Набор реагентов для выявления генетического полиморфизма в гене АСЕ человека методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле "АмплиСенс® ACE-I/D-EPh" по ТУ 9398-164-01897593-2011 — инструкция и характеристики

РУ: ФСР 2011/11260 от 22.07.2011 · класс риска 2а

Производитель: ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Россия)

Автоматически отфильтрованный фрагмент инструкции по применению (страницы, где похоже, что есть таблица технических характеристик) — не полный документ. Карточка РУ на портале Росздравнадзора →

Текст инструкции: технические характеристики

--- стр. 2 ---
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................................................................3
НАЗНАЧЕНИЕ................................................................................................................................3
ПРИНЦИП МЕТОДА.....................................................................................................................3
ВАРИАНТЫ  И  ФОРМЫ ВЫ ПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ..................................................4
М ЕРЫ  ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ................................................................................................4
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И  ОБОРУДОВАНИЕ................................................... 5
ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И  ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА.... 6
ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К  ЭКСТРАКЦИИ РНК/ДНК.....................6
СОСТАВ......................................................................................................................................... 7
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ...................................................................................7
ЭКСТРАКЦИЯ РНК/ДНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ.................................................7
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ
............................................................................................ 7
А . Подготовка пробирок для амплификации......................................................................7
Б. Проведение амплификации..............................................................................................8
ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ......................9
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ......................................................................................... 9
СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И  ХРАНЕНИЯ.......................12
О Г Л А В Л Е Н И Е


--- стр. 3 ---
с п и с о к  СОКРАЩЕНИЙ
В  настоящей инструкции применяются следующие сокращения и  обозначения:
ОКО - отрицательный контрольный образец
п к о - положительный контрольный образец
П Ц Р - полимеразная цепная реакция
Ф Г У Н  ЦНИИЭ 
Роспотребнадзора
- федеральное государственное учреждение науки  
«Центральный научно-исследовательский институт 
эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в  сфере 
защиты прав потребителей и  благополучия человека_____
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов «АмплиСенс® ЛСЕ-1/D-EPh» предназначен для выявления  
делеционного полиморфизма (I/D) в  гене ангиотензин-превращающего фермента  
человека {АСЕ) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с  
электрофоретической детекцией продуктов амплификации в  агарозном геле. Длина 
делеции -  289 п.н., идентификационный номер полиморфизма в  базе данных NCBI - 
rs4646994.
Материалом для проведения ПЦР служат пробы ДНК, выделенные из образцов  
периферической крови. Для полного анализа необходимо дополнительно  
использовать наборы реагентов для экстракции РНК/ДНК из клинического материала 
и  набор реагентов «ЭФ» для электрофоретической детекции продуктов  
амплификации в  агарозном геле, рекомендованные Ф ГУ Н  ЦНИИЭ  
Роспотребнадзора.
ВНИМАНИЕ! Результаты ПЦР-исследования учитываются в  комплексной  
диагностике заболевания.^
ПРИНЦИП МЕТОДА
Выявление делеционного полиморфизма в гене ангиотензин-превращающего  
фермента методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической  
детекцией включает в  себя три этапа: экстракцию (выделение) РНК/ДНК из образцов 
клинического материала, амплификацию участка гена АСЕ  человека, и  
электрофоретическую детекцию продуктов амплификации в  агарозном геле. С  
образцами выделенной ДНК проводится реакция амплификации фрагмента гена АСЕ, 
содержащего I/D  полиморфизм, при помощи специфических праймеров и  фермента 
Taq-полимеразы. Определение размеров амплифицированных фрагментов  
осуществляется после окончания ПЦР с помощью электрофоретической детекции  
продуктов амплификации в  агарозном геле.
^  в соответствии с Директивой Европейского Союза 98/79/ЕС.


