Набор реагентов для детекции генетических полиморфизмов методом пиросеквенирования с применением системы генетического анализа серии PyroMark "АмплиСенс® Пироскрин" по ТУ 9398-161-01897593-2011 — инструкция и характеристики

РУ: ФСР 2012/13246 от 19.03.2012 · класс риска 2а

Производитель: ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Россия)

Автоматически отфильтрованный фрагмент инструкции по применению (страницы, где похоже, что есть таблица технических характеристик) — не полный документ. Карточка РУ на портале Росздравнадзора →

Текст инструкции: технические характеристики

--- стр. 6 ---
Ф орма 15 включает комплект реагентов «КОЛО-скрин» -  профиль генетического 
исследования «Болезнь Крона». Комплект реагентов предназначен для выявления 
генетических полиморф измов в генах, ассоциированных с предрасположенностью к 
болезни Крона.
Форма 16 включает комплект реагентов «ФАРМ А-скрин-1» -  профиль генетического 
исследования «I фаза биотрансформации, профиль 1». Комплект реагентов 
предназначен для выявления генетических полиморфизмов в генах, влияющих на 
индивидуальные особенности фармакологического ответа.
Форма 17 включает комплект реагентов «ФАРМА-скрин-2а» -  профиль 
генетического исследования «II фаза биотрансформации, профиль 1». Комплект 
реагентов предназначен для выявления генетических полиморфизмов в генах, 
влияющих на индивидуальные особенности ф армакологического ответа.
Форма 18 включает комплект реагентов «ФАРМА-скрин-2б» -  профиль 
генетического исследования «II фаза биотрансформации, профиль 2». Комплект 
реагентов предназначен для выявления генетических полиморфизмов в генах, 
влияющих на индивидуальные особенности ф армакологического ответа.
Форма 19 включает комплект реагентов «ФАРМА-скрин-транспорт» -  профиль 
генетического исследования «Транспорт лекарств». Комплект реагентов 
предназначен для выявления генетических полиморфизмов в генах, влияющих на 
индивидуальные особенности фармакологического ответа.
Форма 20 включает комплект реагентов «ФАРМА-скрин-Варфарин» -  профиль 
генетического исследования «Варфарин». Комплект реагентов предназначен для 
выявления генетических полиморфизмов в генах, влияющих на расчет дозы 
варфарина с помощью Интернет-ресурса www.warfarindosing.org/.
Форма 21 включает комплект реагентов «ФАРМА-скрин-Иматиниб» -  профиль 
генетического исследования «Иматиниб». Комплект реагентов предназначен для 
выявления генетических полиморфизмов в генах, ассоциированных с 
эффективностью терапии иматинибом.
Форма 22 включает комплект реагентов «ССР5с1е132-скрин» -  профиль 
генетического исследования «CCR5del32». Комплект реагентов предназначен для 
выявления делеционного полиморфизма в гене CCR5, влияющего на 
индивидуальные особенности иммунитета.
Форма 23 включает комплект реагентов «СПОРТ-мио-скрин» -  профиль 
генетического исследования «Структура мышц». Комплект реагентов предназначен 
для выявления генетических полиморфизмов в генах, ассоциированных с
6 из 26


