Набор реагентов для выявления PНК вируса гепатита C (HCV) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле "АмплиСенс® HCV-EPh" по ТУ 9398-028-01897593-2009 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 3 --- УТВЕРЖДЕНА Приказом Росздравнадзора от № УТВЕРЖДАЮ Директор Федерального государственного учреждения науки «Центральный научно-исследова- гельский институт эпидемиологии» 'Федеральной службы по надзору в сфере зафиты прав потребителей и благополучия человека ------ВД1.Покровский 2009 г. ИНСТРУКЦИЯ по применению набора реагентов для выявления РНК вируеа гепатита С (H C V ) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле «АмплиСенс® HCV-EFh» --- стр. 4 --- ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ. Набор реагентов выпускается в 7 формах комплектации: Форма 1 включает комплекты реагентов «РИБО-сорб» вариант 100, «РЕВЕРТА-L» вариант 100, «ПЦР-комилект» вариант 100 R (пробирки 0,5 мл), «ЭФ» вариант 200. Форма 2 включает комплекты реагентов «РИБО-сорб» вариант 100, «РЕВЕРТА-Е» вариант 100, «ПЦР-комплект» вариант 100 R (пробирки 0,2 мл), «ЭФ» вариант 200. Форма 3 включает комплекты реагентов «РИБО-преп» вариант 100, «РЕВЕРТА-Е» вариант 100, «ПЦР-комплект» вариант 100 R (пробирки 0,5 мл), «ЭФ» вариант 200. Форма 4 включает комплекты реагентов «РИБО-преп» вариант 100, «РЕВЕРТА-Е» вариант 100, «ИЦР-комплект» вариант 100 R (пробирки 0,2 мл), «ЭФ» вариант 200. Форма 5 включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант 100 R (пробирки 0,5 мл); Форма 6 включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант 100 R (пробирки 0,2 мл); Форма 7 включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант 200. ВНИМАНИЕ! Заявленные аналитические характеристики набора реагентов при работе с формами 5, 6 и 7 гарантируются только в случае применения дополнительных комплектов реагентов «РИБО-сорб» или «РИБО-преп», «РЕВЕРТА-Е» и «ЭФ» производства ФГУП ЦНИИЭ Роспотребнадзора. СОСТАВ. Комплект реагентов «РИБО-сорб» вариант 100 (ТУ 9398-004-01897593-2008) - комплект реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала - включает: Реактив Описание Объем (мл) Кол-во Лизирующий раствор Прозрачная бесцветная жидкость* 45 1 флакон Раствор для отмывки 1 Прозрачная бесцветная жидкость* 40 1 флакон Раствор для отмывки 3 Прозрачная бесцветная жидкость 100 1 флакон Раствор для отмывки 4 Прозрачная бесцветная жидкость 40 1 флакон Сорбент Суспензия белого цвета 1,25 2 пробирки РНК-буфер Прозрачная бесцветная жидкость 0,5 10 пробирок Комплект реагентов рассчитан на выделение РНК из 100 проб, включая контроли. Комплект реагентов «РИБО-преп» вариант 100 (ТУ 9398-071-01897593-2008) - комплект реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала включает: ' При хранении лизирующего раствора, раствора для отмывки I и раствора для лизиса при температуре от 2 до 8 °С возможно образование осадка в виде кристаллов. --- стр. 5 --- Реактив Описание Объем (мл) Кол-во лизиса Прозрачная бесцветная жидкость* 30 1 флакон преципитации Прозрачная бесцветная жидкость 40 1 флакон отмывки 3 Прозрачная бесцветная жидкость 50 1 флакон отмывки 4 Прозрачная бесцветная жидкость 20 1 флакон Прозрачная бесцветная жидкость 1,2 8 пробирок гентов рассчитан на выделение РНК из 100 проб, включая контроли. агентов «РЕВЕРТА-L» вариант 100 (ТУ 9398-005-01897593-2008) - комплект получения кДНК на матрице РНК включает: ^еактив Описание Объем (мл) Кол-во Прозрачная бесцветная жидкость 0,01 10 пробирок Прозрачная бесцветная жидкость 0,125 10 пробирок Mlv) Прозрачная бесцветная жидкость 0,06 1 пробирка Прозрачная бесцветная жидкость 1,2 2 пробирки ентов рассчитан на проведение 120 реакций обратной транскрипции, включая 1гентов «ПЦР-комплект» вариант 100 R или вариант 200- комплект ЩР-амплификации кДНК HCV- включает: ? Описание «ПЦР-комплект» вариант 100 R «ПЦР-комплект» вариант 200 Объём (мл) Кол-во Объём (мл) Кол-во CV Прозрачная бесцветная жидкость . . . . . . 