Набор реагентов для одновременного выявления ДНК вируса гепатита В (HBV) и РНК вируса гепатита D (HDV) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией "АмплиСенс® HBV/HDV-FL" по ТУ 9398-179-01897593-2012 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 3 ---
с п и с о к С О КР А Щ Е Н И Й
В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения:
ВКО - внутренний контрольный образец
К+ - положительный контроль ПЦР
К- - отрицательный контроль ПЦР
ОКО - отрицательный контрольный образец
ОК - отрицательный контроль экстракции
ОТ - обратная транскрипция
- положительный контрольный образецПКО
ПК - положительный контроль экстракции
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии
Роспотребнадзора
- Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный
научно-исследовательский институт эпидемиологии»
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека______________________
HBV - вирус гепатита В
HCV - вирус гепатита С
HDV - вирус гепатита D («Дельта»)
FEP - флуоресцентная детекция по «конечной точке»
FRT - флуоресцентная детекция в режиме «реального времени»
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов «А м плиС енс® HBV/HDV-FLn предназначен для одновременного
выявления Д Н К вируса гепатита В {HBV) и РН К вируса гепатита D (HDV) в
клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Материалом для проведения ПЦР
служат пробы РНК/ДНК, выделенные из плазмы крови.
ВНИМАНИЕ! Результаты ПЦР-исследования учитываются в комплексной
диагностике заболевания^
ПРИНЦИП М Е ТО Д А
Принцип тестирования основывается на экстракции РН К/ДНК из плазмы крови
совместно с ВКО, проведении реакции обратной транскрипции РНК и ПЦР-
амплификации Д Н К/кД Н К с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме
«реального времени» (формат FRT). По каналу, соответствующему флуорофору
РАМ, детектируется продукт амплификации ВКО. По каналу, соответствующему
флуорофору JOE, детектируется продукт амплификации ДН К HBV. По каналу,
соответствующему флуорофору ROX, детектируется продукт амплификации РНК
HDV. Положительный контрольный образец этапа экстракции ПКО HBV/HDV-rec
детектируется по каналам, соответствующим флуорофорам РАМ (ВКО), JOE {HBV) и
ROX {HDV). Контрольный образец амплификации - ПКО кДНК HBV/HDV-FL -
^ В соответствии с директивой Европейского Союза 98/79/ЕС.
--- стр. 4 ---
является комплексным для HBV, HDV и ВКО и аналогично детектируется по каналам,
соответствующим флуорофорам FAM (ВКО), JOE (HBV) и ROX {HDV).
Ф ОРМАТЫ И Ф О Р М Ы В Ы П УС КА Н А Б О Р А Р Е А ГЕ Н ТО В
Набор реагентов в ы пускается в 1 ф ормате:
Ф ормат FRT
Набор реагентов выпускается в 5 формах комплектации;
Форма 1 включает комплекты реагентов «РИБО-преп» вариант 5 0 -2 штуки, «ПЦР-
комплект» вариант FRT.
Форма 2 включает комплекты реагентов «РИБО-сорб» вариант 5 0 -2 штуки, «ПЦР-
комплект» вариант FRT.
Форма 3 включает комплекты реагентов «МАГНО-сорб» вариант 100-1000, «ПЦР-
комплект» вариант FRT.
Форма 4 включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT.
Форма 5 включает наборы реагентов оптом, расфасованные по отдельным
реагентам, с маркировкой реагентов на их оптовой фасовке.
Форма комплектации 1 предназначена для проведения полного ПЦР-
исследования, включая экстракцию РНК/ДНК из клинического материала методом
преципитации, проведение обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК/ДНК с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Форма комплектации 2 предназначена для проведения полного ПЦР-
исследования, включая экстракцию РНК/ДНК из клинического материала методом
сорбции на силикагеле, проведение обратной транскрипции РНК и амплификации
кДНК/ДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального
времени».
Форма комплектации 3 предназначена для проведения полного ПЦР-
исследования, включая экстракцию РНК/ДНК из клинического материала магнитной
сепарацией, проведение обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК/ДНК с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Форма комплектации 4 предназначена для проведения обратной транскрипции
РНК и амплификации кДНК/ДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в
режиме «реального времени». Для проведения полного ПЦР-исследования
необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции РНК/ДНК,
рекомендованные ФБУН ЦН ИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
Форма комплектации 5 предназначена для производственных целей для
последующей маркировки на языке заказчика и комплектации по наборам.