--- стр. 7 ---
индивидуальными морфологическими особенностями мышечной ткани и 
предрасположенностью к типу физической нагрузки.
Форма 24 включает комплект реагентов «СПОРТ-энерго-скрин» -  профиль 
генетического исследования «Энергетический обмен». Комплект реагентов 
предназначен для выявления генетических полиморфизмов в генах, 
ассоциированных с индивидуальными особенностями энергетического обмена 
мышечной ткани и предрасположенностью к типу физической нагрузки.
Форма 25 включает наборы реагентов оптом, расфасованные по отдельным 
реагентам, с маркировкой реагентов на их оптовой фасовке.
Форма комплектации 1  предназначена для связывания ПЦР-продукта, 
проведения очистки реакционной смеси и денатурации ампликона с использованием 
станции для пробоподготовки Vacuum Ргер W orkstation. Для связывания ПЦР- 
продукта необходимо использовать дополнительный реагент Streptavidin Sepharose 
High Performance (GE Healthcare). Состав формы комплектации 1  и описание 
входящих в нее реагентов находятся в соответствующем приложении к данной 
инструкции.
Формы комплектации 2-24 предназначены для проведения амплификации ДНК и 
постановки реакции пиросеквенирования. Для проведения полного ПЦР- 
исследования необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции ДНК, 
рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Состав форм 
комплектаций 2-24 и описание входящих в них генетических локусов находятся в 
соответствующих приложениях к данной инструкции.
Форма комплектации 25 предназначена для производственных целей для 
последующей маркировки на языке заказчика и комплектации по наборам. 
ВНИМАНИЕ! Форма комплектации 25 используется только в соответствии с 
регламентом, утвержденным ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖ НОСТИ
Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно­
биологические (ПЦР) исследования клинического материала на наличие 
возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-эпидемических 
правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV  групп 
патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СанПиН
2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с 
медицинскими отходами» и методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация
7 из 26


--- стр. 8 ---
работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при 
работе с материалом, содержащим микроорганизмы 1-IV групп патогенности».
При работе всегда следует выполнять следующие требования:
- Следует рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные, 
организовывать работу и хранение в соответствии с СП 1.3.2322-08 
«Безопасность работы с микроорганизмами III-IV  групп патогенности 
(опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
- Убирать и дезинф ицировать разлитые образцы или реактивы, используя 
дезинфицирующие средства в соответствии СП 1.3.2322-08 «Безопасность 
работы с микроорганизмами III-IV  групп патогенности (опасности) и 
возбудителями паразитарных болезней».
- Удалять неиспользованные реактивы в соответствии с требованиями СанПиН
2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с 
медицинскими отходами».
ВНИМАНИЕ! При удалении пробирок, содержащих продукты ПЦР, недопустимо их 
открывание и разбрызгивание содержимого, поскольку это может привести к 
контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны, оборудования и реагентов,
- Применять набор строго по назначению, согласно данной инструкции.
- Допускать к работе с набором только специально обученный персонал.
- Не использовать набор по истечении срока годности.
- Избегать контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой. При контакте 
немедленно промыть пораженное место водой и обратиться за медицинской 
помощью.
- Листы безопасности материалов (MSDS -  material safety data sheet) доступны по 
запросу.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ 
ЗОНЫ 1, 2. Экстракция ДНК и проведение амплификации
1. Комплект реагентов для выделения РНК/ДНК -  «РИБО-преп» (ТУ 9398-071- 
01897593-2008), «ДНК-сорб-В» (ТУ 9398-003-01897593-2009) или аналогичные.
2. Дополнительные материалы и оборудование для экстракции ДНК -  согласно 
инструкции к комплекту реагентов для выделения РНК/ДНК.
3. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс).
4. Вортекс (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).
5. Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс g (например, 
MiniSpin, Eppendorf, Германия).
8 из 26


