Набор реагентов для выявления PНК вируса гепатита D (HDV) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле "АмплиСенс® HDV-EPh" по ТУ 9398-029-01897593-2009 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 7 --- :у отрицательного контроля (ОК) выделения внеети 100 мкл отрицательного кон- образца (ОКО). В пробирку положительного контроля (ПК) выделения внести СО и 10 мкл положительного контрольного образца (ПКО HDV-rec). крытые пробы тщательно перемешать на вортексе и проценрифугировать в тече- л 5 тыс об/мин на микроцентрифуге для удаления капель е внутренней поверхно- и пробирки. I ресуспендировать сорбент на вортексе. В каждую пробирку отдельным нако- добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента. Перемешать на вортексе, в штатив на 1 мин, еще раз перемешать и оставить на 5 мин, фугировать пробирки для осаждения сорбента при 10 тыс. об/мин. в течение 30 с штрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель [й наконечник для каждой пробы. i пробирки по 400 мкл раствора для отмывки 1. Перемешать на вортексе до :суспендировапия сорбента, процентрифугировать 30 с при 10 тыс об/мин. на эифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и наконечник для каждой пробы. пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3. Тщательно ресуспендировать вортексе. Проценрифугировать 30 с при 10 тыс об/мин. на микроцентрифуге, досадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный нако- каждой пробы. > отмывку раствора для отмывки 3, следуя пункту 9. в пробирки по 400 мкл раствора для отмывки 4. Тщательно ресуспендировать вортексе, процентрифугировать 30 с при 10 тыс. об/мин. на микроцентрифуге, удалить надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечни- зуя вакуумный отсасыватель. пробирки в термостат при температуре 60 “С на 5-10 мин для подсушивания ри этом крышки пробирок должны быть открыты. добавить по 50 мкл РНК-элюента, используя наконечник с аэрозольным барь- цный от РПКаз. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат при темпера- la 2-3 мин. Перемешать на вортексе и процентрифугировать пробирки па мак- эборотах микроцентрифуги (12-13 тыс. об./мин) в течение 1 мин. Супернатант 1ищенные РНК и ДНК. Пробы готовы к постановке реакции обратной транс- [ЦР. ) обратной транскрипции следует проводить сразу после получения РНК/ДНК- гь раствор РНК/ДНК для реакции нужно очень осторожно, не захватывая сор бент взмутился, необходимо осадить его на центрифуге. --- стр. 8 --- [енная РНК может храниться до 4 ч при температуре от 2 до 8 ° С. Для длителБио препарата, необходимо, не захватывая сорбент, отобрать раствор РНК/ДНК, пере- ^льнyю пробирку и хранить при температуре минус 70 “С в течение года. (СТАНОВКА РЕАКЦИИ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ И ПРОВЕДЕНИЕ в ЗОНЕ 2 - комнате для подготовки и проведения амплификации (ПЦР). иовка реакции обратной траиекрниции 1Й объем реакции - 20 мкл, объем РНК-пробы - 10 мкл) 1ние! При работе с РНК необходимо использовать только одноразовые стериль- вые расходные материалы, имеющие специальную маркировку «RNase-free», эк работы: еобходимое количество микропробирок на 0,5 (0,2) мл. ъ реакционную смесь на 12 реакций. Для этого в пробирку с DTT лиофилизи- бавить 125 мкл RT-mix и тщательно перемещать на вортексе, осадить капли с 'ирки. ому раствору добавить 6 мкл ревертазы, пипетировать 5 раз, перемешать на зить капли с крышки пробирки. кропробирки по 10 мкл готовой реакционной смеси. мкл РНК-пробы в пробирку с реакционной смесью, используя отдельный на- рьером для каждой пробы. Осторожно перемешать пипетированием. эобирки в амплификатор (термостат) при температуре 37 “С на 30 мин. в реакции обратной транскрипции кДНК для последующей постановки ПЦР аза ДНК-буфером (к 20 мкл кДНК отдельным наконечником добавить 20 мкл 1ккуратно перемещать пипетированием 10 раз). I препарат кДНК можно хранить при температуре минус 20 “С в течение емпературе минус 70 “С в течение года. зка ПЦР эбъем реакции - 25 мкл, объем кДНК-пробы - 10 мкл) омплектах для амплификации семейства «АмплиСенс» обязательно применя- ;тарт», который обеспечивается разделением