Набор реагентов для выявления РНК поливирусов и энтеровирусов группы С (HEV-C) с дифференцировкой вакцинных штаммов полиовирусов (Sabin1, Sabin2, Sabin3) в объектах окружающей среды и клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией "АмплиСенс® Poliovirus-FL" по ТУ 9398-160-01897593-2010 — инструкция и характеристики

РУ: ФСР 2011/11257 от 28.07.2011 · класс риска 3

Производитель: ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Россия)

Автоматически отфильтрованный фрагмент инструкции по применению (страницы, где похоже, что есть таблица технических характеристик) — не полный документ. Карточка РУ на портале Росздравнадзора →

Текст инструкции: технические характеристики

--- стр. 1 ---
УТВЕРЖДЕНА УТВЕРЖДАЮ
Приказом Росздравнадзора Директор Федерального
от_______№_________________ государственного учреждения
науки «Центральный научно- 
исследовательский институт 
\Шы^ии» Федеральной 
:ро ;на^^ в сфере
'и
юка
кПокровский
2011 г .
ИНСТРУКЦИЯ
по применению набора реагентов  
для выявления РНК полиовирусов и  
энтеровирусов группы С (HEV-C) с дифференцировкой  
вакцинных штаммов полиовирусов (Sabini, Sabin2, SabinS) в  
объектах окружающей среды и кпиническом материале  
методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с  
гибридизационно-флуоресцентной детекцией
«АмплиСенс® Poliovirus-FL»


--- стр. 2 ---
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ......................................................................................... 3
НАЗНАЧЕНИЕ.........................................................................................................3
ПРИНЦИП МЕТОДА................................................................................................ 3
ВАРИАНТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТО В ........................................4
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ............................................... ....................4
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ............................................................................... 5
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ..........................................6
ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА... 7
ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАКЦИИ РН К.......................7
ВАРИАНТ F E P ........................................................................................................ 9
СОСТАВ 9
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ ................................................... .................9
ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ.............................................. 10
РЕАКЦИЯ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ............................................................... 10
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ И ДЕТЕКЦИИ ПО «КОНЕЧНОЙ ТОЧКЕ»..............10
ФЛУОРЕСЦЕНТАЯ ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУКТОВ АМПЛИФИКАЦИИ ПО «КОНЕЧНОЙ
ТОЧКЕ»................................................................................................................. 13
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ........................................................................ 14
ВАРИАНТ FRT....................................................................................................... 17
СОСТАВ................................................................................................................ 17
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ...................................................................17
ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ.............................................. 18
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО
ВРЕМЕНИ»............................................................................................................18
АНАЛИЗ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ.......................................................20
СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ...................24
ОГЛАВЛЕНИЕ


--- стр. 3 ---
список СОКРАЩЕНИИ
В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения:
ВКО -  внутренний контрольный образец для наборов с гибридиза­
ционно-флуоресцентной детекцией
ОКО -  отрицательный контрольный образец
пко -  положительный контрольный образец
ПЦР -  полимеразная цепная реакция
ФГУН ц нииэ 
Роспотребнад­
зора
-  федеральное государственное учреждение науки «Централь­
ный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Фе­
деральной службы по надзору в сфере защиты прав потреби­
телей и благополучия человека
FEP -  детекция по «конечной точке»
FRT -  детекция в режиме «реального времени»
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов «АмплиСенс Poliovirus-FL»  предназначен для выявления РНК 
полиовирусов и энтеровирусов группы С (HEV-C) с дифференцировкой вакцинных 
штаммов полиовирусов (Sabin 1 , Sabin 2, Sabin 3)  в клиническом материале и  
объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с 
гибридизационно-флуоресцентной детекцией.
В соответствии с действующей в РФ нормативно-методической документацией 
клинический материал от пациентов с подозрением на полиомиелит, острыми 
вялыми параличами должен исследоваться в соответствии с МУК 4.2.2410-08. 
«Организация и проведение вирусологических исследований материалов от 
больных полиомиелитом, с подозрением на это заболевание, с синдромом острого 
вялого паралича (ОВП)».
ВНИМАНИЕ! Результаты ПЦР-исследования учитываются в комплексной характе­
ристике исследуемых образцов.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Метод основан на одновременной амплификации в двух реакционных пробирках 
(формат «мультиплекс-ПЦР») и детекции в режиме «реального времени» или по 
окончании амплификации участков кДНК полиовирусов и энтеровирусов группы С 
(HEV-C), вакцинных штаммов полиовирусов {Sabin 1 , Sabin 2, Sabin 3), а также уча­
стка внутреннего контрольного образца (ВКО). Реакционная смесь содержит олиго- 
нуклеотидные праймеры и флуоресцентно меченные гибридизационные зонды (ФМ- 
зонды), которые комплементарны внутренним специфическим участкам амплифи- 
цируемого фрагмента. Флуоресцентный сигнал, испускаемый ФМ-зондом, детекти­
руется оптическим блоком амплификатора непосредственно в процессе реакции в
3


