Набор реагентов для выявления ДНК Chlamydia trachomatis сероваров (типов) A, B и C в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией "АмплиСенс® Chlamydia trachomatis-A, B, C-FL" по ТУ 9398-194-01897593-2012 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 1 --- Приказом Росздравнадзора Директор Федерального о т ________________№ _______________ б ю д ж е т н о г о у ч р е ж д е н и я н а у ки « Ц е н т р а л ь н ы й н а у ч н о - и с с л е д о в а т е л ь с к и й и н с т и т у т э п и д е м и о л о г и и » Ф е д е р а л ь н о й с л у ж б ы п о н а д з о р у в с ф е р е ip a e п о т р е б и т е л е й и ш я ч е л о в е к а В .И .П о к р о в с к и й ~ 2 0 1 2 г. УТВЕРЖДАЮ . И Н С Т Р У К Ц И Я п о п р и м е н е н и ю н а б о р а р е а г е н т о в д л я в ы я в л е н и я Д Н К C h la m y d ia tra c h o m a tis с е р о в а р о в ( т и п о в ) А , В и С в к л и н и ч е с к о м м а т е р и а л е м е т о д о м п о л и м е р а з н о й ц е п н о й р е а к ц и и ( П Ц Р ) с г и б р и д и з а ц и о н н о - ф л у о р е с ц е н т н о й д е т е к ц и е й « А м п л и С е н с ® C h l a m y d i a t r a c h o m a t i s - A , В , С - F L » АмплиСенс'^ ш 1 Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии», Российская Федерация, 111123, город Москва, улица Новогиреевская, дом За IVD --- стр. 2 --- СПИСО К С О К Р А Щ Е Н И Й .......................................................................................................................... 3 НАЗН АЧ ЕН И Е.................................................................................................................................................3 ПРИНЦИП М Е Т О Д А .................................................................................................................................... 3 ФОРМАТЫ И Ф О РМ Ы В Ы П У С КА Н А БО РА Р Е А Г Е Н Т О В ......................................................... 4 АН АЛИ ТИ ЧЕ С КИ Е Х А Р А К Т Е Р И С Т И К И ............................................................................................. 6 МЕРЫ П Р Е Д О С Т О Р О Ж Н О С Т И ............................................................................................................ 6 Д О П О Л Н И ТЕЛ ЬН Ы Е М А ТЕ Р И А Л Ы И О Б О Р У Д О В А Н И Е......................................................... 8 ВЗЯТИЕ, ТР А Н С П О Р ТИ Р О В А Н И Е И ХР АН ЕН И Е И С С ЛЕД УЕМ О ГО М АТЕРИАЛА ... 9 ФОРМ АТ FE P ................................................................................................................................................10 С О С Т А В ..........................................................................................................................................................10 ПРОВЕДЕНИЕ П Ц Р -И С С Л Е Д О В А Н И Я ........................................................................................... 12 ЭКСТРАКЦИЯ Д Н К ИЗ И С С ЛЕД УЕМ Ы Х О Б Р А З Ц О В ...............................................................12 ПРОВЕДЕНИЕ А М П Л И Ф И К А Ц И И ...................................................................................................... 13 А. Подготовка пробирок для ам пл иф и кац и и ................................................................................. 13 Б. Проведение а м п л и ф и ка ц и и .............................................................................................................16 Ф ЛУО РЕСЦЕНТНАЯ Д Е ТЕ КЦ И Я П РО ДУКТО В АМ П Л И Ф И КА Ц И И ПО «КОНЕЧНОЙ Т О Ч К Е »...........................................................................................................................................................17 ИНТЕРПРЕТАЦИЯ Р Е З У Л Ь Т А Т О В ...................................................................................................18 ФОРМ АТ FR T................................................................................................................................................20 С О С Т А В ......................................................................................................................................................... 20 ПРОВЕДЕНИЕ П Ц Р -И С С Л Е Д О В А Н И Я ........................................................................................... 22 ЭКСТРАКЦИЯ Д Н К ИЗ И С С ЛЕ Д УЕ М Ы Х О Б Р А З Ц О В ...............................................................22 ПРОВЕДЕНИЕ АМ П Л И Ф И КА Ц И И С ДЕ ТЕКЦ И ЕЙ В РЕ Ж И М Е «РЕАЛЬНО ГО В Р Е М Е Н И »................................................................................................................................................... 23 А. Подготовка пробирок д ля а м пл иф и кац и и ................................................................................. 23 Б. Проведение ам плиф икации с детекцией в режиме «реального врем ени» .............26 АНАЛИЗ И И Н Т Е Р П Р Е ТА Ц И Я Р Е З У Л Ь Т А Т О В ...........................................................................27 СРОК ГО ДН О С ТИ. У С Л О В И Я ТР А Н С П О Р ТИ Р О В А Н И Я И Х Р А Н Е Н И Я.........................30 СИМВОЛЫ , И С П О Л Ь ЗУ Е М Ы Е В П ЕЧАТН О Й П Р О Д У К Ц И И.................................................31 ОГЛАВЛЕНИЕ --- стр. 3 --- с п и с о к С О К Р А Щ Е Н И Й В настоящ ей инструкции прим еняю тся следую щ ие сокращ ения и обозначения; BKO-FL - внутренний контрольны й образец для наборов с гибридизационно-ф луоресцентной детекцией ОКО - отрицательны й контрольны й образец ПКО - полож ительны й контрольны й образец ПЦР - полим еразная цепная реакция К+ - полож ительны й контроль ПЦР К - - отрицательны й контроль ПЦР В - - отрицательны й контроль экстракции ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора - Ф едеральное бю дж етное учреж дение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Ф едеральной службы по надзору в сф ере защ иты прав потребителей и благополучия человека FEP - ф луоресцентная детекция по «конечной точке» FRT - ф луоресцентная детекция в реж им е «реального времени» Н А ЗН АЧ ЕН И Е Набор реагентов «А м плиС енс® Chlamydia trachomatis-A, В, С -FL» предназначен для выявления Д Н К возбудителя трахом ы Chlamydia trachomatis сероваров А, В и С путем ам плиф икации специф ического ф рагм ента Д Н К д анного микроорганизма методом ПЦР с гибридизационно-ф луоресцентной детекцией продуктов амплиф икации. М атериалом для проведения ПЦР служ ат пробы ДНК, полученные путем экстракции Д Н К из отделяем ого конъю нктивы (м азков с конъюнктивы). ВН И М АН И Е! Р езультаты П Ц Р -исследования учиты ваю тся в комплексной диагностике забо л е ван ия ^ ПРИНЦИП М Е Т О Д А Выявление Chlamydia trachomatis сероваров А, В, С методом мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-ф луоресцентной детекцией включает в себя три этапа: экстракцию Д Н К из образцов клинического материала, амплиф икацию участка Д Н К данного м икроорганизм а и гибридизационно- ф луоресцентную детекцию , которая производится л ибо непосредственно в ходе ПЦР (формат FRT), л ибо после ее заверш ения (ф орм ат FEP). Экстракция ДН К из клинического м атериала проводится