--- стр. 4 ---
ВАРИАНТЫ И  ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ 
Набор реагентов выпускается в 2 формах комплектации.
Форма 1  включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант 50 R  (пробирки
0,5 мл).
Форма 2 включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант 50 R  (пробирки
0,2 мл).
Формы комплектации 1  и  2 предназначены для проведения амплификации участка 
гена АСЕ человека. Для проведения полного ПЦР-исследования необходимо  
использовать комплекты реагентов для экстракции РНК/ДНК и  электрофоретической 
детекции продуктов амплификации, рекомендованные Ф Г У Н  ЦНИИЭ  
Роспотребнадзора.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Работа должна проводиться в  лаборатории, выполняющей молекулярно­
биологические (ПЦР) исследования клинического материала на наличие  
возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-эпидемических  
правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV  групп  
патогенности (опасности) и  возбудителями паразитарных болезней», СП  2.1.7.728-
99 «Правила сбора, хранения и  удаления отходов лечебно-профилактических  
учреждений» и  методических указаний М У  1.3.2569-09 «Организация работы  
лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе 
с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV  групп патогенности».
П ри работе всегда следует выполнять следующие требования:
- Следует рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные,  
организовывать работу и  хранение в соответствии с СП  1.3.2322-08  
«Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности  
(опасности) и  возбудителями паразитарных болезней».
- Убирать и  дезинфицировать разлитые образцы или реактивы, используя  
дезинфицирующие средства в  соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность  
работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и  
возбудителями паразитарных болезней».
- Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в  
отдельных помещениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Выделения,  
продолжать в  Зоне Амплификации и  Детекции. Не возвращать образцы,  
оборудование и  реактивы в  Зону, в  которой была проведена предыдущая стадия 
процесса.


--- стр. 8 ---
Для внесения в пробирки реагентов, проб ДНК и контрольных образцов  
используются одноразовые наконечники с фильтрами.
1. Отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1-R АСЕ  для  
амплификации ДНК исследуемых и  контрольных проб.
2. На поверхность воска внести по 10 мкл ПЦР-смеси-2 red, при этом она не должна  
проваливаться под воск и  смешиваться с содержимым пробирки под воском.
3. Сверху добавить по капле минерального масла для ПЦР.
4. Под масло или непосредственно на масло, используя наконечники с  
аэрозольными барьерами, внести по 10 мкл ДНК-проб, выделенных из  
исследуемых или контрольных проб этапа в  экстракции ДНК (ОК).
5. Поставить контрольные реакции:
а) отрицательный контроль (К-) -  внести в  подготовленную пробирку 10 мкл ТЕ- 
буфера;
б) положительный контроль (К+) -  внести в  пробирку 10 мкл П КО  ДНК  
человека.
Рекомендуется перед постановкой в  амплификатор осадить капли со стенок  
пробирок кратким центрифугированием на центрифуге/вортексе (1-3 с).
Б. Проведение амплификации
1. Запустить на амплификаторе нужную программу (см. табл. 1).
2. Когда температура в  ячейках достигнет 95 °С (режим паузы) поставить пробирки 
в  ячейки амплификатора и  нажать кнопку продолжения программы.
Таблица 1
Программа амплификации ДНК
GeneAmp PCR System 2400 (Perkin 
Elmer),
«Терцин» («ДНК-Технология»)
GeneAmp PCR System 2700 (Applied 
Biosystems) Gradient Palm Cycler 
(Corbett Research) 
MaxyGene (Axygen)
цикл температура время циклы температура время циклы
0 95 X пауза 95 X пауза
1 95 X 5 мин 1 95 X 5 мин 1
2
95 X Ю с
45
95 X 15c
4560Х Ю с 60 X 15c
72 X 15с 72 X 20 c
3 72 X 2 мин 1 72 X 2 мин 1
4 4 Х хранение 4 X хранение
3. После окончания реакции собрать пробирки в штатив и  отправить в  помещение 
для детекции продуктов амплификации.
Пробы после амплификации можно хранить 16 ч  при комнатной температуре, в 
течение 1  нед при температуре от 2 до 8 °С (однако, перед проведением  
электрофореза необходимо нагреть пробирки до комнатной температуры для