1,1 1 пробирка HCV юск Прозрачная бесцветная жидкость 0,005 110 пробирок объемом 0,5 или 0,2 мл — — lue 11розрачная жидкость синего цвета 1,2 1 пробирка 1,2 2 пробирки Твердое вещество белого цвета — — 1,7 2 пробирки заело Бесцветная вязкая жидкость 4,0 1 флакон 8,0 1 флакон ’К Прозрачная бесцветная жидкость 0,2 1 пробирка 0,2 1 пробирка 1 Трозрачная бесцветная жидкость 0,5 1 пробирка 0,5 1 пробирка зтов вариант 100 R рассчитан на проведение 110 реакций амплификации. 1И. --- стр. 12 --- , в пробирки по 400 мкл раствора для преципитации, перемешать на вортексе. )ифугировать пробирки на микроцентрифуге в течение 5 мин при 13 тыс об/мин. ю отобрать надосадочную жидкость, не задевая осадок, используя вакуумный гель и отдельный наконечник на 200 мкл для каждой пробы, i в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3, плотно закрыть крышки [О промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз. Можно провести процедуру [енно для всех пробирок, для этого необходимо накрыть пробирки в штативе 1Ы Ш КОЙ или другим штативом, прижать их и переворачивать штатив. )ифугировать при 13 тыс об/мин в течение 1-2 мин на микроцентрифуге. 30, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя 1Й отсасыватель и отдельный наконечник на 10 мкл для каждой пробы, в пробирки по 200 мкл раствора для отмывки 4, плотно закрыть крышки и ю промыть осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз. )ифугировать при 13 тыс об/мин в течение 1-2 мин на микроцентрифуге. 30, не захватывая осадок, отобрать надосадочную жидкость, используя [й отсасыватель и отдельный наконечник на 10 мкл для каждой пробы. 'ь пробирки в термостат с температурой 65 °С на 5 мин для подсушивания ри этом крышки пробирок должны быть открыты). в пробирки по 50 мкл РНК-буфера. Перемешать на вортексе. Поместить в г с температурой 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе. шфугировать пробирки при 13 тыс об/мин в течение 1 мин на [трифуге. Падосадочная жидкость содержит очищенные РНК и ДНК. Пробы постановке реакции обратной транскрипции и ПЦР. ая РНК может храниться до 4 ч при температуре от 2 до 8 °С. Для длительного епарата необходимо отобрать раствор РНК, не захватывая осадок, перенести в зробирку и хранить в течение года при температуре не выше минус 68 °С. СВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ, ПЦР- [КАЦИИ. 1 в ЗОНЕ 2 - помещении для проведения ПЦР-амилификации). ше реакции обратной транскринции . ем реакции - 20 мкл, объем РНК-пробы - 10 мкл). 5оты: --- стр. 13 --- IE! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые le расходные материалы, имеющие специальную маркировку «RNase-free», ». i необходимое количество микропробирок на 0,5 (0,2) мл. 1ить реакционную смесь на 12 реакций. Для этого в пробирку с RT-mix внести T-G-mix-1, тщательно перемешать на вортексе, осадить капли с крышки иному раствору добавить 6 мкл ревертазы (MMlv), перемешать на вортексе, аили с крышки пробирки. иикропробирки по 10 мкл готовой реакционной смеси. I наконечник с аэрозольным барьером, добавить 10 мкл РНК-пробы в с реакционной смесью. Осторожно перемешать. пробирки в амплификатор (термостат) при температуре 37 °С на 30 мин. /ю в реакции обратной транскрипции кДНК для последующей поетановки ПЦР ! 2 раза ДНК-буфером (к 20 мкл кДНК отдельным наконечником добавить К-буфера). парат кДНК можно хранить в течение 1 нед при температуре не выше 1ЛИ в течение года при температуре не выше минус 68 °С. le ПЦР-амилифиции. *1 реакции - 25 мкл, обьем кДНК-пробы - 10 мкл). ; реагентов применяется «горячий старт», который обеспечивается нуклеотидов и Taq-полимеразы прослойкой воска. Плавление воска и не реакционных компонентов происходит только при 95 °С, что нижает количество неспецифически затравленных реакций. ты. а пробирок для проведения ПЦР. ьзовании комплекта реагентов «ПЦР-комплект» вариант 100 R пункты 1 ять не нужно. воском для ПЦР прогреть в термостате при температуре 95 °С до полного 1Я. [а дно микропробирок