нуклеотидов и Taq-полимеразы а. Плавление воска и перемещивание реакционных компонентов происходит ературе 95 "С, что значительно снижает количество неспецифически затрав 7 ка пробирок для проведения ПЦР. ходимое количество пробирок с ПЦР-смесъю-1 R HDV и воском для ампли- исследуемых и контрольных проб. --- стр. 9 --- 8 <ность воска внести по 10 мкл ПЦР-смеси-2 red («верхней»), при этом ПЦР- d не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1 R HDV. Завить по капле масла минерального для ПЦР (примерно 25 мкл). готовленные для ПЦР пробирки. Под масло или непосредственно на масло, ис- 1конечники с аэрозольными барьерами, внести по 10 мкл кДНК, полученных в брагной транскрипции РНК. [ительные пробирки предназначаются для контролей этапа ПЦР (см. ниже): ельный контрольный образец (К-) - вместо кДНК-пробы внести в подготовлен- ирку 10 мкл ДНК-буфера; гельный контрольный образец (К+) - внести в пробирку 10 мкл ПКО кДНК южительного контрольного образца). )ТЫ. а амплификаторе нужную программу (см. табл. 2): фатура в ячейке амплификатора достигнет 95 °С, поместить пробирки в ячейки гора, закрыть крышку прибора и снять программу с паузы. 1мплификации на амплификаторе с регулированием температур по матрице при- мплификаторе с активным регулированием - 1 ч 30 мин. Таблица 2. Программа для амплификации участка кДНК HDV. Амплификат температуры нагрева-охла 1 °С/сек); “У “РТС-100” ( оры с регулированием по матрице (скорость ждения не менее iniCycler”, VIJ Research). Амплификаторы с активным регули рованием (по раствору в пробирке): “GeneAmp PCR System 2400” (Perkin Elmer) “Omn-E” (Hybaid) «Терцик» (ДНК-техпология) температура время циклы температура время циклы 95 "С пауза 95 "С пауза 95 "С 5 мин 1 95 "С 5 мин 1 95 "С 1 мин 42 95 ”С Юс 42 67 “С 1 мин 67 "С Юс 72 "С 1 мин 72 "С Юс 72 "С 1 мин 1 72 "С 1 мин 1 10 "С хранение 10 "С хранение ния реакции собрать пробирки в специальный штатив и отправить в комнату тродуктов ПЦР (ЗОНУ 3). Пробы после амплификации можно хранить 16 ч 1Й температуре, в течение 1 нед при температуре 2-8 °С (однако, перед нрове- рофореза необходимо нагреть пробирки до комнатной температуры для раз- са). --- стр. 10 --- ЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРОДУКТОВ ПЦР-АМПЛИФИКАЦИИ в ЗОНЕ 3 - комнате для анализа продуктов амплификации. ^ РАБОТА С АМПЛИФИЦИРОВАННОЙ ДНК ДОЛЖНА ПРОВОДИТЬСЯ ЯОЙ КОМНАТЕ СОТРУДНИКОМ ЛАБОРАТОРИИ, НЕ ПРОИЗВОДЯ- ЗПУЛЯЦИЙ В ЗОНЕ 1 И ЗОНЕ 2. 1ие рабочих растворов и агарозного геля. гь рабочий электрофорезный буфер. В мерный цилиндр влить 25 мл концеитри- ТБЕ, довести дистиллированной водой до 500 мл, закрыть цилиндр пара- перемешать. \НИЕ! Этидия бромид - канцерогенное соединение, поэтому при работе с ним одать правила безопасности; работать только в перчатках, избегать попадания на стые, ири попадании на кожу или слизистые тщательно промыть соответствую- юдой. агенты, содержащие этидия бромид, перед утилизацией следует подвергать спе- аботке (см. пункт «Обеззараживание»). i одного флакона пересыпать в стеклянную колбу из термостойкого стекла на лить 100 мл рабочего буфера, перемешать вращением колбы и плавить в микро- ечи до полного растворения агарозы. Время плавления агарозы в микроволновой остью 800 Вт при ее загруженности 1 колбой - 1,5 мин. Если в микроволновую остью 800 Вт ставится 5 колб с агарозой, время плавления увеличивается до :ле этого вновь поместить колбу с агарозой в микроволновую печь на 1,5 мин эсти 800 Вт), довести агарозу до кипения. Вынуть колбу из микроволновой печи агарозу, вращая колбу, до температуры 65-70 °С. столик для заливки гелей, залить расплавленный гель в форму камеры. Устано- 1КИ, не касаясь дна формы, на расстоянии не менее 3 см друг от друга. Толщина а быть около 0,6 см. ого застывания геля (30 мин при комнатной температуре), осторожно вынуть из зки, не повредив лунки. Поместить подложку с готовым гелем в камеру, лунки :полагаться ближе к отрицательному электроду. ДНК, соответственно, движется шьному. Залить в камеру готового буфера столько, чтобы он покрывал гель на эк работы. : продуктами амплификации последовательно выставить в штатив, отобрать