--- стр. 4 ---
«режиме реального времени» (формат FRT) или флуоресцентным детектором по 
окончании амплификации (формат FEP). ФМ-зонды для каждой из мишеней имеют 
свою длину волны, что позволяет регистрировать сигнал по соответствующему ка­
налу. Для детекции семи возбудителей и ВКО используется амплификатор или 
флуоресцентный детектор с оптическим блоком, имеющим 3 и более каналов.
ВАРИАНТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ 
Набор реагентов выпускается в 1  варианте.
Вариант FEP/FRT
Набор реагентов выпускается в 1  форме комплектации:
Форма 1  включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FEP/FRT-50 F.
Форма комплектации 1  предназначена для проведения амплификации участков 
кДНК полиовирусов и энтеровирусов группы С (HEV-C), вакцинных штаммов полио- 
вирусов (Sabin 1 , Sabin 2, Sabin 3) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по 
«конечной точке», либо в режиме «реального времени». Для проведения полного 
ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты реагентов для экстракции 
(выделения) РНК и  проведения реакции обратной транскрипции, рекомендованные 
ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора («РИБО-сорб» или «РИБО-преп» и  «РЕВЕРТА-L») 
или другие рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 
Аналитическая чувствительность
Таблица 1
Аналитическая чувствительность набора реагентов  
« Ам п л и Се н  с®  Poliovirus-FL»
Вид исследуемого 
материала
Комплект для 
выделения 
ДНК
Комплект для 
амплификации 
и детекции
Аналитическая
чувствительность,
ГЭ/мл
Концентрат воды «РИБО-сорб»
«ПЦР-комплект» 
вариант 
FEP/FRT-50 F
1x10^
Фекалии «РИБО-преп»
«ПЦР-комплект» 
вариант 
FEP/FRT-50 F
5x10^
Аналитическая специфичность
Специфичность набора реагентов проверялась на штаммах: 
энтеровирусов (Coxsakie В1, В2, ВЗ, В4, В5, В6; Polio (Sabin) I, II, ill), вирусов гриппа 
А (H13N2. H9N2, H8N4, H2N3, H4N6, H11N6, H12N5, H3N8, H1N1, H6N2, H10N7,
4


--- стр. 5 ---
H5N1), гриппа В, риновирусов, RS вирусов, аденовирусов человека -  3, 5, 7, 37, 40 
типов. Специфичность оценивалась также на штаммах N.meningitides, St  
pneumoniae, Н.influenzae, Clebsiella К 65 SW4, Listeria monocytogenes УСХЧ 19, Liste­
ria monocytogenes УСХЧ 52, Proteus vulgaris 115/98, Pseudomonas aeruginosa ДН cl, 
Staphylococcus aureus 653, Staphylococcus aureus  29112, l\/lorganella Morgan!! 619 с
01, Enterobacter faecalls 356.
При проведении тестирования данных панелей, а также образцов ДНК человека 
неспецифических реакций выявлено не было.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно-биоло- 
гические (ПЦР) исследования клинического материала на наличие возбудителей 
инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-эпидемических правил СП
1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности 
(опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СанПиН 2.1.7.2790-10 «Са­
нитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами» и  
методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация работы при исследованиях ме­
тодом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III- 
IV групп патогенности».
При работе всегда следует выполнять следующие требования;
-  Следует рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные, ор­
ганизовывать работу и хранение в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопас­
ность работы с микроорганизмами I1I-IV групп патогенности (опасности) и  воз­
будителями паразитарных болезней».
-  Убирать и дезинфицировать разлитые образцы или реактивы, используя де­
зинфицирующие средства в соответствии СП 1.3.2322-08 «Безопасность рабо­
ты с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и  возбудителями 
паразитарных болезней».
-  Удалять неиспользованные реактивы в соответствии с требованиями СанПиН 
2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с ме­
дицинскими отходами».
ВНИМАНИЕ! При удалении отходов после амплификации (пробирок, содержащих 
продукты ПЦР) недопустимо открывание пробирок и разбрызгивание содержимого, 
поскольку это может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны, 
оборудования и реагентов.