--- стр. 11 ---
в комплекте реагентов применяется «горячий старт», который 
обеспечивается использованием химически модифицированной Taq- 
полимеразы, которая активируется при прогреве реакционной смеси при 95 °С 
в течение 15 мин.
Необходимые реакт ивы :
ПЦР-смесь-1, 2,5х ПЦР-буфер blue, полимераза (TaqF), минеральное масло для 
ПЦР.
А. Подготовка пробирок для амплификации
Выбор пробирок для амплификации зависит от используемого 
амплификатора.
Для внесения в пробирки реагентов, проб ДНК и контрольных образцов 
используются одноразовые наконечники с фильтрами.
1. Подготовить реакционную смесь для каждого исследуемого полиморфизма. Для 
проведения N реакций смешать в отдельной пробирке 5*(N+1) мкл 
соответствующей ПЦР-смеси-1. 10*(N+1) мкл 2,5х ПЦР-буфера blue и
0,5*(N+1) мкл полимеразы (TaqF).
ВНИМАНИЕ! Приготовленную смесь хранить не более 2 ч.
2. Перемешать смесь на вортексе и раскапать по 15 мкл в пробирки для проведения 
ПЦР.
3. Сверху добавить каплю минерального масла для ПЦР.
4. В пробирки с реакционной смесью внести по 10 мкл проб ДНК в концентрации 1- 
3 нг/мкл, полученных в результате экстракции из исследуемых образцов.
5. В качестве отрицательного контроля анализа по каждому исследуемому 
генетическому локусу необходимо использовать отрицательный контрольный 
образец экстракции Д Н К (ОКО). Пробу, выделенную из ОКО, следует разбавить в 
той же пропорции, что и ДНК, экстрагированную из клинических проб.
Рекомендуется перед постановкой в амплификатор осадить капли со стенок 
пробирок кратким центрифугированием на центрифуге/вортексе (1-3 с).
Б. Проведение амплификации
1. Запустить на амплиф икаторе соответствующую программу амплификации (см. 
табл. 1).
2. Когда температура в ячейках достигнет 95 °С (режим паузы), поставить пробирки 
в ячейки амплиф икатора и нажать кнопку продолжения программы.
Таблица 1
Программа амплификации
11 из 26


--- стр. 12 ---
«Терцик» Gradient Palm Cycler, MaxyGene, 
GeneAmp PCR System 2700
Цикл Температура, °C Время Циклы Температура, °С Время Циклы
95 Пауза 95 Пауза
95 15 мин 1 95 15 мин
95 Ю с 95 15с
60 Ю с 45 60 15 с 45
72 15с 72 20 с
72 2 мин 1 72 2 мин 1
10 Хранение 10 Хранение
3. По окончании выполнения программы приступить к подготовке продуктов 
амплификации к пиросеквенированию.
ПРОВЕДЕНИЕ ПРОБОПОГОТОВКИ И ПИРОСЕКВЕНИРОВАНИЯ 
Прибор РугоМагк Q24
А. Программирование прибора РугоМагк Q24
1. Запустить программное обеспечение РугоМагк Q24.
2. Приступить к настройке тестов:
а) в меню F ile выбрать вкладку N e w  A s s a y , в ней выбрать вкладку A Q  A s s a y ,
-  в строку S e q u e n c e  to  A n a l y z e ввести анализируемую последовательность;
-  определить порядок ввода в реакционную смесь нуклеотидов нажатием 
кнопки G e n e r a te  D is p e n s a t i o n  O rd er,
б) в меню F ile выбрать вкладку S a v e  a s , задать название теста, сохранить тест и 
закрыть окно настройки тестов.
3. Подготовка анализа -  создание шаблона эксперимента;
а) в меню F ile выбрать вкладку N e w  R u n ,
-  в меню I n s t r u m e n t  M e t h o d выбрать Р у г о М а г к  Q 2 4  M e t h o d  0 01 R e v . А (1 )_ 1 
или метод, указанный в инструкции к набору реагентов Р у г о М а г к  G o ld  Q 24 
R e a g e n ts ;
-  в окне P la te  S e t u p для каждой исследуемой ячейки в верхней строке 
нажатием правой кнопки мыши с помощью опции L o a d  A s s a y ввести тесты 
для исследуемых образцов;
-  в окне P la te  S e t u p во второй и третьей строке нажатием левой кнопки мыши 
задать параметры исследуемых образцов (названия, примечания);
б) в меню F ile выбрать вкладку S a v e  A s , задать название анализа, сохранить 
шаблон эксперимента на электронном носителе (флеш-карте) и закрыть окно 
настройки тестов.
4. В меню T o o ls подготовленного шаблона эксперимента выбрать Р ге  R u n
In fo r m a tio n . В появившемся окне будет указано количество реактивов,
12 из 26