в присутствии внутреннего контрольного образца (BKO-FL), которы й позволяет контролировать вы полнение процедуры исследования для каждого образца. Затем с полученны м и пробам и Д Н К проводится реакция амплиф икации участков Д Н К Chlamydia trachomatis сероваров А, В, С при помощи специф ичных к этим участкам Д Н К прайм еров и ф ерм ента Taq-полимерэзы. В ’ в соответствии с Директивой Европейского Союза 98/79/ЕС. --- стр. 4 --- составе реакционной смеси присутствую т ф луоресцентно-меченые олигонуклеотидны е зонды , которы е гибридизую тся с комплементарны м участком амплиф ицируемой Д Н К-м иш ени, в результате чего происходит нарастание интенсивности ф луоресценции. К олигонуклеотидны м зондам, специфичным к различным Д Н К-м иш еням , прикреплены различны е ф луоресцентны е метки. Это позволяет регистрировать накопление специф ического продукта амплификации каждой Д Н К-м иш ени путем изм ерения интенсивности ф луоресцентного сигнала по соответствую щ ему каналу. Д етекция ф луоресцентного сигнала при использовании ф ормата FEP осущ ествляется после окончания ПЦР с пом ощ ью ф луоресцентного ПЦР-детектора, а при использовании ф орм ата FR T - непосредственно в ходе ПЦР с помощью ам плиф икатора с систем ой детекции ф луоресцентного сигнала в режиме «реального времени». Ф О Р М А ТЫ И Ф О Р М Ы В Ы П У С К А Н А Б О Р А Р Е А ГЕ Н Т О В Н абор р е а ге н то в в ы п у с к а е т с я в д в у х ф о р м а та х . Ф о р м а т FEP Набор реагентов вы пускается в 6 ф орм ах комплектации: Ф о р м а 1 вклю чает ком плект реагентов «П Ц Р -ком плект» вариант FEP (пробирки 0,5 мл). Ф о р м а 2 вклю чает ком плект реагентов «П Ц Р -ком плект» вариант FEP (пробирки 0,2 мл). Ф о р м а 3 вклю чает ком плект реагентов «П Ц Р -ком плект» вариант FEP-100 L. Ф ор м а 4 вклю чает комплекты реагентов «Д Н К-сорб-А М » вариант 100, «Транспортную сред у с м уколитиком (ТС М )» 100 пробирок по 0,5 мл, «ПЦР- комплект» вариант FE P -100 L. Ф о р м а 5 вклю чает ком плект реагентов для экстракции Д Н К экспресс-методом «ЭДЭМ» и ком плект реагентов «П Ц Р-комплект» вариант FE P-100 L. Ф орм а 6 вклю чает наборы реагентов оптом, расф асованны е по отдельным реагентам, с м аркировкой реагентов на их оптовой ф асовке. Формы ком плектации 1, 2 и 3 предназначены для проведения амплификации ф рагментов Д Н К Chlamydia trachomatis сероваров А, В, С с гибридизационно- ф луоресцентной д етекцией по «конечной точке». Д ля проведения полного ПЦ Р-исследования необходим о использовать комплекты реагентов для экстракции ДНК, реком ендованны е Ф БУН ЦНИИ Э пидемиологии Роспотребнадзора. --- стр. 5 --- Формы комплектации 4 и 5 предназначены для проведения полного ПЦР- исследования, включающего взятие клинического материала, экстракцию из него ДНК и амплиф икацию Д Н К Chlamydia trachomatis сероваров А, В, С с гибридизационно- ф луоресцентной детекцией по «конечной точке». Форма ком плектации 6 предназначена для производственны х целей для последующ ей м аркировки на язы ке заказчика и ком плектации по наборам. ВН И М АН И Е! И спользование ф ормы ком плектации 6 производится только в соответствии с реглам ентом , утверж денны м Ф Б УН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Ф о р м а т FRT Набор реагентов вы пускается в 6 ф орм ах комплектации; Ф о р м а 1 вклю чает ком плект реагентов «П Ц Р -ком плект» вариант FRT. Ф о р м а 2 вклю чает ком плект реагентов «П Ц Р -ком плект» вариант FRT-100 F. Ф о р м а 3 вклю чает ком плект реагентов «П Ц Р -ком плект» вариант FRT-100 L. Ф о р м а 4 вклю чает комплекты реагентов «Д Н К-сорб-А М » вариант 100, «Транспортную сред у с м уколитиком (ТСМ )» 100 пр обирок по 0,5 мл и «ПЦР- комплект» вариант FR T-100 L Ф о р м а 5 вклю чает ком плект реагентов для экстракции Д Н К экспресс-методом «ЭДЭМ» и ком плект реагентов «П Ц Р-комплект» вариант FR T-100 L. Ф орм а 6 вклю чает наборы реагентов оптом, расф асованны е по отдельным реагентам, с м аркировкой реагентов на их оптовой ф асовке. Формы комплектации 1, 2 и 3 предназначены для проведения амплификации ф рагментов Д Н К Chlamydia trachomatis сероваров А, В, С с гибридизационно- ф луоресцентной детекцией в реж име «реального времени». Для проведения полного П Ц Р -исследования необходим о использовать комплекты реагентов для экстракции ДН К, реком ендованны е ФБУН ЦНИИ Э пидем иологии Роспотребнадзора. Формы ком плектации 4 и 5 предназначены для проведения полного ПЦР- исследования, включающего взятие клинического материала, экстракцию из него ДНК и амплиф икацию ф рагм ентов Д Н К Chlamydia trachomatis сероваров А, В, С с гибридизационно-ф луоресцентной детекцией в реж им е «реального времени». Форма ком плектации 6 предназначена для производственны х целей для последующ ей м аркировки на язы ке заказчика и ком плектации по наборам. --- стр. 6 --- В Н И М А Н И Е! И спользование ф ормы комплектации 6 производится только в соответствии с реглам ентом , утверж денны м Ф Б УН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. А Н А Л И Т И Ч Е С КИ Е Х А Р А К Т Е Р И С Т И К И А н а л и ти ч е с ка я ч у в с т в и т е л ь н о с т ь кл ^Транспортг 'д п я М^ Ком плект Г|,^мплификации : А|Налитическая М )|(^ Й т ё л ь н о с ть , Отделяемое конъюнктивы «Транспортная среда с муколитиком (ТОМ)» «ДНК-сорб-АМ» «ПЦР-комплект» варианты FEP и FRT 1x10^ Отделяемое конъюнктивы «Транспортная среда ТС- ЭДЭМ» «эдэм » «ПЦР-комплект» варианты FEP и FRT 5x10' А н а л и ти ч е с ка я с п е ц и ф и ч н о с т ь О тсутствовали неспециф ические реакции при тестировании образцов ДНК человека и панели образцов Д Н К следую щ их микроорганизмов: Chlamydia trachomatis серовар Е; Chlamydia trachomatis LG V биовар; Staphylococcus spp.; Streptococcus spp.; Neisseria gonorrhoeae; Neisseria spp.; HSV 1 и 2 типа; Candida albicans; Mycoplasma hominis; Ureaplasma urealyticum; Ureaplasma parvum; Mycoplasma genitalium; Trichomonas vaginalis; Treponema pallidum; Toxoplasma gondii; Escherichia coll; Gardnerella vaginalis; Lactobacillus spp.; CMV; HPV. М ЕРЫ П Р Е Д О С ТО Р О Ж Н О С ТИ Работа д олж на проводиться в лаборатории, вы полняю щ ей молекулярно биологические (П Ц Р ) исследования клинического м атериала на наличие возбудителей инф екционны х болезней, с соблю дением санитарно-эпидемических правил СП 1.3.2322-08 «Б езопасность работы с м икроорганизм ам и III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарны х болезней», СанПиН 2.1.7.2790-10 «С анитарно-эпидем иологические требования к обращ ению с медицинскими отходам и» и м етодических указаний М У 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использую щ их методы ам плиф икации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содерж ащ им м икроорганизмы I-IV групп патогенности». При работе всегда следует выполнять следующ ие требования: ^ Количество геномных эквивалентное микроорганизма (ГЭ) в 1 мл образца клинического материала, помещенного в указанную транспортную среду. --- стр. 7 --- - С ледует рассм атривать исследуемы е образцы как инф екционно-опасные, организовы вать работу и хранение в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с м икроорганизм ам и