из- :ла по 10-15 мкл пробы и внести в лунки геля (если для нанесения разных проб I один и тот же наконечник, то его необходимо промывать буфером из камеры --- стр. 11 --- несения каждой пробы). В каждом ряду лунок геля должен быть обязательно пред- и, желательно, маркер молекулярных масс. )чить камеру к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК движется к положитель- ктроду), и включить источник. Если нет нарушения контактов, то при прохождении лектродов должны подниматься пузырьки. Оптимальное напряжение электрическо- 0 В/см. При использовании камеры SE-2 («Хеликон») и источника питания «Эльф- С-технология») параметры источника следующие: напряжение 250 В, стабилизация Кению, время электрофореза - 18-20 мин. раситель пройдет примерно половину длины геля (не менее 1,5 см), выключить ис- жа, перенести гель на трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лун- эх. Получить изображение геля на компьютере с помощью видеосистемы, отмечая 1анесения проб, занести в базу данных. 1МАНИЕ! 1 просматривании геля и фотографировании глаза и лицо должны быть защи- (иальной маской или стеклянной пластиной! УЛЬТАТОВ г результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию па электрофо- пецифических полос амплифицированной кДНК (см. табл. 2 и приложение), на амплифицированных специфических фрагментов ДНК: /са гепатита D - 255 п.н, реннего контроля (ВКО) - 500 н.н. титическая чувствительность набора реагентов - не менее 5000 копий/мл РНК атита D. Таблица 2. Оценка результатов анализа контрольных точек. онтроль- 1я точка Какой этап ПЦР- анализа контролируется Специфические полосы на элек- трофореграмме Полоса 255 п.н. Полоса 500 п.н. К Выделение РНК Есть Есть К Выделение РНК Нет Есть ■ ПЦР Нет Нет f ПЦР Есть Нет :е, соответствующей положительному контролю этапа выделения (ПК), долж- две яркие светящиеся оранжевые полосы: специфическая - на уровне 255 нл1. и [утреннего контрольного образца HDV - на уровне 500 п.н. :е, соответствующей отрицательному контролю этапа выделения (ОК), долж- олько полоса ВКО на уровне 500 п.н. --- стр. 12 --- ке, соответствующей положительному контролю этапа ПЦР (К+), должна быть ецифическая светящаяся оранжевая полоса на уровне 255 п.н. кке, соответствующей отрицательному контролю этапа ПЦР (К-) не должно саких полое. тельными считаются образцы, которые содержат специфическую светящуюся la уровне 255 пт. большей или меньшей интенеивности, независимо от наличия шутреннего контроля. Полоса внутреннего контрольного образца может отсутст- пробах с высокой концентрацией РНК HDV. ельиыми считаются образцы, которые содержат только полосу 500 1ьн. большей шей интенеивности 'лос 255 п.н. и 500 п.н. в дорожках могут наблюдаться нечеткие размытые полосы димеров, которые располагаютея ниже уровня 100 нуклеотидных пар. зьтаты анализа не подлежат учету в следующих случаях: льтаты анализа контрольных точек не совпадают с приведенными в табл. 2, то со- тощий этап анализа следует переделать. рожке какой-либо из проб отсутствуют обе полосы, и 255 п.н. и 500 п.н., результат [О данной пробе считается недействительным, необходимо повторить исследова- клинической пробы с самого начала. Причиной могла явиться ошибка в процедуре i клинического материала, приведшая к потере РНК/ДНК или ингибированию ОТ Р. IX появляются неспецифические полосы на разных уровнях. Возможные причины: е «горячего старта» или неверный температурный режим в ячейках амплификато- i специфической полосы 255 п.н. в любом из отрицательных контрольных образ- К-) указывает на контаминацию реактивов или проб. В этом случае результаты зитают недействительными. Требуется повторить анализ проб, а также предпри- по выявлению источника контаминации. КИВАНИЕ. зраживание биоматериала и реагентов следует проводить на каждой стадии от- ■щая одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) в контейнеры, дезинфицирующий 0,2 % раетвор ДП-2Т. этапные гели и буфер из камеры помещают в пластиковую емкость на 5 л с плот- ющейся крыщкой. Добавляют 1 объем 0,5 М раствора калия перманганата и за- 2,5 М соляной кислоты. Аккуратно перемешивают и оставляют при комнатной