пробирок по 5 мкл буфера для нанесения
образцов.
7. В подготовленные пробирки с буфером для нанесения образцов внести по 5 мкл
ПЦР-продукта согласно маркировке, используя для каждого образца отдельный
наконечник. Тщательно перемешать и осадить на вортексе. Оставшийся объем
ПЦР-продукта поместить в холодильник и хранить при температуре от минус 24
до минус 16 °С до следующего этапа работы (проведение реакции тагментации).
8. Аккуратно внести 5 мкл маркера молекулярных масс в первую лунку геля. Для
правильной оценки концентрации амплифицированных образцов маркер
молекулярных масс должен быть обязательно представлен в каждом ряду
дорожек геля. Избегать перетекания маркера в соседние лунки.
9. Аккуратно внести весь объем подготовленной смеси ПЦР-продукта с
буфером для нанесения образцов в свободные лунки геля, используя для
стр. 28 из 53
--- стр. 29 ---
каждого образца отдельный наконечник. Избегать перетекания образцов в
соседние лунки.
10. Для каждого амплифицируемого фрагмента (А, В, С и D) должны быть
обязательно представлены контрольные образцы ОК, ПК. Аналогично
исследуемым образцам приготовить смесь контрольных образцов с буфером
для нанесения образцов и внести в свободные лунки геля. Для более точного
учета результатов контрольные и исследуемые образцы по каждому
амплифицируемому фрагменту рекомендуется располагать на одном ряду.
11. Подключить камеру к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК движется к
положительному электроду), и включить источник. Если нет нарушения контактов,
то при прохождении тока от электродов должны подниматься пузырьки.
Оптимальное напряжение электрического поля 10 В/см.
12. По завершении времени электрофореза (краситель ксиленцианол при этом
пройдет примерно половину длины геля (~ 1,5 см)) выключить источник тока и
перенести гель на трансиллюминатор. Получить изображение геля на
компьютере с помощью видеосистемы, отметив порядок нанесения.
ВНИМАНИЕ! При просматривании геля и фотографировании глаза и лицо
должны быть защищены маской или стеклянной пластиной!
13. Последовательно провести:
а) учет результатов в контрольных и исследуемых образцах,
б) оценку концентрации в исследуемых образцах.
Б. Учет результатов
Учет результатов проводится по наличию или отсутствию на электрофореграмме
специфических полос амплифицированных фрагментов А, В, С и D ДНК вируса
иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1).
Длины полученных специфических полос амплифицированных фрагментов ДНК в
исследуемых образцах должны соответствовать длинам соответствующих
фрагментов ДНК контрольных образцов.
Учет результатов в к о н т р о л ь н ы х образцах
Провести визуальное сравнение размеров специфических полос
амплифицированных фрагментов ДНК в дорожках с положительными контролями с
маркером молекулярных масс. Характеристика полос маркера молекулярных масс
приведена в табл. 6.
стр. 29 из 53
--- стр. 30 ---
Таблица 6
Характеристика маркера молекулярных масс
Верхняя 10 42
2 8 42
3 6 50
4 5 42
5 4 33
6 3 125
7 2 48
8 1.5 36
9 1 42
10 0,5 42
Результат считается достоверным, если получены правильные результаты для
положительного и отрицательного контролей экстракции, в соответствии с табл. 7. В
дорожках, соответствующих отрицательным контролям этапа экстракции, не должно
быть никаких полос.
Таблица 7
Оценка результатов анализа контрольных образцов
',1 .Tifisn It" ri
ОК Экстракция РНК, ОТ-ПЦР Нет
ПК Экстракция РНК, ОТ-ПЦР Есть
Результаты анализа не подлежат учету в следующих случаях:
1. Для положительного контроля экстракции (ПК) не выявляется специфическая
светящаяся полоса на соответствующем уровне (для любого из фрагментов А
и/или В и/или С и/или D). Это может свидетельствовать об ошибках, допущенных
на этапе экстракции нуклеиновых кислот и/или постановках ОТ-ПЦР и 11-го раунда
ПЦР. Необходимо повторить исследование для всех образцов, в которых не
обнаружены специфические полосы, начиная с этапа экстракции РНК для тех
фрагментов, для которых положительный контроль был отрицательным.
Например, если в положительном контроле на фрагмент А отсутствует
специфическая полоса, необходимо повторить исследование на фрагмент А для
всех исследуемых образцов, оказавшихся отрицательными по этому фрагменту.
2. Для отрицательного контроля экстракции (ОК) выявляется светящаяся полоса.
Вероятна контаминация лаборатории фрагментами амплификации или
стр. 30 из 53
--- стр. 31 ---
контаминация реагентов, исследуемых образцов на каком-либо этапе ПЦР-
исследования. Необходимо предпринять меры по выявлению и ликвидации
источника контаминации и повторить исследование для всех образцов, в которых
обнаружен специфический фрагмент РНК, начиная с этапа экстракции РНК.
Учет результатов в исследуемых образцах
1. Образцами, подходящими для секвенирования, считаются образцы, которые
содержат специфические светящиеся полосы большей или меньшей
интенсивности на уровнях, соответствующих уровням фрагментов ДНК
контрольных образцов (см. табл. 8).
Таблица 8
Молекулярные массы амплифицируемых фрагментов ДНК
I - А ь О Г Т Я ' ' ' ' i yj у ” . ' ' У : ' У JJв'1; IУS-. > и i ’ 1 1 . Ш , M l 1 .) 1 - , ,и f 1 / 1
Фрагмент А 2343 1
Фрагмент В 2618
Фрагмент С 2566
Фрагмент D 2620
ВНИМАНИЕ! Наличие «шмера» и дополнительных неспецифических фрагментов
амплификации над или под специфической полосой не влияет на качество сиквенса.
2. Для образцов, которые не содержат специфических светящихся полос на
необходимом уровне и имеют вирусную нагрузку в пределах аналитической
чувствительности набора реагентов, необходимо провести повторное
исследование, начиная с первого этапа анализа (экстракция РНК), Если при
повторном исследовании образцы вновь не содержат специфических светящихся
полос на необходимом уровне, то по этим образцам выдается результат «не
определено по причине низкой вирусной нагрузки».
В. Оценка концентрации ДНК в исследуемых ПЦР-фрагментах
Концентрация ДНК в каждом исследуемом образце определяется путем
сравнения интенсивности свечения специфических полос образцов с
интенсивностью свечения полос маркера молекулярных масс.
Для примера на рис. 1 представлен результат электрофореза образцов имеющих
различные концентрации ДНК.
стр. 31 из 53
--- стр. 35 ---
6. Используя восьмиканальный дозатор внести в первые 48 ячеек плашки № 3 по
25 мкл продуктов амплификации из соответствующих лунок плашки № 2,
используя одноразовые отдельные наконечники с фильтрами.
ВНИМАНИЕ! Строго соблюдать смену наконечников при переходе от одного ряда к
другому.
7. Аккуратно перемешать пипетированием, не допуская появления пузырьков
воздуха около 5-10 раз.
8. Инкубировать плашку № 3 на рабочем столе в течение 5 мин при комнатной
температуре (от 18 до 25 °С).
9. Плашку № 2 с остатком образцов накрыть адгезивной пленкой и хранить при
температуре от минус 24 до минус 16 °С или удалить в контейнер для сброса.
10. Поместить плашку № 3 на магнитный штатив.
ВНИМАНИЕ! Далее все процедуры до п. 19 проводятся строго на магнитном
штативе!
11. Выдержать плашку № 3 на магнитном штативе в течение 5 мин, либо до полного
осаждения частиц.
12. Отобрать супернатант из ячеек, не касаясь наконечником магнитных частиц.
13. Используя восьмиканальный дозатор добавить в каждую ячейку по 200 мкл
Раствора для отмывки 3.
14. Инкубировать плашку № 3 на магнитном штативе в течение 30 сек при
комнатной температуре (от 18 до 25 °С).
15. Отобрать супернатант из ячеек, не касаясь наконечником магнитных частиц.
16. Повторить пункты 13-15.