--- стр. 5 ---
ВНИМАНИЕ! Форма комплектации 5 используется только в соответствии с
регламентом, утвержденным ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
А Н А Л ИТИЧ ЕС КИЕ Х А Р А КТИ С ТИ КИ
А налитическая чув ств и тел ь но сть
Формат
Объём
экстракции,
мкл
Комплект для
экстракции РНК/ДНК
Аналитическая
чувствительность
HBV, МЕ/мл HDV, копий/мл
100
Формат FR T
«РИБО-сорб»
«РИБО-преп»
NucliSENS easvMAG
100 100
200 «МАГНО-сорб» 50 50
1000 «МАГНО-сорб»
NucliSENS easyMAG 10 10
А налитическая сп ец и ф и чн о сть
Оценка аналитической специфичности набора реагентов проведена посредством
добавления в реакцию геномной Д Н К/РН К следующих организмов и вирусов: вирус
гепатита А, вирус гепатита С, вирус иммунодефицита человека, цитомегаловирус,
вирус Эпштейна-Барр, вирус простого герпеса типы 1, 2, вирус ветряной оспы, вирус
герпеса человека типы 6, 8, парвовирус В19, вирус клещевого энцефалита, вирус
лихорадки западного Нила, аденовирус типы 2, 3, 7, Escherichia соН , Staphylococcus
aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae. Homo sapiens.
Перекрестные реакции для указанных организмов и вирусов зарегистрированы не
были.
МЕРЫ П Р Е Д О С ТО Р О Ж Н О С ТИ
Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно
биологические (ПЦ Р) исследования клинического материала на наличие
возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-эпидемических
правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп
патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СанПиН
2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с
медицинскими отходами» и методических указаний М У 1.3.2569-09 «Организация
работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при
работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».
При работе всегда выполнять следующие требования:
- Следует рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные,
организовывать работу и хранить в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность
работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и
возбудителями паразитарных болезней».
--- стр. 6 ---
- Убирать и дезинфицировать разлитые образцы или реактивы, используя
дезинфицирующие средства в соответствии СП 1.3.2322-08 «Безопасность
работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и
возбудителями паразитарных болезней».
- Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в
отдельных помещениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Выделения,
продолжать в Зоне Амплификации и Детекции. Не возвращать образцы,
оборудование и реактивы в зону, в которой была проведена предыдущая стадия
процесса.
- Удалять неиспользованные реактивы в соответствии с СанПиН 2.1.7.2790-10
«Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими
отходами».
ВНИМАНИЕ! При удалении отходов после амплификации (пробирок, содержащих
продукты ПЦР) недопустимо открывание пробирок и разбрызгивание содержимого,
поскольку это может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны,
оборудования и реагентов.
- Применять набор строго по назначению, согласно данной инструкции.
- Допускать к работе с набором только специально обученный персонал.
- Не использовать набор по истечении срока годности.
- Использовать одноразовые перчатки, лабораторные халаты, защищать глаза во
время работы с образцами и реактивами. Тщ ательно вымыть руки по окончании
работы.
- Избегать контакта реагентов с кожей, глазами и слизистой оболочкой. При
контакте немедленно промыть пораженное место водой и обратиться за
медицинской помощью.
- Листы безопасности материалов (M SDS - material safety data sheet) доступны по
запросу.
Д О П О Л Н И ТЕ Л Ь Н Ы Е М А ТЕ Р И А Л Ы И О Б О Р У Д О В А Н И Е
ЗОНА 1. Э кстракция Р Н К /Д Н К из клинического м атериала
1. Ламинарный бокс.
2. Центрифуга/вортекс.
3. Автоматические дозаторы переменного объема.
4. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся
пробирки объемом 1,5 мл.
5. Одноразовые наконечники с фильтром до 200 мкл и до 1000 мкл.
--- стр. 7 ---
6. Штативы для наконечников и пробирок объемом 1,5 мл.
7. Холодильник от 2 до 8 °С.
8. Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по М У 1.3.2569-09.
9. Емкость с дезинфицирующим раствором.
П р и использовании комплекта реагентов «РИБО-сорб» ТУ 9398-004-01897593-2008)
или «РИБО-преп» (ТУ 9398-071-01897593-2008):
1. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С.
2. Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 12 тыс д.
3. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления
надосадочной жидкости.
4. Одноразовые наконечники до 200 мкл.
5. Одноразовый флакон на 10-20 мл.
При использовании комплекта реагентов «МАГНО-сорб» (ТУ 9398-106-01897593-2012):
1. Термостат для пробирок объемом 5 мл, диаметром 12 мм от 25 до 100 °С.
2. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С.
3. Магнитный штатив для пробирок типа «Эппендорф» на 1,5 мл.
4. Магнитный штатив для пробирок на 5 мл, диаметр 12 мм.
5. Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления
надосадочной жидкости.
6. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся
пробирки объемом 1,5 мл.
7. Одноразовые полипропиленовые или полистирольные пробирки объемом до 5 мл
диаметром 12 мм, круглодонные.
8. Одноразовые полипропиленовые крышки для пробирок объемом до 5 мл
диаметром 12 мм.
9. Автоматический дозатор переменного объема с возможностью дозирования от
1000 до 5000 мкл.
10.Одноразовые наконечники до 200 мкп, до 1000 мкл и до 5000 мкп.
При использовании автоматических станций для экстракции нуклеиновых кислот:
1. Автоматическая станция для экстракции РН К/Д НК (например, NucliSENS
easyMAG (bioMerieux, Франция)).
2. Набор реактивов и расходных материалов к автоматической станции (например
NucliSENS easyM AG (NucliSens буфер для экстракции 1, NucliSens буфер для
экстракции 2, NucliSens буфер для экстракции 3, NucliSens буфер для лизиса,
NucliSens магнетизированная силика) (bioMeheux, Франция)).
3. Для автоматической станции например NucliSENS easyMAG (bioMerieux,
--- стр. 8 ---
Франция) требуется дополнительный комплект реагентов «ЕМ-плюс» (ФБУН
ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).
ЗОНА 2. П роведение реакции обратной транскр ипции, ПЦР и гибридизационно-
ф луоресцентной д етекц и и продуктов ам плиф икации
1. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс).
2. Центрифуга/вортекс.
3. Автоматические дозаторы переменного объема.
4. Одноразовые наконечники с фильтром до 200 мкл в штативах.
5. Штативы для пробирок объемом 0,2 мл или 0,5 мл (в соответствии с
используемыми комплектами реагентов),
6. Холодильник от 2 до 8 °С.
7. Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по М У 1.3.2569-09.
8. Емкость для сброса наконечников.
9. Программируемый амплификатор роторного типа (например, Rotor-Gene 3000
или 6000 (Corbett Research, Австралия)) или амплификатор планшетного типа
(например, iCycler i0 5 (Bio-Rad, США), МхЗОООР (Stratagene, США)) и
рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора в
методических рекомендациях по применению данного набора реагентов.
10.Одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл или 0,1 мл;
а) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с выпукпой крышкой - при
использовании прибора планшетного типа;
б) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с плоской крышкой - при
использовании прибора роторного типа,
ВЗЯТИЕ, Т Р А Н С П О Р Т И Р О В А Н И Е И Х Р А Н Е Н И Е И С С Л Е Д УЕ М О ГО МАТЕРИАЛА
Перед началом работы следует ознакомиться с методическими рекомендациями
«Взятие, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-
диагностики», разработанными ФГУН Ц Н ИИ Э Роспотребнадзора, Москва, 2008 г.
Для проведения ПЦР-исследования используется плазма периферической крови.
Взятие крови проводится утром натощак в пробирку с раствором ЭДТА в качестве
антикоагулянта. Закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают. В
течение 6 ч с момента взятия крови следует отобрать плазму и перенести в новую
пробирку. Для этого пробирку с кровью центрифугируют 20 мин при 800-1600 д.
Хранить плазму можно не более 3 сут. при температуре от 2 до 8 °С и длительно -
при температуре не выше минус 68 °С.
В отдельных случаях допускается использование сыворотки крови.