--- стр. 13 ---
необходимое для проведения анализа. Переписать или распечатать эту 
информацию для проведения подготовки картриджа.
Б. Подготовка картриджа 
Необходимые реакт ивы :
Набор реагентов РугоМагк Gold Q24 Reagents или РугоМагк Gold Q96 Reagents 
(Qiagen), Н 2О стерильная (производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии 
Роспотребнадзора).
ВНИМАНИЕ! Все действия следует осуществлять согласно «Руководству по 
эксплуатации реагентов РугоМагк Gold Q24 Reagents» или «Руководству по 
эксплуатации реагентов РугоМагк Gold Q96 Reagents».
Программное обеспечение рассчитает необходимое для анализа количество 
реактивов; смеси ферментов («Е»), субстратов («8») и нуклеотиды («А», «Т», 
«С», «G»).
1. Растворить лиоф илизированные смеси ферментов и субстратов в Н 2О 
стерильная в соответствии с руководством к соответствующему набору 
реагентов;
2. Внести в соответствующ ие ячейки картриджа рассчитанное для данного 
эксперимента количество реактивов;
3. Закрыть картридж парафильмом.
ВНИМАНИЕ! Растворенные смеси ферментов и субстратов хранить при 
температуре не выше минус 16 °С. Нуклеотиды не замораживать (температура 
хранения +4 °С).
В. Подготовка планшета для секвенирования 
Необходимые реакт ивы :
Праймеры для секвенирования.
1. Перемешать на вортексе праймеры для секвенирования;
2. В соответствии с шаблоном эксперимента, в анализируемые ячейки планшета 
для секвенирования раскапать по 25 мкл праймеров для секвенирования;
3. Закрыть планшет для секвенирования парафильмом.
ВНИМАНИЕ! Необходимо убедиться, что порядок ячеек в планшете для 
секвенирования соответствует заданному шаблону эксперимента.
Г. Подготовка ПЦР-продукта к пиросеквенированию 
Необходимые реакт ивы :
Частицы сефарозы, покрытые стрептавидином (Streptavldin Sepharose High 
Performance, GE Healthcare), связывающий буфер, H 2O стерильная, раствор для 
очистки, денатурирующий раствор, отмывочный буфер.
13 из 26


--- стр. 16 ---
г) поместить зонды устройства вакуумной пробоподготовки в ванночку с
однократным денатурирующим раствором и промыть зонды в течение 5- 
10 с;
д) поместить зонды устройства вакуумной пробоподготовки в ванночку с
однократным отмывочным буфером и промыть зонды в течение 5-10 с;
е) поднять устройство вакуумной пробоподготовки и подержать фильтры
вертикально в течение 2-3 с;
ж) держа устройство вакуумной пробоподготовки над планшетом для
секвенирования, выключить вакуумный перекпючатель { O ff) ]
з) опустить ф ильтры на дно ячеек и аккуратно встряхнуть устройство вакуумной 
пробоподготовки из стороны в сторону несколько раз, так, чтобы частицы 
сефарозы с зондов оказались в ячейках планшета для секвенирования;
и) промыть фильтры в ванночке, содержащей 40-50 мл НгО стерильной, в 
течение 5-10 с;
к) поместить фильтры в ванночку, содержащую 70 мл НгО стерильной,
включить вакуумный переключатель (On) и промыть фильтры в течение 10 с;
л) поднять устройство вакуумной пробоподготовки и подержать фильтры
вертикально в течение 5 с.
м) установить инструмент в позицию P a r k in g , выключить вакуумный насос, 
подождать несколько минут и перекрыть вакуумный переключатель { O ff) .
3. Отжиг праймеров на одноцепочечной ДНК:
а) поставить планшет для секвенирования на предварительно разогретый до 
80 °С фиксатор планшета и инкубировать в течение 2 мин;
ВНИМАНИЕ! Рекомендуется закрыть планшет сверху парафильмом и алюминиевым
прессом, чтобы избежать чрезмерного испарения жидкости из ячеек.
б) снять планшет и дать ему остыть при комнатной температуре в течение 5 мин.
Д. Пиросеквенирование ПЦР-продукта
1. Запуск прибора РугоМагк 024;
а) вставить картридж в прибор и закрепить положение картриджа фиксатором;
б) поднять ф иксатор для планшета, поместить планшет для секвенирования в 
прибор, опустить фиксатор, закрыть прибор;
в) вставить в прибор ф леш-карту с шаблоном эксперимента;
г) на панели прибора выбрать в главном меню R u n и нажать О К,
д) открыть в окне прибора заданный шаблон эксперимента и нажать S e le c t, 
подтвердить выбор шаблона эксперимента (Ves);
16 из 26