III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителям и паразитарны х болезней». - Убирать и дезин ф иц ир овать разлиты е образцы или реактивы, используя дезинф ицирую щ ие средства в соответствии СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с м икроорганизм ам и III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарны х болезней». - Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в отдельных помещ ениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Выделения, продолжать в Зоне Амплиф икации и Детекции. Не возвращать образцы, оборудование и реактивы в зону, в которой была проведена предыдущая стадия процесса. - Удалять не использованны е реактивы в соответствии с СанПиН 2.1.7.2790-10 «С анитарно-эпидем иологические требования к обращ ению с медицинскими отходами». ВН ИМ АН И Е! При удалении отходов после ам плиф икации и детекции (пробирок, содержащ их продукты ПЦ Р) недопустим о откры вание пробирок и разбрызгивание содержимого, поскольку это м ож ет привести к контам инации продуктами ПЦР лабораторной зоны, оборудования и реагентов. - Применять набор строго по назначению , согласно данной инструкции. - Допускать к работе с набором только специально обученны й персонал. - Не использовать набор по истечении срока годности. - Использовать од норазовы е перчатки, лабораторны е халаты , защ ищ ать глаза во время работы с образцам и и реактивами. Тщ ательно вы м ы ть руки по окончании работы. - Избегать контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой. При контакте немедленно пром ы ть пораж енное место водой и обратиться за медицинской помощью. - Листы безопасности м атериалов (M SD S - m aterial safety data sheet) доступны по запросу. --- стр. 8 --- 1. Транспортная среда - «Транспортная среда с м уколитиком (ТСМ )» (ТУ 9398-098- 01897593-2009) или другие реком ендованны е Ф БУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора - при работе с ф орм ами ком плектации 1-3 (формат FEP и ф ормат FRT) и использовании набора реагентов «Д Н К-сорб-А М ». 2. Комплект реагентов для вы деления Д Н К - «Д Н К-сорб-А М », включающий контроли (ТУ 9398-036-01897593-2009), или «Э ДЭ М » (ТУ 9398-158-01897593-2010) или другие реком ендованны е Ф БУН ЦНИИ Э пидем иологии Роспотребнадзора - при работе с ф орм ам и ком плектации 1-3 (ф орм ат FEP и ф орм ат FRT). 3. Д ополнительны е м атериалы и оборудование для экстракции Д Н К - согласно инструкции к ком плекту реагентов для экстракции ДН К. 4. Бокс абактериальной воздуш ной среды (ПЦ Р-бокс). 5. Ц ентриф уга/вортекс. 6. А втом атические дозаторы переменного объем а (от 5 д о 20 мкл, при работе с «ПЦР- комплектом» вариант FR T-100 F, вариант FE P-100 L и вариант FRT-100 L - от 5 до 20 мкл и от 20 до 200 мкл). 7. О дноразовые наконечники с ф ильтром до 100 мкл в ш тативах. 8. Ш тативы для пробирок объем ом 0,2 мл или 0,5 мл (в соответствии с используемыми ком плектам и реагентов). 9. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выш е минус 16 “С для выделенных проб ДН К. 10.Отдельный халат, ш апочки, обувь и одноразовы е перчатки по М У 1.3.2569-09. 11.Емкость для сброса наконечников. При работе с «П Ц Р -ком плектом » вариант FEP: 12.П рограмм ируемы й ам плиф икатор (например, «Терцик» («ДНК-Технология», Россия), G radient Palm C ycler (Corbett Research, Австралия), M axyG ene (Axygen, США), G eneAm p PCR S ystem 2700 (Applied Biosystem s, С Ш А ) и рекомендованные ФБУН ЦНИИ Э пидем иологии Роспотребнадзора в м етодических рекомендациях по применению данн ого набора реагентов). 13. Ф луоресцентный П Ц Р -детектор (например, A LA -1/4 (BioSan, Латвия), четы рехканальны й «Д жин» («Д Н К-Технология», Р оссия) и рекомендованные ФБУН ЦНИИ Э пидем иологии Роспотребнадзора в м етодических рекомендациях по применению данн ого набора реагентов). При работе с «П Ц Р -ком плектом » вариант FRT: 14.П рограмм ируемы й ам плиф икатор с системой детекции ф луоресцентного сигнала в ДО П О Л Н И ТЕЛ ЬН Ы Е М А ТЕРИ АЛ Ы И ОБОРУДОВАНИЕ --- стр. 9 --- режиме «реального врем ени» (например, R otor-G ene 3 0 0 0 /6 0 0 0 (Corbett Research, Австралия), R o to r-G en e Q (Q iagen, Германия), iC ycler iQ, iQ 5 (Bio-Rad, СШ А) и рекомендованны е Ф Б УН Ц Н И И Эпидемиологии Роспотребнадзора в методических рекомендациях по прим енению данного набора реагентов). 15.Одноразовы е полипропиленовы е пробирки для П Ц Р объем ом 0,2 мл или 0,1 мл - при работе с «П Ц Р -ко м пл екто м » вариант F R T -1 0 0 F: а) тонкостенны е пробирки для П Ц Р объемом 0 ,2 мл с выпуклой крышкой (например, A xygen, С Ш А ) - при использовании прибора планш етного типа; б) тонкостенны е пробирки для П Ц Р объемом 0,2 мл с плоской крышкой (например, A xygen, С Ш А ), или пробирки для П Ц Р к Rotor-G ene, объемом 0,1 мл в стрипах по 4 шт. с крышками (наприм ер, Corbett Research, Австралия; Q iagen, Герм ания) - при использовании прибора роторного типа. ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА Перед началом работы сл едует ознакомиться с м етодическим и рекомендациями «Взятие, транспортировка, хранение клинического м атериал а для П Ц Р - диагностики», разработанны м и Ф 1^Н Ц Н И И Э Р оспотребнадзора, Москва, 2008 г. М атериалом для исследования служит отд ел яем ое конъюнктивы человека. --- стр. 10 --- Ф О Р М А Т F E P ФОРМАТ FEP СОСТАВ Комплект реагентов «ДНК-сорб-АМ» вариант 100 - комплект реагентов для выделения Д Н К из клинического материала - включает; : 06beAf>;AOt.й . Кол-во Лизирующий раствор Прозрачная бесцветная жидкость^ 30 1 флакон Отмывочный раствор Прозрачная бесцветная жидкость 100 1 флакон Сорбент универсальный Суспензия белого цвета 1,0 2 пробирки ТЕ-буфер для элюции ДНК Прозрачная бесцветная жидкость 5,0 2 пробирки К комплекту реагентов «Д Н К -сор б-А М » прилагаю тся следую щ ие реагенты; |^;Лол-во ВКО комплексный Прозрачная бесцветная жидкость 1.0 1 пробирка BKO-FL Прозрачная бесцветная жидкость 1.0 1 пробирка ОКО Прозрачная бесцветная жидкость 1,2 1 пробирка Комплект реагентов рассчитан на вы деление Д Н К из 100 образцов, включая контроли. Входит в состав формы комплектации 4. Транспортная среда с муколитиком (ТСМ): Щ ^ Щ ^ 'О п и с а н и е ^ ^О бъ ем , м лМ - Кол-во Транспортная среда с муколитиком (ТСМ) Прозрачная жидкость розового цвета 0.5 100 пробирок Входит в состав формы комплектации 4. Комплект реагентов «ЭДЭМ» - комплект реагентов для экстракции Д Н К экспресс- методом « Э Д Э М » включает: ОЯмСЭЯив;^’ w ' О бъ ем , м л Кол-во Транспортная среда ТС-ЭДЭМ Прозрачная бесцветная жидкость 0,5 100 пробирок ВКО-Дилюент Прозрачная бесцветная жидкость 0,3 100 пробирок При хранении лизирующего раствора при температуре от 2 до 8 °С возможно образование осадка в виде кристаллов. 