8
--- стр. 11 ---
Ф О Р М А Т F R T
Комплект реагентов «М А ГН О -со рб» вариант 100-1000 - комплект реагентов для
выделения РН К/Д Н К из клинического материала вклю чает:
; Р еакт и в V О п и сан и е Объем, мл Кол-во
Лизирующий раствор
МАГНО-сорб
Прозрачная бесцветная
жидкость^ 70 4 флакона
Компонент А Прозрачная бесцветная
жидкость 0,6 4 пробирки
Раствор для отмы вки 5 Прозрачная бесцветная
жидкость^ 60 4 флакона
Раствор для отмывки 6 Прозрачная бесцветная
жидкость 20 4 флакона
Раствор для отмы вки 7 Прозрачная бесцветная
жидкость 6,0 4 флакона
Магнетизированная силика Суспензия черного цвета 0,9 4 пробирки
Буфер для элюции Прозрачная бесцветная
жидкость 1,2 12 пробирок
Комплект реагентов рассчитан на выделение РНК/ДНК из 100 проб, включая контроли.
Объем исследуемого материала 1000 мкл.
Входит в состав формы комплектации 3.
Комплект реагентов «П Ц Р -ком пл ект» вариант FR T - комплект реагентов для
проведения реакции обратной транскрипции РНК и амплификации кДНК вируса
гепатита D {HDV) и Д Н К вируса гепатита В {HBV) с гибридизационно-
флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» вклю чает:
■ Т Р еакт и в г ..О п и сан и е [ Объем, мл Кол-во
RT-G-mix-2 Прозрачная бесцветная
жидкость 0,015 4 пробирки
ОТ-ПЦР-смесь-1-FL H B V /H D V Прозрачная бесцветная
жидкость 0,3 4 пробирки
ОТ-ПЦР-смесь-2-FEP/FRT Прозрачная бесцветная
жидкость 0,2 4 пробирки
Полимераза (TaqF) Прозрачная бесцветная
жидкость 0,02 4 пробирки
ТМ-Ревертаза (MMIv) Прозрачная бесцветная
жидкость 0,01 4 пробирки
ПКО кДНК H B V /H D V -F L Прозрачная бесцветная
жидкость 0,1 4 пробирки
Буфер для элюции Прозрачная бесцветная
жидкость 1,2 2 пробирки
Комплект реагентов рассчитан на проведение 112 реакций обратной транскрипции и
При хранении лизирующего раствора МАГНО-сорб и раствора для отмывки 5 при температуре ниже
20 “С возможно образование осадка в виде кристаллов.
1 1
--- стр. 12 ---
Ф О Р М А Т F R T
амплификации, включая контроли.
Входит в состав форм комплектации 1, 2, 3, 4.
К комплекту р еагентов прилагаю тся контрольны е образцы этапа экстракции:
'Р е а кт и в W - О п и сан и е О бъем, мл Кол-во
ОКО Прозрачная бесцветная
жидкость 1,2 4 пробирки
ПКО H B V /H D V -rec Прозрачная бесцветная
жидкость 0,06 4 пробирки
ВКО /CZ-rec Прозрачная бесцветная
жидкость 0,28 4 пробирки
ПРО ВЕДЕН ИЕ П Ц Р -И С С Л Е Д О В А Н И Я
ПЦР-исследование состоит из следующих этапов:
- Экстракция Р Н К/Д Н К из исследуемых образцов.
- Проведение реакции обратной транскрипции и амплификации с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
- Анализ и интерпретация результатов.
ЭКСТРАКЦИЯ Р Н К /Д Н К из И С С Л Е Д УЕ М Ы Х О Б Р А ЗЦ О В
ВНИМАНИЕ! Для работы с РН К/Д НК необходимо использовать только одноразовые
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку
«RNase-free», «D Nase-free».
Для экстракции РН К/Д Н К используются комплекты реагентов, рекомендованные
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора;
- при использовании комплекта реагентов «Р И Б О -преп» порядок работы см. в
приложении 1 «Экстракция РНК/ДНК с использованием комплекта реагентов
«РИБО-преп»».
- при использовании комплекта реагентов «Р И Б О -сорб» порядок работы см. в
приложении 2 «Экстракция РНК/ДНК с использованием комплекта реагентов
«РИБО-сорб»».