--- стр. 17 ---
е) после завершения реакции вынуть ф леш-карту и приступить к обработке 
результатов анализа на компьютере.
2. Обработка результатов анализа:
а) запустить программное обеспечение РугоМагк Q24;
б) в меню F ile выбрать вкладку O p e n и открыть файл с результатами анализа;
в) проанализировать результаты секвенирования нажатием кнопки A n a ly z e  A ll 
W e lls,
г) в меню R e p o r t s выбрать опцию S N P  A n a l y s i s  R e s u l t s , посмотреть или 
сохранить результаты анализа нажатием кнопок P r e v ie w или S a v e , 
соответственно.
Прибор Р угоМ агк Q96 MD
А. Программирование прибора РугоМагк Q96 MD
1. Включить прибор.
ВНИМАНИЕ! Перед запуском необходимо прогреть прибор в течение 90 мин.
2. Запустить программное обеспечение Р у г о М а г к  M D
3. Приступить к настройке тестов:
а) в главном меню выбрать S N P , затем вкладку S i m p l e x  E n tr ie s , нажатием 
правой кнопкой мыши выбрать пункт N e w  E n tr y ,
-  в строку E n t r y  Ю ввести название теста;
-  в строку S e q u e n c e  to  A n a l y z e ввести анализируемую последовательность;
-  определить порядок ввода в реакционную смесь нуклеотидов нажатием 
кнопки G e n e r a te  D i s p e n s a t i o n  O rd er,
б) сохранить тест, нажав S a v e , и закрыть окно настройки тестов.
4. Подготовка анализа -  создание шаблона эксперимента:
Секвенирование одного планшета:
а) в главном меню выбрать S N P  R u n s , в открывшемся окне нажатием правой 
кнопкой мыши в папке S N P  R u n s выбрать пункт N e w  S N P  R u n ,
*
б) в открывшемся окне задать название и параметры эксперимента;
в) в строке I n s t r u m e n t  P a r a m e te r s выбрать I n s t r u m e n t  P a r a m e te r s  M D 0 0 0 3 C D T 
или метод, указанный в инструкции к набору реагентов;
г) в окне A c t i v e  W e lls с помощью мыши выбрать ячейки, в которых находятся 
исследуемые образцы, и нажать кнопку A c tiv a te ,
д) выбрать вкладку S e t u p , затем E n tr y , нажать кнопку S i m p l e x , в строке E n tr y 
выбрать нужный тест и с помощью «карандаша» отметить ячейки с 
исследуемыми образцами;
17 из 26