17. Высушить магнитные частицы в течение 5-10 мин при комнатной температуре
(от 18 до 25 °С).
18. Снять плашку с магнитного штатива.
19. В каждую используемую ячейку внести по 25 мкл НгО стерильной, затем
аккуратно перемешать пипетированием около 5-10 раз.
20. Инкубировать плашку № 3 на рабочем столе в течение 5 мин при комнатной
температуре (от 18 до 25 °С).
21. Поместить плашку № 3 на магнитный штатив на 5 мин, либо до полного
осаждения частиц.
22. Подготовить плашку № 4 к работе. Разметить первые 48 ячеек.
стр. 35 из 53
--- стр. 36 ---
23. Не снимая плашку № 3 с магнитного штатива, перенести из ячеек плашки № 3 по
21 мкл элюата в соответствующие ячейки плашки № 4 не касаясь наконечником
магнитных частиц.
24. Удалить использованную плашку № 3 в контейнер для сброса.
25. Перейти к следующему этапу, либо закрыть плашку № 4 адгезивной пленкой и
хранить при температуре от 2 до 8 °С, не более 5 дней, а при температуре от
минус 24 до минус 16 °С - длительное время.
ЭТАП 6. ИЗМЕРЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ПРОБ
(проводится в ЗОНЕ 3)
ВНИМАНИЕ! Работа с амплифицированной ДНК должна проводиться в отдельной
комнате сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в зоне 1 и зоне 2 .
Успешное окончание исследования во многом зависит от точности измерения
количества и качества ДНК в образцах, полученных в результате проведения данного
этапа работ.
Оценку измерения количества и качества ДНК в образцах, полученных в результате
проведения данного этапа работ, можно осуществлять различными способами, в
зависимости от возможностей лаборатории.
Оценка количества ДНК в образцах
Для количественной оценки библиотеки ДНК рекомендуется использовать
флуориметрические методы, специфичные для двухцепочечной ДНК, например. Qubit
3.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific Inc., США) c использованием набора реагентов
Qubit dsDNA HS Assay System или аналогичный. При этом рекомендуется использовать
2 мкл каждого образца ДНК и 198 мкл рабочего раствора Qubit.
Не рекомендуются методы, которые измеряют общее количество нуклеиновых
кислот, например методы, основанные на измерении поглощения в УФ-диапазоне,
такие как Nanodrop.
Оценка качества ДНК в образцах
Для оценки качества образцов рекомендуется использовать приборы, позволяющие
произвести оценку отношение поглощения образца при 260 нм к поглощению при
280 нм, например Nanodrop (Thermo Fisher Scientific Inc., США) или аналогичный. Для
подготовки образцов к секвенированию с использованием набора реагентов
«АмплиСенс® H/\/-Resist-NGS», они должны обладать следующими характеристиками
(см табл. 10 ).
стр. 36 из 53
--- стр. 37 ---
Допустимые характеристики образцов для секвенирования
Таблица 10
Концентрация образца
Отношение поглощений А 260/280 нм
2-15000 нг/мкл
1.7-2,1
ЭТАП 7. ТАГМЕНТАЦИЯ ДНК
(проводится в ЗОНЕ 3)
ВНИМАНИЕ! Работа с амплифицированной ДНК должна проводиться в отдельной
комнате сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в зоне 1 и зоне 2 .
1. Разморозить Буфер ТрМ-А (5х) и Буфер ТрМ-В в течение 10-15 мин.
2. Аккуратно перемешать на вортексе Буфер ТрМ-А (5х) и Буфер ТрМ-В в течение
1 мин, осадить содержимое пробирок на вортексе.
3. Разморозить смесь ТрМ. Осадить содержимое пробирок на вортексе.
4. В пробирку с смесью ТрМ добавить 250 мкл буфера ТрМ-А (5х).
5. Подготовить плашку № 4 к работе. Если плашка хранились в холодильнике, то
необходимо центрифугировать плашку при 280 g в течение 1 мин.
6 . Аккуратно снять адгезивную пленку с поверхности плашки.
7. Подготовить новую плашку № 5 к работе. Разметить первые 48 ячеек.
8. Внести в 48 ячеек плашки № 5 из соответствующих лунок плашки № 4 объем
элюата, содержащий 50 нгДНК.
ВНИМАНИЕ! Строго соблюдать смену наконечников при переходе от одного ряда к
другому.
9. Довести объем элюата в каждой ячейки плашки № 5 до 17,5 мкл НгО
стерильной.
10. Внести в каждую из используемых ячеек плашки № 5 по 7,5 мкл приготовленной
смеси ТрМ с буфером ТрМ-А (5х).
11. Выставить значение объема на восьмиканальной пипетке 25 мкл и аккуратно
перемешать пипетированием 10 раз образцы в плашке № 5.
ВНИМАНИЕ! Строго соблюдать смену наконечников при переходе от одного ряда к
другому.
12.Закрыть плашку № 5 адгезивной пленкой.
13.Немедленно поместить плашку № 5 в амплификатор, запрограммированный для
выполнения следующей программы (см.табл 1 1):
стр. 37 из 53
--- стр. 38 ---
Таблица 11
Программа реакции тагментации
14. Вынуть плашку № 5 из амплификатора. Немедленно удалить адгезивную пленку с
поверхности плашки и внести в каждую ячейку плашки № 5 по 1 мкл буфера
ТрМ-В.
ВНИМАНИЕ! Время между окончанием инкубации и внесением во все лунки буфера
ТрМ-В не должно превышать 10 мин.
15. Аккуратно перемешать образцы в плашке № 5 пипетированием, не допуская
появления пузырьков воздуха около 10 раз с помощью восьмиканальной пипетки.
ВНИМАНИЕ! Строго соблюдать смену наконечников при переходе от одного ряда к
другому.
16. Перейти к следующему этапу, либо закрыть Плашку № 5 адгезивной пленкой и
хранить при температуре от 2 до 8 ®С, не более 5 дней, а при температуре от
минус 24 до минус 16 °С - длительное время.
ЭТАП 8. ОЧИСТКА РЕАКЦИОННОЙ СМЕСИ ПОСЛЕ РЕАКЦИИ ТАГМЕНТАЦИИ
(проводится в ЗОНЕ 3)
ВНИМАНИЕ! Работа с амплифицированной ДНК должна проводиться в отдельной
комнате сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в зоне 1 и зоне 2 .
1. Ресуспендировать магнитные частицы Х-Риге>1, интенсивно перемешивая на
вортексе в течение 1-2 минут до гомогенного состояния.
2. В каждую используемую ячейку плашки № 5 отдельным наконечником внести по
47 мкл X-Pure-1, перемешать пипетированием около 5-10 раз.
3. Инкубировать плашку № 5 на рабочем столе в течение 5 мин при комнатной
температуре (от 18 до 25 °С).
4. Поместить плашку на магнитный штатив.
ВНИМАНИЕ! Далее все процедуры до п. 11 проводятся на магнитном штативе. Не
удалять плашку со штатива!
5. Выдержать плашку № 5 на магнитном штативе в течение 5 мин либо до полного
осаждения частиц.
6 . Отобрать супернатант из ячеек, не касаясь наконечником магнитных частиц.
стр. 38 из 53
--- стр. 43 ---
16. Ресуспендировать магнитные частицы X-Pure-2, интенсивно перемешивая на
вортексе в течение 1-2 минут до гомогенного состояния.
17. В первые 48 ячеек плашки № 9 внести по 12 мкл ресуспендированных X-Pure-2.
18. Внести в первые 48 ячеек плашки № 9 по 28 мкл надосадочной жидкости из
соответствующих ячеек плашки № 8, используя одноразовые отдельные
наконечники с фильтрами.
19. Выставить значение объема на восьмиканальном дозаторе равным 40 мкл, и,
используя одноразовые наконечники, аккуратно перемешать пипетированием, не
допуская появления пузырьков воздуха около 10-15 раз.
20. Плашку № 8 с остатком образцов накрыть адгезивной пленкой, убрать в
холодильную камеру и хранить при температуре от минус 24 до минус 16 °С или
удалить в контейнер для сброса.
