Набор реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В (HBV) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле "АмплиСенс® HBV-EPh" по ТУ 9398-040-01897593-2009 — инструкция и характеристики
Открытые закупки, где изделие проходит ТЗ
Сейчас открытых закупок, где изделие полностью проходит ТЗ, нет; список обновляется каждый день.
Построчная сверка ТЗ с характеристиками этого изделия и все закупки под ваши товары — в кабинете, 7 дней бесплатно.
Попробовать бесплатно
Текст инструкции: технические характеристики
--- стр. 3 --- УТВЕРЖДЕНА Приказом Росздравнадзора от № УТВЕРЖДАЮ Директор Федерального государственного учреждения науки «Вентральный научно-исследова тельский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и лучия человека В.И.Покровский ИНСТРУКЦИЯ по применению набора реагентов для выявления ДНК вируса гепатита В (HBV) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле «АмплиСенс® HBV- EPh» --- стр. 4 --- ФОРМА КОМПЛЕКТАЦИИ. Набор реагентов выпускается в 7 формах комплектации: Форма 1 включает комплекты реагентов «РИБО-сорб» вариант 100, «ПЦР-комплект» вариант 100 R (пробирки 0,5 мл), «ЭФ» вариант 200. Форма 2 включает комплекты реагентов «РИБО-сорб» вариант 100, «ПЦР-комплект» вариант 100 R (пробирки 0,2 мл), «ЭФ» вариант 200. Форма 3 включает комплекты реагентов «РИБО-преп» вариант 100, «ПЦР-комплект» вариант 100 R (пробирки 0,5 мл), «ЭФ» вариант 200. Форма 4 включает комплекты реагентов «РИБО-преп» вариант 100, «ПЦР-комплект» вариант 100 R (пробирки 0,2 мл), «ЭФ» вариант 200. Форма 5 включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант 100 R (пробирки 0,5 мл). Форма 6 включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант 100 R (пробирки 0,2 мл). Форма 7 включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант 200. ВНИМАНИЕ! Заявленные аналитические характеристики набора реагентов при работе с формами 5, 6 и 7 гарантируются только в случае применения дополнительных комплектов реагентов «РИБО-сорб» или «РИБО-преп» и «ЭФ» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. СОСТАВ. Комплект реагентов «РИБО-сорб» вариант 100 (ТУ 9398-004-01897593-2008) - комплект реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала включает: Реактив Описание Объем (мл) Кол-во Лизирующий раствор Прозрачная бесцветная жидкость* 45 1 флакон Раствор для отмывки 1 Прозрачная бесцветная жидкость* 40 1 флакон Раствор для отмывки 3 Прозрачная бесцветная жидкость 100 1 флакон Раствор для отмывки 4 Прозрачная бесцветная жидкость 40 1 флакон Сорбент Суспензия белого цвета 1,25 2 пробирки РНК-буфер Прозрачная бесцветная жидкость 0,5 10 пробирок Комплект реагентов рассчитан на выделение ДНК из 100 проб, включая контроли. ’При хранении лизирующего раствора, раствора для отмывки 1 и раствора для лизиса при температуре от 2 до 8 °С возможно образование осадка в виде кристаллов. --- стр. 5 --- Комплект реагентов «РИБО-преп» вариант 100 (ТУ 9398-071-01897593-2008) - комплект реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала включает: Реактив Описание Объем (мл) Кол-во Раствор для лизиса Прозрачная бесцветная жидкость* 30 1 флакон Раствор для преципитации Прозрачная бесцветная жидкость 40 1 флакон Раствор для отмывки 3 Прозрачная бесцветная жидкость 50 1 флакон Раствор для отмывки 4 Прозрачная бесцветная жидкость 20 1 флакон РНК-буфер Прозрачная бесцветная жидкость 1,2 8 пробирок Комплект реагентов рассчитан на выделение ДНК из 100 проб, включая контроли. Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант 100 R или вариант 200 - комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК HBV включает: Реактив Описание «ПЦР-комплект» вариант 100 R «ПЦР-комплект» вариант 200 Объём (мл) Кол-во Объём (мл) Кол-во ПЦР-смесь-1 HBV Прозрачная бесцветная жидкость — — U 1 пробирка ПЦР-смесь-1-R НВ V раскапана под воск Прозрачная бесцветная жидкость 0,005 110 пробирок объемом 0,5 или 0,2 мл — — ПЦР-смесь-2 blue Прозрачная жидкость синего цвета 1,2 1 пробирка 1,2 2 пробирки Воск для ПЦР Твердое вещество белого цвета — — 1,7 2 пробирки Минеральное масло для ПЦР Бесцветная вязкая жидкость 4,0 1 флакон 8,0 1 флакон ПКО ДНК HBV Прозрачная бесцветная жидкость 0,2 1 пробирка 0,2 1 пробирка ДНК-буфер Прозрачная бесцветная жидкость 0,5 1 пробирка 0,5 1 пробирка Комплект реагентов вариант 100 R рассчитан на проведение 110 реакций амплификации, включая контроли. Комплект реагентов вариант 200 рассчитан на проведение 220 реакций амплификации, включая контроли. Дополнительно к комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа выделения: --- стр. 14 --- 5. После окончания реакции собрать пробирки в специальный штатив и отправить в помещение для детекции продуктов ПЦР-амплификации (ЗОНУ 3). Пробы после амплификации можно хранить в течение 16 ч при комнатной температуре, в течение 1 нед при температуре от 2 до 8 °С (однако, перед проведением электрофореза необходимо нагреть пробирки до комнатной температуры для размягчения воска). Анализ продуктов амплификации проводится разделением фрагментов ДНК в агарозном геле. ЭТАП 3. ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ ПЦР-АМПЛИФИКАЦИИ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ. (проводится в ЗОНЕ 3 - помещении для детекции продуктов ПЦР-амплификации). ВНИМАНИЕ! Работа с амплифицированными ДНК должна проводиться в отдельной комнате сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в зоне 1 и зоне 2. Приготовление рабочих растворов и агарозного геля. 1. Приготовить рабочий электрофорезный буфер. В мерный цилиндр влить 25 мл трис- боратного буфера (ТБЕ) концентрированного с бромидом этидия, довести дистиллированной водой до 500 мл, закрыть цилиндр парафильмом и перемешать. ВНИМАНИЕ! Бромид этидия - канцерогенное соединение, поэтому при работе с ним следует соблюдать правила безопасности: работать только в перчатках, избегать попадания на кожу и слизистые, при попадании на кожу или слизистые тщательно промыть соответствующий участок водой. Все реагенты, содержащие этидия бромид, перед утилизацией следует подвергать специальной обработке (см. раздел «Обеззараживание»), 2. Агарозу для электрофореза ДНК из одного флакона пересыпать в стеклянную колбу из термостойкого стекла на 250 мл. Налить 100 мл рабочего буфера, перемешать вращением колбы и плавить в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Время плавления агарозы в микроволновой печи мощностью 800 Вт при ее загруженности 1 колбой - 1,5 мин. Если в микроволновую печь мощностью 800 Вт ставится 5 колб с агарозой, время плавления увеличивается до 5 мин. Вынуть колбу с расплавленной агарозой из микроволновой печи, аккуратно перемешать, вращая колбу. После этого вновь поместить колбу с агарозой в микроволновую печь на 1,5 мин (при мощности 800 Вт), довести агарозу до кипения. Вынуть колбу из микроволновой печи и остудить агарозу, вращая колбу, до температуры 65-70 °С. 3. Выровнять столик для заливки гелей, залить расплавленный гель в форму камеры. Установить гребенки, не касаясь дна формы, на расстоянии не менее 3 см друг от друга. Толщина геля должна быть около 0,6 см. 4. После полного застывания геля (30 мин при комнатной температуре), осторожно вынуть из него гребенки, не повредив лунки. Поместить подложку с готовым гелем в камеру, --- стр. 15 --- лунки должны располагаться ближе к отрицательному электроду. ДНК, соответственно, движется к положительному. Залить в камеру готового буфера столько, чтобы он покрывал гель на 5 мм сверху. Порядок работы. 