--- стр. 6 ---
-  Применять набор строго по назначению, согласно данной инструкции.
-  Допускать к работе с набором только специально обученный персонал.
-  Не использовать набор по истечении срока годности.
-  Избегать контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой. При контакте не­
медленно промыть пораженное место водой и обратиться за медицинской по­
мощью.
-  Спецификация по безопасности материалов (MSDS - material safety data sheet) 
доступна по запросу.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
1. Комплект реагентов для выделения РНК - «РИБО-сорб» (ТУ 9398-004-01897593- 
2008), «РИБО-преп» (ТУ 9398-071-01897593-2008) или другие рекомендованные 
ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.
2. Дополнительные материалы и  оборудование для экстракции РНК - согласно инст­
рукции к комплекту реагентов для выделения РНК.
3. Комплект реагентов для проведения реакции обратной транскрипции -  «РЕВЕРТА-L» 
(ТУ 9398-005-01897593-2008).
4. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс).
5. Центрифуга/вортекс.
6. Автоматические дозаторы переменного объема от 5 до 20 мкл и от 20 до 200 мкл.
7. Одноразовые наконечники с фильтром до 100 мкл и 200 мкл в штативах.
8. Штативы для микропробирок объемом 0,2 или 0,5 мл (в соответствии с используе­
мыми комплектами реагентов). Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой 
не выше минус 16 °С для выделенных проб ДНК.
9. Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.2569-09.
10. Емкость для сброса наконечников.
При детекции «по конечной точке»:
11. Программируемый амплификатор (например, «Терцик» («ДНК-Технология», Россия), 
Gradient Palm Cycler (Corbett Research, Австралия), MaxyGene (Axygen, США), Ge- 
neAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems) или аналогичные).
12.Флуоресцентный ПЦР-детектор (например, ALA-1/4 (BloSan, Латвия), «Джин» 
(«ДНК-Технология», Россия) или аналогичные).
13. Одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР (плоская крышка, 
нестрипованные) на 0,2 или 0,5 мл:
а) объемом 0,2 мл (например, Axygen, США) - для амплификаторов,


--- стр. 7 ---
адаптированных для ПЦР-пробирок 0,2 мл (Gradient Palm Cycler, GeneAmp 
PCR System 2700, MaxyGene и др.);
б) объемом 0,5 мл (например, Ахудеп, США) для амплификаторов, 
адаптированных для ПЦР-пробирок 0,5 мл («Терцик» и др.).
При детекции в  режиме «реального времени»:
10. Программируемый амплификатор с системой детекции флуоресцентного сигнала 
в режиме «реального времени» (например, Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett Research, 
Австралия), iQ iCycler, iQ5 (Bio-Rad, США), МхЗОООР (Stratagene, США), «ДТ-96» 
(«ДНК-Технология», Россия) или аналогичные).
11. Одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР:
а) на 0,2 мл (плоская крышка, нестрипованные), (например, Ахудеп, США) для 
постановки в ротор на 36 пробирок - для приборов для ПЦР в реальном вре­
мени с детекцией через дно пробирки (например, Rotor-Gene);
б) на 0,2 мл (куполообразная крышка) (например, Ахудеп, США) - для приборов 
для ПЦР в реальном времени с детекцией через крышку (например, iQ5, 
МхЗОООР).
ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА
Перед началом работы следует ознакомиться с методическими рекомендациями 
«Взятие, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР- 
диагностики», разработанными ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва, 2008 г . 
Материалом для проведения ПЦР служат стерильные и нестерильные типы клини­
ческого материала и концентраты воды.
В соответствии с действующей в РФ нормативно-методической документацией 
клинический материал от пациентов с подозрением на полиомиелит, острыми вялы­
ми параличами должен исследоваться в соответствии с МУК 4.2.2410-08. «Органи­
зация и проведение вирусологических исследований материалов от больных полио­
миелитом, с подозрением на это заболевание, с синдромом острого вялого парали­
ча (ОВП)».
ПОДГОТОВКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА К ЭКСТРАКЦИИ РНК
Все манипуляции, связанные с подготовкой проб, проводятся с использованием 
дозаторов переменных объемов, одноразовых полипропиленовых пробирок, нако­
нечников с фильтрами и др. материалов в соответствии с документами, перечислен­
ными в разделе «Меры предосторожности».
1. Образцы СМЖ и концентратов воды не требуют предварительной подготовки.
7