21. Инкубировать плашку № 9 на рабочем столе в течение 10 мин, при комнатной
температуре (от 18 до 25 °С) перемешивая пипетированием через каждые
2 минуты, при помощи восьмиканального дозатора.
22. Подготовить 2 отдельные одноразовые пробирки объемом 1,5 мл.
23.Объединить первые 24 образца из плашки № 9 в первую пробирку, отобрав по
40 мкл каждого из исследуемых образцов, затем аккуратно объединить во второй
пробирке по 40 мкл каждого из оставшихся 24 образцов.
24. Поместить пробирки на магнитный штатив.
ВНИМАНИЕ! Далее все процедуры до п. 31 проводятся на магнитном штативе. Не
удалять пробирки со штатива!
25. Выдержать пробирки на магнитном штативе в течение 10 мин, либо до полного
осаждения частиц с открытыми крышками.
26.Отобрать супернатант из каждой пробирки, не касаясь наконечником магнитных
частиц, и удалить в контейнер для сброса.
27. Добавить в каждую пробирку по 1200 мкл раствора для отмывки 3.
28. Инкубировать содержимое пробирок на магнитном штативе в течение 1 мин.
29.Отобрать супернатант из каждой пробирки, не касаясь наконечником магнитных
частиц, и удалить в контейнер для сброса.
30. Повторить пункты 27-29.
31. Снять пробирки с магнитного штатива.
32. Высушить магнитные частицы в течение 5 мин при комнатной температуре (от
18 до 25 °С).
стр. 43 из 53
--- стр. 44 ---
33. в каждую пробирку внести по 20 мкл Н2О стерильной и аккуратно перемешать
содержимое пробирки пипетированием около 10-15 раз.
34. Инкубировать содержимое пробирок в течение 5 мин при комнатной
температуре (от 18 до 25 °С).
35. Поместить пробирки на магнитный штатив.
36. Выдержать пробирки на магнитном штативе в течение 5 мин, либо до полного
осаждения частиц с открытыми крышками.
37. Перенести в одну новую одноразовую пробирку объемом 1.5 мл по 18 мкл
надосадочной жидкости из каждой пробирки, находящейся на магнитном штативе.
Хранить полученную библиотеку от минус 24 до минус 16 °С. Данная смесь может
храниться в течение 3 недель при температуре от минус 20 до минус 15 °С.
ЭТАП 11. ОЦЕНКА КОНЦЕНТРАЦИИ В СМЕШАННОМ ОБРАЗЦЕ ПОСЛЕ
НОРМАЛИЗАЦИИ С ПОМОЩЬЮ АМПЛИФИКАЦИИ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ
«РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ»
(проводится в ЗОНЕ 3)
1. Произвести количественную оценку концентрации полученной библиотеки.
Для проведения количественной оценки рекомендуется использовать
флуориметрические методы, специфичные для двухцепочечной ДНК, например.
Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific Inc., США) c использованием набора
реагентов Qubit dsDNA HS Assay System. При этом рекомендуется использовать
2 мкл каждого образца ДНК и 198 мкл рабочего раствора Qubit.
2. Произвести оценку средней длины фрагментов полученной библиотеки.
Для проведения оценки качества полученной библиотеки рекомендуется
использовать автоматическую станцию, основанную на методе гель-
электрофореза (например. Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, США).
3. Произвести расчет молярной концентрации библиотеки с помощью
специализированных программ либо по формуле:
Q[nM] = m[ng] х 10^ / Mw [kDa] х 649
Где Mw - средняя длина библиотеки [кОа]
4. Довести концентрацию полученной библиотеки до 4 нМ с помощью Н 2О
стерильной.
5. Приготовить разведение полученной библиотеки с концентрацией 40 пМ. Для
этого в новую пробирку объемом 1,5 мл добавить 2 мкл полученной библиотеки и
198 мкл Н2О стерильной.
стр. 44 из 53
--- стр. 45 ---
6. Приготовить разведение полученной библиотеки с концентрацией 4 пМ. Для этого
в новую пробирку объемом 1,5 мл добавить 10 мкл полученного разведения
библиотеки 40 пМ и 90 мкл НгО стерильной.
7. Разморозить К+ NGS в течение 5-10 мин.
8. Приготовить разведения К+ NGS:
- К+ NGS 100 пМ. Для этого в новую пробирку объемом 1,5 мл добавить 2 мкл
К+ NGS и 198 мкл НгО стерильной. Аккуратно перемешать пипетированием
около 10-15 раз.
- К+ NGS 10 пМ. Для этого в новую пробирку объемом 1,5 мл добавить 10 мкл
полученного разведения К+ NGS 100 пМ и 90 мкл НгО стерильной. Аккуратно
перемешать пипетированием около 10-15 раз.
- К+ NGS 1 пМ. Для этого в новую пробирку объемом 1,5 мл добавить 10 мкл
полученного разведения К+ NGS 10 пМ и 90 мкл НгО стерильной. Аккуратно
перемешать пипетированием около 10-15 раз.
9. Разморозить ПЦР-смесь-РЬ-Р5 / Р7, ПЦР-смесь-2-FRT, EvaGreen (20х) в
течение 5-10 мин.
10. В отдельной пробирке объемом 1,5 мл смешать последовательно реагенты:
- ПЦР-смесь-2-FRT 100 мкл
- Полимераза (TaqF) 10 мкл
- EvaGreen (20х) 18 мкл
- ПЦР-смесь-FL Р5 / Р7 200 мкл
1 1.Отобрать 18 пробирок (объемом 0,2 мл) для амплификации исследуемых и
контрольных образцов в соответствии со схемой 5.
Схема 5
Обозначение Вносимый образец Количество пробирок
1 К- 3
2 К+ NGS 100 пМ 3
3 K+NGS100 пМ 3
4 К+ NGS1 пМ 3
5 Образец 40 пМ 3
6 Образец 4 пМ 3
12. Внести в каждую пробирку по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.
13. В подготовленные пробирки с соответствующими обозначениями внести:
- в три пробирки с надписью 1 (К-) внести 10 мкл НгО стерильной,
- в три пробирки с надписью 2 внести 10 мкл К+ NGS 100 пМ,
- в три пробирки с надписью 3 внести 10 мкл К+ NGS 10 пМ,
стр. 45 из 53
--- стр. 51 ---
СРОК годности. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ и ХРАНЕНИЯ
Срок годности. 12 мес. Набор реагентов с истекшим сроком годности применению
не подлежит. Срок годности вскрытых реагентов соответствует сроку годности,
указанному на этикетках для невскрытых реагентов, если в инструкции не указано
иное.
Транспортирование. Набор реагентов транспортировать при температуре от 2 до
8 °С не более 5 сут в термоконтейнерах, содержащих хладоэлементы, всеми видами
крытых транспортных средств. При получении разукомплектовать в соответствии с
указанными температурами хранения.
Хранение. Комплекты реагентов «РИБО-золь-Е», «Комплект для стабилизации
РНК», «Комплект для нормализации и оценки качества библиотек», хранить при
температуре от 2 до 8 °С. Калибратор HIV-Q, растворитель Q и тРНК 1 мкг/мкл (из
комплекта реагентов «РИБО-золь-Е») хранить температуре от минус 24 до
минус 16 °С.
Комплекты реагентов «ОТ-ПЦР-комплект-ВИЧ-NGS», «ПЦР-комплект-ВИЧ-NGS»,
«Комплект для подготовки библиотек», «Комплект для индексации библиотек»,
«Комплект для оценки концентрации библиотек» хранить при температуре от
минус 24 до минус 16 °С. Х-Риге-1, раствор для отмывки 3 (из комплекта реагентов
«Комплект для подготовки библиотек») хранить при температуре от 2 до 8 °С.
Комплекты реагентов «Комплект для массового параллельного секвенирования, v2-
500», «Комплект для массового параллельного секвенирования, v3-600» хранить при
температуре от 2 до 8 '’С. «Набор буферов для секвенирования MiSeq v2 Reagent
Tray 500 cycles», «Набор буферов для секвенирования MiSeq v3 Reagent Tray 600
cycles» и «Буфер НТ1» хранить при температуре от минус 24 до минус 16 °С.