1. Пробирки с продуктами амплификации выставить в штатив последовательно, отобрать из-под слоя масла по 10-15 мкл проб и внести в лунки геля (если для нанесения разных проб используется один и тот же наконечник, то его необходимо промывать буфером из камеры после нанесения каждой пробы). В каждом ряду дорожек геля должен быть обязательно представлен К+ и, желательно, маркер молекулярных масс ДНК. 2. Подключить камеру к источнику тока, соблюдая полярность (ДНК движется к положительному электроду), и включить источник. При использовании камеры «SE-2» («Хеликон») и источника питания «Эльф-4» («ДНК-Технология») параметры источника следующие: напряжение 250 В, стабилизация по напряжению, время электрофореза - 18- 20 мин. Оптимальная напряженность электрического поля при этом составляет 10 В/см. 3. Когда краситель пройдет примерно половину длины геля (не менее 1,5 см), выключить источник тока, перенести гель на трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх. Получить изображение геля на компьютере с помощью видеосистемы, отметив порядок нанесения, занести в базу данных. ВНИМАНИЕ! При просматривании геля и фотографировании глаза и лицо должны быть защищены маской или стеклянной пластиной! УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ. Учёт результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК (см. табл. 3). Длина специфических полос амплифицированных фрагментов ДНК: HBV - 470 п.н. ВКОЯЯК -770 п.н. Таблица 3 Результаты постановки контролей различных этапов ПЦР-анализа Контрольный образец Контролируемый этап ПЦР-анализа Специфическая полоса на электрофореграмме 470 п.н. 770 п.н. «ПК» Выделение ДНК Есть Есть «ок» Выделение ДНК Нет Есть «К-» ПЦР Нет Нет «к+» ПЦР Есть Нет 1. В дорожке, соответствующей положительному контролю этапа выделения (ПК), должны быть две яркие светящиеся оранжевые полосы: специфическая - на уровне 470 п.н. и полоса внутреннего контрольного образца - на уровне 770 п.н. --- стр. 16 --- 2. В дорожке, соответствующей отрицательному контролю этапа выделения (ОК), должна быть только полоса ВКО на уровне 770 п.н. 3. В дорожке, соответствующей положительному контролю этапа ПЦР (К+), должна быть только полоса положительного контроля - 470 п.н., и должна отсутствовать полоса внутреннего контроля 770 п.н. 4. В дорожке, соответствующей отрицательному контролю этапа ПЦР (К-) не должно быть никаких полос, за исключением возможных праймер-димеров, находящихся ниже уровня 100 п.н. 5. Положительными считаются образцы, которые содержат специфическую светящуюся полосу на уровне 470 п.н. большей или меньшей интенсивности, независимо от наличия полосы внутреннего контроля. Полоса внутреннего контроля может отсутствовать в пробах с высокой концентрацией ДНК HBV. 6. Отрицательными считаются образцы, которые содержат только полосу 770 п.н. большей или меньшей интенсивности. 7. Кроме полос 470 п.н. и 770 п.н. в дорожках могут наблюдаться нечеткие размытые полосы праймер-димеров, которые располагаются ниже уровня 100 нуклеотидных пар. Результаты анализа не подлежат учету в следующих случаях: 1. Если результаты анализа контрольных точек не совпадают с приведенными в таблице 3, то соответствующий этап анализа следует переделать. 2. Если в дорожке какой-либо из проб отсутствуют обе полосы, и 470 п.н. и 770 п.н., результат анализа по данной пробе считается недействительным, необходимо повторить исследование этой клинической пробы с первого этапа проведения анализа (выделение ДНК). Возможные причины: ошибка в процедуре обработки клинического материала, приведшая к потере ДНК или ингибированию ПЦР. 3. Если в дорожке какой-либо из проб отсутствуют обе полосы, и 470 п.н. и 770 п.н., и присутствуют неспецифические полосы на разных уровнях, результат анализа по данной пробе считается недействительным, необходимо повторить исследование этой клинической пробы со второго этапа проведения анализа (проведение ПЦР- амплификации). Возможные причины: отсутствие «горячего старта» или неверный температурный режим в ячейках амплификатора. 4. Появление специфической полосы 470 п.н. в любом из отрицательных контрольных образцов (OK, К-) указывает на контаминацию реактивов или проб. Требуется повторить анализ проб с первого этапа анализа (выделение ДНК), а также предпринять меры по выявлению источника контаминации.