10 --- стр. 11 --- Ф О Р М А Т F E P К комплекту прилагается реагент: Щ р б ъ е м ^ л ^ У ^ К о л - в о ПЦР-буф ер-Фон Прозрачная бесцветная жидкость 0.5 2 пробирки Комплект реагентов рассчитан на вы деление Д Н К из 100 образцов, включая контроли. Входит в состав формы комплектации 5. К о м п л е кт р е а ге н т о в « П Ц Р -к о м п л е к т » в а р и а н т F E P - комплект реагентов для амплиф икации ф рагм ентов Д Н К C h lam y d ia tra ch o m atis сероваров А, В и С с гибридизационно-ф луоресцентной д етекцией по «конечной точке» - вклю чает; i S i f e - e o ‘ ^ ПЦР-смесь-1-FL C .trachom atis А, В, С раскапана под воск Прозрачная бесцветная жидкость 0,01 110 пробирок объемом 0,5 или 0,2 мл ПЦР-смесь-2-FL-red Прозрачная жидкость красного цвета 1,1 1 пробирка ПЦР-смесь-Ф он-red^ Прозрачная жидкость красного цвета 0,6 1 пробирка Минеральное масло для ПЦP^ Бесцветная вязкая жидкость 4,0 1 флакон ПКО ДНК C .trach o m atis А, В, С Прозрачная бесцветная жидкость 0,2 1 пробирка ДНК-буфер Прозрачная бесцветная жидкость 0,5 1 пробирка Комплект реагентов рассчитан на проведение 110 реакций амплификации, включая контроли. * Реагент используется при исследовании проб ДНК, выделенных с помощью набора «ДНК-сорб- АМ». ® Реагент используется при применении амплификаторов без термостатируемой крышки (например, «Терцик», «ДНК-Технология», Россия). 1 1 i --- стр. 12 --- Ф О Р М А Т F E P Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FEP-100 L - комплект реагентов для ам плиф икации ф рагм ентов Д Н К C h lam y d ia tra ch o m atis сероваров А, В и С с гибридизационно-ф луоресцентной д етекцией по «конечной точке» - включает; ПЦРч;месь C.trachomatis А, В, С -1у о ПЦР-смесь-Фон C.trachom atis А, В, С -1уо ПКО ДНК C.trachom atis А, В, С -1уо ДНК-буфер Порошок белого цвета Порошок белого цвета Порошок белого цвета Прозрачная бесцветная жидкость 0.5 110 пробирок объемом 0,2 мл 15 пробирок объемом 0,2 мл 1 пробирка 5 пробирок Комплект реагентов рассчитан на проведение 110 реакций амплификации, включая контроли. ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ П Ц Р -исследование состоит из следую щ их этапов; - Экстракция Д Н К из исследуемы х образцов. - Проведение ам плиф икации. - Ф луоресцентная д етекц и я продуктов ам плиф икации по «конечной точке». - И нтерпретация результатов. Д етальная инф орм ация по процедуре проведения ПЦР-исследования в зависимости от используемого оборудования излож ена в методических рекомендациях Ф Б УН Ц Н И И Эпидемиологии Р оспотребнадзора «Исследование клинического м атери ал а на наличие Д Н К C h lam y d ia trach o m atis сероваров А, В, С методом П Ц Р с гибридизационно-ф луоресцентной д етекц и ей ». ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ Для экстракции Д Н К используются комплекты реагентов «ДНК-сорб-АМ » или «Э Д Э М » производства Ф Б УН Ц Н И И Эпидем иологии Роспотребнадзора, или другие, реком ендованны е Ф Б УН Ц Н И И Эпидем иологии, в соответствии с инструкцией к используем ом у набору. Э кстракция Д Н К из каждого клинического образца проводится в присутствии внутреннего контрольного образца (B K O -F L f. ® При использовании комплекта реагентов «ЭДЭМ» внутренний контрольный образец (BKO-FL) входит в состав реагента ВКО-дилюент. 12 --- стр. 13 --- Ф О Р М А Т F E P При использовании формы выпуска набора 4 для экстракции Д Н К используется входящий в набор ком плект реагентов « Д Н К -со р б -А М ». При использовании формы выпуска набора 5 для экстракции Д Н К используется входящий в набор комплект реагентов « Э Д Э М » . ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ А. Подготовка пробирок для амплификации Выбор пробирок для амплификации зависит от используемого амплификатора. Для внесения в пробирки реагентов, проб ДНК и контрольных образцов используются одноразовые наконечники с фильтрами. А1. Подготовка пробирок при использовании комплекта реагентов «ПЦР- комплект» вариант FEP Общий объем реакционной смеси - 30 мкл, включая объем пробы ДНК • 10 мкл. 1. О тобрать необходим ое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-FL C .tra c h o m a tis А, В, С для ам плиф икации Д Н К исследуемы х и контрольных проб. 2. В пробирки с ПЦР-смесью-1-FL C .tr a c h o m a tis А, В, С на поверхность засты вшего воска внести по 10 мкл ПЦР-смеси-2-FL-red, при этом она не должна проваливаться под воск и см еш иваться с ПЦР-смесью-1-FL C .tr a c h o m a tis А, В, С. 3. Сверху добавить каплю минерального масла для ПЦР (при использовании ам плиф икатора без терм остатируем ой крышки). 4. В подготовленны е пробирки внести по 10 мкл проб ДНК, полученных в результате экстракции из исследуемы х или контрольных образцов. 5. Поставить контрольны е реакции; а) отрицательный контроль ПЦР (К-) - внести в пробирку 10 мкл ДНК-буфера. б) положительный контроль ПЦР (К+) - внести в пробирку 10 мкл ПКО ДНК C .tr a c h o m a tis А, В, С. в) отрицательный контроль экстракции ДНК (В-) - внести в пробирку 10 мкл пробы, вы деленной из ОКО. 6. Приготовить о б р азец «Фон». 6а.П ри исследовании проб Д Н К , выделенных с помощ ью набора «ДНК-сорб- 13 --- стр. 14 --- Ф О Р М А Т F E P AM», для приготовления образца «Фон» в пробирку с ПЦР-смесью-1-FL C .tra c h o m a tis А, В, С на поверхность засты вш его воска внести 20 мкл ПЦР- смеси-Фон-red. Сверху добавить каплю минерального масла для ПЦР (при использовании ам плиф икатора б ез терм остатируем ой крышки). бЬ.При исследовании проб Д Н К , выделенных с помощ ью набора «ЭДЗМ», для приготовления образца «Фон» в пробирку с ПЦР-смесью-1-FL C .tra c h o m a tis А, В, С на поверхность засты вш его воска внести 10 мкл ПЦР- буфера-Фон и 10 мкл пробы «В-», полученной в соответствии с инструкцией к набору «ЭДЭМ». С верху добавить каплю минерального масла для ПЦР (при использовании ам пл иф икатора без термостатируемой крышки). ^ Реком ендуется перед постановкой в ам плиф икатор осадить капли со стенок пробирок кратким центриф угированием на центриф уге/вортексе (1-3 с). А2. Подготовка пробирок при использовании комплекта реагентов «ПЦР- комплект» вариант FEP-100 L Общий объем реакционной смеси - 25 мкл. А2-1. Подготовка пробирок при анализе проб ДНК, полученных при ф экстракции с помощью набора «ДНК-сорб-АМ» 1. О тобрать необходим ое количество пробирок с ПЦР-смесью C .tra ch o m a tis А, В, С-1уо для ам плиф икации Д Н К исследуемы х и контрольных проб. 2. В подготовленны е пробирки внести по 25 мкл проб ДНК, полученных в результате экстракции из исследуемы х или контрольных образцов. ^ 3. Приготовить раствор ПКО ДНК C .tra c h o m a tis А, В, С-1уо. Для этого необходимо в пробирку с ПКО ДНК C .tra c h o m a tis А, В, С-1уо добавить 200 мкл ДНК-буфера, тщ ател ь но перем еш ать и осадить капли кратковременным центриф угированием на центриф уге/вортексе (1 -2 с). Приготовленный раствор ПКО ДНК C .tra c h o m a tis А, В, С-1уо можно хранить при тем пературе от 2 до 8 °С в течен ие 9 мес. 4. Поставить контрольны е реакции; а) отрицательный контроль ПЦР (К-) - внести в пробирку 25 мкл ДНК-буфера. б) положительный контроль ПЦР (К+) - внести в пробирку 15 мкл ДНК- буфера и 10 мкл предварительно подготовленного раствора ПКО ДНК C .tra c h o m a tis А, В, С-1уо. в) отрицательный контроль экстракции ДНК (В-) - внести в пробирку 14 --- стр. 15 --- Ф О Р М А Т F E P 25 мкл пробы, вы деленной из О КО . 5. Приготовить о б р азец «Фон»: в пробирку с ПЦР-смесью-Фон C .tra ch o m a tis А, В, С-1уо внести 25 мкл ДНК-буфера. 