Комплект реагентов «ЭФ NGS», а также с инсталляционный носитель информации с
ПО «ДЕОНА NGS» хранить при температуре от 18 до 25 °С в защищенном от света
месте. Маркер молекулярных масс, буфер для нанесения образцов, Н20 стерильная
(из комплекта реагентов «ЭФ NGS») хранить при температуре от минус 24 до минус
16 "С. Реагенты X-Pure-1 и раствор для отмывки 3 (из комплекта реагентов «ЭФ
NGS»), хранить при температуре от 2 до 8 ”0.
ВНИМАНИЕ! Не допускается замораживание/оттаивание реагентов из «Комплекта
для подготовки библиотек», «Комплекта для массового параллельного
секвенирования, v2-500», «Комплект для массового параллельного секвенирования,
V3-600».
стр. 51 из 53
--- стр. 52 ---
ГАРАНТИЙНЫЕ ОБЯЗАТЕЛЬСТВА ПРОИЗВОДИТЕЛЯ
Производитель гарантирует соответствие основных параметров и характеристик
набора реагентов, требованиям, указанным в технической и эксплуатационной
документации, в течение указанного срока годности при соблюдении всех условий
транспортирования, хранения и применения.
Рекламации на качество набора реагентов «АмплиСенс® H/V-Resist-NGS»
направлять по адресу 111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, дом ЗА, e-mail:
cs@pcr.ru''''.
При выявлении побочных действий, не указанных в инструкции по применению
набора реагентов, нежелательных реакций при его использовании, фактов и
обстоятельств, создающих угрозу жизни и здоровью граждан и медицинских
работников при применении и эксплуатации набора реагентов, рекомендуется
направить сообщение по адресу, указанному выше, и в уполномоченную
государственную регулирующую организацию (в РФ - Федеральная служба по
надзору в сфере здравоохранения) в соответствии с действующим
законодательством.
Заведующий НПЛ ОМДиЭ
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзор
Главный врач ФГБУЗ ГЦГ и Э ФМБА Pocci
Е.Н. Родионова
С.А. Богдан
Отзывы и предложения о продукции «АмплиСенс» вы можете оставить, заполнив анкету
потребителя на сайте: www.amDlisens.ru.
стр. 52 из 53
--- стр. 53 ---
СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ
Содержимого
REF Номер по каталогу
V
достаточно для
проведения П ;
1— 1
количества тестов
LOT Код партии Использовать до
Медицинское изделие
для диагностики in vitro
■ ■
Обратитесь к
инструкции поIVD □и применению
Не допускать
воздействияVER Дата изменения
1
H i
А
Температурный
диапазон
Изготовитель
Осторожно! Обратитесь
к инструкции по
применению
гО
солнечного света
Дата изготовления
стр. 53 из 53
--- стр. 54 ---
--- стр. 55 ---
111123. Москва, ул. Новогиреевская За тел. (495) 974-96-46. Факс : (495) 305-54-23. e-mail: obtk(5)Dcr.ru
ПАСПОРТ КАЧЕСТВА
Набора реагентов для выявления мутаций устойчивости вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-
1) к антиретровирусным препаратам в биологическом материале методом полимеразной цепной
реакции (ПЦР) с последующим массовым параллельным секвенированием продуктов
амплификации
«АмплиСенс*^ H/V-Resist-NGS»
ФБУН «ЦЕНТРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ»
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Форма 1 LOT 10.11.16
10.11.16
10.11.17
ТУ 9398-240-01897593-2015.
Комплектность, упаковка и маркировка набора указанной серии соответствуют требованиям ТУ.
1. Технические характеристики:
Наименование показателя Норма Результаты контроля
Образцы контрольной панели
«РНК вируса иммунодефицита
человека типа 1» с концентрацией
порядка 10^, 10“, 10^ копий/мл
Наличие специфических светящихся полос,
соответствующих амплифицированным фрагментам А, В,
С и D ДНК вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-
1) на уровне фрагментов ДНК маркера молекулярных масс
(фрагмент А - 2343 п.н., фрагмент В - 2618 п.н., фрагмент
С - 2566 п.н., фрагмент D - 2620 п.н.)
соответствует
Образцы контрольной панели
«РНК вируса иммунодефицита
человека типа 1» с концентрацией
порядка 10®, 10“, 10® копий/мл
Для форм комплектации 1 и 2
Определена нуклеотидная последовательность,
удовлетворяющая условиям валидности, описанные в
инструкции к набору реагентов
соответствует
Положительный контроль
экстракции (ПК) - Калибратор H IV -Q
Наличие специфических светящихся полос,
соответствующих размеров: фрагмент А - 2343 п.н.,
фрагмент В - 2618 п.н., фрагмент С - 2566 п.н., фрагмент
D - 2620 п.н. при электрофоретической детекции
соответствует
Отрицательный контроль
экстракции (ОК) - ОКО
Отсутствие специфических светящихся полос при
электрофоретической детекции
соответствует
2. Состав, внешний вид:
Наименование реагента /
комплекта реагентов Характеристика и нормы Результаты
контроля
В составе формы
комплектации
Раствор А Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Раствор В Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Раствор С Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Раствор D Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Раствор Е Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Раствор для отмывки 3 Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
РНК-буфер Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
тРНК 1 мкг/мкл Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Гликоген 1% Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Калибратор H IV -Q Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Растворитель Q Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
ОКО Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Раствор А Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
2-меркаптоэтанол Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
0,05% раствор SDS Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
ОТ-ПЦР-смесь-1-АВИЧ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
ОТ-ПЦР-смесь-1-В ВИЧ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
ОТ-ПЦР-смесь-1-С ВИЧ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Форма 1: REF NG-V0-F-1-S; Форма 2: REF NG-V0-F-2-S; Форма 3: REF NG-V0-F-3-S
--- стр. 56 ---
Наименование реагента /
комплекта реагентов Характеристика и нормы Результаты
контроля
В составе формы
комплектации
ОТ-ПЦР-смесь-1-D ВИЧ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
HI-FI Reaction Mix Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
HI-FI Enzyme Mix Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
ПЦР-смесь-1-А ВИЧ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
ПЦР-смесь-1-В ВИЧ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
ПЦР-смесь-1-С ВИЧ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
ПЦР-смесь-1-D ВИЧ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Q5 буфер Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Q5 полимераза Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Трис-боратный буфер (ТБЕ)
концентрированный с бромидом
этидия
Прозрачная жидкость оранжевого цвета соответствует 1 2 3
Агароза для электрофореза ДНК Порошок белого цвета соответствует 1 2 3
Маркер молекулярных масс Прозрачная жидкость синего цвета соответствует 1 2 3
Буфер для нанесения образцов Прозрачная жидкость синего цвета соответствует 1 2 3
Н20 стерильная Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
X-Pure-1
Прозрачная бесцветная жидкость,
содержащая мелкодисперсные частицы
бурого цвета
соответствует 1 2 3
Раствор для отмывки 3 Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Смесь ТрМ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Буфер ТрМ-А (5х) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Буфер ТрМ-В Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Н20 стерильная Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Q5 полимераза Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Q5 буфер Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
дНТФ(1,76тМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
X-Pure-1
Прозрачная бесцветная жидкость,
содержащая мелкодисперсные частицы
бурого цвета
соответствует 1 2
Раствор для отмывки 3 Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №701 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №702 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №703 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №704 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №705 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №706 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №501 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №502 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №503 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №504 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №505 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №506 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №507 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №508 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Раствор для отмывки 3 Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
X-Pure-1
Прозрачная бесцветная жидкость,
содержащая мелкодисперсные частицы
бурого цвета
соответствует 1 2
X-Pure-2
Прозрачная бесцветная жидкость,
содержащая мелкодисперсные частицы
бурого цвета
соответствует 1 2
Н20 стерильная Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
ПЦР-смесь-2-FRT Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Форма 1: REF NG-V0-F-1-S; Форма 2: REF NG-V0-F-2-S; Форма 3: |REF| NG-V0-F-3-S
--- стр. 57 ---
Наименование реагента /
комплекта реагентов Характеристика и нормы Результаты
контроля
В составе формы
комплектации
Полимераза(TaqF) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
EvaGreen (20х) Прозрачная жидкость оранжевого цвета соответствует 1 2
ПЦР-смесь-FL Р5 / Р7 Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
К+ NGS Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Н20 стерильная Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
NaOH, сухая навеска Таблетки белого цвета соответствует 1 2
Н20 стерильная Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Набор буферов для
секвенирования MiSeq v2 Reagent
Tray 500 cycles
Картридж, содержащий 14 лунок с
прозрачной бесцветной жидкостью, 4
пустые лунки, 2 лотка с бесцветной
жидкостью, 1 лоток с окрашенной
жидкостью
соответствует 1
Набор буферов для
секвенирования MiSeq v3 Reagent
Tray 600 cycles
Картридж, содержащий 14 лунок с
прозрачной бесцветной жидкостью, 4
пустые лунки, 2 лотка с бесцветной
жидкостью, 1 лоток с окрашенной
жидкостью
соответствует 2
Буфер HT1 Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Буфер PR2 Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Проточная ячейка РЕ MiSeq Flow
Cell
Флакон, содержащий прозрачную
бесцветную жидкость, в которую погружена
проточная ячейка (пластина из стекла и
пластика)
соответствует 1 2
3. Условия транспортирования и хранения:
Транспортирование. Набор реагентов транспортировать при температуре от 2 до 8 °С не более 5 сут. При
получении разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения.