--- стр. 18 ---
е) во вкладках S a m p l e  Ю и N o t e s задать названия и примечания для 
исследуемых образцов;
ж) выбрать вкладку G e n e r a l, нажать V ie w , выбрать R u n ,
з) в появившемся окне будет указано количество реактивов, необходимое для 
проведения анализа, переписать или распечатать эту информацию для 
проведения подготовки картриджа;
и) нажать S a v e и закрыть окно.
Секвенирование нескольких планшетов («пакетный» запуск):
а) повторить процедуру создания шаблона эксперимента для каждого планшета 
в отдельности (см. пункт 4а);
б) в главном меню выбрать B a tc h , в открывшемся окне нажатием правой кнопкой 
мыши в опции B a t c h выбрать пункт N e w  B a tc h ,
в) выбрать вкладку S e t u p , задать название и параметры эксперимента;
г) в главном меню нажать S N P  R u n s и перенести с помощью мыши каждый 
созданный шаблон в окно R u n  N a m e ,
д) установить функции Use B urcode и A n a l y z e  SNP,
е) нажать S a v e ,
ж) в меню B a tc h выбрать S e t u p  I n fo r m a tio n ,
з) в появившемся окне будет указано количество реактивов, необходимое для 
проведения анализа; переписать или распечатать эту информацию для 
проведения подготовки картриджа.
Б. Подготовка картриджа 
Необходимые реакт ивы :
Набор реагентов РугоМагк Gold Q96 Reagents (Qiagen), Н 2О стерильная 
(производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора).
ВНИМАНИЕ! Все действия следует осуществлять согласно «Руководству по 
эксплуатации реагентов РугоМагк Gold Q96 Reagents».
Программное обеспечение рассчитает необходимое для анализа количество 
реактивов: смеси ферментов («Е»), субстратов («8») и нуклеотиды («А», «Т», 
«С», «G»).
1. Растворить лиоф илизированные смеси ф ерм ентов и субстратов в Н 2О 
стерильная в соответствии с руководством к набору РугоМ агк Gold Q96 
Reagents;
2. Внести в соответствующ ие ячейки картриджа рассчитанное для данного 
эксперимента количество реактивов;
3. Закрыть картридж парафильмом.
18 из 26


--- стр. 19 ---
ВНИМАНИЕ! При работе с картриджем необходимо предварительно вставить в него 
наконечники, отведя в стороны фиксаторы.
ВНИМАНИЕ! Растворенные смеси ферментов и субстратов хранить при 
температуре не выше минус 16 °С. Нуклеотиды не замораживать (температура 
хранения +4 °С).
В. Подготовка планшета для секвенирования 
Необходимые реакт ивы :
Праймеры для секвенирования.
1. Перемешать на вортексе праймеры для секвенирования;
2. В соответствии с шаблоном эксперимента, в анализируемые ячейки планшета 
для секвенирования раскапать по 12 мкл праймеров для секвенирования,
3. Закрыть планшет для секвенирования парафильмом.
ВНИМАНИЕ! Необходимо убедиться, что порядок ячеек в планшете для 
секвенирования соответствует заданному шаблону эксперимента.
Г. Подготовка ПЦР-продукта к пиросеквенированию 
Необходимые реакт ивы :
Частицы сефарозы, покрытые стрептавидином (Streptavidin Sepharose High 
Performance, GE Healthcare), связывающий буфер, НгО стерильная, раствор для 
очистки, денатурирующий раствор, отмывочный буфер.
ВНИМАНИЕ! Перед началом работы необходимо прогреть все реактивы и растворы 
при температуре от 22 до 25 °С.
ВНИМАНИЕ! Перед началом работы необходимо приготовить однократный 
денатурирующий раствор и однократный отмывочный буфер из соответствующих 
10-кратных стоковых растворов; для разведения 10-кратных стоковых растворов 
необходимо использовать стерильную НгО.
Г1. Иммобилизация ПЦР-продукта
1. Аккуратно встряхнуть бутылку с сефарозными частицами до получения 
однородной взвеси.
2. Приготовить в отдельной емкости (пробирке или флаконе) соответствующего 
объема следующую смесь для иммобилизации продукта ПЦР из расчета на 
1  анализируемый образец:
а) частицы сефарозы -  2 мкл;
б) связывающий б уф ер - 4 0  мкл;
в) НгО стерильная -  28 мкл.
19 из 26