- при использовании комплекта реагентов «М А ГН О -со рб» порядок работы для
экстракции Р Н К/Д Н К из 1000 мкл и 200 мкл плазмы крови см. в приложении 3
«Экстракция Р Н К/Д Н К с использованием комплекта реагентов «МАГНО-сорб»».
При использовании автоматических станций для экстракции нуклеиновых кислот
компаний bioMerieux и Oiagen совместно с набором реагентов необходимо
использование протоколов и реагентов, позволяющих проводить экстракцию РНК/ДНК
1 2
--- стр. 13 ---
Ф О Р М А Т F R T
из образцов плазмы и сыворотки крови объемом от 0,1 мл до 1 мл.
Процедура экстракции проводится в соответствии с инструкцией к автоматическим
станциям.
Обязательным условием является внесение ВКО в образцы или лизирующий
раствор до начала экстракции в объёме 10 мкл на одну пробу.
При экстракции образца для проведения нескольких различных исследований
(допустима одновременная экстракциия нуклеиновых кислот для обнаружения РНК
HDV, РНК HCV, РНК HGV, Д Н К HBV, РНК ВИЧ и НС\/-генотипирования) внести все
требуемые препараты ВКО (аналогично).
Программируемый объем элюции - 50-60 мкл (допускается увеличение объёма
элюции до 100 мкп).
При использовании автоматической станции NucliSENS easyMAG (bioMerieux,
Франция) обязательно использование дополнительного комплекта реагентов «ЕМ-
плюс» (производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора). Допускается
использование режимов лизиса в приборе (On-board) и вне прибора (Off-board).
После окончания экстракции РНК/ДНК, извлечь пробирки из прибора и провести
реакцию О Т-П Ц Р /П Ц Р . Очищенная РНК/ДНК может храниться до 4 ч при
температуре от 2 до 8 °С. Для длительного хранения препарат необходимо хранить
при температуре не выше минус 16 °С в течение 1 мес. или не выше минус 68 °С в
течение года.
Также см. методические рекомендации ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора по применению набора реагентов для одновременного
выявления Д Н К вируса гепатита В (HBV) и РНК вируса гепатита D (HDV) и
«АмплиСенс® HBV/HDV-FL».
13
--- стр. 14 ---
Ф О Р М А Т F R T
ПРО ВЕДЕНИЕ Р Е А КЦ И И О Б Р А ТН О Й Т Р А Н С КР И П Ц И И И АМ ПЛИФ ИКАЦИИ С
ДЕТЕКЦИЕЙ В Р Е Ж И М Е «Р Е А Л Ь Н О ГО В Р ЕМ ЕН И »
Общий объем р еакционно й см еси - 25 мкл, вклю чая объ ем пробы РНК/ДНК -
10 мкл.
ВНИМАНИЕ! При работе с РН К/ДНК необходимо использовать только одноразовые
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку
«RNase-free», «D Nase-free».
А. Подготовка пр о б и р о к для ам плиф икации
Выбор пробирок д л я ам плиф икации за в и си т от используемого
ам плиф икатора.
Для внесения в п робирки реагентов, проб Р Н К/Д Н К и контрольны х образцов
использую тся о д н о р азо в ы е наконечники с ф ильтрам и.
ВНИМАНИЕ! Компоненты реакционной смеси следует смешивать непосредственно
перед проведением ПЦР-исследования. Смешивать реагенты из расчета на
необходимое число реакций, включающее тестирование исследуемых и
контрольных образцов, необходимо согласно расчетной табл ице (см. табл. 1).
1. До начала работы разморозить, тщательно перемешать на вортексе все реагенты
набора и осадить капли с крышек пробирок.
2. Отобрать необходимое количество пробирок для амплификации с учетом
количества исследуемых, контрольных образцов (два контроля экстракции, один
контроль амплификации). Тип пробирок стрипов или плашек выбрать в
зависимости от используемого прибора.