6. Ч ерез 20 с (или бол ее) после внесения проб убедиться, что лиоф илизированная смесь растворилась (раствор в пробирках прозрачный), если ж е в какой-либо из пробирок смесь не полностью растворилась, тщ ательно п ер ем еш ать е е пипетированием. Реком ендуется перед постановкой в ам плиф икатор осадить капли со стенок пробирок кратким центриф угированием на центриф уге/вортексе (1-3 с). А2-2. Подготовка пробирок при анализе проб ДНК, полученных при экстракции с помощью комплекта реагентов «ЭДЭМ» 1. О тобрать необходим ое количество пробирок с ПЦР-смесью C .tra ch o m a tis А, В, С-1уо для ам плиф икации Д Н К исследуемы х и контрольных проб. 2. Внести в каждую из пробирок по 15 мкл ДНК-буфера. 3. Затем в подготовленны е пробирки внести по 10 мкл проб Д Н К , полученных в результате экстракции из исследуемы х или контрольных образцов, и тщ ательно п ерем еш ать пипетированием. 4. Приготовить раствор ПКО ДНК C .tra c h o m a tis А, В, С-1уо. Для этого необходимо в пробирку с ПКО ДНК C .tra c h o m a tis А, В, С-1уо добавить 200 мкл ДНК-буфера, тщ ател ь но перем еш ать и осадить капли кратковременным центриф угированием на центриф уге/вортексе (1 -2 с). Приготовленный раствор ПКО ДНК C .tra c h o m a tis А, В, С-1уо м ожно хранить при тем пературе от 2 до 8 °С в течен и е 9 мес. 5. Поставить контрольны е реакции; а) отрицательный контроль ПЦР (К-) - внести в пробирку 10 мкл ДНК-буфера. б) положительный контроль П Ц Р (К+) - внести в пробирку 10 мкл предварительно подготовленного раствора П КО Д Н К C .trachom atis А, В, С -1уо. в) отрицательный контроль экстракции ДНК (В-) - внести в пробирку 10 мкл пробы, вы деленной из О КО . 6. Приготовить об разец «Фон»: в пробирку с ПЦР-смесыо-Фон C .tra ch o m a tis А, В, С-1уо внести 15 мкл ДНК-буфера и 10 мкл пробы «В-», полученной в соответствии с инструкцией к набору «ЭДЭМ», и тщ ательно перемешать пипетированием. 7. Ч ерез 20 с (или более) после внесения проб убедиться, что 1 5 --- стр. 16 --- Ф О Р М А Т F E P лиоф илизированная смесь растворилась (раствор в пробирках прозрачный), если ж е в какой-либо из пробирок смесь растворилась не полностью, тщ ательно п ерем еш ать е е пипетированием. Реком ендуется п еред постановкой в ам плиф икатор осадить капли со стенок пробирок кратким центриф угированием на центриф уге/вортексе (1-3 с). Б. Проведение амплификации 1. Запустить на ам плиф икаторе соответствую щую программу термоциклирования: при использовании «П Ц Р -ком пл екта» вариант F E P - программу «АмплиСенс-1- FEP» (см. табл. 1), при использовании «П Ц Р -ком пл екта» вариант FE P-100 L - программу «АмплиСенс-1-FEP F» (см. табл. 2). 2. Когда тем п ер атур а в ячейках достигнет 95 °С (реж им паузы), поставить пробирки в ячейки ам плиф икатора и нажать кнопку продолжения программы. Таблица 1 Программа «АмплиСеис-1-FEP» «Терцик» GeneAmp PCR System 2700 Gradient Palm Cycler, MaxyGene Цикл Темпе ратура, °С Время Циклы Темпе ратура, °С Время Циклы Темпе ратура, °C Время Циклы 0 95 Па'р а 95 Па'/за 95 Пауза 1 95 5 мин 1 95 5 мин 1 95 5 мин 1 2 95 2 с 35 95 20 с 20 95 2 с 2465 5 с 65 25 с 65 Ю с 72 5 с 72 30 с 72 Ю с 3 95 2 с 9 95 20 с 24 95 2 с 2060 Ю с 60 30 с 60 15с 72 5 с 72 30 с 72 Ю с 4 95 2 с 1 95 20 с 1 95 2 с 160 Ю с 60 30 с 60 15с 5 10 Хранение 10 Хранение 10 Хранение 16 --- стр. 17 --- Ф О Р М А Т F E P Таблица 2 Программа «АмплиСенс-1-FEP F» «Терцик» GeneAmp PCR System 2700 Gradient Palm C ycler, MaxyGene Цикл Темпе- ратура, °C Время Циклы Темпе р а т у р а ^Время Циклы Темпе р а т у р а ^Время Циклы 95 Пауза 95 Пауза 95 Пауза 95 15 мин 95 15 мин 1 95 15 мин 95 2 с 95 20 с 95 2 с 65 5 с 35 65 25 с 20 65 Ю с 24 72 5 с 72 30 С 72 Ю с 95 2 с 95 20 с 95 2 с 60 Ю с 60 30 с 24 60 15с 20 72 5 с 72 30 с 72 Ю с 95 2 с 60 Ю с 1 95 20 с 60 30 с 1 95 2 с 60 15с 1 10 Хранение 10 Хранение 10 Хранение Прим ечание - Програм мы терм оциклирования/ам плиф икации для других моделей амплиф икаторов описаны в методических реком ендациях «Исследование клинического м атер и ал а на наличие Д Н К C h la m y d ia trach o m atis сероваров А, В, С методом П Ц Р с гибридизационно-ф луоресцентной д етекц и ей ». 3. По окончании вы полнения программы приступить к ф луоресцентной детекции. ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ ПО «КОНЕЧНОЙ ТОЧКЕ» Детекция проводится с помощью ф луоресцентного П Ц Р -д етектора (согласно инструкции к используем ом у прибору) путем измерения интенсивности ф луоресцентного сигнала по трем каналам: - по каналу FA M (или аналогичному, в зависим ости от модели прибора) регистрируется сигнал о накоплении продукта ам плиф икации ф рагмента Д Н К C hlam ydia tra ch o m atis сероваров А, В, С. - по каналу H E X (или аналогичному, в зависим ости от модели прибора) регистрируется сигнал о накоплении продукта амплиф икации ф рагмента Д Н К C h lam ydia tra ch o m atis лю бого серовара. - по каналу R O X (или аналогичному, в зависим ости от модели прибора) регистрируется сигнал о накоплении продукта амплиф икации Д Н К ВКО. ВНИМАНИЕ! Д о проведения детекции в програм м ное обеспечении ПЦР-детектора должны быть внесены и сохранены соответствую щ ие настройки - см. вкладыш к 1 7 --- стр. 18 --- Ф О Р М А Т F E P ПЦ Р-ком плекту, а та кж е м етодические реком ендации Ф Б УН Ц Н И И Эпидемиологии Роспотребнадзора «И ссл ед ование клинического м атери ал а на наличие Д Н К C hlam ydia tra ch o m atis сероваров А, В, С м етодом П Ц Р с гибридизационно- ф луоресцентной д етекц и ей ». ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ Полученны е результаты интерпретирую т на основании данных об уровне ф луоресцентного сигнала относительно ф она по соответствую щ им каналам для контрольных образцов и проб Д Н К , полученных путем экстракции из клинических образцов. И нтерпретац и я производится автом атически с помощью программного обеспечения используем ого прибора. Принцип интерпретации результатов следующий: - ДНК C h la m y d ia tra c h o m a tis сероваров А, В, С обнаружена, если для данной пробы сигнал по каналу РАМ выше установленного для этого канала порогового значения положительного результата. - ДНК C h la m y d ia tra c h o m a tis сероваров А, В, С не обнаружена, обнаружена ДНК C h la m y d ia tra c h o m a tis других сероваров, если для данной пробы сигнал по каналу РАМ ниже установленного для этого канала порогового значения отрицательного результата, а сигнал по каналу HEX выше установленного для этого канала порогового значения положительного результата. - ДНК C h la m y d ia tra c h o m a tis , включая серовары А, В, С, не обнаружена, если для д анной пробы сигнал по каналам РАМ и H E X ниже установленных для этих каналов пороговых значений отрицательного результата, а сигнал по каналу R O X выше установленного порогового значения. - Результат ан ал и за невалидный, если для д анной пробы сигнал по каналам РАМ и H E X ниж е порогового значения отрицательного результата, и сигнал по каналу R O X ниже установленного порогового значения. - Результат ан ал и за сомнительный, если для д анной пробы сигнал по каналу РАМ и/или по каналу H E X выше установленного порогового значения отрицательного результата, но ниже порогового значения положительного результата (сигнал находится м ежду пороговыми значениям и). 