для амплификации по 5 мкл ПЦР-смеси-1 HCV. 1вить по капле (примерно 10-15 мкл) расплавленного воска так, чтобы он накрыл жидкость, закрыть крышки пробирок, подписать на каждой г название инфекции. Пробирки с разлитой ПЦР-смесью-1 HCV и воском гть при температуре от 2 до 8 °С в течение 1 нед. --- стр. 14 --- ать необходимое количество подготовленных в п. 2 пробирок, или пробирок с ПЦР- ю-1-R ЯСКдля амплификации кДНК исследуемых и контрольных проб, верхность воска внести по 10 мкл ПЦР-смеси-2 blue, при этом она не должна [иваться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1-R HCV. / добавить по капле минерального масла для ПЦР (примерно 25 мкл). дение ПЦР-амплификации. юдготовленные для 1ПДР пробирки. Под масло или непосредственно на масло, !уя наконечники с аэрозольными барьерами, внести по 10 мкл кДНК-проб, шых в реакции обратной транскрипции. 1ть контрольные реакции амплификации; нательный контроль (К-) - вместо кДНК-пробы внести в подготовленную зрку 10 мкл ДНК-буфера; «(ительный контроль (К+) - внести в пробирку 10 мкл ПКО кДНК HCV. гь на амплификаторе нужную программу (см. табл. 1, 2 и 3). Когда температура в достигнет 95 °С (режим паузы) поставить пробирки в ячейки амплификатора и нажать родолжения программы. [дуется перед постановкой в амплификатор осадить капли со стенок пробирок ттрифугированием на вортексе (1-3 с). Таблица 1. Программа амплификации кДНК HCV \мплификаторы с активным регулированием (по раствору в пробирке) «Терцик» («ДНК-Т ехнология») «Gradient Palm Cycler» («Corbett Research») [ИКЛ температура время циклы температура время циклы 0 95 °С пауза 95 °C пауза 1 95 °С 5 мин 1 95 °C 5 мин 1 2 95 °С Юс 95 °C 20 c 67 °С Юс 42 67 °C 20 c 42 72 °С Юс 72 °C 20 c 3 72 °С 1 мин 1 72 °C 1 мин 1 4 10 °с хранение 4°C хранение --- стр. 16 --- грудником лаборатории, не производящим манипуляиий в зоне 1 и зоне 2. ение рабочих растворов и агарозного геля. вить рабочий электрофорезный буфер. В мерный цилиндр влить 25 мл трис- го буфера (ТБЕ) коииеигрироваииого с бромидом этидия, довести [ированной водой до 500 мл, закрыть цилиндр парафильмом и перемешать. гНИЕ! Бромид этидия - канцерогенное соединение, поэтому при работе с ним соблюдать правила безопасности; работать только в перчатках, избегать И Я на кожу и слизистые, при попадании на кожу или слизистые тщательно . соответствующий участок водой. тенты, содержащие этидия бромид, перед утилизацией следует подвергать щой обработке (см. раздел «Обеззараживание»). для электрофореза ДНК из одного флакона пересыпать в стеклянную колбу из )йкого стекла на 250 мл. Налить 100 мл рабочего буфера, перемещать вращением I плавить в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Время 1я агарозы в микроволновой печи мощностью 800 Вт при ее загруженности 1 - 1,5 мин. Если в микроволновую печь мощностью 800 Вт ставится 5 колб с , время плавления увеличивается до 5 мин. Вынуть колбу с расплавленной из микроволновой печи, аккуратно перемешать, вращая колбу. После этого 'местить колбу с агарозой в микроволновую печь на 1,5 мин (при мощности 800 ести агарозу до кипения. Вынуть колбу из микроволновой печи и остудить вращая колбу, до температуры 65-70 °С. ть столик для заливки гелей, залить расплавленный гель в форму камеры, зть гребенки, не касаясь дна формы, на расстоянии не менее 3 см друг от друга. I геля должна быть около 0,6 см. шного застывания геля (30 мин при комнатной температуре), осторожно вынуть гребенки, не повредив лунки. Поместить подложку с готовым гелем в камеру, )лжны располагаться ближе к отрицательному электроду. ДНК, соответственно, I к положительному. Залить в камеру готового буфера столько, чтобы он 3 гель на 5 мм еверху. 