Хранение.
Комплекты реагентов «РИБО-золь-Е», «Комплект для стабилизации РНК», «Комплект для нормализации и
оценки качества библиотек», хранить при температуре от 2 до 8 °С. Калибратор HIV-Q, растворитель Q и
тРНК 1 мкг/мкл (из комплекта реагентов «РИБО-золь-Е») хранить температуре от минус 24 до минус 16 °С.
Комплекты реагентов «ОТ-ПЦР-комплект-ВИЧ-NGS», «ПЦР-комплект-ВИЧ-NGS», «Комплект для
подготовки библиотек», «Комплект для индексации библиотек», «Комплект для оценки концентрации
библиотек» хранить при температуре от минус 24 до минус 16 °С. Х-Риге-1, раствор для отмывки 3 (из
комплекта реагентов «Комплект для подготовки библиотек») хранить при температуре от 2 до 8 °С.
Комплекты реагентов «Комплект для массового параллельного секвенирования, v2-500», «Комплект для
массового параллельного секвенирования, v3-600» хранить при температуре от 2 до 8 °С. «Набор
буферов для секвенирования MiSeq v2 Reagent Tray 500 cycles», «Набор буферов для секвенирования
MiSeq v3 Reagent Tray 600 cycles» и «Буфер НТ1» хранить при температуре от минус 24 до минус 16 °С.
Комплект реагентов «ЭФ NGS», а также с инсталляционный носитель информации с ПО «ДЕОНА NGS»
хранить при температуре от 18 до 25 °С в защищенном от света месте. Маркер молекулярных масс,
буфер для нанесения образцов, Н20 стерильная (из комплекта реагентов «ЭФ NGS») хранить при
температуре от минус 24 до минус 16 °С. Реагенты Х-Риге-1 и раствор для отмывки 3 (из комплекта
реагентов «ЭФ NGS»), хранить при температуре от 2 до 8 °С.
ВНИМ АНИЕ! Не допускается замораживание/оттаивание
библиотек», «Комплекта для массового параллельного
массового napajp^;qf(f?^)[i:g'C^KBeHHpoBa v3-600».
реагентов из «Комплекта
секвенирования, v2-500».
для подготовки
«Комплект для
Дата вы,
Руководи (Наумкина Е.М .)
(Ф.И.О.)
Форма 1: REF NG-V0-F-1-S; Форма 2; |REF| NG-V0-F-2-S; Форма 3: |REF| NG-V0-F-3-S
--- стр. 58 ---
1 I i - ; l p u l l l И ^ ' l Ч ) l ' . . : M C ^ l ! Р К р с Р -
’ ' ‘ ' I . . I ’ ’
i;c 'iP.i bip ^ ..........^ ^ '
гЬУИ ЦНИШпидсмио.-м.'МГ,!
:Ма:к
- ■^ O'JZ- -'ui-s ’
111'Ц L~.Sp1
(V
•V
4>. * f
TN
--- стр. 59 ---
111123. Москва, ул. Новогиреевская За тел. (495) 974-96-46. Факс : (495) 305-54-23. e-mail: obtk@pcr.ru
ПАСПОРТ КАЧЕСТВА
Набора реагентов для выявления мутаций устойчивости вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-
1) к антиретровирусным препаратам в биологическом материале методом полимеразной цепной
реакции (ПЦР) с последующим массовым параллельным секвенированием продуктов
амплификации
«АмплиСенс'^ W/V-Resist-NGS»
ФБУН «центральный научно -исследовательскии институт эпидемиологии »
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Форма 2 LOT 11.11.16
(^11.11.16
11.11.17
ТУ 9398-240-01897593-2015.
Комплектность, упаковка и маркировка набора указанной серии соответствуют требованиям ТУ.
1. Технические характеристики:
Наименование показателя Норма Результаты контроля
Образцы контрольной панели
«РНК вируса иммунодефицита
человека типа 1» с концентрацией
порядка 10®, 10“*, 10® копий/мл
Наличие специфических светящихся полос,
соответствующих амплифицированным фрагментам А, В,
С и D ДНК вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-
1) на уровне фрагментов ДНК маркера молекулярных масс
(фрагмент А - 2343 п.н., фрагмент В -2618 п.н., фрагмент
С - 2566 П.Н., фрагмент D - 2620 п.н.)