--- стр. 9 ---
размягчения воска).
Анализ продуктов амплификации проводится разделением фрагментов ДНК в  
агарозном геле.
ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ
Детекцию провести в  соответствии с инструкцией к  используемому комплекту 
реагентов для электрофоретической детекции продуктов амплификации («ЭФ» или  
другие комплекты реагентов, рекомендованные Ф ГУ Н  ЦНИИЭ Роспотребнадзора).
Разделение фрагментов рекомендуется проводить в  агарозном геле толщиной  
около 0,6 см, концентрацией агарозы 1,7%, расстоянием между гребенками не менее 
6 см. Количество продукта амплификации, вносимого в лунку -  5 мкл. В  каждом  
ряду дорожек геля должен обязательно присутствовать положительный контроль  
(К+) и  маркер молекулярных масс ДНК. Оптимальная напряженность  
электрического поля составляет 10 В/см. Продолжительность электрофореза  
должна быть достаточной для четкого разделения двух амплифицируемых  
фрагментов.
ВНИМАНИЕ! Работа с амплифицированной ДНК должна проводиться в  
отдельной комнате сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций  
в зоне 1  и зоне 2.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Учёт результатов ПЦР-исследования проводится по наличию или отсутствию на  
электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК.
Длина специфических полос амплифицированных фрагментов ДНК:
АСЕ  I  422 п.н.
ACED  133 п.н.
Результаты анализа полиморфизма в гене АСЕ  (см. рис.1)
1. Наличие в  дорожке полосы 422 п.н. при отсутствии полосы 133 п.н. соответствует 
гомозиготе по инсерции (генотип нАСЕ  1 /1 » ): см. рис.1, образцы 9-12.
2. Наличие в дорожке полосы 133 п.н. при отсутствии полосы 422 п.н. соответствует  
гомозиготе по делеции (генотип «АСЕ D ID »): см. рис.1, образцы 1-4.
3. Наличие в дорожке двух полос 422 п.н. и  133 п.н. соответствует гетерозиготе  
(генотип «АСЕ  I/D»): см. рис.1, образцы 5-8.
4. В дорожке, соответствующей положительному контролю этапа ПЦР (К+),  
должны быть две полосы на уровне 422 п.н. и  133 п.н.: см. рис.1, образец 14.


--- стр. 10 ---
5. В дорожках, соответствующих отрицательному контролю экстракции (ОК) и  
отрицательному контролю этапа ПЦР (К-), не должно быть никаких полос; см.  
рис.1, образцы 13, 15.
6. В  дорожках, соответствующих гетерозиготам, допускается наличие слабых  
дополнительных полос на уровне около 380-400 и.о., соответствующих  
гетеродимерам: см. рис.1, образцы 5-8, 14.
7. Кроме полос 422 п.н. и 133 п.н. в дорожках могут наблюдаться нечеткие  
размытые полосы праймер-димеров, которые располагаются ниже уровня
100 нуклеотидных пар.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены  
правильные результаты для положительного и отрицательного контролей  
амплификации и отрицательного контроля экстракции ДНК, в соответствии с  
табл. 2.
Таблица 2
Результаты для контролей различных этапов ПЦР-исследования
Контроль”
ОК
к -
к +
Контролируемый этап 
ПЦР-исследования
Выделение (экстракция) 
РНК
ПЦР
ПЦР
Специфическая полоса на 
электрофореграмме
133 п.н.
Нет
Нет
Есть
422 п.н.
Нет
Нет
Есть
*  См. рис.1 образцы 13, 15, 14, соответствующие контролям О К , К -, К + .
Результаты анализа не подлежат учету в следующих случаях:
1. Если в  дорожке, соответствующей какому-либо клиническому образцу,  
отсутствуют обе полосы, при прохождении положительного контроля  
амплификации (К+), результат анализа по данному образцу считается  
недействительным: необходимо повторить исследование этого клинического  
образца с первого этапа анализа (экстракция РНК/ДНК). Возможные причины:  
ошибка в  процедуре обработки клинического материала, приведшая к  потере  
ДН К, или ингибирование ПЦР.
2. Если в  дорожке, соответствующей какому-либо клиническому образцу или
положительному контролю амплификации (К+), отсутствуют обе полосы (422 и  
133 П . Н . ) ,  и  присутствуют неспецифические полосы на разных уровнях, результат 
анализа по данной пробе считается недействительным, необходимо повторить  
исследование этого клинического образца со второго этапа анализа  
(амплификация). Возможные причины: отсутствие «горячего старта» или
неверный температурный режим в  ячейках амплификатора.
10