16 0 Т Ы . и с продуктами амплификации выетавить в щтатив последовательно, отобрать тоя масла по 10-15 мкл проб и внести в лунки геля (если для нанесения разных юльзуется один и тот же наконечник, то его необходимо промывать буфером из после нанесения каждой пробы). В каждом ряду дорожек геля должен быть ьно представлен К+ и, желательно, маркер молекулярных масс ДНК. --- стр. 17 --- ь камеру к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК движется к зному электроду), и включить источник. При использовании камеры «SE-2» ) и источника питания «Эльф-4» («ДНК-Технология») параметры источника : напряжение 250 В, стабилизация по напряжению, время электрофореза - 18- гимальная напряженность электрического поля при этом составляет 10 В/см. ении времени электрофореза (краситель ксиленцианол при этом пройдет [оловину длины геля - 1,5 см), выключить источник тока, перенести гель на 1инатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх. Получить е геля на компьютере с помощью видеосистемы, отметив порядок нанесения, 13у данных. При просматривании геля и фотографировании глаза и лицо должны 1Ы маской или стеклянной пластиной! ЬТАТОВ. [ьтатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию на 1мме специфических полос амплифицированной кДНК (см. табл. 4). нфических полос амплифинироваииых фрагментов кДНК: - 240 ПЛ1. HGV+HDV)-rtc - 440 и.и. Таблица 4. льтаты цостановки контролей различных этапов ПЦР-анализа Ы 1Ы Й Контролируемый этап ПЦР-анализа Специфическая полоса на электрофореграммеец 240 п.н. 440 п.н. Выделение РНК Есть Есть Выделение РНК Нет Есть ПЦР Нет Нет НЦР Есть Нет соответствующей положительному контролю этапа выделения (ПК), ь две яркие светящиеся оранжевые полосы; специфическая - на уровне юса внутреннего контрольного образца - на уровне 440 п.н. соответствующей отрицательному контролю этапа выделения (ОК), только полоса ВКО на уровне 440 и.и. гоответствующей положительному контролю этапа ПЦР (К+), должна ецифическая светящаяся оранжевая полоса на уровне 240 п.н. оответствующей отрицательному контролю этапа ПЦР (К-) не должно полос. ж . --- стр. 18 --- 1ьными считаются образцы, которые содержат специфическую светящуюся 'ровне 240 п.н. большей или меньшей интенсивности, независимо от наличия :твия полосы внутреннего контрольного образца. Полоса внутреннего го образца может отсутствовать в пробах с высокой концентрацией РНК HCV. ьными считаются образцы, которые содержат только полосу 440 п.н. и меньшей интенсивности. )с 240 п.н. и 440 п.н. в дорожках могут наблюдаться нечеткие размытые тмер-димеров, которые располагаются ниже уровня 100 нуклеотидных пар. 1алпза не подлежат учету в еледуюпшх елучаях: таты анализа контрольных точек не совпадают с приведенными в таблице 4, 'вующий этап анализа следует переделать. ожке какой-либо из проб отсутствуют обе полосы, и 240 п.н. и 440 п.н., 1ализа по данной пробе считается недействительным, необходимо повторить [е этой клинической пробы с первого этапа проведения анализа (выделение ожные причины: ошибка в процедуре обработки клинического материала, с потере РНК/ДНК или ингибированию ОТ и/или ПЦР. )жке какой-либо из проб отсутствуют обе полосы, и 240 п.н. и 440 п.н., и )т неспецифические полосы на разных уровнях, результат анализа по данной гается недействительным, необходимо повторить исследование этой i пробы, начиная с этапа проведения ПЦР-амплификации. Возможные 'сутствие «горячего старта» или неверный температурный режим в ячейках эра. шецифической полосы 240 п.н. в любом из отрицательных контрольных К, К-) указывает на контаминацию реактивов или проб. Требуется повторить с первого этапа анализа (выделение РНК), а также предпринять меры по юточника контаминации. ВАННЕ. дние биоматериалов и реагентов проводят для каждой стадии отдельно, норазовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники), колбы-ловушки отсасывателей на 20-24 ч в специальные контейнеры, содержащие 'ющий 0,2% раствор ДП-2Т. le гели и буфер из камеры помещают в пластиковую емкость на 5 л с плотно дейся крышкой. На 1 л обезвреживаемых реагентов добавляют 1 л 0,5 М тия перманганата и затем 1 л 2,5 М соляной кислоты. Аккуратно эт и оставляют при комнатной температуре на 4-6 ч. Для нейтрализации