соответствует
Образцы контрольной панели
«РНК вируса иммунодефицита
человека типа 1» с концентрацией
порядка 10®, Ю'', 10® копий/мл
Для форм комплектации 1 и 2
Определена нуклеотидная последовательность,
удовлетворяющая условиям валидности, описанные в
инструкции к набору реагентов
соответствует
Положительный контроль
экстракции (ПК) - Калибратор H IV -Q
Наличие специфических светящихся полос,
соответствующих размеров: фрагмент А - 2343 п.н.,
фрагмент В -2618 п.н., фрагмент С - 2566 п.н., фрагмент
D - 2620 п.н. при электрофоретической детекции
соответствует
Отрицательный контроль
экстракции (ОК) - ОКО
Отсутствие специфических светящихся полос при
электрофоретической детекции
соответствует
Наименование реагента /
комплекта реагентов Характеристика и нормы Результаты
контроля
В составе формы
комплектации
Раствор А Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Раствор В Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Раствор С Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Раствор D Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Раствор Е Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Раствор для отмывки 3 Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
РНК-буфер Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
тРНК 1 мкг/мкл Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Гликоген 1% Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Калибратор H IV -Q Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Растворитель Q Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
ОКО Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Раствор А Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
2-меркаптоэтанол Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
0,05% раствор SDS Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
ОТ-ПЦР-смесь-1-АВИЧ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
ОТ-ПЦР-смесь-1-В ВИЧ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
ОТ-ПЦР-смесь-1-С ВИЧ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Форма 1: REF NG-V0-F-1-S; Форма 2: |REF| NG-V0-F-2-S; Форма 3: |REF| NG-V0-F-3-S
--- стр. 60 ---
Наименование реагента /
комплекта реагентов Характеристика и нормы Результаты
контроля
В составе формы
комплектации
ОТ-ПЦР-смесь-1-D ВИЧ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
HI-FI Reaction Mix Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
HI-FI Enzyme Mix Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
ПЦР-смесь-1-АВИЧ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
ПЦР-смесь-1-В ВИЧ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
ПЦР-смесь-1-С ВИЧ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
ПЦР-смесь-1-D ВИЧ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Q5 буфер Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Q5 полимераза Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Трис-боратный буфер (ТБЕ)
концентрированный с бромидом
этидия
Прозрачная жидкость оранжевого цвета соответствует 1 2 3
Агароза для электрофореза ДНК Порошок белого цвета соответствует 1 2 3
Маркер молекулярных масс Прозрачная жидкость синего цвета соответствует 1 2 3
Буфер для нанесения образцов Прозрачная жидкость синего цвета соответствует 1 2 3
Н20 стерильная Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
X-Pure-1
Прозрачная бесцветная жидкость,
содержащая мелкодисперсные частицы
бурого цвета
соответствует 1 2 3
Раствор для отмывки 3 Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2 3
Смесь ТрМ Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Буфер ТрМ-А (5х) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Буфер ТрМ-В Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Н20 стерильная Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Q5 полимераза Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Q5 буфер Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
дНТФ (1,76 тМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
X-Pure-1
Прозрачная бесцветная жидкость,
содержащая мелкодисперсные частицы
бурого цвета
соответствует 1 2
Раствор для отмывки 3 Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №701 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №702 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №703 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №704 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №705 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №706 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №501 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №502 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №503 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №504 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №505 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №506 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №507 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Индекс праймер №508 (5 пМ) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Раствор для отмывки 3 Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
X-Pure-1
Прозрачная бесцветная жидкость,
содержащая мелкодисперсные частицы
бурого цвета
соответствует 1 2
X-Pure-2
Прозрачная бесцветная жидкость,
содержащая мелкодисперсные частицы
бурого цвета
соответствует 1 2
Н20 стерильная Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
ПЦР-смесь-2-FRT Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Форма 1; REF NG-V0-F-1-S; Форма 2: RER NG-V0-F-2-S; Форма 3: |REF| NG-V0-F-3-S
--- стр. 61 ---
Наименование реагента /
комплекта реагентов Характеристика и нормы Результаты
контроля
в составе формы
комплектации
Полимераза(TaqF) Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
EvaGreen (20х) Прозрачная жидкость оранжевого цвета соответствует 1 2
ПЦР-смесь-FL Р5 / Р7 Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
К+ NGS Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Н20 стерильная Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
NaOH, сухая навеска Таблетки белого цвета соответствует 1 2
Н20 стерильная Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Набор буферов для
секвенирования MiSeq v2 Reagent
Тray 500 cycles
Картридж, содержащий 14 лунок с
прозрачной бесцветной жидкостью, 4
пустые лунки, 2 лотка с бесцветной
жидкостью, 1 лоток с окрашенной
жидкостью
соответствует 1
Набор буферов для
секвенирования MiSeq v3 Reagent
Тray 600 cycles
Картридж, содержащий 14 лунок с
прозрачной бесцветной жидкостью, 4
пустые лунки, 2 лотка с бесцветной
жидкостью, 1 лоток с окрашенной
жидкостью
соответствует 2
Буфер НТ1 Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Буфер PR2 Прозрачная бесцветная жидкость соответствует 1 2
Проточная ячейка РЕ MiSeq Flow
Cell
Флакон, содержащий прозрачную
бесцветную жидкость, в которую погружена
проточная ячейка (пластина из стекла и
пластика)
соответствует 1 2
3. Условия транспортирования и хранения:
Транспортирование. Набор реагентов транспортировать при температуре от 2 до 8 °С не более 5 сут. При
получении разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения.
Хранение.
Комплекты реагентов «РИБО-золь-Е», «Комплект для стабилизации РНК», «Комплект для нормализации и
оценки качества библиотек», хранить при температуре от 2 до 8 °С. Калибратор HIV-Q, растворитель Q и
тРНК 1 мкг/мкл (из комплекта реагентов «РИБО-золь-Е») хранить температуре от минус 24 до минус 16 °С.
Комплекты реагентов «ОТ-ПЦР-комплект-ВИЧ-NGS», «ПЦР-комплект-ВИЧ-NGS», «Комплект для
подготовки библиотек», «Комплект для индексации библиотек», «Комплект для оценки концентрации
библиотек» хранить при температуре от минус 24 до минус 16 °С. Х-Риге-1, раствор для отмывки 3 (из
комплекта реагентов «Комплект для подготовки библиотек») хранить при температуре от 2 до 8 °С.
Комплекты реагентов «Комплект для массового параллельного секвенирования, v2-500», «Комплект для
массового параллельного секвенирования, v3-600» хранить при температуре от 2 до 8 °С. «Набор
буферов для секвенирования MiSeq v2 Reagent Tray 500 cycles», «Набор буферов для секвенирования
MiSeq v3 Reagent Tray 600 cycles» и «Буфер НТ1» хранить при температуре от минус 24 до минус 16 °С.
Комплект реагентов «ЭФ NGS», а также с инсталляционный носитель информации с ПО «ДЕОНА NGS»
хранить при температуре от 18 до 25 °С в защищенном от света месте. Маркер молекулярных масс,
буфер для нанесения образцов, Н20 стерильная (из комплекта реагентов «ЭФ NGS») хранить при
температуре от минус 24 до минус 16 °С. Реагенты X-Pure-1 и раствор для отмывки 3 (из комплекта
реагентов «ЭФ NGS»), хранить при температуре от 2 до 8 °С.
ВНИМАНИЕ! Не допускается замораживание/оттаивание
библиотек», «Комплекта для массового параллельного
массового паралдет|(( 5:5Р9у<:^квенирования, v3-600».
Дата вы,
реагентов из «Комплекта
секвенирования, v2-500».
для подготовки
«Комплект для
Руководи (Наумкина Е.М.)
(Ф.И.О.)
Форма 1; REF NG-V0-F-1-S; Форма 2: REF| NG-V0-F-2-S; Форма 3: |REF| NG-V0-F-3-S
--- стр. 62 ---
--- стр. 63 ---
111123. Москва, ул. Новогиреевская ЗА тел. (495)-974-96-42. Факс (495)-305-54-23. e-mail: obtk@Pcr.ru
ФБУН «ЦЕНТРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ»
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
ПАСПОРТ КАЧЕСТВА
Набора реагентов для определения тропизма и выявления мутаций устойчивости вируса
иммунодефицита человека (ВИЧ-1) к антиретровирусным препаратам в клиническом материале методом
полимеразной целной реакции (ПЦР) с последующим секвенированием продуктов амплификации
«Ампл иСенс® H/\AResist-Seq»
Форма 4 LOT 25.12.16 2016-12-25
2017-12-25
ТУ 9398-013-01897593-2011
Комплектность, упаковка и маркировка набора указанной серии соответствуют требованиям ТУ.
Наименование показателя Норма Результаты
контроля
Образцы контрольной панели производства ВИЧ с
концентрациями РНК ВИЧ-1 порядка 10®, Ю'', 10®
копий/мл
Появление специфических светящихся
полос на электрофореграмме*
соответствует
Разведение образца контрольной панели
производства ВИЧ с концентрацией РНК ВИЧ-1
порядка 10® копий/мл до концентрации 500 копий/мл
(при экстракции из 200 мкл) или до концентрации
100 копий/мл (при экстракции из 1000 мкл)
Появление специфических светящихся
полос на электрофореграмме*.
Результат может быть получен для
трех повторов из четырех
соответствует
Лейкоциты крови от ВИЧ-инфицированных доноров
(при тестировании форм комплектации 3, 4, 7 и 8)
Появление специфической светящейся
полосы на электрофореграмме,
соответствующей фрагменту гена
белка оболочки (env) на уровне 799 п.н.
соответствует
Лейкоциты крови от ВИЧ-негативных доноров с
добавлением СОП ПКО ДНК ВИЧ-1 в концентрации
500 ГЭ/мл (при тестировании форм комплектации 3,
4, 7 и 8)
Появление специфической светящейся
полосы на электрофореграмме,
соответствующей фрагменту гена
белка оболочки (env) на уровне 799 л.н.
соответствует
Высококонцентрированный положительный
контроль (ВПК)
Появление специфических светящихся
полос на электрофореграмме*
соответствует
Низкоконцентрированный положительный контроль
(НПК)
Появление специфических светящихся
полос на электрофореграмме*
соответствует
Отрицательный контроль экстракции (ОК) Отсутствие специфических полос соответствует
* соответствующих фрагментам генов протеазы (pro) (на уровне 570 п.н.), интегразы (inf) (на уровне 1085 п.н.),
обратной транскриптазы (rev) (на уровне 765 п.н.) и белка оболочки (env) (на уровне 424 п.н.)