1 8 --- стр. 19 --- Ф О Р М А Т F E P Если для пробы получен невалидный или сомнительный результат, требуется повторить П Ц Р -и ссл ед ов ание соответствую щ его исследуемого образца. Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с табл. 3. Таблица 3 Результаты для контролей различных этапов ПЦР-исследования Контроль Контролируем ы й этап ПЦР- исследования Сигнал по каналам FAM и МЕХ Сигнал по каналу ROX Обозначение результата в программах некоторых детекторов Ниже порогового Выше В - Экстракция ДНК значения отрицательного результата порогового значения « -» или «ОК» Ниже порогового Ниже К - ПЦР значения отрицательного результата порогового значения «ид» • К+ ПЦР Выше порогового значения положительного Выше порогового значения «+» или «ОК» результата ВНИМАНИЕ! 1. Если для положительного контроля П Ц Р (К+) сигнал по каналам РАМ и/или МЕХ ниже порогового значения положительного результата, необходимо повторить ам плиф икацию и детекцию для всех образцов, для которых, соответственно, сигнал по каналам РАМ и/или H E X ниже порогового значения положительного результата. 2. Если для отрицательного контроля экстракции Д Н К (В -) или/и отрицательного контроля П Ц Р ( К -) сигнал по каналам РАМ или/и H E X выше порогового значения положительного результата, необходимо повторить ПЦ Р-исследование для всех образцов, для которых, соответственно, сигнал по каналам РАМ или (и) H E X выше порогового значения положительного результата. --- стр. 20 --- Ф О Р М А Т F R T ФОРМАТ FRT СОСТАВ Комплект реагентов «ДНК-сорб-АМ» вариант 100 - комплект реагентов для выделения Д Н К из клинического материала включает: Лизирующий раствор Прозрачная бесцветная жидкость^ 30 1 флакон Отмывочный раствор Прозрачная бесцветная жидкость 100 1 флакон Сорбент универсальны й Суспензия белого цвета 1.0 2 пробирки ТЕ-буфер для элю ции Д Н К Прозрачная бесцветная жидкость 5,0 2 пробирки К комплекту реагентов «Д Н К -сор б-А М » прилагаю тся следую щ ие реагенты: ^ К о л - в о ВКО комплексный Прозрачная бесцветная жидкость 1,0 1 пробирка BKO-FL Прозрачная бесцветная жидкость 1,0 1 пробирка ОКО Прозрачная бесцветная жидкость 1.2 1 пробирка Комплект реагентов рассчитан на вы деление Д Н К из 100 образцов, включая контроли. Входит в состав формы комплектации 4. Транспортная среда с муколитиком (ТСМ): м лк ,^ К б л -в о Транспортная среда с муколитиком (ТСМ) Прозрачная жидкость розового цвета 0,5 100 пробирок Входит в состав формы комплектации 4. Комплект реагентов «ЭДЭМ» - комплект реагентов для экстракции Д Н К экспресс- методом « Э Д Э М » включает: Р еакт ив О писаний: О б ъ ем , м л Транспортная среда ТС-ЭДЭМ Прозрачная бесцветная жидкость 0,5 100 пробирок ВКО-Дилюент Прозрачная бесцветная жидкость 0,3 100 пробирок ^ При хранении лизирующего раствора при температуре от 2 до 8 “С возможно образование осадка в виде кристаллов. 20 --- стр. 21 --- Ф О Р М А Т F R T Ф К комплекту прилагается реагент: “'О б ъ ем , м л^'^&ёКбл~во ПЦР-буфер-Фон Прозрачная бесцветная жидкость 0.5 2 пробирки Комплект реагентов рассчитан на вы деление Д Н К из 100 образцов, включая контроли. Входит в состав формы комплектации 5. Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT - комплект реагентов для амплиф икации ф рагм ентов Д Н К C h lam y d ia tra ch o m atis сероваров А, В, С с гибридизационно-ф луоресцентной д етекцией в реж и м е «реального времени» - включает: ; О бъ ем , м л : К о л -в & ПЦР-смесь-1 -FL C .trachom atis А, В, С раскапана под воск Прозрачная бесцветная жидкость 0,01 110 пробирок объемом 0,2 мл ПЦР-смесь-2-FL-red Прозрачная жидкость красного цвета 1.1 1 пробирка ПКО ДНК C .trach o m atis А, В, С Прозрачная бесцветная жидкость 0,2 1 пробирка ДНК-буфер Прозрачная бесцветная жидкость 0,5 1 пробирка Комплект реагентов рассчитан на проведение 110 реакций амплиф икации, включая контроли. Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 F - комплект реагентов для амплиф икации ф рагм ентов Д Н К C h lam y d ia tra ch o m atis сероваров А, В, С с гибридизационно-ф луоресцентной д етекцией в реж и м е «реального времени» - включает: М М М ПЦР-смесь-1-FL C .trachom atis А, В, С Прозрачная бесцветная жидкость 1.2 1 пробирка ПЦР-смесь-2-FRT Прозрачная бесцветная жидкость 0,3 2 пробирки Полимераза (TaqF) Прозрачная бесцветная жидкость 0,03 2 пробирки ПКО ДНК C .trach o m atis А, В, С Прозрачная бесцветная жидкость 0.2 1 пробирка ДНК-буфер Прозрачная бесцветная жидкость 0.5 1 пробирка Комплект реагентов рассчитан на проведение 110 реакций амплиф икации, включая контроли. 21 --- стр. 22 --- Ф О Р М А Т F R T Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 L - комплект реагентов для амплиф икации ф рагм ентов Д Н К C h lam y d ia tra ch o m atis сероваров А, В и С с гибридизационно-ф луоресцентной д етекцией в реж и м е «реального времени» - включает: ПЦР-смесь C.trachom atis А, В, С-1уо ПКО ДНК C .trachom atis А, В, С-1уо ДНК-буфер Порошок белого цвета Порошок белого цвета Прозрачная бесцветная жидкость 0,5 Щ ^ К о п -в 6 110 пробирок объемом 0,2 мл 1 пробирка 5 пробирок Комплект реагентов рассчитан на проведение 110 реакций амплиф икации, включая контроли. ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ П Ц Р -исследование состоит из следую щ их этапов; - Экстракция Д Н К из исследуемы х образцов. - Проведение ам плиф икации с гибридизационно-ф луоресцентной детекцией в режиме «реального врем ени». - Анализ и интерпретация результатов. Д етальная инф орм ация по процедуре проведения ПЦР-исследования в зависимости от типа используемого оборудования излож ена в методических рекомендациях Ф Б У Н Ц Н И И Эпидемиологии Р оспотребнадзора «Исследование клинического м атер и ал а на наличие Д Н К C h lam y d ia tra ch o m atis сероваров А, В, С методом П Ц Р с гибридизационно-ф луоресцентной д етекц и ей». ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ Для экстракции Д Н К используются наборы реагентов «ДНК-сорб-АМ » или «Э Д Э М » производства Ф Б У Н Ц Н И И Эпидемиологии Роспотребнадзора, или другие рекомендованны е Ф Б УН Ц Н И И Эпидемиологии Р оспотребнадзора в соответствии с инструкцией к используем ом у набору. Экстракция Д Н К из каждого исследуемого g образца проводится в присутствии внутреннего контрольного образца (BKO-FL) . ® При использовании комплекта реагентов «ЭДЭМ» внутренний контрольный образец (BKO-FL) входит в состав реагента ВКО-дилюент. 22 --- стр. 23 --- Ф О Р М А Т F R T При использовании формы выпуска набора 4 для экстракции Д Н К используется входящий в набор ком плект реагентов «Д Н К -сор б -А М ». При использовании формы выпуска набора 5 для экстракции Д Н К используется входящ ий в набор комплект реагентов « Э Д Э М ». ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ» А. Подготовка пробирок для амплификации Выбор пробирок для амплификации зависит от используемого амплификатора с системой детекции в режиме «реального времени». Для внесения в пробирки реагентов, проб ДНК и контрольных образцов используются одноразовые наконечники с фильтрами. А1. Подготовка пробирок для проведения амплификации при помощи комплекта реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT Общий объем реакционной смеси - 30 мкл, включая объем пробы ДНК - 10 мкл. 1. Отобрать необходим ое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-FL C .tra ch o m a tis А, В, С для ам плиф икации Д Н К исследуемы х и контрольных проб. 2. На поверхность воска внести по 10 мкл ПЦР-смеси-2-FL-red, при этом она не должна проваливаться под воск и см еш иваться с ПЦР-смесью-1-FL C .tra c h o m a tis А, В, С. 3. В подготовленны е пробирки внести по 10 мкл проб ДНК, полученных в результате экстракции из исследуемы х или контрольных образцов. 4. Поставить контрольны е реакции: а) отрицательный контроль ПЦР (К-) - внести в пробирку 10 мкл ДНК-буфера. б) положительный контроль ПЦР (К+) - внести в пробирку 10 мкл ПКО ДНК C .tra c h o m a tis А, В, С. в) отрицательный контроль экстракции ДНК (В-) - внести в пробирку 10 мкл пробы, вы деленной из О КО . 23 --- стр. 24 --- Ф О Р М А Т F R T А2. Подготовка пробирок для проведения амплификации при помощи комплекта реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 F Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, включая объем пробы ДНК - 10 мкл. 1. Перемеш ать содерж имое пробирок с реагентами ПЦР-смесь-1-FL C .tra ch o m a tis А, В, С, ПЦР-смесь-2-FRT, полимераза (TaqF) и осадить капли кратковременным центрифугированием (1-2 с) с помощью центрифуги/вортекса. 2. Отобрать необходим ое количество пробирок или стрипов для амплификации Д Н К исследуемы х и контрольных проб. 3. Для проведения N реакций (включая 2 контроля П Ц Р ) смешать в отдельной пробирке 10*(N +1) мкл ril4P4:Mecn-1-FL C .tra c h o m a tis А, В, С, 5,0*(N +1) мкл ПЦР- смеси-2-FRT и 0 ,5 *(N + 1 ) мкл полимеразьг (TaqF). 4. Перемеш ать подготовленную смесь и осадить капли кратковременным центрифугированием с помощью центриф уги/вортекса (1-2 с). 5. Внести в каждую пробирку по 15 мкл подготовленной смеси. 6. В подготовленны е пробирки внести по 10 мкл проб ДНК, полученных в результате экстракции из исследуемы х или контрольных образцов. 7. Поставить контрольны е реакции: а) отрицательный контроль ПЦР (К-) - внести в пробирку 10 мкл ДНК-буфера. б) положительный контроль ПЦР (К+) - внести в пробирку 10 мкл ПКО ДНК C .tra c h o m a tis А, В, С. в) отрицательный контроль экстракции ДНК (В-) - внести в пробирку 10 мкл пробы, вы деленной из О КО . АЗ. Подготовка пробирок для проведения амплификации при помощи комплекта реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 L АЗ-1. Подготовка пробирок при анализе проб ДНК, полученных при экстракции с помощью набора «ДНК-сорб-АМ» 1. Отобрать необходим ое количество пробирок с ПЦР-смесью C .tra c h o m a tis А, В, С-1уо для ам плиф икации Д Н К исследуемы х и контрольных проб. 2. В подготовленны е пробирки внести по 25 мкл проб ДНК, полученных в результате экстракции из исследуемы х или контрольных образцов. 3. Приготовить раствор ПКО ДНК C .tra c h o m a tis А, В, С-1уо. Для этого необходимо в пробирку с ПКО ДНК С. tra c h o m a tis А, В, С-1уо добавить 200 мкл ДНК- буфера, тщ ател ь но перем еш ать и осадить капли кратковременным 24 --- стр. 25 --- Ф О Р М А Т F R T центриф угированием с помощью центриф уги/вортекса (1 -2 с). Приготовленный раствор ПКО ДНК C .tra c h o m a tis А, В, С-1уо можно хранить при тем пературе от 2 до 8 в теч е н и е 9 мес. 4. Поставить контрольны е реакции: а) отрицательный контроль ПЦР (К-) - внести в пробирку 25 мкл ДНК-буфера. б) положительный контроль ПЦР (К+) - внести в пробирку 15 мкл ДНК- буфера и 10 мкл предварительно подготовленного раствора ПКО ДНК C .tra c h o m a tis А, В, С-1уо. в) отрицательный контроль экстракции ДНК (В-) - внести в пробирку 25 мкл пробы, вы деленной из О КО . 5. Через 20 с (или бол ее) после внесения проб и контролей убедиться, что лиоф илизированная смесь растворилась (раствор в пробирках прозрачный), если ж е в какой-либо из пробирок смесь не полностью растворилась, тщ ательно перем еш ать е е пипетированием . АЗ-2. Подготовка пробирок при анализе проб ДНК, полученных при экстракции с помощью комплекта реагентов «ЭДЭМ» 1. Отобрать необходим ое количество пробирок с ПЦР-смесью C .tra ch o m a tis А, В, С-1уо для ам плиф икации Д Н К исследуемы х и контрольных проб. 2. Внести в каждую из пробирок по 15 мкл ДНК-буфера. 3. Затем в подготовленны е пробирки внести по 10 мкл проб ДНК, полученных в результате экстракции из исследуемы х или контрольных образцов. 4. Приготовить раствор ПКО ДНК C .tra c h o m a tis А, В, С-1уо. Для этого необходимо в пробирку с ПКО ДНК C .tra c h o m a tis А, В, С-1уо добавить 200 мкл ДНК- буфера, тщ ател ь но перем еш ать и осадить капли кратковременным центриф угированием с помощью центриф уги/вортекса (1-2 с). Приготовленный раствор ПКО ДНК C .tra c h o m a tis А, В, С-1уо можно хранить при температуре от 2 до 8 “С в те ч е н и е 9 мес. 5. Поставить контрольны е реакции: а) отрицательный контроль ПЦР (К-) - внести в пробирку 10 мкл ДНК-буфера. б) положительный контроль ПЦР (К+) - внести в пробирку 10 мкл предварительно подготовленного раствора ПКО ДНК С. tra ch o m a tis А, В, С -1уо. в) отрицательный контроль экстракции ДНК (В-) - внести в пробирку 10 мкл пробы, вы деленной из О КО . 6. Через 20 с (или б о л ее) после внесения проб убедиться, что лиофилизированная 2 5 --- стр. 26 --- Ф О Р М А Т F R T смесь растворилась (раствор в пробирках прозрачны й), если ж е в какой-либо из пробирок смесь не полностью растворилась, тщ ател ь но перемеш ать ее пипетированием. Б. Проведение амплификации с детекцией в режиме «реального времени» 1. Запрограммировать прибор (амплиф икатор с системой детекции в режиме «реального врем ени») для выполнения соответствующей программы амплификации и детекции ф луоресцентного сигнала «АмплиСенс-1» (см. табл. 4). Таблица 4 Программа «АмплиСенс-1» Цикл Приборы роторного ти па® Темпера тура, "С 95 95 60 72 95 60 72 Время 15 мин 5 с 20 с 1 5 с 5 с 20 с детекция флуоресц. сигнала 1 5 с Число повторов циклов 1 40 Приборы планшетного типа1 0 Темпера тура, °С 95 95 60 72 95 60 72 Время 15 мин 5 с 20 с 1 5 с 5 с 30 с детекция флуоресц. сигнала 1 5 с Число повторов циклов 1 40 Д етекция ф луоресцентного сигнала назначается по каналам для флуорофоров FAM, JO E, R O X (при одноврем енном проведении других тестов назначается детекция и по другим используемы м каналам ). 2. Реком ендуется перед постановкой в ам плиф икатор осадить капли со стенок пробирок кратковрем енны м (1-3 с) центриф угированием с помощью центриф уги/вортекса. 3. Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора. 4. Запустить вы полнение программы амплиф икации с д етекц и ей ф луоресцентного сигнала. 5. По окончании вы полнения программы приступить к анализу и интерпретации результатов. ® например, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия), Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия) и рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора в методических рекомендациях по применению данного набора реагентов. например, iCycler Ю, iQ5 (Bio-Rad, США) и рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора в методических рекомендациях по применению данного набора реагентов. 