3. Для приготовл ения реакционной смеси необходимо в отдельной стерильной
пробирке смешать реагенты из расчета на 1 реакцию; 10 мкл О Т-ПЦР-смеси-1-
FL HBV/HDV, 5 мкл О Т-П Ц Р -см еси -2-FEP /FR T, 0,25 мкл RT-G-m ix-2, 0,5 мкл
полимеразы (TaqF) и 0,25 мкл ТМ -Р евертазы (M M Iv). Тщательно перемешать
смесь на вортексе и осадить капли с крышки пробирки.
4. Внести в пробирки по 15 мкл готовой реакционной смеси.
5. В готовые пробирки внести по 10 мкл Р Н К/Д Н К-проб, выделенных из
клинических образцов.
ВНИМАНИЕ! При добавлении РНК/ДНК-проб, выделенных с помощью комплекта
реагентов «РИБО-сорб», «МАГНО-сорб» и NucliSENS easyMAG, необходимо
избегать попадания сорбента в реакционную смесь.
14
--- стр. 15 ---
Ф О Р М А Т F R T
6. Поставить контрол ь ны е реакции;
а) полож ительны й контроль экстракции (ПК) - внести в пробирку 10 мкл
Р Н К/Д Н К-пробы , выделенной из образца ПКО HBV/HDV-rec.
б) отрицательны й контроль экстракции (О К) - внести в пробирку 10 мкл
РН К/Д Н К-пробы , выделенной из образца ОКО.
в) полож ительны й контрол ь ПЦР (К+) - внести в пробирку 10 мкл ПКО кДНК
HBV/HDV-FL.
При подозрении на возможную контаминацию также необходима постановка
отрицательного контроля ПЦР (К -). Для этого в пробирку с готовой реакционной
смесью внести 10 мкл буф ера для элю ции.
Таблица 1
С хем а при гото вл ения реакционны х см есей для ф орм ата FRT
Объем реактивов на указанное количество исследуемых
точек с запасом на один образец
Объем реагента на одну ■
реакцию (мкл) 10,00 5,00 0,25 ' 0 ,5 0 ; 0,25
Ч и с л о
к л и н и че с к и х
о б р а зц о в
Ч и с л о
и с с л е д у е м ы х
то че к ^
О Т - П Ц Р -
с м е с ь-1 - F L
HBV/HDV
О Т - П Ц Р -
с м е с ь-2 -
F E P / F R T
R T - G - m ix - 2П о ли м е р а за
( T a q F )
тм-
Р е ве р та за
(M M Iv)
4 7 80 40 2,0 4,0 2,0
6 ® 9 100 50 2,5 5,0 2,5
8 11 120 60 3,0 6,0 3,0
10® 13 140 70 3,5 7,0 3,5
12 15 160 80 4,0 8,0 4,0
W 17 180 90 4,5 9,0 4,5
16 19 200 100 5,0 10,0 5,0
18 21 220 110 5,5 11,0 5,5
■ 20 Ш 23 240 120 6 ,0 - ‘ 12,0 6,0
22® 25 260 130 6,5 13,0 6,5
34 ■ .,...'.0 37 380 190 9.5 19,0 9.5
46 49 500 250 12,5 25,0 12,5
Б. Проведение ам п л и ф и кац и и с детекцией в реж им е «реального времени»
1. Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора.
2. Запрограммировать прибор (амплификатор с системой детекции в режиме
«реального времени») для выполнения соответствующей программы
амплификации и детекции флуоресцентного сигнала (см. табл. 2, 3).
Ч и с л о к л и н и ч е с к и х о б р а з ц о в + 2 к о н тр о л я э та п а э кс тр а кц и и Р Н К / Д Н К + 1 к о н тр о л ь О Т - П Ц Р , (N + 3 , N
- к о л и ч е с тв о к л и н и ч е с к и х о б р а з ц о в )
® Э кс тр а кц и я о д н о го с тр и п а на п р и б о р е N u c liS E N S e a sy M A G (8 п р о б и р о к)
® П а н е л ь и з 1 2 п р о б и р о к на э кс тр а к ц и ю
’ ’ Э кс тр а кц и я д в у х с тр и п о в на пр и б о р е N u c liS E N S e a sy M A G ( 1 6 п р о б и р о к)
® П а н е л ь и з 2 4 п р о б и р о к на э кс тр а к ц и ю , э к с тр а к ц и я т р е х с тр и п о в на п р и б о р е N u c liS E N S e a sy M A G
15