Допускается появление неспецифических продуктов амплификации в виде шмеров или дополнительных полос,
если при этом целевой ампликон хорошо отличим, и интенсивность (яркость) щмеров и дололнительных полос не
превышает интенсивность целевого ампликона.
2. Состав, внешний вид:
Наименование реагента /
комплекта реагентов
Характеристика и нормы Результаты
контроля
В составе формы
комплектации
Раствор А Прозрачная вязкая жидкость
желтого цвета соответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
Раствор В Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
Раствор С Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
Раствор D Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
Раствор Е Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
Раствор для отмывки 3 Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
РНК-буфер Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
тРНК 1 мкг/мкл Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
Гликоген 1% Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
Форма 1; |REF| TM-V0-50-F-1-S, Форма 2: |REFJ TM-V0-50-F-2-S, Форма 3; |REF TM-V0-50-F-3-S,
Форма 4: |REf| TM-V0-50-F-4-S, Форма 5: |r^TM-V0-50-F-5, Форма 6: |r^TM-V0-50-F-6,
Форма 7:| re3 TM-V0-50-F-7, Форма 8: |rBf1 TM-V0-50-F-8
--- стр. 64 ---
Наименование реагента /
комплекта реагентов
Характеристика и нормы Результаты
контроля
В составе формы
комплектации
Калибратор HIV-Q Порошок желтого цвета соответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
Растворитель Q Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
ОКО Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
Раствор для лизиса Прозрачная жидкость голубого
цвета соответствует 3 4 7 8
Раствор для преципитации Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 3 4 7 8
Раствор для отмывки 4 Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 3 4 7 8
РНК-буфер Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 3 4 7 8
ПКО ДНК ВИЧ-1 Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 3 4 7 8
Гемолитик Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 3 4 7 8
ОТ-ПЦР-смесь-1 Pro/Rev Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 4 5 6 8
ОТ-П ЦР-смесь-2-504 Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
RT-G-mix-1 Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
Полимераза(TaqF) Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
ТМ-Ревертаза (MMIv) Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
ПЦР-смесь-1 Pro Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 4 5 6 8
ПЦР-смесь-1 Rev Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 4 5 6 8
ОТ-ПЦР-смесь-2-FL Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
ОТ-ПЦР-смесь-1 Int Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 2 4 6 8
ПЦР-смесь-1 Int Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 2 4 6 8
ОТ-ПЦР-смесь-1 Env Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 3 4 7 8
ПЦР-смесь-1 Env Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 3 4 7 8
Лизирующий раствор Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
Раствор для отмывки 2 Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
Сорбент Суспензия белого цвета соответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
НгО стерильная Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
Трис-боратный буфер (ТБЕ)
концентрированный с
бромидом этидия
Прозрачная жидкость оранжевого
цвета соответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
Агароза для электрофореза
ДНК Порошок белого цвета соответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
Праймер Рго-1 Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 4 5 6 8
Праймер Рго-2 Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 4 5 6 8
Праймер Rev-1 Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 4 5 6 8
Праймер Rev-2 Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 4 5 6 8
Праймер Rev-3 Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 4 5 6 8
Праймер Rev-4 Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 4 5 6 8
Маркер молекулярных массПрозрачная жидкость синего
цвета соответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
Буфер для нанесения
образцов
Прозрачная жидкость синего
цвета соответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
Раствор F Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
Раствор для денатурации Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 3 4 5 6 7 8
Праймер lnt-1 Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 2 4 6 8
Праймер lnt-2 Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 2 4 6 8
Праймер lnt-3 Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 2 4 6 8
Праймер lnt-4 Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 2 4 6 8
Праймер Env-1 Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 3 4 7 8
Праймер Env-2 Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 3 4 7 8
Смесь Seq Прозрачная жидкость розового
цвета соответствует 1 2 3 4
5х буфер Seq Прозрачная бесцветная жидкостьсоответствует 1 2 3 4
Форма 1: iREFl TM-V0-50-F-1-S, Форма 2: |REF| TM-V0-50-F-2-S, Форма 3:
ФормаД^^Е^ TM-V0-50-F-4-S, Форма 5: KE^TM-V0-50-F-5, Форма
Форма 7: |REf| TM-V0-50-F-7, Форма 8:
TM-V0-50-F-3-S,
TM-V0-50-F-6,
ITM-V0-50-F-8
--- стр. 65 ---
3. Условия транспортирования и хранения:
Транспортирование. Набор реагентов транспортировать при температуре от 2 до 8 °С не более 5 сут.
При получении разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения.
Хранение. Комплекты реагентов «РИБО-золь-Е», «РИБО-преп» и «Ампли-сорб», а также реагенты
ГЕМОЛИТИК, раствор для лизиса, раствор для преципитации, ПКО ДНК ВИЧ-1 и ОКО хранить при
температуре от 2 до 8 °С. тРНК 1 мкг/мкл, калибратор HIV-Q и растворитель О (из комплекта реагентов
«РИБО-золь-Е») хранить температуре температуре не выше минус 16 °С.
Комплекты реагентов «ОТ-ПЦР-комплект-Рго/Rev», «ОТ-ПЦР-комплект-1пЬ, «ОТ-ПЦР-комплект-Env»,
«ПЦР-комплект-Рго/Rev», «ПЦР-комплект-1пЬ>, «ПЦР-комплект-Env», «Комплект для подготовки к
секвенированию Pro/Rev», «Комплект для подготовки к секвенированию 1пЬ>, «Комплект для подготовки
к секвенированию Env», «Комплект для секвенирования» хранить при температуре не выше минус
16 °С.
«Комплект для секвенирования» хранить в защищенном от света месте.
Комплект реагентов «ЭФ» хранить при температуре от 18 до 25 °С в защищенном от света месте.
ВНИМАНИЕ! Не допускается замораживание/оттаивание реагентов из «Комплекта для
секвенирования» и раствора для денатурации из «Комплекта для подготовки к секвенированию» более
двух раз.
Дата в
ГРУППА
КОНТРОЛ
PyKOBc^ejp{A,qiCTl (Наумкина Е.М.)
(Ф.И.О.)
Форма 1: IrEFI TM-V0-50-F-1-S, Форма 2: |REF| TM-V0-50-F-2-S, Форма 3;
Форма 4: [RE^ TM-V0-50-F-4-S, Форма 5: |r^TM-V0-50-F-5, Форма
Форма 7: |R ^ TM-V0-50-F-7, Форма 8
TM-V0-50-F-3-S,
TM-V0-50-F-6,
TM-V0-50-F-8
--- стр. 90 ---
3. УСТАНОВКА ПРОГРАММЫ
Установка ПО «ДЕОНА NGS» осуществляется путем копирования архива
дистрибутива с инсталляционного носителя на жесткий диск компьютера. Затем
производится распаковка архива дистрибутива в любом каталоге, например:
tar xzf ngshiv-1.0.tar.gz
ngshiv-1.0/ngshiv
Для запуска программы необходимо вводить имя исполняемого файла с добавлением
пути к корневому каталогу дистрибутива в переменную окружения PATH.
стр. 9 из 12
--- стр. 91 ---
4. ПРОВЕРКА ПРОГРАММЫ
Для проверки работоспособности программы можно выполнить прогон на тестовом
примере, входящем в состав дистрибутива.
1) Перейдите в каталог test дистрибутива. Убедитесь, что он не содержит никаких
подкаталогов; при необходимости, удалите их.
2) Запустите программу без параметров;
../ngshiv
Ожидаемые результаты:
- сообщения в консоли соответствуют нормальному сценарию работы программы (рис.
2 ):
- в каталоге test были созданы два подкаталога, sampleOI и sample02, каждый из
которых содержит файлы coverage.svg и report.html.
При получении сообщений об ошибках следует обратиться к разделу 5 данного
документа.
стр. 10 из 12
--- стр. 92 ---
5. СООБЩЕНИЯ СИСТЕМНОМУ ПРОГРАММИСТУ
При нормальной работе программы на консоль оператора выдаются сообщения,
отображающие текущий статус (рис. 2).