26 --- стр. 27 --- Ф О Р М А Т F R T АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ Анализ результатов проводят с помощью програм м ного обеспечения прибора, используемого для проведения П Ц Р с д етекцией в реж и м е «реального времени». Анализирую т кривые накопления ф луоресцентного сигнала по трем каналам; - по каналу для ф луороф ора FA M регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплиф икации ф рагм ента Д Н К C h lam yd ia trachom atis сероваров А, В, С; - по каналу для ф луороф ора JO E регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта ам плиф икации Д Н К C h la m y d ia trachom atis любого серовара; - по каналу для ф л уороф ора R O X регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта ам плиф икации Д Н К ВКО. Результаты интерпретирую тся на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой ф луоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что опред ел яет наличие (или отсутствие) для данной пробы Д Н К значения порогового цикла С / в соответствую щ ей граф е в таб л и ц е результатов. Принцип интерпретации результатов следую щ ий: - ДНК C h la m y d ia tra c h o m a tis сероваров А, В, С обнаружена, если для данной пробы в таб л и ц е результатов по каналу для ф луороф ора FAM определено значение порогового цикла Ct. При этом кривая ф луоресценции данной пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъ ем а ф луоресценции. - ДНК C h la m y d ia tra c h o m a tis сероваров А, В, С не обнаружена, обнаружена ДНК C h la m y d ia tra c h o m a tis других сероваров, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для ф луороф ора FA M не определено (отсутствует) зн ачен и е порогового цикла Ct, а в таб л и ц е результатов по каналу для детекции ф луороф ора JO E определено зн ачен и е порогового цикла Ct. При этом кривая ф луоресценции данной пробы по каналу для флуорофора JOE должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъ ем а ф луоресценции. - ДНК C h la m y d ia tra c h o m a tis , включая серовары А, В, С, не обнаружена, если для данной пробы в таб л и ц е результатов соответственно по каналам для ф луороф оров FA M и J O E не определено (отсутствует) значение порогового цикла C t (кривая ф луоресценции не пересекает пороговую линию ), а в таблице 2 7 --- стр. 28 --- Ф О Р М А Т F R T результатов по каналу для ф луороф ора R O X оп ред ел ено значение порогового цикла Ct, не превы ш аю щ ее указанное граничное значение. - Результат анализа невалидный, если для д анной пробы не определено (отсутствует) зн ачен и е порогового цикла C t по канал ам для флуорофоров FAM и JO E, а по каналу для ф луороф ора R O X зн ачен и е C t такж е не определено (отсутствует) или превы ш ает указанное граничное значение. В этом случае требуется повторно провести П Ц Р -и ссл ед ов ан ие соответствующего клинического образца. ВНИМАНИЕ! Граничны е значения C t указаны во вклады ш е, прилагаемом к набору реагентов. См. такж е м етодические реком ендации Ф Б УН Ц Н И И Эпидемиологии Роспотребнадзора «И ссл ед ов ани е клинического м атери ал а на наличие Д Н К C hlam ydia tra ch o m atis сероваров А, В, С м етодом П Ц Р с гибридизационно- ф луоресцентной д е текц и ей ». Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с таблицей оценки результатов контрольных реакций (табл. 5). Таблица 5 Результаты для контролей различных этапов ПЦР-исследования Контроль Контролируем ы й этап ПЦР- исследования Значение порогового цикла, Ct по каналу для ф луороф оров РАМ, JOE по каналу для ф луороф ора ROX В - Экстракция ДНК Значение отсутствует Определено значение меньше граничного К - ПЦР Значение отсутствует Значение отсутствует К+ ПЦР Определено значение меньше граничного Определено значение меньше граничного ВНИМАНИЕ! 1. Если для полож ительного контроля ГИДР (К+) зн ачен и е порогового цикла C t по каналам РАМ и/или J O E отсутствует или превы ш ает граничное значение, необходимо повторить амплиф икацию для всех образцов, для которых отсутствует зн ачен и е порогового цикла, соответственно, по каналам РАМ и/или JOE. 28 --- стр. 29 --- Ф О Р М А Т F R T 2. Если для отрицательного контроля экстракции Д Н К (В -) или/и отрицательного контроля П Ц Р ( К -) по каналам FAM или/и J O E опред ел ено значение порогового цикла Ct, необходим о повторить П Ц Р -и ссл ед ов ан ие для всех образцов, для которых оп ред ел ено зн ачени е порогового цикла, соответственно, по каналам РАМ или/и JO E . 29 --- стр. 30 --- СРОК г о д н о с т и . УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ и ХРАНЕНИЯ Срок годности. 9 мес. Набор реагентов с истекшим сроком годности применению не подлежит. С рок годности вскрытых реагентов соответствует сроку годности, указанному на этикетках для невскрытых реагентов, если в инструкции не указано иное. Транспортирование. Н абор реагентов транспортировать при тем пературе от 2 до 8 °С не б о л ее 5 сут. «П Ц Р -ком пл ект» вариант F R T -1 0 0 F при получении разукомплектовать в соответствии с указанны ми тем п ературам и хранения. Хранение. Комплект реагентов «ДНК-сорб-АМ » и «Транспортную среду с муколитиком (Т С М )» хранить при тем пературе от 2 до 25 °С. ВКО комплексный, ВКО- FL и О КО (из комплекта реагентов «ДНК-сорб-АМ »), комплект реагентов «ЭДЭМ » и комплект реагентов «П Ц Р -ком пл ект» хранить при тем пературе от 2 до 8 °С. П Ц Р -см есь-1-F L C .tra c h o m a tis А, В, С , П Ц Р -см есь C .tra c h o m a tis А, В, С-1уо , П Ц Р - смесь-Фон C .tra c h o m a tis А, В, С-1уо хранить в защ и щ ен н ом от света месте. П Ц Р - смесь-2-F R T и полим еразу (T a q F ) хранить при те м п ер атур е не выше минус 16 °С. П Ц Р-см есь C .trach o m atis А, В, С-1уо, П Ц Р -см есь-Ф он C .trach o m atis А, В, С-1уо и ПКО Д Н К C .tra c h o m a tis А, В, С-1уо (до растворения) хранить в пакетах с влагопоглотителем. Условия отпуска. Д л я лечебно-проф илактических и санитарно-проф илактических учреждений. Рекламации на качество набора реагентов «АмплиСенс® C h la m y d ia tra c h o m a tis -A , В , С-FL» направлять на предприятие-изготовитель ФБУН Ц НИИ Эпидемиологии Р оспотребнадзора (1 1 1 1 2 3 г. М осква, ул. Новогиреевская, д. За) в отдел по работе с реклам ациям и и организации обучения (тел. (495) 974-96-46, факс (495) 9 1 6 -1 8 -1 8 , e-m ail: products@ pcr.ru). Заведующий НПЛ О М Д и Э V Е.Н. Родионова ФБУН Ц Н И И Эпидемиологии Роспотребнадзора Главный врач Ф ГВ У «П оликлиника № 1» ^ Е.Л.Никонов Управления д ел ам и П рези д ен та ^ / у у / / у у у Российской Ф едерации , Отзывы и предложения о продукции «АмплиСенс» вы можете оставить, заполнив анкету потребителя на сайте: www.amplisensTu. 30 --- стр. 31 --- с и м в о л ы , ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ R E F LOT Номер в каталоге Код партии А V Осторожно! Обратитесь к сопроводительной документации Максимальное число тестов в IVD VER II ш 1 Изделие для in vitro диагностики Дата изменения Ограничение температуры Верхнее ограничение температуры Производитель ( w f Использовать до Обратитесь к руководству по эксплуатации Не допускать попадания солнечного света Дата изготовления Беречь от влаги 31 --- стр. 32 --- Пронумеровано, прошнуровано и скреплено лист БУН ЦНИИ Эпидемиологии 51в.В.Малеев