Набор реагентов для выявления РНК энтеровирусов (Enterovirus) в объектах окружающей среды и клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле "АмплиСенс® Enterovirus-EPh" по ТУ 9398-096-01897593-2009 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 2 --- « С О Г Л А С О В А Н О » И.Содиректора ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Мовсесянц --- стр. 3 --- ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ....................................................................................................3 НАЗНАЧЕНИЕ......................................................................................................................3 ПРИНЦИП МЕТОДА............................................................................................................3 ВАРИАНТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ............... 4 АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ............................................................................4 МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ.........................................................................................4 ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ...............................................4 ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА.... 6 ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАЦИИ ДНК/РНК....................6 СОСТАВ................................................................................................................................7 ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ............................................................................7 ЭКСТРАЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ.......................................................7 ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ...............................................8 ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ......................................................................................8 А. Подготовка пробирок для проведения ПЦР ...........................................................8 Б. Проведение амплификации......................................................................................8 ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ............................................................................9 ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ...................................................................................9 СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ.....................10 2 --- стр. 4 --- ПИСОК СОКРАЩЕНИЙ В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения: ВКО - внутренний контрольный образец кДНК - комплементарная ДНК ПЦР - полимеразная цепная реакция око - отрицательный контрольный образец от - обратная транскрипция ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией пко - положительный контрольный образец смж - спинномозговая жидкость ФГУН цнииэ Роспотребнадзора - федеральное государственное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека EPh - электрофоретическая детекция НАЗНАЧЕНИЕ Набор реагентов «АмплиСенс® Enterovirus-EPh» предназначен для выявления РНК энтеровирусов (Enterovirus), выделенной из стерильных и нестерильных типов клинического материала (спинномозговая жидкость, отделяемое везикул, мазки из ротоглотки, образцы фекалий) в соответствии с показаниями представленными в МУ 3.1.1.2363-08 «Эпидемиологический надзор и профилактика энтеровирусной (неполно) инфекции», методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации. ВНИМАНИЕ! Результаты ПЦР-исследования учитываются в комплексной диагностике заболевания. ПРИНЦИП МЕТОДА Выявление РНК энтеровирусов ( Enterovirus) методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с электрофоретической детекцией включает в себя следующие этапы: экстракция (выделение) РНК из образцов клинического материала, получение кДНК в ходе реакции обратной транскрипции, ПЦР-амплификация участка кДНК данного микроорганизма и электрофоретическая детекция. Экстракция РНК из клинического материала проводится в присутствии внутреннего контрольного образца (ВКО Enterovirus-rec), который позволяет контролировать выполнение процедуры исследования для каждого образца. Затем с полученными пробами РНК проводится реакция обратной транскрипции, в ходе которой получают кДНК. Пробы кДНК используются для амплификации участка кДНК Enterovirus при помощи специфичных к этому участку ДНК праймеров и фермента Taq-полимеразы. Специфический продукт амплификации имеет определенный размер и детектируется методом электрофореза в агарозном геле. --- стр. 5 --- ВАРИАНТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ Форма 1 включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант 50. Форма комплектации 1 предназначена для проведения амплификации кДНК Enterovirus. Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции (выделения) РНК, комплекты реагентов для проведения реакции обратной транскрипции и комплекты реагентов для электрофоретической детекции продуктов амплификации, рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Аналитическая чувствительность Вид клинического материала Комплект для выделения ДНК Комплект для амплификации и детекции Аналитическая чувствительность смж «РИБО-сорб» «ПЦР-комплект» варианты FEP и FRT 5x103 ГЭ/мл. СМЖ «РИБО-преп» «ПЦР-комплект» варианты FEP и FRT 5x103 ГЭ/мл. Аналитическая специфичность Специфичность набора реагентов проверялась на следующих штаммах микроорганизмов: штаммы энтеровирусов (Coxsakie В1, В2, ВЗ, В4, В5, В6; Polio (Sabin) I, II, III); вирусов гриппа A (H13N2, H9N2, H8N4, H2N3, H4N6, H11N6, H12N5, H3N8, H1N1, H6N2, H10N7, H5N1), В, риновирусов, RS вирусов, аденовирусов человека - 3, 5, 7, 37, 40 типов; штаммах N meningitidis, St pneumoniae, Н influenzae, Clebsiella К 65 SW4, Listeria monocitogenes УСХЧ 19, Listeria monocitogenes УСХЧ 52, Proteus vulgaris 115/98, Pseudomonas aeruginosa ДН c1, Staphilococcus aureus 653, Staphilococcus aureus 29112, Morganella Morganii 619 c 01, Enterobacter faecalis 356. При проведении тестирования данных панелей, а также образцов ДНК человека неспецифических реакций выявлено не было. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно биологические (ПЦР) исследования клинического материала на наличие возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-эпидемических правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СП 2.1.7.728- 99 «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений» и методических указаний МУ 1.3.1888-04 «Организация работы при --- стр. 6 --- исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III - IV групп патогенности». При работе всегда следует выполнять следующие требования: - Следует рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные, организовывать работу и хранение в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». - Убирать и дезинфицировать разлитые образцы или реактивы, используя дезинфицирующие средства в соответствии СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». - Удалять неиспользованные реактивы в соответствии с требованиями СП 2.1.7.728-99 «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно профилактических учреждений». ВНИМАНИЕ! При удалении отходов после амплификации (пробирок, содержащих продукты ПЦР) недопустимо открывание пробирок и разбрызгивание содержимого, поскольку это может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны, оборудования и реагентов. - Применять набор строго по назначению, согласно данной инструкции. - Допускать к работе с набором только специально обученный персонал. - Не использовать набор по истечении срока годности. - Избегать контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой. При контакте немедленно промыть пораженное место водой и обратиться за медицинской помощью. - Спецификация по безопасности материалов (MSDS - material safety data sheet) доступна по запросу. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ 1. Комплект реагентов для выделения РНК - «РИБО-сорб» (ТУ 9398-004-01897593- 2008) «РИБО-преп» (ТУ 9398-071-01897593-2008) или другие рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. 2. Дополнительные материалы и оборудование для экстракции РНК - согласно инструкции к комплекту реагентов для выделения РНК. 3. Комплект реагентов для проведения реакции обратной транскрипции «РЕВЕРТА- Ь> (ТУ 9398-005-01897593-2008) или другие рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. 4. Дополнительные материалы и оборудование для проведения реакции обратной --- стр. 7 --- транскрипции - согласно инструкции к комплекту реагентов для ОТ. Комплект реагентов для электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле - «ЭФ» (ТУ 9398-070-01897593-2008) или другие рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Дополнительные материалы и оборудование для электрофоретической детекции - согласно инструкции к комплекту реагентов для электрофоретической детекции. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс). Центрифуга/вортекс. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, «ТЕРМО 24-15», «Биоком», Россия). 3.Автоматические дозаторы переменного объема (от 5 до 20 мкл, от 20 до 200 мкп и от 50 до 1000 мкл). 1 .Одноразовые наконечники с фильтром до 100 мкл в штативах. 2. Штативы для микропробирок объемом 0,2 мл или 0,5 мл (в соответствии с используемыми комплектами реагентов). 3. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С для выделенных проб ДНК. 14.Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.1888-04. 15. Емкость для сброса наконечников. 16. Программируемый амплификатор (например, «GeneAmp PCR System 2400» («Applied Biosystems»), «Терцик» («ДНК-технология»), «GeneAmp PCR System 2700» («Applied Biosystems»), «Gradient Palm Cycler» («Corbett Research»), «Maxygene» («Axygen»), «Biometra», «MiniCycler», «РТС-100» («MJ Research» или аналогичные). ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА Перед началом работы следует ознакомиться с методическими рекомендациями «Взятие, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР- диагностики», разработанными ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва, 2008 г. Материалом для исследования служат стерильные и нестерильные типы клинического материала (спинномозговая жидкость, отделяемое везикул, мазки из ротоглотки, образцы фекалий) в соответствии с показаниями представленными в МУ 3.1.1.2363-08 «Эпидемиологический надзор и профилактика энтеровирусной (неполно) инфекции». ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАЦИИ ДНК/РНК Спинномозговая жидкость, отделяемое везикул, мазки из ротоглотки не требуют специальной подготовки для экстракции РНК. --- стр. 9 --- ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Экстрация РНК из каждого клинического образца проводится в присутствии внутреннего контрольного образца (ВКО Enterovirus-rec). ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ Реакцию обратной транскрипции провести в соответствии с инструкцией к используемому комплекту реагентов для обратной транскрипции («РЕВЕРТА-L» или другие комплекты реагентов, рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, включая объем пробы ДНК - 10 мкл. А. Подготовка пробирок для проведения ПЦР 1. Пробирку с воском для ПЦР прогреть в термостате при температуре 95 °С до полного расплавления. 2. Раскапать на дно микропробирок для амплификации по 5 мкл ПЦР-смеси-1 Enterovirus. Сверху добавить по капле (примерно 10-15 мкл) расплавленного воска так, чтобы он полностью накрыл жидкость, закрыть крышки пробирок, подписать на каждой сокращенное название инфекции. Пробирки с разлитой ПЦР-смесью-1 Enterovirus и воском можно хранить при температуре от 2 до 8 °С. 3. Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1 Enterovirus для амплификации кДНК исследуемых и контрольных проб. 4. В пробирки с ПЦР-смесью-1 Enterovirus на поверхность застывшего воска внести по 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1 Enterovirus. 5. Сверху добавить каплю минерального масла для ПЦР (при использовании амплификатора без термостатируемой крышки). 6. В подготовленные пробирки внести по 10 мкл кДНК-проб, полученных в реакции обратной транскрипции РНК. 7. Поставить контрольные реакции: а) отрицательный контроль (К-) -внести в пробирку 10 мкл ДНК-буфера. б) положительный контроль (К+) - внести в пробирку 10 мкл ПКО кДНК Enterovirus. Рекомендуется перед постановкой в амплификатор осадить капли со стенок пробирок кратким центрифугированием на вортексе (1-3 с). Б. Проведение амплификации 1. Запустить на амплификаторе соответствующую программу термоциклирования (см. табл. 1). 8 --- стр. 10 --- 2. Когда температура в ячейках достигнет 95 °С (режим паузы) поставить пробирки в ячейки амплификатора и нажать кнопку продолжения программы. Таблица 1 Программа амплификации кДНК Enterovirus Амплификаторы с активным регулированием (по раствору в пробирке): Амплификаторы с матричным регулированием температуры: «Biometra», «MiniCycler», «РТС-100» («MJ Research») «GeneAmp PCR System 2400» («Applied Biosystems»), «Терцик» («ДНК-технология») «GeneAmp PCR System 2700» («Applied Biosystems»), «Gradient Palm Cycler» («Corbett Research»), «Maxygene» («Axygen») ,иклтемпература время циклы температура время циклы температура время циклы 0 95 °С пауза 95 °C пауза 95 °С пауза 1 95 °С 5 мин 1 95 °C 5 мин 1 95 °С 5 мин 1 2 95 °С Юс 42 95 °C Юс 42 95 °С 1 мин 4258 °С Юс 58 °C 25 с 58 °С 1 мин 72 °С Юс 72 °C 25 с 72 °С 1 мин 3 72 °С 1 мин 1 72 °C 1 мин 1 72 °С 1 мин 1 4 4 °С хранение 4 °C хранение 10 °С хранение 3. После окончания реакции пробирки отправить в помещение для детекции продуктов ПЦР-амплификации (ЗОНУ 3). Пробы после амплификации можно хранить 16 ч при комнатной температуре, в течение 1 нед при температуре от 2 до 8 °С (однако, перед проведением электрофореза необходимо нагреть пробирки до комнатной температуры для размягчения воска). Анализ продуктов амплификации проводится разделением фрагментов ДНК в агарозном геле. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ Детекцию провести в соответствии с инструкцией к используемому комплекту реагентов для электрофоретической детекции продуктов амплификации («ЭФ» или другие комплекты реагентов, рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ Интерпретация результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной кДНК. Длина специфических полос амплифицированных фрагментов кДНК: Enterovirus - 207 п.н. ВКО Enterovirus-rec - 440 п.н. Принцип интерпретации следующий: - Положительными считаются образцы, которые содержат специфическую светящуюся полосу на уровне 207 п.н. большей или меньшей интенсивности, --- стр. 11 --- независимо от наличия полосы внутреннего контроля. Полоса внутреннего контроля может отсутствовать в пробах с высокой концентрацией РНК Enterovirus. - Отрицательными считаются образцы, которые содержат только полосу 440 п.н. большей или меньшей интенсивности. Кроме полос 207 п.н. и 440 п.н. в дорожках могут наблюдаться нечеткие размытые полосы праймер-димеров, которые располагаются ниже уровня 100 нуклеотидных пар. Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты для положительного и отрицательного контролей амплификации и отрицательного контроля выделения РНК, в соответствии с табл. 2. Таблица 2 Результаты постановки контролей различных этапов ПЦР-анализа Контроль Контролируемый этап ПЦР-анализа Специфическая полоса на электрофореграмме 207 п.н. 440 п.н. ОК Выделение (экстракция) РНК Нет Есть К- ПЦР Нет Нет К+ ПЦР Есть Нет ВНИМАНИЕ! 1. Если в дорожке положительного контроля ПЦР (К+) отсутствует специфический продукт 207 п.н. необходимо повторить амплификацию и детекцию для всех образцов, в которых не обнаружена кДНК Enterovirus. 2. Если в дорожке отрицательного контроля экстракции ДНК (В-) и/или отрицательного контроля ПЦР (К-) присутствует специфический продукт 207 п.н. необходимо повторить ПЦР-исследование для всех образцов, в которых обнаружена кДНК Enterovirus, начиная с этапа выделения (экстракции) РНК. СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ. Срок годности. 9 мес. Набор реагентов с истекшим сроком годности применению не подлежит. Транспортирование. Набор реагентов транспортировать при температуре от 2 до 8 °С не более 5 сут. Хранение. Набор реагентов хранить при температуре от 2 до 8 °С. Условия отпуска. Для лечебно-профилактических и санитарно-профилактических учреждений. Рекламации на качество набора реагентов «АмплиСенс® Enterovirus-EPh» 10