NGS HIV: HIV drug resistance prediction from next- generation sequencing data
[ngshiv] INFO. Analysing sample 'sampleOl'.
[ngshiv] INFO: Preparing reads...
[ngshiv] INFO: Assembling reads...
[ngshiv] INFO- Calculating coverage...
[ngshiv] INFO: Collecting AA variants...
[ngshiv] INFO: Calling variants...
[ngshiv] INFO: Predicting drug resistance at 0.010 threshold...
[ngshiv] INFO Predicting drug resistance at 0.200 threshold...
[ngshiv] INFO Predicting tropism...
[ngshiv] INFO: Finished 'sampleOl' analysis.
[ngshiv] INFO: Analysing sample 'sample02'.
[ngshiv] INFO: Assembling reads...
[ngshiv] INFO: Calculating coverage...
[ngshiv] INFO: Collecting AA variants...
[ngshiv] INFO: Calling variants...
[ngshiv] INFO: Predicting drug resistance at 0.010 threshold...
[ngshiv] INFO: Predicting drug resistance at 0.200 threshold...
[ngshiv] INFO: Predicting tropism...
[ngshiv] INFO: Finished 'sample02' analysis.
[ngshiv] INFO: Finished processing all samples.
Рис.2. Пример вывода программы «ДЕОНА NGS» на консоль
Кроме того, на консоль могут выдаваться сообщения об ошибках (табл. 2).
Сообщения об ошибках
Таблица 2
Сообщение об ошибке Описание ошибки и возможные действия
can’t open file 'xxx' for reading Не удается открыть входной файл с именем ххх для
чтения. Возможно, файл с таким именем не существует
или у процесса нет прав на его чтение.
can’t open file ’xxx' for writing Не удается открыть выходной файл с именем ххх для
записи. Возможно, имя файла недопустимо, или у
процесса нет прав на его создание.
Failed loading project from ’xxx’ Ошибка при попытке загрузить файл проекта. Проверьте,
что файл project.json находится в корневом каталоге
проекта и имеет правильный формат.
failed to assemble reads Не удалось произвести сборку чтений. Причинами могут
быть ошибки при подготовке или секвенировании образца,
контаминация.
стр. 11 из 12
--- стр. 96 ---
pcotnmended
borage;
-70°C
ontributor:
eferences;
Dr. Malcolm Martin.
Adachi A, Gendelman HE, Koenig S, Folks T, Willey R, Rabson A, Martin MA, Production
of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman
celts transfected with an infectious molecular clone, i Wrol 59:284-291, 1986.
lOTE: Acknowledgment for publications should read "The following reagent was obtained
through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: pNL4-3 from Dr,
Malcolm Martin," Also include the reference cited above in any publications. Scientists
at for-profit institutions or who intend commercial use of this reagent must
contact Dr, Sally Hu at the NIH Office of Technology Transfer,
Email: husOmail.nih.aov. Phone: 301-435-5606, before the reagent can be
released. Please specify the name and a description of the intended use of the
reagent.
.ast Updated: November 12, 2013
ALL REClPieNTS OF THIS NATERIAL MUST COMPLY WITH ALL APPLICABLE BIOLOGICAL, CHEMICAL,
AND/OR RADIOCHEMICAL SAFETY STANDARDS INCLUDING SPECIAL PRACTICES, EQUIPMENT,
FACILITIES, AND REGULATIONS. NOT FOR USE IN HUMANS,
REV: 11/12/2013 Page 2 of 2
--- стр. 97 ---
^Трограмма предоставления ВИЧ препаратов
Национальным институтом здоровья США
20301 Сенчури Бульвар
дом 6, пом. 200
Джермантаун, Мэриленд 20874
США
Реагент:
Каталожный номер:
Серия:
Класс выпуска:
Содержит:
Клонирующий вектор:
Сайт встраивания:
Тел. 240 686 4740
Факс 301 515 4015
aidsreagent.org
ТЕХНИЧЕСКАЯ СПЕЦИФИКАЦИЯ
PNL4-3
114
110199
С
Юмкг очищенной плазмидной ДНК (1,0 мг/мкл).
PUC18
5'SmaI-£coRI фрагмент провирусной NY5 (5' S m a l во фланкирующих
последовательностях к 3'EcoRI) и 3' фрагмент провирусной LAV (5' EcoRI
к 3' N ru l во фланкирующих последовательностях) были клонированы
«тупыми концами» в pUC18 на P v u ll сайте после удаления полилинкерных
сайтов.
Номер доступа в Gen Bank: AF324493
Штамм-хозяин:
Описание:
Особые характеристики:
НВ101
Полноразмерная, репликационно и инфекционно-компетентная
химерная ДНК.
После трансфекции этот клон нацелен на производство патогенных вирусных
частиц в большом разнообразии клеток. Потомство, инфекционные вирионы, были
синтезированы в клетках мыши, норки, обезьяны и нескольких не Т-клеточных
линиях, что указывает на отсутствие какого-либо внутриклеточного препятствия
размножению вирусной РНК или образованию или сборке белка. Источник
провирусов; NY5 (5') и LAV (3') клонирован непосредственно из геномной ДНК.
Ссылки:
Файл сиквенса*О бновлен 14 мая 2010
Карта плазмиды
Структура и сайты рестрикции
ОС данные
ВСЕ ПОЛУЧАТЕЛИ ДАННОГО МАТЕРИАЛА ДОЛЖНЫ СОБЛЮДАТЬ ВСЕ ДЕЙСТВУЮЩИЕ СТАНДАРТЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ,
ХИМИЧЕСКОЙ И / ИЛИ РАДИОХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ, В ТОМ ЧИСЛЕ В ЧАСТИ МЕТОДОВ РАБОТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМОГО
ОБОРУДОВАНИЯ И ПРИНАДЛЕЖНОСТЕЙ, А ТАКЖЕ ПРЕДУСОМТРЕННЫЕ ЗАКОНОМ ТРЕБОВАНИЯ.
НЕ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ НА ЛЮДЯХ
Ред: 12.11.2013 Страница 1 из 2
--- стр. 98 ---
Рекомендуемое
Хранение:
-70°С
Исследователь: Доктор Мальком Мартин.
Ссылки:
Примечание:
Адачи А, Гендельман ХЕ, Кениг С, Фолке Т, Уилли Р, Рабсон А, Мартин МА.
Создание ассоциированных с синдромом приобретенного иммунодефицита
ретровирусов в клетках человека и животных, трансфектированных с
помощью патогенного молекулярного клона. Дж Вирол 59: 284-291, 1986.
Если вы признательны за публикации, укажите что "Следующий реагент
был получен по программе NIH AIDS, отдел СПИДа, NIAID, NIH: pNL4-3 от
доктора Малкольма Мартина". Также дайте ссылку вверху в любых
публикациях. Ученые некоммерческих институтов или те, кто
намерен использовать этот реагент в коммерческих целях должны
связаться с доктором Салли Ху в NIH Управлении по трансферу
технологий, по E-mail: hus@mail.nih.Qov или телефону: 301-435-
5606, до выпуска реагента. Пожалуйста, укажите название
реагента и назначение реагента.
Последнее обновление: 12 Ноября 2013
ВСЕ ПОЛУЧАТЕЛИ ДАННОГО МАТЕРИАЛА ДОЛЖНЫ СОБЛЮДАТЬ ВСЕ ДЕЙСТВУЮЩИЕ СТАНДАРТЫ
БИОЛОГИЧЕСКОЙ, ХИМИЧЕСКОЙ И / ИЛИ РАДИОХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ, В ТОМ ЧИСЛЕ В ЧАСТИ
МЕТОДОВ РАБОТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМОГО ОБОРУДОВАНИЯ И ПРИНАДЛЕЖНОСТЕЙ, А ТАКЖЕ ПРЕДУСОМТРЕННЫЕ
ЗАКОНОМ ТРЕБОВАНИЯ.
НЕ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ НА ЛЮДЯХ.
Ред: 12.11.2013 Страница 2 из 2